REALIZACE GENETICKÉ INFORMACE. transkripce, posttranskripční modifikace, translace, posttranslační modifikace

Transkript

1 REALIZACE GENETICKÉ INFORMACE transkripce, posttranskripční modifikace, translace, posttranslační modifikace

2 Realizace genetické informace = syntéza proteinů - proteosyntéza nejprve přepis informace z DNA do mrna = transkripce úprava primárního transkriptu = posttranskripční modifikace potom překlad informace z mrna do sekvence AK = translace úprava polypeptidového řetězce do fukční a aktivní podoby = posttranslační modifikace současně je třeba syntetizovat proteosyntetický aparát = enzymy, ribosomy a trna

3 SYNTÉZA RNA - TRANSKRIPCE přepis z DNA zajišťuje RNA polymeráza - vždy ve směru 5 3 (matrice se čte ve směru 3 5 ) rychlost transkripce asi 30 nukleotidů / sec nasedá na DNA v místě promotoru = charakteristické místo na DNA, obvykle několik desítek párů bazí před začátkem přepisovaného genu; jeho důležitou součástí je TATA box, asi 25 bp proti proudu na promotor se naváží proteiny zvané transkripční faktory - na ně se pak naváže RNA polymeráza - tak vzniká transkripční iniciační komplex = promotor + transkripční faktory + RNA polymeráza pro každý gen je kódující jen 1 řetězec DNA - podle orientace promotoru

4 INICIACE TRANSKRIPCE hnrna

5 RNA POLYMERÁZA u prokaryont syntetizuje všechny typy RNA jeden enzym u eukaryont existují 3 typy polymerázy: I - v jadérku, velkou molekulu rrna II - v jádře, molekuly pre-mrna (hnrna) III - v jádře, trna + malé molekuly rrna

6 Průběh transkripce iniciace (lokální odvinutí asi 17 bp) elongace (krátký hybridní úsek DNA-RNA v délce asi 12 bp) terminace (v krátkém úseku je RNA dvouvláknová ve tvaru vlásenky, to vyvolá konformační změnu a uvolnění RNA-polymerázy); detaily terminace transkripce nejsou dosud známy

7 Posttranskripční modifikace capping na 5 konci - před ukončením transkripce k prvnímu nukleotidu se připojí modifikovaný guanin jako tzv. Gppp čepička chrání primární transkript před nukleázami a umožní napojení mrna na malou podjednotku ribozomu připojení polya konce - po skončení transkripce se na 3 konec pre-mrna asi nukl. za terminačním signálem AAUAAA připojí adenosinů nutný pro export mrna z jádra do cytoplazmy nutný pro rozpoznání molekuly RNA ribosomem chrání primární transkript před nukleázami

8 POSTTRANSKRIPČNÍ MODIFIKACE u eukaryont primární transkript obsahuje tis. nukleotidů, tj. asi 10x více nukleotidů, než je potřeba pro běžný protein; pre-mrna obvykle obsahuje introny, ty jsou pomocí částic snrnp vystřiženy a exony připojeny k sobě - tzv. sestřih RNA (modifikace se týkají všech typů RNA) snrnp se nachází v jádře a jsou tvořeny z tzv. snrna a proteinů snrna = small nuclear RNA, je dlouhá cca 150 nukleotidů několik různých snrna se spojují s proteiny za vzniku snrnp (small nuclear ribonucleoproteins) snrnp se spojují ještě s dalšími proteiny za vzniku spliceosomu výsledná mrna může opustit jádro a v cytoplazmě podléhá translaci

9 SESTŘIH hnrna (splicing, processing) na začátku a konci intronu signální sekvence - jsou rozpoznány spliceosomy (intron vytvoří smyčku) význam intronů? akumulace mutací stavebnicový princip - umožňuje rekombinaci exonů a vznik více molekul mrna z jednoho primárního transkriptu alternativní sestřih

10 PROTEOSYNTÉZA - TRANSLACE proces energeticky náročný - na vznik peptidové vazby nutné 4 molekuly GTP syntéza proteinu o 400 AK trvá asi 20 sec. (rychlost syntézy je 20 AK / sec.) místem translace ribosomy každá AK určena kodonem (tripletem bazí v mrna) 61 tripletů pro 21 AK - iniciační kodon AUG (kodony mezi sebou nemají mezery, čtou se jako třípísmenková slova. Čtecí rámec specifikuje první písmeno iniciačního kodonu AUG. - terminační kodony - UAA, UAG, UGA genetický kód - rozluštěn na počátku 60. let 20. století: tripletový univerzální nepřekryvný degenerovaný Espero Publishing, s.r.o.

11 trna přenašečem aktivovaných AK každá trna může nést jen jednu z 21 možných AK - specifitu zajišťuje aminoacyl-trna-syntetáza pro každou AK je vlastní enzym, (rozpozná i více typů trna, existují-li pro danou AK) aminokyselinové rameno - AK se váže na 3 konec trna makroergní vazbou (vždy končí sekvencí CCA) antikodonové rameno - antikodon v trna během translace čte pořadí kodonů v mrna

12 RIBOSOMY složeny z rrna + proteinů, tvoří 2 podjednotky prokaryontní ribosom - průměr 30 nm, 70S (50S+30S) eukaryontní ribosom - průměr 32 nm, 80S (60S+40S), v cytoplazmě asi ribosomů podjednotky ribosomů se spojují při iniciaci translace polyzom - více ribozomů na 1 molekule mrna Espero Publishing, s.r.o.

13 RIBOSOMY - pokračování menší podjednotka váže mrna větší podjednotka má 3 funkční místa pro trna: A-místo (aminoacylové) - pro vazbu trna P-místo (peptidylové) - pro vazbu peptidyl-trna, zde vzniká peptidová vazba mezi -COOH iniciační AK a -NH 2 následující AK E-místo (exit) - zde opouští volná trna ribozom funkcí ribosomů - prostorová orientace mrna a dvou aminoacyl-trna s navázanými AK (komplementarita kodonu a antikodonu) ribosom se posunuje po mrna ve směru 5 3 (syntéza proteinu začíná N-, končí C-koncem)

14 INICIACE TRANSLACE 5 konec mrna se spojí s menší podjednotkou ribozomu do P-místa v menší podjednotce nasedne trna s Met + iniciační faktory komplex klouže po mrna až se antikodon spojí s kodonem AUG nyní se připojí větší podjednotka ribozomu do A-místa nasedne další trna

15 PRŮBĚH TRANSLACE - elongace Met Met Asn Asn UAC UUG UAC UUG 5 AUG AAC UGG UAG 5 AUG AAC UGG UAG JKP, 1999 vznik peptidové vazby katalyzován peptidyltransferázou - enzymovou aktivitu vykazuje (např. u E. coli) 23S rrna (jde o ribozym) - energii si nese AK vázaná na trna

16 Met Met Asn Trp UAC Asn Trp UAC UUG ACC UUG ACC 5 AUG AAC UGG UAG 5 AUG AAC UGG UAG JKP, 1999 energii pro posun ribozomu po mrna dodávají translační faktory spotřeba asi 4 GTP na 1 triplet

17 PRŮBĚH TRANSLACE - terminace Met Met Asn Trp Asn Trp UUG ACC 5 AUG AAC UGG UAG UUG ACC 5 AUG AAC UGG UAG dosáhne-li se terminačního kodonu do A-místa nepřichází žádná trna, ale uvolňovací faktory uvolní se polypeptid od trna a ukončí translaci translační komplex se rozpadne JKP, 1999

18 POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE chemické úpravy polypeptidového řetězce: odštěpení formylové skupiny z methioninu na N-konci odštěpení methioninu na N-konci polypeptidu metylace, fosforylace, hydroxylace tvorba S-S můstků mezi SH- skupinami AK glykosylace (v ER a Golgiho komplexu) odstranění signálních sekvencí vyštěpení bloků AK z polypeptidů (např. vznik pepsinu z pepsinogenu, vznik insulinu) spojování více podjednotek (např. Hb = 2α + 2β) připojení prostetických skupin (např. hem v Hb)

19 BIOMEMBRÁNY STRUKTURA A FUNKCE MEMBRÁNOVÝCH ORGANEL

20 BIOMEMBRÁNY základní princip strukturální a funkční organizace buněk - silná 7,5 nm (v TEM se jeví jako dvojitá kontura na povrchu všech buněk i dalších organel uvnitř buňky) ohraničují a současně spojují všechny buňky s okolím uvnitř bb. ohraničují a propojují jednotlivé kompartmenty umožňují regulovanou výměnu látek, energie a informací mezi buňkou a okolím i mezi vnitřními kompartmenty tvoří jeden funkčně i morfologicky propojený systém (mimo vnitřní membr. mitochondrií)

21 TEORIE KOMPARTMENTŮ v buňce je mnoho různých prostorů, které rozdělují složitý systém na fyzicky oddělené subsystémy (např. organely) umožňují zajistit různé optimální reakční podmínky uvnitř buňky - např.: kyselé ph v lysosomech, vysoká koncentrace Ca 2+ v ER, různé koncentrace substrátu aj.

22 CYTOPLAZMATICKÁ u prokaryontních bb. MEMBRÁNA ohraničuje buňku vůči okolí, zároveň vykonává další funkce např. tylakoidy, mesozomy (zastupují funkci chloroplastů a mitochondrií) z evolučního hlediska je cytopl. membrána jednou z primárních buněčných struktur přesto na ni připadá jen malá část (asi 2 5 % povrchu všech biomembrán eukaryontních buněk), většina membrán připadá na ostatní membránové struktury (zejména drsné ER a jaderný obal)

23 Chemické složení biomembrán (ve vahových procentech) u všech živočišných bb. podobné (poměr lipidy/proteiny 1:2) rostlinné a živočišné buňky se liší obsahem cholesterolu plazmatická membrána jaderná membrána endopl. retikulum Golgiho komplex mitochondrie - vnější m. mitochondrie - vnitřní m. erytrocyt myelinová pochva proteiny lipidy cukry

24 MEMBRÁNOVÉ PROTEINY globulární integrální proteiny: jsou zanořeny do hydrofobní oblasti transmembránové proteiny pronikají celou membránou (zejména receptorové proteiny mohou procházet membránou opakovaně např. bakteriorhodopsin prochází 7x) periferní proteiny: jsou přiloženy k membráně z jedné či druhé strany; často se dotýkají integrálních některé transmembránové proteiny jsou na vnější straně navázány k extracelulární matrix a na vnitřní straně k cytoskeletu buňky. Tím je vytvořena požadovaná pevnost živočišných buněk. laterální migrace pohyb molekul proteinů v ploše membrány (rozhoduje tekutost lipidové vrstvy a vazba proteinů na další buněčné struktury)

25 Hlavní funkce membránových proteinů např.: enzymy, receptory, transportní systémy, imunoglobuliny, antigeny, rodopsin v buňkách sítnice transport látek enzymatická aktivita vedení signálů spojování buněk mezi sebou rozpoznání jednotlivých buněk mezi sebou připevnění k extracelulární matrix

26 MEMBRÁNOVÉ LIPIDY Fosfolipidy - glycerol + 2 MK (z toho 1 nenasycená) + fosfátová skupina - vznik amfifilie - hydrofilní a hydrofobní konce ve vodném prostředí autoagregace v micely nebo lipidovou dvouvrstvu asymetrie membrán (s tím souvisí polarita) vnější: fosfatidyllecithin, glykolipidy vnitřní: fosfatidylserin, fosfatidylethanolamin Cholesterol - u živočiš. bb. tvoří až 25 % lipidů, u prokar. bb. se nevyskytuje vůbec ovlivňuje fluiditu membrány (při teplotě okolo 37 C cholesterol brání pohybu fosfolipidů a tím zvyšuje tuhost membrány) snižuje bod přechodu (při nízkých teplotách cholesterol naopak brání úplnému ztuhnutí membrány)

27 BIOMEMBRÁNY jsou tekuté řetězce MK jsou volně pohyblivé pohyblivější jsou kratší a nenasycené MK (řetězce se ohýbají, rotují kolem své osy, vyměňují si místo se sousedy až 10 7 x/sec.) laterální difuse - pohyb lipidů i proteinů v ploše membrány - např. u prokaryontních buněk až 2 µm/s flip-flop pohyb - překlápění mezi vrstvami fosfolipidů = fluidita membrány membrána se snižující se teplotou tuhne - při poklesu teploty se sníží pohyblivost MK = rigidita membrány

28 MEMBRÁNOVÉ CUKRY na vnější straně membrány membránové sacharidy jsou obvykle rozvětvené oligosacharidy s méně než 15 monosacharidy některé se kovalentně vážou k membránovým lipidům za vzniku tzv. glykolipidů většina se ovšem váže k membránovým proteinům za vzniku glykoproteinů složení oligosacharidů v membránách je různé u různých druhů a dokonce i v rámci jednoho druhu (např. krevní skupiny A, B, AB a 0 jsou dány jinými oligosacharidy v membránách erytroc.) glykokalyx - u živoč. bb. vně cytopl. membrány = několik nm silná vrstva proteinů a polysacharidů napojená na oligosacharidové řetězce biomembrány není to samostatná biomembrána

29 fluidně mozaikový model biomembrány model Singer - Nicolsona

30 Důkazy fluidity membrány časosběrný film - membrány se stále přestavují a pohybují capping - shlukování receptorů po jejich vazbě s antigeny fúze buněk - vznik syncicií, zygoty, využívají se při hybridizaci buněk a v genovém inženýrství fúze membrán - zajišťuje kontinuitu membrán, endocytózu a exocytózu, dělení buněk do 1 hodiny po fúzi se proteiny kompletně promíchají laterálním pohybem Espero Publishing, s.r.o.

31 ENDOPLAZMATICKÉ RETIKULUM největší nitrobuněčný kompartment - 15 % objemu b. (asi polovina všech membrán buňky); velikost se může rychle měnit (během několika minut) podle potřeby vnějších i vnitřních faktorů systém cisteren a trubiček podle vazby s ribozómy se dělí na hladné a drsné ER souvisí s vnější membránou jaderného obalu i s cytoplazmatickou membránou syntéza stavebních jednotek ostatních organel syntéza proteinů a glykoproteinů na export zásobárna Ca +2

32 DRSNÉ ER váže ribozomy tvoří % povrchu všech membrán buňky v sekrečních buňkách (pankreas, plazmatické bb.) proteosyntéza na ribozomech -řetězec jde hned do lumen DER posttranslační modifikace = N-glykosilace proteiny ve váčcích jdou k další modifikaci do GK EM snímek krysího hepatocytu glykogen obr. 4.39; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990 Espero Publishing, s.r.o.

33 HLADKÉ ER metabolismus lipidů (hepatocyty) - fosfolipidy - cholesterol - steroidní hormony v játrech se účastní přeměny glykogenu na glukózu detoxikace (hepatocyty barbituráty, jedy, drogy) Leydigova b. ve varleti (1-HER, 2-DER, 3-mitochondrie, 4-peroxizomy, 5-sekundární lysozom) vápníková pumpa ve svalových bb. = sarkoplazmatické retikulum (transport Ca 2+ do lumina) při homogenizaci buňky se rozpadá na mikrosomy 2 4 obr. 63; K. Kapeller: Cytomorfológia, Osveta, Martin, 1990

34 GOLGIHO APARÁT stálá struktura v blízkosti jádra (v b. může být i několik GA) cisterny = cis strana - dictyosomy sekreční měchýřky = strana trans vnitřní obsah cisteren není propojen nikdy se neváže s ribosomy zdrojem primárních lyzosomů membr. váčky; 2 Golgiho aparát; 3 ER; 4 jaderný obal Espero Publishing, s.r.o. obr. 4.41; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990

35 FUNKCE GOLGIHO KOMPLEXU další modifikace látek a jejich distribuce: glykosilace sulfatace fosforylace připojování MK skladování proteinů koncentrování proteinů albumin, parathormon, glukagon, gastrin, insulin, glykoproteiny membrány, lysosomální enzymy, proteoglykany buněčné stěny aj. - nejvíce rozvinut v žlázových buňkách, např. pankreatu zymogenní granula doprava na místo určení - exocytóza z buňky, do jádra, mitochondrií, lysosomů, ER, membrány membrány sekrečních měchýřků se recyklují, opačným směrem probíhá endocytóza

36 cesta sekrečních proteinů v pankreatu Espero Publishing, s.r.o. obr. 4.40; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990

37 LYZOSOMY obsahují kyselé hydrolázy (ph = 5) je udržováno aktivním transportem protonů do lumina lyzosomů rozpoznávací molekuly v membráně určují, se kterými kompartmenty mohou lyzosomy fúzovat hlavní funkcí - rozklad a trávení nepotřebných látek nejsou přítomny u rostlinných buněk - funkci zde přebírají vakuoly

38 Primární lyzosomy vznikají odštěpováním z cisteren GK na straně trans (velikost 50 nm) enzymy glykosylovány v drsném ER po fúzi s jiným kompartmentem vzniká sekundární lyzosom

39 Sekundární lyzosomy trávicí vakuoly - fúze s fagosomy multivesikulární tělíska - fúze s pinocytickými měchýřky autofagické vakuoly - s vlastními nefunkčními organelami (produkty hydrolýzy reutilizovány v cytoplazmě nebo exocytovány z buňky) realizují programovanou smrt buňky specializované funkce: akrosom spermií v leukocytech likvidace mikrobů se špatnou funkcí lyzosomů spojeny některé nemoci

40 Lyzosomální choroby revmatická arthritida - aktivace lyzosomálních enzymů uvolněných z makrofágů do extracelulární matrix střádací choroby (tesaurismózy) - asi 20 dědičných chorob podmíněných hromaděním neodbouraných látek v lyzosomech při defektu hydrolytických enzymů (mukopolysacharidy, gangliosidy) - např. Tay-Sachsova choroba

41 PEROXISOMY podobné lyzosomům - odštěpují se z HER obsahují: oxidázy - odnímají ze substrátu H + za vzniku H 2 O 2 katalázy - rozkládají vzniklý H 2 O 2 funkce: účastní se oxidací při odbourávání lipidů a při fotorespiraci ochrana buňky před toxickým peroxidem vodíku uvolněný kyslík využívá k detoxikacím (např. v hepatocytech oxidace ethanolu na acetaldehyd, oxidace fenolu, formaldehydu) vrozené chybění peroxisomů či katalázy těžké poruchy vývoje mozku, smrt do 6 měs. po naroz.

42 GLYOXISOMY jsou analogem peroxisomů u rostlinných b. enzymaticky přeměňují zásobní tuky na cukry během klíčení semen VAKUOLY jsou analogem lyzosomů u rostlinných b. Druhy vakuol: potravní vakuola prvoků kontraktilní vakuola u sladkovodních prvoků pumpuje vodu ven z těla centrální vakuola u starších rostlinných bb. jejich membrána = tonoplast vznikají z ER a GA v buňkách apikálních meristémů v mladých bb. je množství malých vakuol, dospělá b. obsahuje zpravidla jednu centrální vakuolu, která vyplňuje až 90 % objemu buňky

43 vakuoly obsahují: VAKUOLY meziprodukty buněčného metabolismu (AK, cukry ) ionty (K +, Na +, Ca 2+, Cl -, NO 3- ) rezervní látky (sacharidy, bílkoviny) barviva rozpustná ve vodě (antokyany a flavony) alkaloidy (nikotin, kofein, kokain, kolchicin, kodein, morfin) odpadní látky někdy dochází ke krystalizaci obsahu vakuol = BUNĚČNÉ INKLUZE Funkce udržování stálosti cytoplazmy (např. ph) zásobní odpadní ukládají se zde zplodiny buněčného metabolismu po celý život buňky