Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Transkript

1 Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Mária Majeská Čudejková 3. Proteosyntéza

2 Centrální dogma molekulární biologie

3 Rozluštění genetického kódu in vitro Marshall Nirenberg a Heinrich Matthaei zjistili, že poly-u RNA produkuje polyfenylalanin v cell-free roztoku z E. coli Studie s nukleotidovými kopolymery, objasnily některé kodóny Poly-A dává polylysin, poly-c polyprolin, poly-g polyglycin V roce 1964 rozluštili Marshall Nirenberg a Philip Leder celý kód Ukázali, že trinukleotidy navázané na ribosomy řídí vazbu specifických aminoacyl-trna Pomocí 14 C značených aminokyselin se všemi možnými kombinacemi trinukleotidů přiřadili všech 64 kodónů

4 Technika rozluštění genetického kódu

5 Genetický kód je degenerovaný 4 nukleotidy, 20 AMK (23 proteinogénních AMK) 4 2 = = 64 Jedna aminokyselina může být specifikována víc než jedním kodonem

6 Univerzální genetický kód

7 Molekula trna Všechny trna mají délku cca 80 nukleotidů

8 Aktivace aminokyselin pro proteosyntézu Aminoacyl-tRNA synthasa Aminoacyl-tRNA aktivují aminokyselinu pro tvorbu peptidové vazby Enzym aminoacyl-trna synthasy zajišťují správné přiřazení aminokyseliny k odpovídající trna Kodóny jsou rozpoznávány aminoacyl-trna na základě komplementarity bazí Párování bazí umožňuje trna vnést určitou aminokyselinu do ribosomu

9 Rozpoznávání trna specifickou aminoacyl-trna synthasou u E. coli 21 aminoacyl-trna synthas vysokoenergetická vazba mezi AMK a trna je později využita pro tvorbu kovalentní vazby mezi AMKs polypetidovýho řetězce

10 Komplex trna a aminoacyl-trna synthasy

11 The Wobble Hypothesis kolísavé párovaní bází (Francis Crick, 1966) První dvě báze kodónu tvoří normální kanonické párování (vodíkové vazby A=U, G C) s 2 a 3 bazí antikodónu Poslední pozice je méně striktně kontrolována a může se objevit i nekanonické párování Pravidla pro třetí bázi kodónu: A=U, C G, ale navíc U A/G, G U/C, I (vzniklý deaminací A) U/C/A Výhody: disociace trna z mrna templátu je rychlejší a tím je rychlejší i proteosyntéza Pravidla jsou v souladu s genetickým kódem a nezpůsobují nesprávné přiřazení aminokyseliny!!!

12 Kolísavé párování bází pro G a I

13 Struktura ribosomů E. coli ribosom průměr 25 nm, 2520 kda, 2 disociabilní podjednotky Malá podjednotka 30S kda, 21 proteinů a 16S rrna Velká podjednotka 50S kda, 34 proteinů, dvě rrna - 23S a 5S Ribosomy tvoří zhruba 2/3 RNA 20,000 ribosomů na buňku, 20% buněčné hmoty Eukaryotní ribosomy Mitochondriální a chloroplastové ribosomy podobné prokaryotním předpokládaný prokaryotní původ Cytoplasmatické ribosomy jsou větší a komplexnější, ale mají shodnou většinu strukturních a funkční vlastností

14 Prokaryotní a eukaryotní ribosomy

15 Proteosyntéza a její fáze Proteosyntéza má vždy tři fáze: iniciaci, elongaci a terminaci Iniciace spočívá ve vazbě mrna a iniciační aminoacyl-trna na malou podjednotku ribosomu a následnou vazbu velké podjednotky Elongace: probíhá syntéza peptidových vazeb mezi AMK, které jsou prostřednictvím trna navázané v akceptorovém místě (A) a peptidylovém místě (P) ribosomu Terminace nastává při dosažení "stop" kodónu dochází k uvolnění peptidového řetězce a rozpadu translačního komplexu

16 Vazba trna na ribosom

17 Iniciace proteosyntézy u prokaryot Iniciační trna přenáší N-formylovaný Met: f-met-trna f Met Je použita pouze pro iniciaci, při elongaci působí Met-tRNA m Met (neformylovaný Met) N-formyl Met je první aminokyselina u všech E. coli proteinů, ale zhruba u poloviny je posttranslačně odštěpen N-formyl je přidán enzymem formyltransferasa Iniciační trna je připojena k 30S za pomoci iniciačních faktorů a poté dochází k navázaní mrna k 30S Vazba mrna na ribosom vyžaduje interakci pyrimidinové sekvence na 3'-konci 16S RNA s purinovou sekvencí na 5'-konci mrna Vazebné místo ribosomu na 5'-konci mrna Shine-Delgarno sekvence

18 Iniciace proteosyntézy u prokaryot Shine-Delgarno sequence

19 Iniciace u eukaryot Zásadním iniciačním signálem je struktura mrna s 5'- methyl-gtp a poly A koncem Komplexní interakce iniciačních faktorů (nejméně 11) Iniciační trna je specifická přenáší Met a působí pouze při iniciaci - trna i Met, není formylována Met nacházející se uvnitř peptidového řetězce je přenášen jinou trna

20 Iniciace proteosyntézy u eukaryot

21 Elongační cyklus Elongační faktory jsou nezbytné pro funkci buňky, vysoký obsah (EF-Tu tvoří 5% celkových proteinů E. coli) EF-Tu váže aminoacyl-trna a GTP Aminoacyl-tRNA se váže do A místa ribosomu jako komplex s EF-Tu a GTP GTP je pak hydrolyzováno a EF-Tu:GDP disociuje EF-Ts recykluje EF-Tu výměnou GTP za GDP Nezbytné konformační změny jsou řízeny energií získanou hydrolýzou GTP

22 Elongace

23 Terminace proteosyntézy Proteiny nazývané terminační faktory rozpoznávají stop kodón v A místě ribosomu Vazba terminačního faktoru transformuje peptidyltransferasu na hydrolasu, která odštěpí peptidový řetězec z trna Terminační faktor způsobuje rozpad elongačního komplexu

24 Terminace

25 Recyklace ribosomů v buňce

26 Polyribosom

27 Shrnutí Produkce proteinů eukaryotní buňkou

28 Skládání proteinů Protein Folding Proteiny jsou skládány do aktivní formy molekulárními chaperony a chaperoniny Chaperony E. coli Hsp70, rozpoznávají nesložené hydrofobní části peptidového řetězce Vážou se na tyto části a ochraňují je dokud nedojde ke správnému složení GroES-GroEL komplex hlavní chaperonin u E. coli GroEL 2 kruhy, každý 7 x 60 kda podjednotek (Hsp60) Nesložený protein se váže dovnitř komplexu a jeho skládání je řízeno energií získanou hydrolýzou ATP (stovky ATP/ molekulu)

29 Chaperony a chaperoniny

30 Struktura komplexu GroES-GroEL u E. coli

31 Degradace proteinů Některé proteinové degradace jsou nespecifické, náhodně rozštěpené nebo poškozené proteiny jsou rychle degradovány Existuje ovšem také selektivní degradační dráha využívající energie ATP a hydrolýzy v proteasomu ubiquitinová degradační dráha Ubiquitin je malý protein s vysoce konzervovanou sekvencí v eukaryotech, 76 aminokyselin (8.5 kda) Proteiny určené k degradaci jsou označeny ubiquitinovým řetězcem Aaron Ciechanover, Avram Hershko, Irwin Rose Nobelova cena za chemii 2004

32 Značení proteinů ubiquitinem a jejich degradace v proteasomu

33 Příklad chyby při skládání proteinů PrP a PrP* priony

34 Translokace proteinů Nutný proces pro membránové a sekreční proteiny Tyto proteiny jsou syntetizovány se "signální sekvencí" cca aminokyselin na N-konci Signální sekvence má bazický N-konec, centrální doménu 7-13 hydrofobních residuí a nehelikální C-konec Signální sekvence směruje nově syntetizovaný protein do jeho správné destinace Všechny proteiny mimo cytoplasmu musí být translokovány Signální sekvence zabraňuje samovolnému skládání proteinu, takže molekulární chaperony s ním mohou interagovat Signální peptid slouží také pro rozpoznání translokačním aparátem buňky Signální peptidasa odštěpí signální peptid poté co je zajištěno správné složení a cílení proteinu

35 Třídění proteinů v eukaryotní buňce Eukaryotní buňka obsahuje řadu kompartmentů oddělených membránami Většina (ale ne všechny) signálních sekvencí je tvořena odštěpitelným signálním peptidem na N-konci proteinu Některé sekvence jsou u C-konce nebo uvnitř proteinové sekvence (signální kotvy) Rozpoznání signální sekvence je založeno na rozložení náboje, polaritě a sekundární struktuře, ne na specifické sekvenci aminokyselin Syntéza sekrečních a membránových proteinů je spojena s translokací přes membránu endoplasmatického retikula

36

37 Translokace proteinů do endoplasmatického retikula

38 3D-animation-with-basic-narration.html w0/chapter3/animation protein_synthesis quiz_3_.html