AUTOMATIZACE EXTRAKCE NA TUHÉ FÁZI POMOCÍ LAB-ON-VALVE TECHNIKY

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie AUTOMATIZACE EXTRAKCE NA TUHÉ FÁZI POMOCÍ LAB-ON-VALVE TECHNIKY BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Vedoucí bakalářské práce: PharmDr. Petr Chocholouš, Ph.D. Hradec Králové, 2015 Martina Charvátová

2 Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.

3 Ráda bych poděkovala panu PharmDr. Petru Chocholoušovi, Ph.D. za odborné vedení, věcné připomínky a ochotu, kterou mi v průběhu zpracování této bakalářské práce věnoval.

4 OBSAH Seznam obrázků... 6 Seznam tabulek... 7 Seznam zkratek ÚVOD CÍL PRÁCE EXTRAKCE EXTRAKCE NA TUHÉ FÁZI Princip Instrumentace Sorbenty Nepolární vázané fáze Polární vázané fáze Iontově-výměnné vázané fáze Speciální sorbenty Postup SPE Selektivita SPE On-line SPE PRŮTOKOVÉ METODY Průtoková injekční analýza (FIA) FIA systém Kontrolovaná disperze Výhody a nevýhody FIA systému Sekvenční injekční analýza (SIA) SIA systém Výhody a nevýhody SIA systému Mikrosekvenční injekční analýza v uspořádání lab-on-valve (μsia-lov) μsia-lov systém Detekce v μsia-lov Využití μsia-lov Srovnání jednotlivých průtokových metod

5 5.5 Bead injection (BI) SI-BI-LOV systém Typy konfigurace průtokové cely Detekce u BI Kuličky (beads) Problematika BI techniky AUTOMATIZACE EXTRAKCE NA TUHÉ FÁZI SPE v SI-LOV systému Znovupoužitelné analytické kolonky Obnovitelné analytické kolonky Aplikace Chromabond C 18 Hydra Magnetické nanočástice Protein G-Sepharose LiChroprep ZÁVĚR Seznam použité literatury

6 Seznam obrázků Obr. 1 - zajištění průtoku SPE kolonkou [1] Obr. 2 - SPE kolonky a disky používané v klasické extrakci na tuhé fázi [4] Obr. 3 - interakce na nepolárních sorbentech [1] Obr. 4 - interakce na polárních sorbentech [1] Obr. 5 - interakce na iontově-výměnných sorbentech [1] Obr. 6 - přehled provedení jednotlivých kroků SPE [4] Obr. 7 - princip FIA [5] Obr. 8 - základní schéma systému FIA [5] Obr. 9 - srovnání homogenního mísení a mísení vlivem disperze [5] Obr grafické znázornění disperzního koeficientu D [5] Obr princip SIA [5] Obr schéma SIA systému [5] Obr schéma μsia-lov systému [5] Obr microsi-lov přístroje [5] Obr detail nástavce LOV [5] Obr příklad LOV uspořádání [14] Obr průtokové cely pro UV-VIS detekci [5] Obr fluorescenční detekce v LOV formátu [5] Obr způsoby zachycení kuliček v průtokové cele u SI-BI-LOV [5] Obr schéma SI-BI-LOV systému [5] Obr konfigurace průtokové cely u BIS [5] Obr další typy konfigurace průtokové cely u BI [5] Obr detail kuliček používaných u BI [5]

7 Seznam tabulek Tabulka 1 - nepolární sorbenty [1] Tabulka 2 - polární sorbenty [1] Tabulka 3 - iontově-výměnné sorbenty [1] Tabulka 4 - srovnání pracovních parametrů jednotlivých průtokových metod [14] Tabulka 5 - přehled některých analýz využívajících automatizaci SPE (org. část) Tabulka 6 - přehled některých analýz využívajících automatizaci SPE (anorg. část) Seznam zkratek AAS atomová absorpční spektrometrie (atomic absorption spectrometry) AC afinitní chromatografie (affinity chromatography) AFS atomová fluorescenční spektrometrie (atomic fluorescence spectrometry) BI bead injection BIS bead injection spektroskopie ESI ionizace elektrosprejem (electrospray ionization) ETAAS elektrotermální atomová absorpční spektrometrie (electrothermal atomic absorption spectrometry) FIA průtoková injekční analýza (flow injection analysis) HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie (high performance liquid chromatography) ICP-OES optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (inductively coupled plasma optical emission spectrometry) IgG imunoglobulin G LC kapalinová chromatografie (liquid chromatography) LIF laserem indukovaná fluorescence (laser induced fluorescence) LLE extrakce z kapaliny do kapaliny (liquid-liquid extraction) microsia-lov nebo μsia-lov mikrosekvenční injekční analýza v uspořádání labon-valve mikroac (μac) mikroafinitní chromatografie (micro-affinity chromatography) mikrobis (μbis) mikro bead injection spektroskopie 7

8 MPV vícecestný ventil (multiposition valve) MS hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry) MSFIA multisyringe flow injection analysis PAN 1-(2-pyridylazo)-2-naphtol RP reverzní fáze (reversed phase) SDS sodium dodecyl sulfate SI sekvenční injekce (sequential injection) SIA sekvenční injekční analýza (sequential injection analysis) SIC sekvenční injekční chromatografie (sequential injection chromatography) SLE extrakce z tuhé fáze do kapaliny (solid-liquid extraction) SPE extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction) SPE-PTs extrakce na tuhé fázi s použitím špiček automatických pipet (solid phase extraction-pippette tips) SPME mikroextrakce tuhou fází (solid-phase microextraction) SPS spektrometrie tuhé fáze (solid phase spectrometry) XRFS rentgenová fluorescenční spektrometrie (X-ray fluorescence spectrometry) 8

9 1 ÚVOD Předložená bakalářská práce pojednává o extrakci na tuhé fázi jakožto vhodné prekoncentrační metodě před vlastním stanovením analytu a o možnostech její automatizace. Prekoncentrační techniky jsou prováděny za účelem izolace, přečištění a zakoncentrování analytu ze složitých matric vzorků, přičemž k takové izolaci dochází na základě mezimolekulových interakcí mezi analytem a speciálním sorbentem. Automatizace extrakce na tuhé fázi je v této práci popisována ve spojení s průtokovými metodami, které od svého prvního uvedení profesorem Růžičkou v roce 1974 prošly poměrně velkým vývojem. Z původní průtokové injekční analýzy se vyvinula sekvenční injekční analýza, jež se vlivem trendu miniaturizace analýz vyvinula dále v mikrosekvenční injekční analýzu využívající speciální lab-on-valve formát. Labon-valve formát je spojován s další technikou související s průtokovými metodami, a to tzv. bead injection. Jde ve své nejjednodušší podstatě o vpravení speciální suspenze mikrokuliček do systému, kde jsou zachyceny, a po následném vstříknutí vzorku dochází k interakcím komponent vzorku s funkčními skupinami na povrchu kuliček dojde k jejich zachycení. Právě tento systém se prokázal být cenným nástrojem v automatizaci extrakce na tuhé fázi. Katedra analytické chemie Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové se zabývá všemi druhy injekčních analýz již od jejich počátku a bylo zde popsáno mnoho metod použitelných v nejrůznějších aplikacích ve farmaceutické analýze. 9

10 2 CÍL PRÁCE Přestože byly průtokové metody poprvé zavedeny Čechem, jejich problematika včetně možnosti spojení s extrakcí na tuhé fázi je aktuální především v zahraniční literatuře. Proto si kladu za hlavní cíl této práce především vytvoření uceleného seznámení s tímto tématem v českém jazyce. Práce bude členěna do několika kapitol, ve kterých se budu postupně formou rešerše zabývat danou problematikou. Nejprve bude rozebrána extrakce na tuhé fázi ve své klasické podobě, následovat budou kapitoly o průtokových metodách a jejich možném využití k automatizaci extrakce. Na závěr budou ukázány některé konkrétní analýzy využívající tento prekoncentrační krok. 10

11 3 EXTRAKCE Proces extrakce lze z hlediska fyzikální chemie chápat jako přechod složky fázovým rozhraním mezi dvěma vzájemně nemísitelnými kapalinami. V širším analytickém pohledu jsou jako extrakce pojmenovány i mnohé další metody, při nichž je převáděna složka mezi směsi fázovým rozhraním z jedné fáze (plynné, kapalné, pevné) do druhé (kapalné, pevné), i když principiálně jde například o absorpci nebo adsorpci [1]. Jedná se tedy o separační proces, při kterém jsou v kontaktu dvě vzájemně nemísitelné fáze. Látky se rozdělují mezi tyto fáze na základě rozdílných interakcí s danými fázemi (rozdílných rozdělovacích koeficientů). Čím větší je rozdíl mezi rozdělovacími koeficienty látek, tím dokonalejší je jejich oddělení [2]. Podle skupenství, mezi kterými přechází složka, můžeme rozlišit: Z pevné fáze do kapaliny (SLE, solid-liquid extraction). Z pevného materiálu se rozpouští ve vhodném rozpouštědle požadovaná složka, ostatní složky ne. Využívá se často při zpracování analytických vzorků. Z kapaliny do kapaliny (LLE, liquid-liquid extraction). Extrakce založená na rozdělovací rovnováze v soustavě dvou nemísitelných kapalin. Složka z větší části přechází do rozpouštědla, ve kterém je lépe rozpustná. Z kapaliny na tuhou fázi (SPE, solid-phase extraction). Extrakce tuhou fází z roztoku selektivně zachycuje (adsorbuje) požadované složky s afinitou k dané tuhé fázi. Z kapaliny nebo plynu na tuhou fázi (SPME, solid-phase microextraction). Mikroextrakce tuhou fází je modifikací extrakce tuhou fází, ve které nastává zakoncentrování analytu adsorpcí na tuhou fázi (polymer pokrývající křemenné vlákno). Všeobecný trend vývoje extrakčních metod je řízen snahou nahradit zdlouhavé postupy s velkými spotřebami rozpouštědel novými technikami, mezi které řadíme zejména extrakci a mikroextrakci tuhou fází a nadkritickou fluidní extrakci [1]. V této bakalářské práci se budeme zabývat právě pokroky v automatizaci extrakcí na tuhé fázi. 11

12 4 EXTRAKCE NA TUHÉ FÁZI Vyskytuje-li se ve vzorku analyt o koncentraci nižší než je jeho limit stanovení příslušnou analytickou metodou, je třeba provést prekoncentraci analytu před jeho stanovením. Takovou velmi často užívanou prekoncentrační metodou je extrakce z kapaliny do kapaliny a extrakce z kapaliny na tuhou fázi. 4.1 Princip Extrakce na tuhé fázi (solid-phase extraction, dále jen SPE) je v současné době nejvýkonnější technika dostupná pro rychlou a selektivní přípravu vzorku, jejíž podstatou je zachycení molekul látky na tuhém sorbentu, přes který protéká vzorek. Využívá se zde chemických vlastností molekul analytu, které se v důsledku mezimolekulových interakcí adsorbují na sorbentu [1]. Díky separačnímu mechanismu SPE mohou být hledané analyty přednostně izolovány ze složitých matric, přičemž izolace, přečištění a zakoncentrování analytu je dosaženo v několika standardizovaných krocích [3]. SPE nabízí mnoho výhod oproti tradičním separačním technikám, mezi něž patřila zejména extrakce v soustavě kapalina-kapalina, a to především dobrou selektivitu (ovlivněnou výběrem sorbentu) a úsporu pracovních roztoků (často organických rozpouštědel) a vzorků. Nevýhodou je, že přestože se sortiment modifikací SPE sorbentů (tuhých fází) neustále rozšiřuje, pro některé specifické extrakce stále nejsou na trhu vhodné SPE kolonky. Mezi hlavní použití SPE patří: odstranění rušivých složek matrice selektivní obohacení (zkoncentrování) vzorku izolace stopových látek změna rozpouštědla vzorku (analyt je převeden z jedné specifické matrice do jiné, např. z vodné do organické) derivatizace (analyt je zachycován na sorbent, převeden na derivát a pak eluován) [2]. 12

13 Analyt prekoncentrovaný pomocí extrakce na tuhé fázi pak můžeme stanovit vhodnou analytickou metodou, jako je například plynová či kapalinová chromatografie, kapilární elektroforéza nebo spektrofotometrie ve viditelné a ultrafialové oblasti. 4.2 Instrumentace SPE je principiálně velmi jednoduchou technikou, jejímž základem je použití nepříliš drahých extrakčních kolonek na jedno použití o různých velikostech a náplních sorbentů. V principu pak SPE pracuje takto: sorbent kolonky je aktivován a kondiciován pro optimální adsorpci vzorku kapalný vzorek je veden přes SPE kolonku a zkoumané analyty jsou ze vzorku zachyceny materiálem sorbentu na kolonce nežádoucí příměsi mohou být z kolonky selektivně odstraněny promytím správně zvolenými roztoky nakonec jsou z kolonky žádoucí analyty znovuzískány elučním rozpouštědlem získáme vysoce čistý extrakt tento extrakt má často podstatně vyšší koncentraci analytu než měl původní vzorek (dle poměru nadávkovaného vzorku a elučního rozpouštědla) Alternativně může být extrakční kolonka vybrána tak, aby zadržovala příměsi ze vzorku, ale analytům dovolila projít. Průtok kapalin vedených přes kolonku se urychluje vakuem na výstupu z kolonky, tlakem na vstupu kolonky nebo centrifugací [1]. Obr. 1 - zajištění průtoku SPE kolonkou [1] 13

14 SPE kolonky mají tvar stříkačky bez pohyblivého pístu a jsou naplněny povrchově modifikovanými sorbenty o různé velikosti částic. Bývají vyrobeny z polypropylenu nebo případně ze skla. Mimo kolonek se používají i tzv. extrakční disky, což jsou kompozitní tenké membrány z teflonu a příslušného modifikovaného sorbentu, které jsou umístěny v SPE kolonkách. Mezi výhody extrakčních disků patří, že není omezena průtoková rychlost, zkoncentrování vzorku probíhá ve velmi úzké zóně membrány a k eluci stačí řádově mikrolitry rozpouštědla, a proto odpadá odpařování nadbytečného rozpouštědla před chromatografickou analýzou vzorku. Sorbenty pro extrakci mohou být také umístěny přímo do špiček automatických pipet, tato metoda se nazývá SPE-PTs (solid phase extraction-pippette tips) [2]. Obr. 2 - SPE kolonky a disky používané v klasické extrakci na tuhé fázi [4] Pro správnou volbu systému SPE je nutné získat maximální množství informací o struktuře, uspořádání funkčních skupin, molární hmotnosti, polaritě, rozpustnosti, případně pak pk a hodnoty analyzovaných látek. Vhodné je také získání informací o interferentech, které se mohou v matricích vyskytovat [3]. 4.3 Sorbenty Kolonky SPE obsahují sorbenty založené nejčastěji na bázi chemicky modifikovaných částic silikagelu. Při této modifikaci se na povrchové silanolové skupiny chemicky navazují skupiny různých vlastností, které rozhodují o vlastnostech sorbentu. Rozlišujeme tzv. non end-capped neuzavřený sorbent (má část volných silanolových skupin, které se spoluúčastní na výsledných vlastnostech sorbentu) a endcapped uzavřený sorbent (silanolové skupiny jsou zcela pokryty vázanou fází a uplatní se jen její vlastnosti). 14

15 Při separaci se využívají různé mechanismy zachycování látek spočívající v odlišných molekulárních interakcích mezi analytem a sorbentem. Mezi běžně uplatňované interakce patří tyto: van der Waalsovy síly ( nepolární interakce) vodíkové vazby a dipól-dipólové interakce ( polární interakce) kation-aniontové interakce (iontové interakce typu elektrostatických sil mezi opačně nabitými ionty) Každý sorbent nabízí specifickou směs těchto vlastností. Hlavní interakce využívaná pro extrakci analytu se označuje jako primární, vedlejší interakce jako sekundární [1]. Podobně jako u chromatografického děje rozlišujeme reverzní fázi SPE (polární rozpouštědlo a nepolární pevná fáze), normální fázi SPE (nepolární rozpouštědlo a polární pevná fáze) a iontově-výměnné fáze SPE Nepolární vázané fáze Nepolární vázané fáze se vyznačují hydrofobními vlastnostmi, lze je proto využít pro extrakci nepolárních a středně polárních sloučenin. Připojí-li se k tomu navíc u neuzavřených sorbentů uplatnění silanolových skupin, vzrůstá selektivita pro bazické sloučeniny. Tabulka 1 - nepolární sorbenty [1] Označení Funkční skupina R C18 oktadecyl C 18 H 37 C8 oktyl C 8 H 17 C2 ethyl C 2 H 5 CH cyklohexyl PH fenyl CN kyanopropyl CH 2 CH 2 CH 2 CN 15

16 Obr. 3 - interakce na nepolárních sorbentech [1] Polární vázané fáze Polární vázané fáze jsou selektivní pro polární sloučeniny. U prvních dvou uvedených skupin (Tabulka 2) se sekundárně uplatňuje iontová výměna, protože silanolová skupina je slabě kyselá a vyměňuje kationty a aminopropylová skupina zase slabě zásaditá a vyměňuje anionty. Aminopropyl zachycuje z nepolárních rozpouštědel (např. z hexanu) molekuly obsahující OH, NH 2 nebo SH. Zmíněná iontová výměna se může uplatnit ve vodném prostředí o ph = 7,8 a nižším, neboť aminoskupina se hydronizuje, a může k sobě vázat anionty. Kyanopropylové skupiny zachycují nepolární i polární sloučeniny a mohou je extrahovat z vodných roztoků. Rovněž mohou zachycovat polární molekuly z méně polárních rozpouštědel dipól-dipólovou interakcí mezi kyanoskupinou a polární skupinou analytu. Také 3-(2,3-dihydroxypropoxy)propylová skupina má strukturu, která umožňuje zachycování nepolárních i polárních molekul nejčastěji se uplatňuje při extrakci polárních látek z relativně nepolárních rozpouštědel s využitím tvorby vodíkových vazeb. Tabulka 2 - polární sorbenty [1] Označení Funkční skupina R Silica silanol OH NH 2 aminopropyl CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 3-(2,3-dihydroxypropoxy) DIOL (CH 2 ) 3 OCH 2 CH(OH)CH 2 (OH) propyl CN kyanopropyl CH 2 CH 2 CH 2 CN 16

17 Obr. 4 - interakce na polárních sorbentech [1] Iontově-výměnné vázané fáze Mimo aminopropylové vázané fáze existují další iontově-výměnné fáze. Trimethylamoniumpropyl-chloridová fáze je silným iontoměničem pro výměnu aniontů (anex) z vodných i nevodných roztoků náhradou za svůj chloridový anion. Benzensulfonová i propansulfonová kyselina jsou silnými iontoměniči pro výměnu kationtů (katexy). Karboxypropylová skupina je slabým iontoměničem typu katex využívá se k extrakci bazických sloučenin z roztoků o ph = 6,8 a vyšším, kdy se karboxylová skupina výrazněji disociuje. Tabulka 3 - iontově-výměnné sorbenty [1] Označení Funkční skupina R NH 2 aminopropyl (CH 2 ) 3 NH 2 SAX trimethylamoniumpropyl (CH 2 ) 3 N +( CH 3 ) 3 Cl - CBA karboxypropyl (CH 2 ) 3 COOH SCX benzensulfonová kyselina PRS propansulfonová kyselina (CH 2 ) 3 SO 3 H Obr. 5 - interakce na iontově-výměnných sorbentech [1] 17

18 4.3.4 Speciální sorbenty Kromě sorbentů založených na silikagelu jsou využívány i sorbenty jiné, například na bázi aluminy (oxid hlinitý) nebo gel oxidu hořečnatého a křemičitého (Florosil) [1]. 4.4 Postup SPE Před každou extrakcí je nutná příprava vzorku, která spočívá ve vytvoření vzorku, jehož fyzikální a chemické vlastnosti podporují zadržení analytů v extrakční kolonce (tuhé vzorky je například nutno převést do roztoku, vzorky obsahující tuhé nečistoty vyžadují filtraci). Vlastní provedení SPE se pak skládá z 5 kroků: 1) Solvatace kolonky Aby částečky silikagelu zadržovaly analyt, je nezbytné smáčení fáze vázané na silikagel matricí vzorku. Smáčivost se zajistí solvatací kolonku promýváme methanolem, acetonitrilem nebo jiným organickým rozpouštědlem. Tento krok představuje aktivaci pevné fáze pro interakce se vzorkem. 2) Předúprava kolonky Po solvataci následuje nasycení kolonky čistým rozpouštědlem analytu, kdy dojde k ustanovení rovnováhy mezi sorbentem v kolonce a tímto rozpouštědlem. Prostředí se tak upraví pro vlastní vzorek. 3) Aplikace vzorku Vzorek se nalije do kolonky a nechá se dostatečný čas protékat. Podle druhu pevné fáze a vzorku dochází ke specifickým reakcím látek s pevnou fází a žádaná skupina látek se selektivně sorbuje. Nesorbované látky (matrice) procházejí volně kolonkou. 4) Promývání kolonky Účelem jednoho nebo více promývacích kroků je selektivně eluovat nežádoucí sloučeniny z vázaných fází, aniž by byly eluovány analyty. Vhodnou volbou jsou často rozpouštědla, ve kterých jsou analyty nerozpustné. 18

19 KROK 4 KROK 5 KROK 1 KROK 2 KROK 3 5) Eluce analytu z kolonky Závěrečným krokem v SPE extrakci je znovuzískání analytů z extrakční kolonky. Toho je docíleno promytím kolonky rozpouštědlem, které eluuje analyty z vázaných fází do vhodné jímací nádobky [1;2]. Celé provedení SPE je znázorněno na následujícím obrázku (Obr. 6). VYSVĚTLIVKY matrice příměs zkoumaný analyt rozpouštědlo A rozpouštědlo B rozpouštědlo C Výběr správné SPE kolonky nebo disku Příprava SPE kolonky nebo disku Aplikace vzorku Promývání kolonky Eluce zkoumaného analytu z kolonky Obr. 6 - přehled provedení 19 jednotlivých kroků SPE [4]

20 4.5 Selektivita SPE Selektivitu SPE bychom mohli charakterizovat jako stupeň oddělení analytu od ostatních příměsí v původním vzorku. Vysoce selektivní charakter SPE je dán dvěma hlavními faktory: jedinečné charakteristické retenční vlastnosti sorbentu dané primárními a sekundárními interakcemi, které se kombinují s vlastnostmi analytu velké množství použitelných kombinací sorbent-rozpouštědlo pro zajištění vysoce selektivní extrakce (na rozdíl od extrakce v systému kapalina-kapalina, kterou limituje nemísitelnost použitých kapalin) [1]. 4.6 On-line SPE Extrakcí na pevnou fázi v on-line systému je míněn proces SPE, který je přímo spojen s analytickou metodou (nejčastěji HPLC). Mezi výhody takového systému patří: neprovádí se předřazená SPE přímé dávkování vzorků tělních tekutin plně automatizovaný provoz bezpečná manipulace s infekčními materiály zvýšená přesnost a citlivost zvýšená produktivita a nižší náklady připadající na jeden vzorek [2]. 20

21 5 PRŮTOKOVÉ METODY Současná praxe vyžaduje od analytické chemie značné množství analýz s dostatečnou přesností, citlivostí, spolehlivostí a především rychlostí. Klasické analytické postupy toto vše zajistit nemohou, proto se začaly používat různé druhy automaticky pracujících analyzátorů. Existují dva základní typy automatických analyzátorů: diskrétní (dávkovací) každý vzorek je zpracováván ve vlastní nádobce (vialka nebo mikrotitrační destička), kde je inkubován s reagenciemi a následně transportován k detektoru (například automatické titrátory) průtokové vzorek a reagencie protékají v plastových trubičkách k detektoru, pohyb je zajištěn pomocí peristaltických nebo pístových pump Hlavní výhodou diskrétních a průtokových analyzátorů je, že může být naráz zpracováváno více vzorků, přičemž dávkování je prakticky nezávislé na rychlosti zahrnutých chemických reakcí. Průtokové analyzátory jsou navíc charakteristické svojí univerzálností a snadnou automatizací složitých postupů sériových analýz velkého počtu vzorků. Průtokové injekční techniky jsou kinetické metody založené na dvou základních procesech, které se vyskytují současně během pohybu vzorku v systému směrem k detektoru. Jde o disperzi vzorku a chemickou reakci mezi vzorkem a reagenciemi, přičemž u žádného z těchto dějů nedochází k ustalování rovnováhy a signál detektoru je tak nestacionární [5]. Rozlišujeme 4 kategorie průtokových analytických metod: 1) průtoková injekční analýza (FIA, flow injection analysis), která představuje první generaci průtokových metod a byla poprvé popsána Růžičkou a Hansenem v roce 1974 [6] 2) sekvenční injekční analýza (SIA, sequential injection analysis), která prezentuje druhou generaci průtokových metod a byla popsána Růžičkou a Marshallem v roce 1990 [7] 21

22 3) systém Lab-on-valve ve spojení s bead injection (BI), popsán Růžičkou v roce 1994 [8], společně se sekvenční injekční chromatografií zastupují poslední generaci 4) sekvenční injekční chromatografie (SIC, sequential injection chromatography) (2003) spojující kapalinovou chromatografii se sekvenční injekční analýzou [9] 5.1 Průtoková injekční analýza (FIA) Průtoková injekční analýza (dále jen FIA) je první nestacionární průtokovou technikou, která vede k převratnému zrychlení analýzy. Jde o kontinuální průtokovou metodu, která je ve své nejjednodušší formě založená na vstřikování vzorku do kontinuálního nosného proudu činidel. Jak vzorek putuje proudem, dochází k jeho promísení s činidlem za vzniku produktu, který je následně detekován v průtokovém detektoru. Dávkovač Průtokový detektor Činidlo Činidlo Obr. 7 - princip FIA [5] A vstřikování vzorku vstříknutí přesného objemu vzorku do nosného proudu činidel B disperze pohyb vzorku (růžová barva) po proudu, následná disperze umožní promísení vzorku s činidlem za vzniku produktu (žlutá barva) C detekce produktu Rozsah disperze a délka času reakce, při které vzniká produkt, jsou řízeny průtokovou rychlostí a objemem kanálu (případně i jeho geometrií), ve kterém k dějům dochází. Díky tomu je časový interval mezi vstříknutím vzorku a detekcí analytu reprodukovatelný a všechny vzorky jsou tak zpracovávány stejným způsobem [5]. 22

23 5.1.1 FIA systém Oproti jiným automatickým analyzátorům se FIA vyznačuje především jednoduchostí použitého zařízení. Základní schéma se skládá ze 4 částí: 1. zdroj proudu kapaliny peristaltická pumpa (průtokové rychlosti se pohybují kolem 0,5-5,0 ml/min) 2. injekční systém dávkovací nízkotlaký šesticestný ventil se smyčkou daného objemu 3. reakční zóna (tzv. reaktor) přímá trubice, reakční cívka, uzlový reaktor, 4. detektor optický (fotometrický, fluorimetrický, chemiluminiscenční, refraktometrický, AAS atomová absorpční spektrometrie, ) či elektrochemický (iontově selektivní elektrody, vodivostní nebo coulometrický) NOSNÝ PROUD PUMPA VZOREK MÍSÍCÍ CÍVKA DETEKTOR ODPAD Obr. 8 - základní schéma systému FIA [5] FIA systémy bývají sestaveny z několika kanálů, kde je každým kanálem do systému přiváděn určitý roztok (nosný proud, vzorek, činidlo). Tyto kanály jsou v určitých mísících bodech systému propojeny a způsobují při průchodu vzorku jeho přeměnu na detekovatelný produkt, který je následně měřen detektorem na konci systému. Proud nosné kapaliny je čerpán peristaltickou pumpou konstantní rychlostí. Do tohoto proudu se pomocí vstřikovacího ventilu vstříkne definovaný objem vzorku tak, aby bylo proudění co nejméně narušeno. Do proudu nosného roztoku se vzorkem se navíc mohou přidávat potřebná činidla. Po průchodu reaktorem, kde dochází k promíchání roztoků, případně proběhne chemická reakce, jde výsledný roztok do detektoru. Pro detekci ve FIA systému je možné použít jakýkoliv detektor vhodný pro daný reakční produkt. Signál z detektoru je následně veden na zapisovač nebo je zpracováván počítačem. 23

24 Výsledkem analýzy jsou za sebou jdoucí píky závislosti signálu (např. absorbance) na čase jejich výška je mírou analytické koncentrace [10;11] Kontrolovaná disperze Zatímco tradiční metody tzv. vlhké chemické analýzy jsou prováděny v dávkovacím modu, který vede k okamžitému homogennímu mísení vzorku s reagenciemi (A), průtokové injekční techniky jsou založeny na kontrolované disperzi, která vytváří koncentrační gradient během pohybu zóny vzorku směrem k detektoru (B) [5]. A B Obr. 9 - srovnání homogenního mísení a mísení vlivem disperze [5] Základní charakteristikou FIA je tedy kontrolovaná disperze, ke které může dojít buď přímo v rozpouštědle, kdy nedochází k chemické reakci, nebo při chemické reakci v proudu reagentů. K popisu koncentračního gradientu se užívá tzv. disperzní koeficient D, který je dán poměrem počáteční koncentrace a aktuální koncentrace v daném bodě (čase): t Obr. 10 grafické znázornění disperzního koeficientu D [5] 24

25 Disperzní koeficient je vždy větší než 1 a nejčastěji se odečítá v bodě maximální koncentrace (c max ), které pak odpovídá hodnota D max. Podle velikosti disperzního koeficientu rozlišujeme 3 druhy disperze: omezená (D<3) Tyto hodnoty jsou obvyklé v případě, kdy je použita vysoká průtoková rychlost, velký objem nastříknutého vzorku a malá délka reaktoru. Systémy s omezenou disperzí je možno použít v případech, kdy neprobíhá chemická reakce a jde pouze o transport vzorku k detektoru (především potenciometrie). Výhodou je vyšší citlivost a vzorkovací rychlost (počet stanovení za hodinu). střední (3<D<10) Systémy se střední disperzí jsou obvyklé v případech, kdy při stanovení probíhá chemická reakce (dochází k míchání vzorku s činidlem). Vyžadují menší rychlost proudění roztoku, delší reaktor, případně další mísící body. Detekce je obvykle fotometrická nebo fluorimetrická. Citlivost a rychlost vzorkování je nižší. velká (D>10) Systémy s vysokou disperzí užívají k promíchání vzorku s činidlem míchací komůrky nebo velmi dlouhé reaktory. Pro běžná měření není toto uspořádání vhodné a používá se u FIA titrací. Velikost rozptýlené zóny, a tedy i tvar a výška píku zaznamenaného signálu, závisí na objemu vzorku, délce reakčních cívek (případně délce celého vedení) a na parametrech průtokového zařízení. Pro kvalitní záznam signálu je tedy nutno hledat optimální podmínky [10] Výhody a nevýhody FIA systému Vzhledem k tomu, že přiváděné roztoky jsou do systému čerpány pomocí peristaltické pumpy, je nevýhodou toku těchto roztoků jeho pulzování, které s sebou přináší nepravidelnosti průtokové rychlosti. Ve FIA metodě je proto obecně nutné zajistit bezpulzní tok všech chemikálií a přísně reprodukovatelný vnesený objem vzorku. FIA technika je i přes tuto nevýhodu schopna analyzovat velké série vzorků za velmi krátkou dobu a s úspěchem tak automatizovat zejména jednoduché barevné reakce pro stanovení celé řady analytů [5;10]. 25

26 5.2 Sekvenční injekční analýza (SIA) Sekvenční injekční analýza (dále jen SIA) patří do druhé generace průtokových analytických technik, které umožňují racionalizovat a automatizovat složité postupy při analýze velkých sériích vzorků instrumentálními metodami. SIA řeší některé nedostatky FIA techniky spojené s pulzujícím tokem a nutností kontinuálního čerpání nosného proudu, resp. činidel a pomocných látek. Oproti systému FIA používá SIA odlišný princip, který je charakteristický oddělenými měřícími cykly. Nejprve jsou zóny nosného proudu, vzorku a činidla postupně (jednorázově) aspirovány do jednokanálového systému s využitím selekčního vícecestného ventilu (multiposition valve, MPV) a pístového čerpadla. Poté je pohyb pístu čerpadla obrácen, čímž dojde k promísení zóny vzorku a činidla, a vzniká produkt, který je dopraven do detektoru tím je jeden cyklus ukončen. Výsledkem je analytický signál ve formě píku podobně jako u FIA. Tento signál v podstatě představuje záznam změny koncentračního gradientu reakčního produktu při průchodu jeho zóny detektorem. MÍSÍCÍ CÍVKA VZOREK PRODUKT ČINIDLO nosný proud DETEKTOR MPV = vícecestný ventil Obr princip SIA [5] A, B vzorek (červená barva) a činidlo (modrá barva) jsou postupně vstříknuty do nosného proudu pomocí vícecestného selekčního ventilu (MPV multiposition valve), který je poháněn pístovou pumpou C na rozhraní zón vzorku a činidla se začíná vytvářet produkt D, E obrácení toku nosného proudu pomocí obrácení pohybu pístu čerpadla a následný transport výsledného produktu do detektoru 26

27 Hlavní rozdíl mezi FIA a SIA tedy spočívá v geometrii nosného proudu, protože zatímco FIA využívá přímý konstantní tok, základem SIA jsou změny přímého a zpětného toku. Tím je dosaženo vyššího stupně konverze analytu na výsledný produkt [5;11] SIA systém SIA systém je jednokanálový průtokový systém, u kterého došlo ke dvěma důležitým změnám oproti FIA. První změnou je, že peristaltické čerpadlo bylo nahrazeno pístovou pumpou poháněnou přesným krokovým motorkem, což umožňuje obousměrný tok nosného proudu, druhou pak výměna injekčního ventilu za vícecestný selekční ventil umožňující aspiraci přesného objemu různých roztoků do systému. Základní konfigurace SIA systému je tvořena jednokanálovým obousměrným pístovým čerpadlem, vícecestným selekčním ventilem, mísící cívkou (sloužící zároveň jako pojistka proti vniknutí vzorku a činidel do čerpadla) a vhodným detektorem. PÍSTOVÁ PUMPA MÍSÍCÍ CÍVKA ODPAD DETEKTOR ODPAD NOSNÝ PROUD ODPAD ČINIDLO #1 ČINIDLO #2 VZOREK POMOCNÁ PUMPA Obr schéma SIA systému [5] Obecně se dá říci, že SIA systém pracuje v cyklu naprogramovaných pohybů pístu čerpadla synchronizovaných s přepínáním pozic selekčního ventilu. Přesná synchronizace a opakovatelnost těchto kroků je nutnou podmínkou k dosažení reprodukovatelné disperze jednotlivých zón v systému a tím i k získání reprodukovatelného koncentračního gradientu reakčního produktu, resp. odpovědi 27

28 detektoru. Z uvedených skutečností vyplývá, že součástí SIA systému musí být i vhodný mikroprocesor (nejlépe PC) s příslušným programovým vybavením. Zatímco ve FIA je v rámci jedné série měření dávkovaný objem vzorku fixní (dáno konstantní délkou dávkovací smyčky), u SIA je možno v jednotlivých cyklech objem vzorku cíleně měnit v rozsahu jednotek až stovek mikrolitrů programováním doby otevření příslušného kanálu selekčního ventilu. Tím lze optimalizovat disperzi zóny vzorku (a tedy citlivost stanovení) podle koncentrace analytu a také snadno provádět kalibraci, pokud je jeden z kanálů selekčního ventilu propojen s roztokem standardu. Průtokové rychlosti v SIA se prakticky neliší od FIA [11]. Kromě výše uvedeného konvenčního uspořádání SIA systému, kde se využívá detektoru umístěného vně, existuje také microsia systém, který využívá tzv. lab-onvalve platformy a kde je průtoková cela umístěna uvnitř speciální konstrukce upevněné na standardním vícecestném selekčním ventilu (viz kapitola microsia-lov) [5] Výhody a nevýhody SIA systému Za nevýhodu SIA oproti FIA je považována snížená frekvence dávkování vzorku a nutná přítomnost složité počítačové techniky. Na druhé straně má však SIA oproti FIA mnoho výhod, mezi které patří například to, že analýza probíhá v jednokanálovém uspořádání s jedním ventilem, přestože se pracuje s několika roztoky. Navíc díky tomu, že SIA využívá zastavení a změnu směru toku proudu, jsou spotřeby vzorků a hlavně činidel podstatně nižší než u FIA, kde je čerpání jednotlivých roztoků kontinuální. Velkou výhodou SIA je také flexibilita, která je dána snadnou změnou parametrů měření prostřednictvím PC, aniž je třeba měnit konfiguraci SIA systému [11]. 5.3 Mikrosekvenční injekční analýza v uspořádání lab-on-valve (microsia-lov) Konvenční uspořádání SIA systému dominovalo sekvenčním injekčním technikám do té doby, než se objevil trend miniaturizace analýz, což vedlo k vývoji mikrosekvenční injekční analýzy v uspořádání lab-on-valve (microsia-lov nebo také 28

29 μsia-lov). Technika μsia-lov představuje třetí generaci průtokové injekční analýzy a má za cíl dále miniaturizovat koncept SIA a začlenit do něj všechny nezbytné prvky s možnostmi využití pro nejrůznější analytické aplikace. Této miniaturizace bylo dosaženo začleněním víceúčelové průtokové detekční mikrocely s optickými vlákny do kompaktní struktury umístěné na selekční ventil (odtud název lab-on-valve, laboratoř na ventilu). Hlavní výhodou μsia-lov uspořádání oproti tradičním SIA technikám je ekonomičtější a bezpečnější přístup k analýze díky mnohem menším spotřebám vzorků i reagencií [5;12] μsia-lov systém Lab-on-valve platforma se skládá z průhledné monolitické konstrukce vyrobené z plexiskla, vícecestného ventilu jakožto hlavní složky celého zařízení a pohonné jednotky, obvykle pístové pumpy. Základní myšlenkou lab-on-valve nástavce je integrace průtokové cely s ostatními komponenty zařízení (spoje, mikrokolonky, průtokový port pro vzorky a mísící zařízení) do kompaktní konstrukce, která je upevněna na vrcholu standardního vícecestného ventilu [13]. PÍSTOVÁ PUMPA MÍSÍCÍ CÍVKA ODPAD NOSNÝ PROUD ODPAD VZOREK ČINIDLO #1 ČINIDLO #2 Obr schéma μsia-lov systému [5] 29

30 Přístroje μsia-lov patří mezi nejmenší automatizované analyzátory současnosti. Následující obrázek (Obr. 14) ukazuje dva základní používané systémy, jež se liší typem zvolené pumpy a řídícím softwarem. Přístroj zobrazený vlevo (A) prezentuje kombinaci synchronně plnící pumpy s pokročilým softwarem a byl vytvořen ke zlepšení rozvoje nových SI technik, zatímco přístroj vpravo (B) představuje tradiční SI systém, ve kterém je užívána běžná pístová pumpa a vhodný software. Systém B je schopen řešit stejné úkoly jako systém A, ale s nižší frekvencí dávkování vzorku, protože vyžaduje složitější programování. Pro sériové analýzy můžou být systémy vybaveny automatickým dávkovačem vzorků [5]. A B Obr microsi-lov přístroje [5] Uprostřed nástavce je situován centrální průtokový kanál, kterým jsou jednotlivé obvodové porty spojeny a který komunikuje s pístovou pumpou. Víceúčelová průtoková cela je začleněna do portu č. 2 a je vybavena optickými vlákny, která na jedné straně komunikují s externím zdrojem světla a na druhé jsou napojeny k detekčnímu zařízení, což umožňuje sledovat reakce probíhající uvnitř cely v reálném čase [14]. Obr detail nástavce 30 LOV [5]

31 PRŮTOKOVÁ CELA OPTICKÉ VLÁKNO ODPAD VZOREK MÍCHACÍ SMYČKA #2 INJEKČNÍ VENTIL MÍCHACÍ SMYČKA #1 NOSNÝ PROUD ČINIDLA Obr. 16 příklad LOV uspořádání [14] Umístění detekční cely na selekční ventil má za následek značné zkrácení analytické cesty. Spotřeby reakčních činidel a vzorků jsou proto díky práci s mikrolitrovými objemy významně nižší, než u klasické SIA. To dělá z techniky SIA- LOV ideální nástroj například pro biochemická stanovení [14]. Průtoková cela může být také konfigurována v tzv. jet-ring-cell uspořádání, které se využívá v technice zvané bead injection (BI) při monitorování změn optických vlastností kuliček (beads) zachycených uvnitř cely po interakci se vzorkem (viz kapitola Bead injection). Jet-ring-cell představuje specializovanou průtokovou celu, ve které jsou kuličky zachycovány [12] Detekce v μsia-lov Uspořádáním optických vláken je možno detekční celu konfigurovat pro měření absorbance (vlákna jsou proti sobě), fluorescence (úhel vláken je 90 ) nebo absorbance a fluorescence zároveň (přidáním třetího vlákna). Průtoková cela konfigurována pro UV-VIS spektroskopii může být dále přizpůsobena pro kratší světelnou dráhu (1 nebo 2 mm), pro standardní světelnou dráhu (více jak 10 mm) nebo pro dlouhou světelnou dráhu (více jak 50 cm). Délka světelné dráhy je dána volbou šířky prostoru mezi optickými vlákny nebo změnou pozice vláken uvnitř kanálu. Průtokové cely, které jsou uzpůsobeny pro kratší světelné dráhy, jsou 31

32 umístěny uvnitř LOV nástavce a jejich délka je dána vzdáleností mezi konci optických vláken. Průtokové cely pro dlouhé světelné dráhy vyžadují vzhledem ke své délce speciální konstrukci, jež byla vytvořena Garthem Kleinem. Pro spektrofotometrii v LOV uspořádání není nutno chránit průtokovou celu od okolního světla [5]. spektrofotometr zdroj světla Garthova průtoková cela Obr průtokové cely pro UV-VIS detekci [5] Fluorescenční spektroskopie je vedle UV-VIS spektrofotometrie nejčastěji využívanou detekční technikou pro analýzu biomolekulárních látek i pro stopové analýzy mnoha anorganických a organických molekul. Fluorescence je děj, který se řadí mezi luminiscence. Jde tedy o emisi světla látkou, jejíž podstatou je návrat excitovaných elektronů na základní hladiny a s tím spojené vyzařování přebytečné energie ve formě fotonů. Excitace je zde nejčastěji vyvolána absorpcí ultrafialového 32

33 záření a takto vyvolaná fluorescence trvá pouze po dobu působení primárního záření, po odstranění zdroje záření mizí [1]. V LOV formátu je fluorescenční detekce docíleno konfigurací optických vláken do pravého úhlu, kdy jedno optické vlákno vyvolá excitaci a druhé poté zachycuje vyzářené emise. Taková průtoková cela může být naplněna tekutinou nebo kuličkami, čehož se využívá v technice bead injection (viz dále). Vzhledem k tomu, že lze průtokovou celu vybavit i třetím vláknem, můžeme současně snímat fluorescenci i absorbanci, popřípadě lze sledovat i jiné vlastnosti. V poslední době bývá fluorescenční měření často kombinováno s voltametrií pro studie živých buněk v LOV-BI formátu [5]. EMISE EMISE EXCITACE EXCITACE Obr fluorescenční detekce v LOV formátu [5] Využití μsia-lov MicroSIA-LOV systém je využíván například v biochemických analýzách (např. stanovení heparinu), v analýzách fosfátů, při monitorování fermentace stanovení amoniaku, glycerolu, glukózy či volného železa, při monitorování životního prostředí v analýze dusičnanů a dusitanů, při analýze imunoglobulinů nebo při separaci aniontů v případě, že je μsia-lov použita jako předúprava vzorku v metodě kapilární elektroforéza [12]. 33

34 5.4 Srovnání jednotlivých průtokových metod Souhrnné srovnání pracovních parametrů jednotlivých průtokových metod je zobrazeno v následující tabulce. Tabulka 4 - Srovnání pracovních parametrů jednotlivých průtokových metod [14] Parametr FIA SIA μsia-lov objem vzorku μl μl μl dávkování vzorku ruční/automatické, automatické, automatické, do nosného proudu sekvenčně v zóně sekvenčně v zóně průměr hadiček 0,8 mm 0,5-0,8 mm 0,5 0,8 mm průtoková rychlost 0,5 1,0 ml/min řádově ml/min do 1 ml/min segmentace vzduchem NE NE NE počet analýz za hodinu < 120 < 60 < 60 spotřeba činidel nízká až 10x menší oproti násobně menší než FIA SIA geometrie toku pouze přímý tok programovatelná programovatelná (kombinace změn) (kombinace změn) čerpání činidel kontinuální přerušované přerušované kontinuální s odečtením hodnoty v definovaném konstantním detekce čase (tzn. detektor průběžně monitoruje a zaznamenává signál, jehož hodnota odpovídající vzorku je odečítána vždy ve stejný čas od nástřiku) uspořádání jedno i pouze pouze vícekanálové jednokanálové jednokanálové 34

35 5.5 Bead injection (BI) Do třetí generace průtokových technik se kromě μsia-lov řadí také tzv. bead injection (z anglického bead, tedy kulička, dále jen BI), která byla poprvé popsána Růžičkou již v roce Největší rozmach této techniky nastal až po spojení s LOV, proto ji lze v současnosti nalézt i pod názvem BI-LOV, SI-BI-LOV nebo μsi-bi-lov. Principem BI je ve své nejjednodušší podobě vpravení přesně definovaného objemu suspenze mikrokuliček do systému, kde jsou v určitém místě zachyceny, a následně je na ně vstříknut vzorek. Následuje interakce komponent vzorku s funkčními skupinami na povrchu kuliček a dochází k jejich zachycení. Takto zachycené analyty jsou poté detekovány pomocí spektrofotometru, a to buď ve své nativní podobě nebo po reakci s vhodným barvivem či fluorescenčním činidlem. Analyzované molekuly mohou být také eluovány a detekovány až po vymytí kuliček. Na konci každé analýzy jsou kuličky transportovány pomocí zpětného proudu buďto na jiné místo v systému, nebo do odpadu. Charakteristickým znakem BI je automatizovaná obnova reaktivní pevné fáze (v podobě kuliček), což představuje jedinečnou výhodu a otevírá cestu k rozvoji nových analýz, ve kterých budou analyzované molekuly selektivně zachycovány na povrchu kuliček a kvantifikovány, zatímco nezachycený zbytek komplexní matrice vzorku bude odstraněn [5;12] SI-BI-LOV systém SI-BI-LOV systém je konstruován z tvrdého PVC a je umístěn na standardním vícecestném ventilu. Suspenze kuliček je vpravena skrz port č. 6 do mísící cívky pomocí zpětného proudu. Poté je ventil přepnut na port č. 2 a dojde k naplnění průtokové cely kuličkami, které jsou zde zadrženy dutou ucpávkou (A), nebo za pomoci optického vlákna (B). Obr způsoby zachycení kuliček 35 v průtokové cele u SI-BI-LOV [5] A spektroskopická detekce, B monitorování eluovaných látek

36 Zatímco průtoková cela A (Obr. 19) je vhodná pro BI spektroskopii, průtoková cela B je používaná pro monitorování eluovaných látek, podobně jako je tomu u obnovitelné BI chromatografie (renewable column chromatography). Transport kuliček je uskutečňován středně rychlým proudem (rychlosti okolo 50 μl/s), což zajišťuje reprodukovatelné plnění průtokových cel. Bylo zjištěno, že pomalejší rychlosti proudění nezajišťují dostatečné naplnění cel. Následná perfuze vzorku pak probíhá za pomalejších rychlostí (typicky 1 až 20 μl/s). Každý měřící cyklus je zakončen odstraněním kuliček obvykle rychlým proudem (okolo 200 μl/s), avšak tento přístup není doporučován například u průtokové cely B. Zde je riziko vzniku zpětného tlaku vzhledem k dlouhé koloně elastických kuliček, které mohou kanál ucpávat, a mohlo by tak dojít k poškození pumpy. Namísto toho se zde volí menší objemy (100 μl) při velkých průtokových rychlostí zpětného proudu (200 μl/s), čímž se docílí aspirace kuliček do mísící cívky, odkud jsou pak po otočení ventilu vyloučeny do odpadu [5;12]. PÍSTOVÁ PUMPA MÍSÍCÍ CÍVKA ODPAD NOSNÝ PROUD DETEKTOR VZOREK ODPAD ELUENT Obr schéma SI-BI-LOV systému [5] Typy konfigurace průtokové cely Pro zachycení kuliček sorbentu uvnitř průtokové cely se pro různé typy detekce používají různé typy zapojení: 36

37 Bead Injection Spectroscopy (BIS) LOV modul je umístěn na vícecestném ventilu tak, aby byla průtoková cela orientována vertikálně. Gravitace tak napomáhá lepšímu zadržení kuliček. Kuličky jsou v cele drženy pomocí speciální ucpávky krátké hadičky z polyetheretherketonu (PEEK) s vnitřním průměrem 0,1mm, která je na obrázku níže ukázána v místě odtoku cely hned před zelenou PEEK trubkou, jež drží červenou ucpávku na místě. Obr konfigurace průtokové cely u BIS [5] Fluorescenční bead spectroscopy Využívá k zachycení kuliček pár vláken umístěných kolmo na sebe. Kuličky jsou pak drženy na místě pomocí vertikálního optického vlákna (Obr. 22 a.). Kombinace UV-VIS spektrofotometrie a fluorescence Využívá tři optická vlákna, která jsou konfigurována tak, jak je zobrazeno na obrázku níže. Kuličky jsou na místě drženy opět vertikálním vláknem (Obr. 22 b.). Mikrokolonová chromatografie s obnovitelnou kolonou Optická dráha je zde definována vzdáleností mezi optickými vlákny. Sloupec kuliček je zadržován nad jedním z těchto vláken (Obr. 22 c.). BIS v kombinaci s mikrokolonovou chromatografií Využívá dvou párů optických vláken. Horní pár monitoruje kolonku, dolní průtokovou celu. Sloupec kuliček je držen na svém místě pomocí optického vlákna (Obr. 22 d.) [5]. 37

38 a. b. c. d. Obr další typy konfigurace průtokové cely u BI [5] a fluorescenční bead spectroscopy, b - kombinace UV-VIS spektrofotometrie a fluorescence, c mikrokolonová chromatografie s obnovitelnou kolonou, d BIS v kombinaci s mikrokolonovou chromatografií Detekce u BI V současné době existují dvě strategie využívané při detekci analytu v BI technice, případně jejich kombinace: 1. Bead Injection spektroskopie BIS detekce se volí v případě, že analyzované molekuly zachycené na kuličkách jsou schopny absorpce světla v jejich nativní formě nebo pokud reagují s funkčními skupinami na povrchu kuliček a vytváří tak detekovatelný produkt. BIS je metodou volby i v případě, že analyzované molekuly nemohou být detekovatelné v jejich nativní formě. V takovém případě se musí provést dodatečné reakce s fluorogenními činidly nebo případně s enzymem označenými indikátory. 2. Eluce analytů z kuliček Analyzované molekuly jsou eluovány z povrchu kuliček, podobně jako se tomu děje na konci SPE, a poté pokračují do detektoru (např. UV-VIS, EMS, AA), kde jsou detekovány [5]. 38

39 5.5.4 Kuličky (beads) Mezi rozhodující vlastnosti kuliček patří velikost, tvar a materiál, ze kterého jsou vyrobeny. Částice musí být kulaté o velikosti mezi 20 až 150 μm. Bylo prokázáno, že menší kuličky jsou obtížně zachytávány a promývány, zatímco větší mohou ucpávat kanálky. Preferovány jsou měkké polymerní kuličky, protože tvrdé kuličky (ze skla či silice) mohou obrušovat ventil. Pro BIS je další důležitou vlastností kuliček jejich optická průhlednost. Zde je vhodné používat průhledné kuličky vyrobené ze Sephadexu nebo Sepharosy, které jsou navíc dostupné v široké škále funkčních skupin. Pro anorganické analýzy, pro prekoncentraci stopových prvků nebo pro selektivní zachycení biomolekul, jako jsou například protilátky či antigeny, se využívají kuličky potažené iontovýměnnou vrstvou, C-18 či proteinem A. Kuličky vyrobené z Cytodexu jsou používány jako nosiče živých buněk zkoumaných pomocí fluorescenční mikroskopie, grafitové kuličky pak jako obnovitelné voltametrické elektrody u enzymových analýz. V neposlední řadě se musí zvážit i mechanické vlastnosti kuliček Sepharose 4B uličky jsou více elastické než 6B, cytodexové kuličky jsou velmi měkké a křehké, polysorbové a grafitové kuličky jsou zase velmi robustní. Typický objem suspenze kuliček na jednu analýzu u BIS se pohybuje od 2 do 10 μl, což odpovídá přibližně až kuličkám. Suspenze je obvykle v poměru 1:25 až 1:50 částice:kapalina [5]. Obr detail kuliček používaných u BI [5] Více o některých vybraných sorbentech bude uvedeno v dalších kapitolách, ve kterých se budu zabývat v současné době používanými typy sorbentů u konkrétních analýz. 39

40 5.5.5 Problematika BI techniky Existuje řada požadavků, které musí být dodrženy, aby byla analýza v rámci BI techniky proveditelná a reprodukovatelná. Mezi některé potenciální problémy u těchto analýz patří: Kuličky mohou ucpat kanálek. Množství vpravených kuliček se obtížně kontroluje. Hustota sloupce kuliček není vždy reprodukovatelná. Kuličky mohou být v systému zaneseny a zachyceny na místa, kde mohou ucpat systém, nebo se dostanou až do pístu pumpy. Kuličky nemusí být kompletně odstraněny z průtokové cely. Odchylky v absorpci světla kuličkami může činit spektroskopické měření nespolehlivým. Klíčovým pro úspěšné analýzy se stalo spojení s LOV modulem, což vedlo k přesnému programování průtokových rychlostí a dodržení přesných objemů [5]. 40

41 6 AUTOMATIZACE EXTRAKCE NA TUHÉ FÁZI SI-LOV systém se prokázal být cenným nástrojem pro rozpouštění a mísení vzorků a činidel. Univerzálnost systému byla zvýšena možností zadržování pevných částic, které mohou sloužit k zachytávání analytů ze složitých matric vzorků (technika bead injection). Tyto částice (kuličky) jsou umístěny uvnitř systému a představují pevný povrch, na který se může analyt extrahovat. Kuličky jsou také místem chemické reakce mezi analytem a činidly, přičemž následná detekce může být prováděna na eluátu (extrakce na tuhé fázi, SPE) nebo přímo na adsorpční částici pomocí spektrofotometrie (spektrometrie tuhé fáze, SPS). Oba separační procesy mohou být uskutečněny dvěma odlišnými přístupy existuje tzv. dávkovací mód a průtokový mód. SPE v dávkovacím módu je časově velmi náročné a je vyžadována poměrně velká zručnost k naplnění průtokové cely pevnými částečky. V průtokovém módu je toto plnění zjednodušeno [15]. 6.1 SPE v SI-LOV systému Zvyšování selektivity a citlivosti metod je zřejmým klíčem úspěchu analytické chemie. Často je tohoto zvyšování dosahováno pomocí propracovaného a poměrně drahého přístrojového vybavení s využíváním tzv. hyphenated (spojených) technik detekce, které zahrnují hmotnostní spektrometrii, chromatografii a atomovou absorpční nebo emisní spektrometrii. Levnější alternativou může být spektrofotometrie, která je ve skutečnosti nejčastěji využívanou detekční metodou používanou ke kvantifikaci chemických sloučenin. Selektivita a citlivost jsou zde však často pro analytické nároky nepostačující. Této limitace lze předejít použitím extrakce na tuhé fázi před vlastním spektrofotometrickým měřením. Jestliže je navíc SPE prováděno v průtokových systémech, může být reprodukovatelnost a opakovatelnost výrazně vylepšena díky přesně určeným podmínkám a přesnému časování. SPE v SI-LOV systému je prováděna dvěma způsoby: a. využíváním znovupoužitelné analytické kolonky, tedy kolonky pro opakované použití (obnova aktivního povrchu) 41