Mendelova univerzita v Brně. Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství STUDIUM FAKTORŮ OVLIVŇUJÍCÍCH FERMENTAČNÍ PROCES A AEROBNÍ STABILITU KUKUŘIČNÉ SILÁŽE Doktorská disertační práce Ing. Václav Pyrochta Školitel: Prof. MVDr. Ing. Petr Doležal, CSc. Doktorský studijní program: P 4103 Zootechnika Studijní obor: Obecná zootechnika Brno

2 Poděkování Děkuji svému školiteli Prof. MVDr. Ing. Petru Doležalovi, CSc. za pomoc, odborné vedení a cenné rady a připomínky při zpracovávání této disertační práce. Děkuji také všem kolegům z Ústavu výživy zvířat a pícninářství za vytvoření příznivých podmínek ke studiu a obětavou pomoc při realizaci všech pokusů. Na závěr děkuji svým blízkým za podporu, pochopení a všestrannou pomoc v průběhu mého studia. 2

3 Výsledky výzkumu uvedené v disertační práci jsou součástí řešení grantu IGA MZLU v Brně IG /2102/222 Vliv silážních inokulantů na dynamiku fermentačního procesu siláží z Bt kukuřice (GMO). 3

4 Seznam použitých zkratek C stupeň Celsia AGPM svaz výrobců kukuřice Aw vodní aktivita BMK bakterie mléčného kvašení BNLV bezdusíkaté látky výtažkové BSE nemoc šílených krav (bovinní spongioformní encefalopatie) Bt Bacillus thuringiensis CCM siláž kukuřičných palic bez listenů CFU kolonie tvořící jednotky DAM kapalné dusíkaté hnojivo DON deoxynivalenon EU Evropská Unie FAO ranost kukuřičného hybridu G + gram positivní bakterie GMO geneticky modifikované organismy kj kilo Joule KM kyselina mléčná kn kilo Newton KO kyselina octová KPr kyselina propionová LKS siláž kukuřičných palic s listeny ME metabolizovatelná energie MJ mega Joule MRS agar dle De Man, Rogosa, Sharpe NEL netto energie laktace NL dusíkaté látky OH organická hmota ph kyselost SE stravitelná energie ZEA zearalenon 4

5 OBSAH 1. ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED Biologické vlastnosti kukuřice Princip silážování Mikroorganismy v původním silážovaném materiálu Mléčné bakterie Bakterie octového kvašení Klostridie Hnilobné bakterie Kvasinky Plísně Fáze fermentace Aerobní fáze Fermentační fáze Stabilní fáze Fáze zkrmování siláže Technologické faktory ovlivňující kvalitu kukuřičné siláže Volba odrůdy kukuřice Podíl nečistot Vliv termínu seče Faktor obsahu sušiny ve hmotě Faktor kvality řezanky Faktor rychlosti naskladnění, dusání a důkladného zakrytí Faktor doby skladování Způsob odběru siláže a jeho vliv na aerobní stabilitu Silážní aditiva a aerobní stabilita siláží Chemická aditiva a aerobní stabilita siláží Biologická aditiva posilující fermentační proces a aerobní stabilitu Ostatní přísady Aerobní nestabilita siláží Aerobní nestabilita a spontánní záhřev kukuřičné siláže Kvasinky a aerobně nestabilní siláže Plísně a toxiny v aerobně nestabilních silážích Zkrmování aerobně nestabilních kukuřičných siláží Cíl práce Materiál a metodika Metodický postup v pokusech 1., 2., 3. a Modelový pokus se silážováním kukuřice hybridu Romario Modelový pokus kukuřice hybridu Sabre Modelový pokus se silážováním kukuřice hybridu TXP 939 A-V Modelový pokus s Bt kukuřicí hybridu Kuratus Pokusný materiál Charakteristika použitých silážních aditiv v pokusech Charakteristika biologických silážních aditiv použitých v pokusech Charakteristika chemických silážních aditiv použitých v pokusech Použité laboratorní metody Laboratorní sušina

6 Příprava výluhů ze siláží ph KVV Množství kvasných kyselin Množství alkoholu Množství amoniaku Teplota Mikrobiologický rozbor VÝSLEDKY A DISKUSE Modelový pokus s konzervací kukuřičného hybridu Romario Modelový pokus kukuřice hybridu Sabre Modelový pokus kukuřice hybridu TXP 939 A-V Modelový pokus kukuřice hybridu Kuratus Závěr Summary Seznam použité literatury Přílohy Seznam tabulek a grafů Tabulky a grafy

7 1. ÚVOD Zemědělství -kolo v České republice prodělalo po roce 1989 řadu strukturálních změn. Zemědělští podnikatelé dnes v ČR hospodaří na přibližně tis. ha zemědělské půdy, která tak tvoří 54 % celkové rozlohy státu. Na jednoho obyvatele republiky tak připadá 0,42 ha zemědělské půdy. V důsledku zejména ekonomických vlivů, ale také tlaku Evropské unie po zavedení kvót, došlo k podstatnému snížení početních stavů skotu, které mají každoročně klesající tendenci. Početní stavy dojného skotu v České republice zaznamenaly dramatické snížení z 1,2 mil. ks v roce 1989 na 564 tis. ks v roce 2008 (Český statistický úřad ). Ve snaze zefektivnit živočišnou produkci se většina zemědělských podniků zejména v horských a podhorských oblastech zaměřila na extenzivní chov masného skotu. Ten se ve většině těchto oblastech zaměřil na chov krav bez tržní produkce mléka. Tyto podniky využívají vyšších přímých plateb na plochu a nižších investičních nákladů k dosažení zisku, což dokazuje rostoucí tendence těchto chovů. V roce 2001 tyto podniky chovaly 88 tis. ks krav bez tržní produkce mléka a v roce 2008 již 137 tis. ks. Naopak v nížinných výrobních oblastech převládá intenzivní chov dojnic se stále rostoucí užitkovostí. Většina zemědělských podniků s chovem skotu přešla na celoroční krmení konzervovanými objemnými krmivy, kde o výsledku hospodaření rozhoduje kvalita těchto fermentovaných krmiv. Kukuřice má v českém, ale i v celoevropském zemědělství, svoji stabilní pozici. Doposud se využívá v zemědělství především jako zdroj kvalitního sacharidového objemného krmiva. V České republice se využívá kolem 200 tis. ha k výrobě kukuřičné siláže, která zaujímá v krmné dávce úlohu hlavního zdroje energie. I v současné době patří kvalitní kukuřičná siláž k hlavním sacharidovým krmivům, jejíž kvalita a aerobní stabilita významným podílem ovlivňuje užitkovost a zdraví zvířat. Vysoký genetický potenciál zvířat produkujících mléko s sebou přináší značné nároky na vnější chovatelské podmínky, ale také zejména na kvalitu výživy. Z fyziologického i ekonomického hlediska je nezbytné, aby maximum živin v krmné dávce skotu bylo uhrazeno z objemného krmiva. Z hlediska úspěšné konzervace je třeba věnovat zvýšenou pozornost především dodržování všech technologických zásad správného silážování. Je všeobecně známou skutečností, že kukuřice se v porovnání s jinými krmnými plodinami vyznačuje až o 50 % nižšími náklady na produkci energetické jednotky (1 MJ NEL), nejen díky vysoké potenciální produkci, ale i možnostem plné mechanizace sklizně. I přes všechny tyto výhody a přednosti 7

8 je možné se občas setkávat s nekvalitními silážemi, které signalizují určité nedostatky nejen v technologii sklizně, způsobu skladování, ale i odběru siláží pro krmení. Dodržíme - li optimální sklizňovou zralost ( mléčně vosková ) při sklizni na siláž, nebývá u těchto siláží ve výsledné kvalitě zpravidla problém. Pokud dochází ke sklizni až v pozdějších stadiích konec voskové, či začátek plné zralosti, dochází k nárůstu obsahu vlákniny a tím ovlivnění stravitelnosti organické hmoty. Mnohá sledování dokládají, že přirozený výskyt bakterií mléčného kvašení na těchto krmivech nestačí pro optimální silážní proces, proto je nutné tento konzervační proces podpořit přídavky biologických či chemických aditiv. Pro úspěšný průběh fermentace se používají inokulanty, které zvyšují obsah bakterií mléčného kvašení v silážované hmotě. Nedojde-li již od začátku plnění k dokonalému dusání a vytěsnění vzduchu během celého technologického postupu (nestačí dusat pouze vrchní vrstva, nýbrž celý profil), dochází tak k masivnímu rozvoji plísní a kvasinek. Znehodnocené krmivo je dieteticky závadné a způsobuje ekonomické ztráty chovatelům formou nižší užitkovosti, zhoršení reprodukčních ukazatelů a v neposlední řadě i zvýšeným procentem brakace. Mnohem častěji pak musí zootechnici ve spolupráci se zookonzulenty řešit problém dotace energie do krmné dávky vysokoužitkovým dojnicím a korigovat obsah mléčných složek krmivářskými opatřeními, což je neekonomické. 8

9 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Biologické vlastnosti kukuřice Původní domovinou kukuřice jsou tropické a subtropické oblasti Jižní a Střední Ameriky. Je to prastará kulturní plodina, která byla známa Aztékům, Mayům a Inkům již více jak 4000 let před naším letopočtem. Význam kukuřice je vidět již na první pohled, neboť po objevení Ameriky se rozšířila do celého světa a během pouhých 500 let zaujala třetí místo mezi pěstovanými plodinami. Kukuřice se na naše území dostala za nadvlády Turků, kteří ji postupně z Balkánského poloostrova rozšířili v celé Evropě. KALAČ (1973) se zmiňuje o větším pěstování kukuřice na Poděbradsku okolo roku Většímu rozmachu pěstování kukuřice došlo až po druhé světové válce. Kukuřice v systematické botanice řadíme do čeledi lipnicovitých (Poaceae) a v rámci druhu dělíme kukuřici do osmi poddruhů: kukuřice setá, kukuřice koňský zub, kukuřice polozubovitá, kukuřice pukancová, kukuřice cukrová, kukuřice škrobnatá, kukuřice vosková a kukuřice plevnatá (ŠUK et al., 1998). Z morfologického hlediska rozeznáváme na samotné rostlině čtyři základní části rostliny. Kořeny primární a sekundární, které se v optimálně vyvinuté kořenové soustavě rozkládají až do okruhu 2,5 m. Stéblo je v našich podmínkách 1,1 3 m vysoké a počet nadzemních článků je geneticky založen. Hybridy s delší vegetační dobou dosahují zpravidla vyššího vzrůstu a silnějšího stébla. Listy kukuřice slouží k asimilaci sacharidů a výparu vody. Jsou taktéž geneticky založeny a rozeznáváme dva typy postavení listové čepele (planifilní a erektofilní). Květenství kukuřice je specifické tím, že se jedná o rostlinu jednodomou s různopohlavními květy (KUBÁT et al., 2002). Kukuřice je rostlinou, která v krátké době vytvoří velké množství hmoty s vysokým obsahem energie. Pro úspěšný vývoj a růst potřebuje kukuřice harmonické působení jednotlivých vegetačních faktorů, mezi které řadíme světlo, teplo, vodu a vzduch DOLEŽAL, (2006). Světlo. Kukuřice využívá světelnou energii velmi dobře. Na jeden ha plochy kukuřice vytváří tis. m 2 asimilační plochy. Kukuřice má nejen nároky na určitou intenzitu osvětlení, ale také na délku osvětlení v dané vývojové fázi. 9

10 Teplo. Kukuřice je rostlina teplomilná. V průběhu celého vegetačního cyklu potřebuje C sumy efektivnívh teplot. Pozdní jarní mrazíky stejně jako rychlý pokles teplot na podzim způsobuje zastavení růstu a odumírání rostlin. Kritická teplota je -1 až -2 C po dobu déle než 3 hodiny. Voda. Kukuřice je dosti náročná na vodu, její transpirační koeficient je V průměru potřebuje na vytvoření jednoho kg sušiny 256 kg vody. Nedostatek vláhy způsobuje zpomalení nebo až zastavení růstu. Vzduch. Z jednotlivých složek ovzduší je významný především obsah vodních par. Nesprávným uspořádáním porostu v suchých oblastech dochází vlivem proudění vzduchu k nadměrné transpiraci. Nedostatečná vlhkost má také nepříznivý vliv na životnost pylových zrn a opylení palic. Význam pěstování kukuřice u nás zatím převážně spočívá v jejím využití pro výrobu kukuřičné siláže. Vysoký výnosový potenciál a široký sortiment hybridů řadí kukuřici na významné místo krmných plodin v našem zemědělství Princip silážování Siláže jsou konzervovaná objemná krmiva, která se podle obsahu sušiny vyznačují nízkou hodnotou ph (3,7 5,0) s rozdílným obsahem organických kyselin. Kvalitní siláže jsou kyselá, nebo mírně nakyslá šťavnatá krmiva, která se dále vyznačují příjemnou aromatickou vůní po původní hmotě, ze které byla připravena (DOLEŽAL, 2006). Tato krmiva vznikají konzervací čerstvé nebo zavadlé píce především mléčným kvašením, nebo konzervací píce s přídavkem chemických látek inhibující nežádoucí bakteriální činnost (LOUČKA, 1998). Nositeli kvašení siláže jsou různé skupiny mikroorganismů, u kterých je možné stimulovat nebo brzdit jejich aktivitu. Proto stále probíhají snahy o podrobnější poznání životních podmínek těchto organismů, paralelně s možností jejich selektivního ovlivnění (KOPŘIVA et al., 1992). Principem silážování je rychle deaktivovat rostlinné enzymatické systémy, dýchání, proteolýzu, zastavit nebo omezit nežádoucí mikrobiální procesy a cílevědomě usměrnit kvasnou mikroflóru podílející se na fermentaci biomasy (BARANČIC, 1982). Výchozím bodem je přeměna rostlinných sacharidů na kyselinu mléčnou činností bakterií mléčného 10

11 kvašení. Vytvořená kyselina mléčná rychle snižuje hodnotu ph. Vytvořené anaerobní podmínky působí nepříznivě na nežádoucí mikroorganismy plísně, kvasinky, klostridie, kterým je sníženou ph hodnotou a nedostatkem kyslíku bráněno v jejich růstu (MATHIES, 2002). Vedle kyseliny mléčné a octové zabezpečující konzervační efekt v silážích, mohou vznikat také nežádoucí kyseliny máselná, propionová, izomáselná, n-máselná, izovalerová, n- valerová a kapronová. Rozhodující vliv na úspěšný konzervační efekt má snížení ph siláže, především kyselinou mléčnou (JAKOBE et al., 1987). Dále nesmíme opomenout také vznikající oxid uhličitý, který zabezpečuje anaerobní prostředí v prvních dnech, resp. hodinách. Po zasilážování se spotřebovává kyslík, na kterém se podílejí rostlinné enzymy a bakterie. Ty tvoří oxid uhličitý, který rovněž napomáhá konzervačnímu účinku Mikroorganismy v původním silážovaném materiálu Fermentační proces je biochemický proces, při kterém bakterie mléčného kvašení (BMK) přeměňují lehce rozpustné sacharidy na fermentační produkty, zejména na kyselinu mléčnou (KM), která je hlavní příčinou acidifikace silážovaného krmiva a brání nejen pomnožení nežádoucích mikroorganismů, ale i rozkladu organické hmoty a tím i ztrátám sušiny (STEEN et al., 1989). Kvasné procesy při silážování jsou z velké části limitovány druhovým a početním složením mikroorganismů v zelené píci. Vlastní složení mikroorganismů však značně kolísá a závisí vedle druhu píce, také na ročním období, klimatických podmínkách, stupni znečištění píce apod. Při silážování představuje epifytní mikroflóra značné množství zárodků (JAKOBE et al., 1987; PAHLOW, HONIG, 1986; PAHLOW, 1997), které se dostávají do silážního prostoru. Dle PAHLOWA a HONIGA (1994) je počáteční epifytní mikroflóra početnější u kukuřice, než u trav. U silážní kukuřice při sušině 33 % uvádějí průměrné množství epifytní mikroflóry 2,3x105 CFU na 1 g kukuřice. S tím se shoduje i DOLEŽAL (2006), který uvádí obsah epifytní mikroflóry na rostlinách kukuřice v době sklizně jako velmi variabilní co do počtu, tak i do druhového zastoupení. V průměrných letech se uvádí obsah BMK 4x10 4 CFU na g silážované hmoty. Celkový počet mikroorganismů je v průměru 2,3x10 5 CFU na g silážované hmoty. Počet přírodních bakterií mléčného kvašení na rostlinách silně kolísá a navíc jejich schopnost produkovat kyselinu mléčnou je značně variabilní. 11

12 Bakterie mléčného kvašení, které jsou žádoucí, jsou na této různorodé mikroflóře zastoupeny poměrově jen v malém počtu. Významný je nejen absolutní počet zárodků, ale také vzájemné zastoupení jednotlivých kmenů (SCHMIDT, WETTERAU et al., 1974). Vzhledem k tomu, že počet mléčných bakterií je u většiny pícnin velmi malý a nedostačující pro zdárný průběh fermentace (zvláště za nepříznivých podmínkách), je třeba využít všech opatření a možností, které podporují jejich rychlý rozvoj a dominanci (JAKOBE et al., 1987; PAHLOW, HONIG, 1986; WILKINSON, 2005 ). Při výrobě kukuřičných siláží, které jsou sacharidovým krmivem s vysokým obsahem sacharidů, se lze často setkávat s nejednotným názorem na význam aplikace silážních inokulantů. Za normálních okolností by úspěšná fermentace, tedy až na výjimky, neměla být problémem. Rozdílné však jsou ztráty energie a rychlost fermentace mezi ošetřenými a neošetřenými silážemi. Ve většině zemědělských podniků je dnes již samozřejmostí přidávat inokulanty i do silážované kukuřičné hmoty Mléčné bakterie Bakterie mléčného kvašení jsou fakultativně až obligátně anaerobní mikroorganismy, které se mohou rozvíjet jen při omezeném přístupu vzduchu, resp. za nepřístupu vzduchu. Některé druhy jsou však obligátně anaerobní a mohou se proto množit pouze bez přítomnosti vzdušného kyslíku. Ke své existenci potřebují snadno zkvasitelné sacharidy a nepotřebují téměř bílkoviny (VÍTEK, HRABĚ, 1986; WILKINSON, 2005). Je žádoucí, aby při silážování krmiv byly v co nejkratší době vytvořeny takové podmínky, za kterých se mohou mléčné bakterie co nejrychleji množit a konkurenční bakterie být naopak potlačeny. Bakterie potřebují pro svůj růst dostatek pohotových sacharidů, ze kterých bezprostředně využívají především glukózu, fruktózu, sacharózu, melobiózu, méně již arabinózu, skupinu fruktanů (DOLEŽAL, 2002). Pro úspěšný průběh silážování je rozhodující dostatečné množství mléčných bakterií, jejichž činností vzniká především kyselina mléčná, která má vlastnosti silné organické kyseliny. Vysokým stupněm disociace způsobuje silný vzrůst acidity, čímž znemožňuje rozvoj nežádoucích kvasných procesů. Dále tlumí enzymatickou proteolýzu a tím znemožňuje rozvoj bakterií vytvářejících kyselinu máselnou při rozkladu bílkovin. Tento stav nastává při hodnotě ph nižší než 4,0. Poklesne-li v siláži ph pod 3,5, přestanou se mléčné bakterie množit a zastavují svůj metabolismus (JAKOBE et al., 1987). Bakterie mléčného kvašení 12

13 mohou růst v teplotním rozmezí 5 C až 50 C s optimem okolo C (McDONALD et al., 1991). Úspěch vlastní fermentace tak závisí zejména na schopnosti BMK využívat zdroje sacharidů, na rychlosti jejich růstu a množení, na rychlosti acidifikace silážované hmoty a vytvoření anaerobního prostředí, které omezuje množení nežádoucí mikroflóry a tím zajišťuje společně s kyselinou mléčnou konzervační efekt. Kyselina mléčná vzniká v silážích již v prvních 2 3 dnech po zasilážování (asi z 50 %), zbytek dle intenzity fermentace zpravidla do tří týdnů. Produkce kyseliny mléčné většinou ustává do 3 týdnů, pokud nebyla silážovaná hmota inokulovaná kulturou obsahující bakterie mléčného kvašení. Rychlost okyselení silážované hmoty je závislá nejen na obsahu vodorozpustných sacharidů a celkovém množství z nich vytvořené kyseliny mléčné, ale také na přídavku silážních aditiv a obsahu sušiny (DOLEŽAL, 2006). Na základě tvorby produktů kvasných procesů lze rozdělit mléčné bakterie na: Obligátně homofermentativní mléčné bakterie tvořící z glukózy minimálně 85 % kyseliny mléčné. K hlavním zástupcům této skupiny patří rody Lactobacillus a Enterococcus. Některé druhy (Pediococcus rhamnosus, Lactobacillus ruminis) mají význam i pro bachorovou fermentaci. Tyto bakterie nedokáží metabolizovat pentózy. Jejich činností dochází při homofermentativním kvašení glukózy nebo fruktózy za vzniku kyseliny mléčné k velmi malým ztrátám sušiny a energie (McDONALD et al., 1991). C 6 H 12 O ADP + 2 CH 3 CO COOH 2 CH 3 CHOH COOH + 2 ATP + 2 H 2 O (Ztráta sušiny 0 %, energie 0,7 %, McDONALD et al., 1991) Fakultativně homofermentativní mléčné bakterie dokáží fermentovat pentózy i hexózy na kyselinu mléčnou, octovou nebo alkohol. SEDLÁČEK (2007) uvádí v této skupině např. (Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Enterococcus faecium). Heterofermentativní mléčné bakterie při kvašení fermentují sacharidy (pentózy a hexózy) na kyselinu mléčnou, ale také kyselinu octovou, etanol, oxid uhličitý a vodík, zastoupené v určitých poměrech. Typičtí zástupci této skupiny mléčných bakterií jsou: 13

14 Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Leuconostoc mesenteroide (HITZGER et al., 2003). Ty štěpí glukózu dle následující rovnice: 2 C 6 H 12 O 6 + H 2 O 2 CH 3 CHOH COOH + CH 3 COOH + CH 3 CH 2 OH + 2 CO H 2 (ztráty sušiny 24 % a energie 1,7 %, McDONALD et al., 1991). Tyto heterofermentativní bakterie dokáží kvasit fruktózu a tím snížit ztráty (u sušiny 4,8 % a energie 1 %, McDONALD et al., 1991) dle následující rovnice: 3 C 6 H 12 O ADP + 2 CH 3 CO COOH 1 CH 3 CHOH COOH + 1 CH 3 COOH + 2 C 6 H 8 (OH) 6 + CO 2 + H 2 O + 2 ATP Podle požadavků na optimální teplotu ke svému rozvoji se mléčné bakterie dělí na dvě skupiny: - Teplomilné (termofilní) pro tyto bakterie je optimální teplota v rozpětí o C. Výskyt teplomilných bakterií v silážích je nevýhodný, jelikož při kvašení vznikají velké ztráty živin. - Studenomilné (psychrofilní) ty se nejlépe rozvíjejí při teplotách o C. Při těchto teplotách jsou ztráty fermentací nižší, proto je tento typ kvašení v praxi žádoucí (JAKOBE et al., 1987). Fermentační proces není homogenním pochodem, a proto mohou některé z uvedených fermentačních produktů chybět, a naopak se mohou objevit i produkty jiné, (např. kyselina máselná, sirovodík aj.) a mnohdy i nežádoucí biogenní aminy (DOLEŽAL, 2006). Jak uvádějí LIN et al, (1992) a KUNG (2009) proces fermentace začíná nejprve jako smíšený proces, který zahajují mikroorganismy Enterobacter, které zkvašují přítomné sacharidy na kyselinu octovou. Po určité době (v závislosti na obsahu a složení sušiny silážované hmoty, popř. přídavku inokulantů) jsou tyto mikroorganismy potlačeny a proces postupně přechází do hluboce okyselující fáze homofermentativního mléčného kvašení. Nejprve se množí zástupci rodu Lactococcus a Leukonostoccus a posléze bakterie rodu Lactobacillus a Pediococcus. Mléčné bakterie jsou schopné se množit ještě i v poměrně zavadlé píci, i když jen v malém rozsahu (SCHMIDT, WETTERAU et al., 1974). Udává se, že jen 10 % 14

15 z přirozených BMK má schopnost růstu a množení při obsahu sušiny nad 50 % (DOLEŽAL, 2002). Také WILHELM a WURM (1999) konstatují, že vysoký obsah sušiny silážované hmoty je problematický a z pohledu kvality fermentačního procesu nevhodný. Bakterie mléčného kvašení se přestávají množit při hodnotě vodní aktivity (aw) 0,86, zatímco klostridie již při hodnotě 0,94 (LOUČKA, MACHAČOVÁ, 1996) Bakterie octového kvašení Octové bakterie jsou obligátně aerobní bakterie, které fermentují sacharidy nebo ethanol na kyselinu octovou. Má-li se vytvářet kyselina octová vlivem uvedených bakterií, musí mít k biomase přístup vzdušný kyslík (SCHMIDT, WETTERAU, 1974). Jde o aerobní mikroorganismy v přírodě velmi rozšířené. Po snížení ph v silážním prostoru postupně a rychle zanikají. Baktérie octového kvašení jsou velmi citlivé na anaerobní a kyselé prostředí. Jejich aktivita je významně inhibována již při ph 4,5. Optimum tepelného rozmezí pro koliformní zárodky je mezi o C (DOLEŽAL, 2006). Znemožní-li se přístup kyslíku, odnímají se této nežádoucí skupině bakterií podmínky pro jejich další rozvoj. Vzhledem k tomu, že se v udusané siláži kyslík velmi rychle spotřebuje, vyrábějí kyselinu octovou převážně jiné mikroorganismy, např. heterofermentativní bakterie mléčného kvašení či bakterie Coli-aerogenes (JAKOBE et al., 1987; KOPŘIVA et. al., 1992). Mikroorganismy rodu Enterobacter (čeleď Enterobacteriaceae) fermentují v silážované hmotě především sacharidy na kyselinu octovou, plyny, ale i další metabolity, což vede k velkým ztrátám. Jedním ze známých druhů je Erwinia herbicola, jejichž aktivita v silážované hmotě podporuje následný růst Escherichia coli (HITZGER, 2003). V ranných fázích fermentačního procesu mohou tyto organismy spotřebovávat živiny BMK, ale mají i určitou proteolytickou aktivitu, tudíž jsou schopny deaminovat a dekarboxylovat aminokyseliny. Tím přispívají i ke zvýšenému množství amoniaku a toxických biogenních aminů. Z řady studií vyplývá, že bakterie octového kvašení mohou spolu s kvasinkami vyvolávat sekundární fermentaci, zejména u kukuřičných siláží. Preventivním opatřením je dostatečné udusání, dokonalý uzávěr sil a správný odběr siláží omezující aeraci styčné plochy (DOLEŽAL, 2006). 15

16 Klostridie Klostridie jsou běžně označovány jako bakterie máselného kvašení (BARANČIC, 1992). Konkurují mléčným bakteriím zkvašováním sacharidů, přičemž vzniká kyselina máselná. Vedle těchto uvedených fermentačních produktů dále vzniká kyselina octová, propionová, alkohol, acetony, kysličník uhličitý a vodík za značných energetických ztrát. Kromě toho klostridie rozkládají bílkoviny (VÍTEK, HRABĚ, 1986). Klostridie jsou obligátně anaerobní (G + ) bakterie. Jsou velmi citlivé k nízkému ph a při hodnotě ph 4,2 dochází k jejich inhibici. Činnosti máselných bakterií lze zabránit rychlým snížením hodnoty ph pod 4,2, podpořením činnosti bakterií mléčného kvašení a zvýšením obsahu sušiny nad 30 %. Teplotní optimum se pohybuje mezi C. Máselné bakterie potřebují v píci dostatečné množství vody. V píci s vyšším obsahem sušiny nemohou jejich spory klíčit, a proto je významným preventivním opatřením účinné zavadání píce (VÍTEK, HRABĚ, 1986). Podle BOLSENA (1993) a WEISSBACHA (1993) je výskyt klostridií u siláží s obsahem vlhkosti pod 65 % velmi ojedinělý. Klostridia se přestávají množit při vodní aktivitě (aw) 0,94. Rozlišujeme dva druhy klostridií dle McDONALD et al., (1991): - sacharolytické (Clostridium sacharolyticum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium sphenoides), které odbourávají sacharidy a produkují kyselinu máselnou a další zplodiny a tím způsobují odkyselování hotové siláže dle rovnice: C 6 H 12 O 6 CH 3 CH 2 CH 2 COOH + 2 CO H 2 Dále rozkládají již vytvořenou kyselinu mléčnou dle rovnice: 2 CH 3 CHOH COOH CH 3 CH 2 CH 2 COOH + 2 CO H 2 - proteolytické rozkládají bílkoviny a aminokyseliny (Clostridium proteolyticum, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Clostridium bifermentans). Clostridium perfringens fermentuje sacharidy, kyselinu mléčnou i bílkoviny (aminokyseliny) za možné tvorby toxinů. Fermentační produkty mají alkalický charakter, proto klostridiální siláže mají ph zpravidla vždy vyšší (nad 4,8) a nízký obsah kyseliny mléčné (DOLEŽAL, 2006). 16

17 Máselné bakterie často rozkládají bílkoviny za vzniku zásaditých produktů (jako např. amoniak) působících jako pufry, tj. vážou nebo snižují množství obsažených kyselin a tím podporují rozvoj hnilobných bakterií (SCHMIDT, WETTERAU, 1974). Činností enzymů proteolytických klostridií mohou také v silážích vznikat zdravotně závadné biogenní aminy a ve větším množství se tvořit amoniak (DOLEŽAL, 2006). Podle KALAČE a MÍKY (1997), obsah biogenních aminů v siláži souvisí s hodnotou proteolytického rozkladu a zvyšuje se také s délkou uskladnění. Hlavním produktem proteolytických klostridií jsou vedle amoniaku a kyseliny máselné, také biogenní aminy a amidy. Klostridie rozkládají bílkoviny nejprve na jednotlivé aminokyseliny a potom i na aminy, amidy a amoniak. Optimální podmínky pro deaminaci aminokyselin jsou při ph 7,5 8,5. Dekarboxylací aminokyselin vznikají v nadbytečném množství toxiny, mezi které patří hlavně: kadaverin, tyramin, putrescin, spermidin, tryptamin a histamin (KŘÍŽEK, KALAČ, 1993; KALAČ, MÍKA 1997; VOJTÍŠEK, 1998 a další). Biogenní aminy v silážích snižují chutnost zkrmovaných siláží, poškozují sliznici bachoru a střev a negativně působí na bachorovou mikroflóru. Zvyšují prostupnost střevní stěny pro pronikání nestrávených živin a do střeva naopak proniká krev za vzniku chronického zánětu. Biogenní aminy současně snižují detoxikační kapacitu jater a poškozují také ledviny (VOJTÍŠEK, 1998). Takto zvrácený fermentační proces bývá v silážích s nedodržením technologické kázně se silným znečištěním silážní hmoty zeminou. Máselné bakterie jsou schopné odbourávat kyselinu mléčnou, která je nahrazována kyselinou máselnou, zvyšuje se hodnota ph a kvalita siláže se zhoršuje (SCHMIDT, WETTERAU, 1974). Při zkrmování těchto siláží mohou máselné bakterie infikovat mléko. Během dlouhé doby zrání těchto tvrdých sýrů, jako je např. Ementál nebo Gouda, dochází k vyklíčení těchto spor a rozvoji plynotvorných bakterií, které způsobují tzv. pozdní plynatost a čichové a chuťové vady v sýru. Takto infikované mléko není způsobilé pro výrobu těchto sýrů (FAJMONOVÁ, ZEMAN, 1998; ILLEK, 1998). U siláží, které obsahují kyselinu máselnou, dochází v průběhu kvašení ke značným ztrátám živin, zvyšuje se ph, siláž se postupně stává nestabilní a téměř vždy dochází k jejímu znehodnocení. Ztráty sušiny představují 51 % a energie 18, 4 % (McDONALD et al., 1991). Důležitým preventivním opatřením proti výskytu klostridií v silážích je čistota sklízené hmoty, optimální obsah sušiny a rychlá acidifikace hmoty. 17

18 Hnilobné bakterie Hnilobné bakterie jsou přísně aerobní a tvoří významnou složku epifytní mikroflóry. Vyskytují se v silážích, zejména v silážích s nižším obsahem sušiny v jejich povrchových vrstvách. V siláži se pomnoží jen tehdy, vniká-li do siláže kyslík (BARANČIC, 1992). Dále se hnilobné bakterie nemohou rozvíjet při hodnotách ph pod 4,5. Z toho vyplývá, že v dobře uzavřených a uložených silážích nejsou existenční podmínky pro rozvoj hnilobných bakterií (JAKOBE et al., 1987). K jejich expanzivnímu pomnožení dochází až po značném odbourání přítomné kyseliny mléčné kvasinkami, máselnými bakteriemi, nebo neutralizací této kyseliny zplodinami rozkladu bílkovin, pak mohou hnilobné bakterie zahájit svou zhoubnou činnost (SCHMIDT, WETTERAU, 1974). Činností hnilobných bakterií dochází k úplnému organickému rozkladu silážní biomasy za vzniku toxických látek (mrtvolné jedy) vznikající dekarboxylací aminokyselin. Riziko výskytu a působení hnilobných bakterií je vždy při nezakrytí sila, popř. při průniku vzduchu a dešťových srážek do hotové siláže (DOLEŽAL, 2006). Hnilobné bakterie odbourávají dekarboxilací esenciální aminokyseliny a též sacharidy a kyselinu mléčnou. Zplodiny rozkladu bílkovin způsobují nepříjemný pach. Protože tyto bakterie nemohou existovat bez kyslíku, není ve vzduchotěsných silech hnilobný proces možný (SCHMIDT, WETTERAU, 1974). Hnilobné bakterie mají aktivní enzymový systém (amylázy, pektinázy, hydrolázy dekarboxylyázy a další), umožňující využívat širokou škálu živin (škrob, pektiny, bílkoviny, sacharidy a jiné). K významným sporulujícím bacilům vyskytující se v silážích patří Bacillus subtilis, Bacillus mesenteroides, Bacillus micoides (DOLEŽAL, 2006) Kvasinky Kvasinky jak pravé (Sacharomyces, Hansenula) tak nepravé (Torulopsis, Candida) patří k hlavním původcům následné fermentace siláží po jejich otevření (KALAČ, 1980). Významně konkurují mléčným bakteriím a jsou původci mikrobiálního poškození a alkoholového kvašení. Vyznačují se vysokou mikrobiální a enzymatickou aktivitou. Jsou aerobní (až fakultativně anaerobní povahy), takže mohou růst i při relativně nízké koncentraci kyslíku (např. uvnitř silážního žlabu). Jsou silně acidotolerantní a jejich aktivita je inhibována 18

19 až při ph 3,2, zatímco bakterie mléčného kvašení končí aktivitu při ph nad 3,6 (DOLEŽAL, 2006). Z hlediska silážování jsou důležité rody Candida, Sacharomyces, Torulopsis, nebo Hansenula. Pozitivní efekt kvasinek spočívá pouze v počáteční fázi kvašení, kdy se kvasinky podílejí na rychlejší spotřebě kyslíku v silážovaném materiálu a tím i na vytvoření anaerobního prostředí (JAKOBE et al., 1987). I když jsou kvasinky fakultativně anaerobní, za přítomnosti vzduchu je jejich činnost intenzivnější (VÍTEK, HRABĚ, 1986). V aerobních podmínkách (po vyskladnění) patří kvasinky k významným ukazatelům stability a kvality siláže. Rychle se zvyšuje jejich počet (BARANČIC, 1992). Kvašení je doprovázeno značnou ztrátou hmoty (až 49 %) a silnou tvorbou plynů (JAKOBE et al., 1987). Jsou spolehlivým měřítkem následné (sekundární) fermentace. Výsledky výzkumů posledních let dosvědčují, že činnost kvasinek vede k nežádoucímu zvratu kvasných procesů probíhajících v siláži, zejména odbourání kyseliny mléčné. Mohou-li se kvasinky v siláži ve větší míře rozvíjet, je třeba počítat se značnými ztrátami sacharidů, bílkovin a kyseliny mléčné a se zhoršením výsledku silážování (SCHMIDT, WETTERAU, 1974). Za anaerobních podmínek fermentují vodorozpustné sacharidy na etanol a oxid uhličitý (při snížení obsahu energie o 0,2 %) v závislosti na obsahu sušiny siláže (DOLEŽAL, 2006). V silážích by nemělo být více kvasinek než 10 5 CFU/g siláže (jednotek tvořících kolonie). Změny počtu jiných mikroorganismů následují až po kvasinkách (BARANČIC, 1992). K zahřívání siláží činností kvasinek dochází podle BOLSENA (1993), když populace kvasinek dosáhne počtu CFU/g siláže. Počty kvasinek jsou velmi rozdílné a pohybují se od 10 2 CFU/g až po CFU/g u silně zkažené siláže. WEISSBACH (1993), DOLEŽAL a DVOŘÁČEK (2000) konstatují, že siláže, které neobsahovaly žádnou kyselinu máselnou, byly stabilní a resistentní vůči kvasinkám, pokud obsahovaly více než 0,5 % kyseliny octové z hmotnosti siláže. Siláže s nízkým obsahem této kyseliny byly nestabilní nejčastěji při vyšším ph. Inhibice kvasinek se může uskutečnit pouze pomocí nedisociované části kyseliny octové, jejíž koncentrace je ovlivněna hodnotou ph a kyselinou propionovou, zatímco kyselina mléčná a mravenčí má na jejich inhibici malý vliv. Disociace vyjádřená disociační konstantou udává sílu kyseliny ve vodném prostředí. Čím je její konstanta větší, tím je kyselina silnější, tím více je disociována. Řada organických kyselin 19

20 se řadí mezi kyseliny slabé, protože hodnoty jejich disociačních konstant jsou řádově menší než 10-1 (DOLEŽAL, 2006). Hodnoty disociačních konstant významných kyselin: kyseliny mravenčí 1, kyseliny mléčné 1, kyseliny octové 1, kyseliny máselné 1, kyseliny propionové 1, Plísně Plísně jsou nejčastější skupinou polní (epifytní) a skladové mikroflóry, která nejvíce komplikuje činnost krmivářům, ale i veterinárním lékařům a hygienikům. Jsou to obligátně aerobní mikroorganismy, které jsou schopné růstu a množení na všech substrátech, tedy i v silážích, a to nejen v povrchových vrstvách, ale i při velmi nízkém parciálním tlaku kyslíku i uvnitř silážního prostoru (ZEMAN, PROKEŠ, 2007). Plísně patří mezi konkurenty mléčných bakterií, protože odbourávají sacharidy a tím mléčným bakteriím spotřebovávají část potřebné energie. Kromě toho činností plísní dochází k značnému odbourávání bílkovin. Zplodiny, které vznikají, jsou zásadité povahy, vážou kyselinu mléčnou a ta se stává neúčinnou. K tomu se přidružuje ještě přímé odbourávání kyseliny mléčné (SCHMIDT, WETTERAU, 1974; WILKINSON, 2005). Navíc řada toxinogenních druhů plísní vylučuje mykotoxiny (WEISSBACH, 1993; PATTERSON, 1983; GEDEKOVÁ et al., 1981 a další). Plísně snášejí kyselost až do hodnoty ph 2,5 (VÍTEK, HRABĚ, 1986). Patří k nejnebezpečnějším mikrobiálním rizikům siláží (JAKOBE et al., 1987). Dle BARANČICE (1992) doplňují plísně v siláži činnost hnilobných bakterií. Při nízké sušině silážní hmoty vznikají příznivé podmínky pro hnilobné procesy, zvýší-li se však obsah sušiny, vstupuje do popředí aktivita plísní. Výskyt plísní v krmivech je indikátorem špatných skladovacích podmínek. Kontaminovaná krmiva jsou jen v lepším případě podmíněně zkrmitelná (při koncentraci do 10 5 CFU/g siláže), ale zpravidla jsou považována za zkažená a nezkrmitelná, zejména pro březí plemenice a mláďata, pokud koncentrace je vyšší než 10 6 či 10 7 CFU/g substrátu. Je 20

21 potvrzeno při viditelném zaplesnivění krmiv skladovými plísněmi (Mucor, Penicillium, Aspergilus). Zpravidla dochází k výrazné kontaminaci krmiva s vysokou produkcí spor pohybující se řádově v milionech v 1 g krmiva. Takováto krmiva nelze zkrmovat zvířatům (DOLEŽAL, 2006). S výskytem a rozvojem kmenů polních plísní (Fusarium, Alternaria, Penicillium) je spojena zejména problematika produkce mykotoxinů. Je třeba však upozornit, že nebyla zcela prokázaná souvislost mezi produkcí spor plísní a potenciální produkcí mykotoxinů, i když WILKINSON, (2005) předpokládají, že při vyšším výskytu plísní lze očekávat také nález toxinogenních druhů hub. Mykotoxiny jsou toxické látky nebílkovinné povahy, produkované patogenními druhy plísní, z nichž nejvýznamnější jsou rody Aspergillus, Penicillium a Fusarium (OSWEILLER, 2000). V současné době je známo více než 400 mykotoxinů, které produkuje asi druhů plísní (MÜLLER et al., 2000). Podle SUCHÉHO a HERZIGA (1998), KALAČE a MÍKY (1997) mohou produkovat různé kmeny téhož druhu více než jeden typ mykotoxinu a naopak jeden typ mykotoxinu může být tvořen různými druhy plísní. GEDEKOVÁ et al. (1981) zjistili, že Penicillium roquerti a Aspergillus fumigatus jsou potenciálními producenty mykotoxinů v kukuřičné siláži. Z izolovaných kmenů Penicillií a Aspergillů z kukuřičné siláže zjistili, že 65 % kmenů bylo toxinogenních. Také LEPOM et al. (1990) zjistili schopnost tvorby zearalenonu a trichotecenů typu A u 45 % kmenů rodu Fusarium, izolovaných z kukuřičné siláže. Z uvedeného vyplývá, že siláže, zejména kukuřičné, jsou z pohledu výskytu mykotoxinů, vážným potenciálním rizikem, který je v praxi velmi často podceňován. Plesnivá krmiva, tedy i siláže, by proto zásadně neměla být zkrmována zvířaty, protože přenos mykotoxinů z krmiv do živočišných produktů představuje vážný problém i pro samotnou lidskou populaci (DOLEŽAL, 2006). Vyšší výskyt kolonizujících hub v silážích z pomrzlé kukuřice diagnostikovali ČERMÁK a VAČKÁŘ (1987), BARANČIC (1982), BARANČIC a PŘIKRYL (1987), DOLEŽAL a DVOŘÁČEK (1997), jelikož dochází k poškození pletiva rostliny, která jsou vstupní branou pro nežádoucí mikrobiální infekci. Proto není vhodné takto promrzlou rostlinu sklízet na siláž. U takto poškozených rostlin upřednostňujeme sklizeň a konzervaci vlhkého kukuřičného zrna za použití účinných chemických aditiv, jelikož zrna bývají zpravidla méně poškozena mrazem. K rozvoji plísní dochází běžně v pokročilém stadiu sekundární aerobní fermentace hmoty. Z toho důvodu je nežádoucí meziskladování připravené směsné krmné dávky (HITZGER et al., 2003). 21

22 LACEY et al. (1981) uvádí, že kyselinou mravenčí se plesnivění a zahřívání zabrání méně účinně, než kyselinou propionovou. Kyselina propionová má z těkavých mastných kyselin s menším počtem atomů C. Nejlepší antifungální účinky, ale i tato kyselina může být některými druhy (Propionibacterium acidi, či Aspergillus glaucus) zvláště při její menší koncentraci degradována. Plísně jsou citlivé na zvýšenou hodnotu ph, kterou nám může ovlivnit přídavek amoniaku v silážích. Rovněž růst plísní lze zabránit dostatečným vytěsněním vzduchu ze silážované píce a dokonalým neprodyšným uzavřením silážního prostoru (VÍTEK, HRABĚ, 1986). Rozvoj plísní lze velice dobře inhibovat také aplikací účinných aditiv (BOLSEN et al., 1996; MUCK et al., 1991; PAHLOW, HONIG 1994; WIKINSON, 2005 a další). 22

23 2.4. Fáze fermentace Silážování je biologický proces, při kterém dochází mikrobiální činností k biochemickým přeměnám zkvasitelných sacharidů na jednotlivé fermentační produkty. Intenzita a délka těchto pochodů rozhodujícím způsobem ovlivní nejen výslednou jakost siláží, ale i úroveň ztrát, zejména energie. Silážování je považováno za hlavní konzervační metodu, která v porovnání se sušením píce umožňuje získávat krmivo s menšími (10 15 %) ztrátami živin (LOUČKA, MACHÁČKOVÁ, 1996). Vhodná zralost sklizené kukuřice je obecně v mléčně-voskové zralosti, kdy je obsah vodorozpustných, lehce fermentovatelných sacharidů nejvyšší. Obsah těchto lehce fermentovatelných sacharidů nám udává její snadnou silážovatelnost (HITZGER, 2003). Fermentační proces probíhá ve čtyřech fázích: 1. Aerobní fáze 2. Fermentační fáze 3. Stabilní fáze 4. Fáze zkrmování siláže Aerobní fáze Aerobní fáze začíná od posečení, navezení do silážního prostoru až po jeho udusání s následným zakrytím. V této fázi probíhají hlavní dva procesy, jedná se o respiraci a proteolýzu, které se připisují aktivitě rostlinných enzymů. Respirací rozumíme rozložení sacharidů v rostlinné hmotě a prodýchání na oxid uhličitý a vodu. Současně se spotřebovává kyslík a uvolňuje teplo dle následující rovnice: C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O kj Enzymy se uvolňují při sklizni mechanickým narušením rostlinného pletiva. Některé z těchto enzymů, jako např. amylázy a hemicelulázy, rozkládají škrob, hemicelulózu a tím zvyšují hladinu sacharidů v silážované hmotě a nepřímo tak podporují fermentační proces. 23

24 V této fázi se velice uplatňuje epifytní mikroflóra, která obsahuje jak aerobní tak fakultativně anaerobní mikroorganismy, které se podílejí na oxidačních procesech v silážních silech. Postupný zánik aerobních mikroorganismů způsobuje vytváření anaerobního prostředí. Pokud nedojde současně i k rychlému snížení hodnoty ph z původních 6 6,7 na 5,0 5,5, nacházejí v této fázi vhodné podmínky také klostridie, enterobakterie a další nežádoucí zástupci mikroorganismů. Již v této fázi dochází k určité fermentaci za vzniku kyseliny mravenčí, octové a mléčné (DOLEŽAL, 2006). Doba trvání aerobní fáze je různě dlouhá, ale je technologicky žádoucí, aby byla co nejkratší (několik hodin), neboť jinak dochází k neúměrně vysokým ztrátám energie a stravitelnosti organických živin. Tomuto cíli se musí podřídit všechna technologická opatření (doba zavadání, aplikace aditiv, intenzita dusání a další). Tato fáze má klíčovou úlohu pro další průběh fermentace, hygienickou jakost a aerobní stabilitu siláží. Negativní vliv aerobní fáze na kvalitu siláže lze minimalizovat dostatečným mechanickým narušením rostlinného pletiva, rychlým naplněním sila, kvalitním udusáním a vytěsněním vzduchu v naskladněné hmotě s následným hermetickým uzavřením sila (JAMBOR, 1998) Fermentační fáze Fermentační fáze začíná od okamžiku, kdy mikroorganismy spotřebují veškerý kyslík a vytvoří se anaerobní prostředí. Pro tuto fázi je typické silné pomnožení populace BMK, za současného poklesu hodnoty ph pod hranici 5,0 (resp. hodnoty okolo ph 4,2) a intenzivní tvorba kyseliny mléčné. Tato fáze navazuje na fázi aerobní a z bakterií mléčného kvašení se uplatňují zejména bakterie pomaleji rostoucí a citlivější laktobacilární kmeny (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei) a další. U porušených buněk nastává lyze (v několika málo hodinách), zpřístupnění buněčného obsahu a uvolnění rostlinných enzymů pro štěpení sacharidů a rozklad bílkovin. Současně dochází také k uvolnění šťávy u silážovaného materiálu s nižším obsahem sušiny a nastává útlum nežádoucí konkurenční mikroflóry s odlišnými životními požadavky (enterobakterie, kvasinky, plísně, klostridie). BMK mohou fermentovat sacharidy i při nižší hodnotě ph. Při této hodnotě nemohou již enzymy klostridií (proteázy) fermentovat živiny a zanikají (BARANČIČ, 1982; DOLEŽAL, 2002). Mikroflóra hlavní fermentační fáze je zcela odlišná, ale je ovlivněná nejen složením původní epifytní mikroflóry, ale také zejména užitými inokulanty. Dochází k pomnožení BMK na hodnotu převyšující 10 6 CFU/g silážovaného materiálu, což vede k vytváření stále kyselejšího 24

25 prostředí. Tyto bakterie mléčného kvašení nahrazují aktivitu původních zástupců epifytní mikroflóry přítomných na rostlinách za intenzivní produkce kyseliny mléčné, octové a dalších. Tímto se významně zkrátí délka fermentačního procesu. Období aktivní fermentace kvašení trvá zpravidla jen několik dnů (10 dnů, ale až 1 měsíc), průměrně 1 3 týdny, v závislosti zejména na obsahu sušiny a použití inokulantu či chemického přípravku k ošetření silážovaného materiálu. Po skončení hlavní fermentační fáze se hodnota ph pohybuje okolo 4 4,2 a primární proces je ukončen stejně jako BMK, které postupně rovněž zanikají (DOLEŽAL, 2006). Cílem hlavní fermentační fáze je vytvoření stabilního kyselého prostředí s dostatečně nízkou hodnotou ph a vysokou koncentrací konzervující kyseliny mléčné. Ta zajistí bezpečnou inhibici růstu nežádoucí mikroflóry Stabilní fáze Stabilní fáze fermentačního procesu je doba od ukončení fermentační fáze konzervovaného krmiva až do doby, kdy je silážní prostor otevřen a siláž je vystavena povětrnostním podmínkám. Dle úspěšnosti fermentačního procesu může být stabilní fáze různě dlouhá. Po aktivní fázi růstu bakterií mléčného kvašení a snížení ph se silážovaný materiál dostává do stabilní fáze. Je-li silo řádně utěsněno, dochází v této fázi jen k minimální mikrobiální aktivitě. Hlavním faktorem ovlivňujícím kvalitu kukuřičné siláže během stabilní fáze, je propustnost sila vůči kyslíku a změny teplot v závislosti na vnějším prostředí. I nadále se však siláž chová jako živý systém, tzn. že se zpomalují procesy štěpení hemicelulózy a enzymatického uvolnění zbytkových sacharidů k dokvašení. Pokles hodnoty ph je již výrazně pomalejší. V této fázi dochází k přebudovávání obsahu a poměru jednotlivých kvasných kyselin, zejména klesá podíl kyseliny mléčné a mění se její poměr ke kyselině octové (DOLEŽAL, 2006). V rámci řízené fermentace lze použít aditiva obsahující kmeny heterofermentativních mléčných bakterií (Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Propionibacterium shermani), které rostou i při nižší hodnotě ph. Jsou schopné produkovat vyšší podíl acetátu, popř. 1,2 propandiolu s významným antifungálním účinkem (WILKINSON, 2005). Odlišná doba zrání siláží je ovlivněna především obsahem sušiny a přídavkem silážních aditiv. Inhibitory kvasného procesu, jako jsou příměsy zeminy či aerace silážovaného materiálu, prodlužují dobu zrání na 7 8 týdnů, naopak inokulanty tuto dobu zkracují na 3 5 týdnů. 25

26 Fáze zkrmování siláže Po otevření sila a odebírání siláže ke zkrmování, má většinou volný přístup kyslík do čelní stěny siláže. V této fázi může dojít k největším ztrátám sušiny i nutričních látek (LOUČKA et al., 1997). Jsou způsobeny aerobními mikroorganismy, které metabolizují zbytkové sacharidy a produkty fermentace na oxid uhličitý a vodu za vzniku tepla. K nejběžnějším mikroorganismům, které se podílí na aerobní degradaci živin patří kvasinky a plísně. Kromě toho, že dochází ke ztrátám živin, tyto organismy produkují mykotoxiny a jiné toxické látky, které zhoršují zdravotní stav zvířat (JAMBOR, 1998). Těmto rozkladným procesům lze předejít použitím vhodných silážních inokulantů, které vytváří vedle kyseliny mléčné také kyselinu octovou a propionovou, které mají větší antifungální účinek. Velice důležitým faktorem při odběru siláže způsob a kvalita vybírání siláže a následné ošetření silážní stěny. Celou touto problematikou se zabývá face management. Cílem této fáze je zabezpečit aerobní stabilitu siláží při otevření a vlastním zkrmování Technologické faktory ovlivňující kvalitu kukuřičné siláže Vzhledem ke zvyšujícímu se zastoupení siláží v krmných dávkách skotu, je nezbytné věnovat zvýšenou pozornost dodržování technologických zásad při jejich výrobě, resp. více využívat dosud existujících rezerv ke zvýšení kvality krmiv ( ZEMAN, PROKEŠ, 2007). Je třeba si uvědomit, že konzervační přípravky ovlivní výslednou kvalitu vzniklé siláže pouze částečně. I při použití těchto přípravků je nutné dodržovat základní technologická pravidla pro výrobu kvalitní siláže, jako například: sklizeň plodiny ve správné růstové fázi, při optimální sušině, řezanka musí mít optimální délku, hmota má být dostatečně rychle navezena, dobře stlačena a dokonale zakryta. Ze špatného vstupního materiálu není možné vyrobit špičkovou, aromatickou siláž (TYROLOVÁ, 2003, 2004). Pro úspěch silážování je rozhodující silážovatelnost krmiva, dodržení správného technologického postupu silážování a také výběr správného konzervačního prostředku (MATHIES, 2002). Nedodržení či dokonce vynechání některé technologické zásady vede k neúměrným ztrátám při výrobě siláží a k snížení jejich jakosti (JAKOBE et al., 1987). 26

27 Volba odrůdy kukuřice O výši výnosu kukuřice rozhoduje velkou měrou také zvolený hybrid. Neplatí již dřívější doporučení, že kukuřice je nejvhodnější krmnou plodinou pro nížinné oblasti, neboť díky široké nabídce velkého počtu hybridů i s nižšími čísly FAO ( ) a s ohledem i ke strukturálním změnám v chovu skotu, se stává produkčně nejdůležitější výrobní oblastí pěstování silážní kukuřice vedle řepařské oblasti, hlavně oblast bramborářská. Číslo FAO nám udává rannost jednotlivých hybridů. Zkrácení vegetační doby o 1 2 dny představuje 10 jednotek FAO, popřípadě zvýšení 1 2 % v obsahu sušiny ve fyziologické zralosti (HITZGER, 2003). U velmi ranných hybridů se pohybuje FAO od 150 a u velmi pozdních hybridů do FAO 450. Pěstování kukuřice se tak posunuje do vyšších poloh, včetně podhorských. Hraniční hodnoty úhrnu teplot pro stadia zralosti dle AGPM (svaz výrobců kukuřice) jsou patrné v následujícím schématu: Orientační délka vegetace při pěstování kukuřice na siláž dle PROKEŠ (2000): Stadium ranosti Číslo FAO Délka vegetace (dny) Velmi rané Do 120 Rané Středně rané Středně pozdní Pozdní Velmi pozdní nad 450 nad 144 Nesmíme opomenout (Stay green) hybridy, které se vyznačují dlouho zeleným, fotosynteticky aktivním zbytkem rostliny až do fyziologické zralosti. Hybridy s tímto znakem jsou obecně odolnější k lámavosti stébel, napadení houbovými chorobami a lépe se vyrovnávají s nepříznivým klimatickým podmínkám ke konci vegetace (přísušek, nárazový vítr a prudký déšť). Doporučují se do řepařských oblastí, kde oddálí termín sklizně a tím oddálí sklizňové okno. Obecně dosahují vyššího obsahu a kvality škrobu (HITZGER, 2003). 27

28 Podíl nečistot Důležitou podmínkou při sklizni plodin na siláž, je zamezení jejich znečišťování zeminou, nečistotami, pohonnými hmotami, mazacími oleji apod. (ŠKULTÉTY, 1985). Rovněž zpevnění příjezdových komunikací je důležitým faktorem zejména při sklizni za nepříznivého počasí. Zvyšuje se zde riziko znečišťování zeminou koly manipulačních prostředků. V takovémto počasí je nezbytné zamezit dopravním prostředkům průjezd silážní jámou a veškerou manipulaci silážované hmoty zabezpečit dusacími stroji. Důležitým faktorem, který bývá často opomíjen je důkladné vyčištění silážního žlabu před samotným naskladněním. Obr.1: Prázdný silážní žlab Se znečištěným krmivem se do sila dostávají taktéž klostridie, které jsou zodpovědné za máselné kvašení. Díky pufrujícímu účinku brání částečky hlíny rychlému okyselení siláže a podporují tak rozvoj klostrídií, kvasinek a bakterií máselného kvašení (MATHIES, 2002) Vliv termínu seče Krmné plodiny se nesklízejí pro konzervaci až na konci generativního vývoje, jako např. obilniny, nýbrž již během vegetačního růstu. Stanovení optimálního stádia zralosti pícnin je velmi důležité, neboť vedle nutričních aspektů, komplikuje vzájemné vztahy 28

29 mezi vegetační fází rostlin a tzv. kvalitativními parametry (WERMKE, 1979; PROKEŠ 2000; JAMBOR, 2000). Vegetační fáze rozhoduje o přístupnosti energie a živin pro bakterie mléčného kvašení, která se zhoršuje úměrně se zvyšujícím se obsahem obtížně stravitelných látek (KUDRNA et al., 1998). Jako optimální silážní zralost kukuřice je možné charakterizovat to vývojové stadium, ve kterém je dosažena nejvyšší nutriční hodnota (PROKEŠ, 2002). Optimální stadium sklizně kukuřice na siláž se doporučuje ke konci těstovité zralosti zrna, tj v době, kdy dochází již ke stagnaci nárůstu metabolizovatelné energie a kdy sušina celé rostliny leží v rozmezí %. Jak uvádí DOLEŽAL (2006), optimální dobu sklizně kukuřice lze také určit podle určitých fenologických znaků rostliny. Stadium květu je prvotní ukazatel následné sklizně. Sklizeň na siláž by měla nastat v případě optimálních povětrnostních podmínek nejdříve za 40 až 45 dnů od doby, kdy byla polovina rostlin ve stadiu kvetení (pro dělenou sklizeň porosty dozrávají ještě za dalších 14 dní). Dalším znakem je začátek žloutnutí listenů obepínajících klas. Se sklizní se může začít, až se žloutnutí objeví. Mezi poslední kritéria lze zohlednit zralost zrna. Pokud se do zrna jen těžko zaryje nehet, měla by se hmota sklízet na siláž, jakmile se však již na hrotu zrna objeví černá skvrna, musíme urychleně dokončit sklizeň na siláž z celých rostlin, jelikož došlo k ukončení asimilace škrobu, nebo zahájit dělenou sklizeň kukuřice na CCM či LKS. Mezi poslední a velice přesné metody patří odhad sklizně dle sumy efektivních teplot měřené od výsevu kukuřice. Ty mohou rozhodujícím způsobem upozornit na optimální termín sklizně kukuřice. Princip odhadu zralosti spočívá ve znalosti vegetačních požadavků kukuřice, kdy se neodehrává žádný nárůst sušiny při teplotách nižších než 6 o C a vyšších než 30 o C (ŠUK et al., 1998). Výpočet se provádí podle vzorce: Minimální teplota + Maximální teplota Denní efektivní teplota = Podle dosud známých zkušeností existuje úzká souvislost mezi množstvím tepla, které obdrží porost kukuřice v průběhu svého růstu a jednotlivými stadii vývoje růstu. Ideální by bylo tedy vyvinout z této závislosti metodu prognózování termínu sklizně pro každý hybrid na kterémkoli stanovišti PROKEŠ, (2000). 29

30 Faktor obsahu sušiny ve hmotě Obsah sušiny má nezastupitelnou úlohu ve vlastním průběhu fermentace krmiv a má vliv na výslednou kvalitu silážního procesu. Obsah sušiny silážované hmoty není produktem fermentace, přesto je významným technologickým faktorem. Obsah sušiny je vedle hodnoty ph jedním z hlavních měřítek posuzování jistoty fermentačního procesu (PROKEŠ, 2005). Obsah sušiny celé rostliny kukuřice je podle DOLEŽALA (2006) orientačním ukazatelem k zahájení sklizně klasických hybridů, pohybuje-li se v rozmezí %. Toto rozmezí sušiny je nejlepší ke konzervaci kukuřice silážováním, s optimální koncentrací energie a s obsahem sušiny zrna %. ZIMMER a HONIG (1987) doporučují horní hranici sušiny kukuřice 35 %. Pro zdárný průběh fermentačního procesu by neměla být sušina silážní kukuřice vyšší než 35 %. Zcela nežádoucí je obsah sušiny silážované hmoty nad 40 %, kdy vyvstávají problémy nejen s primárním kvašením, ale také s nedostatečným dusáním a následnou aerobní nestabilitou (BÍRO, et al., 1995). Při velmi nízké sušině (pod 22 %) se podle řady autorů obtížně silážují i lehce silážovatelné pícniny, jako je kukuřice (BARANČIC, 1982; REUTER, 1992 a další). Platí obecná zásada, že čím je větší vlhkost silážované hmoty, tím intenzivnější je vlastní mikrobiálně-enzymatický proces, s maximální tvorbou kvasných produktů. Množství dostupné vody v píci má výrazný vliv na mikroorganismy a jejich životaschopnost také v závislosti na kritické hodnotě ph, která je zpravidla kritériem stability siláží (KNABE et al.,1986). Udává se, že jen 10 % z přirozených BMK má schopnost růstu a množení při obsahu sušiny nad 50 % (DOLEŽAL, 2002). Také WILHELM a WURM (1999) konstatují, že vysoký obsah sušiny silážované hmoty je problematický a z pohledu kvality fermentačního procesu nevhodný. Obsah sušiny ovlivňuje vedle kvality fermentačního procesu také úroveň ztrát energie. Při nižší sušině naskladňované hmoty a horší kvality fermentace jsou ztráty NEL vyšší (VESELÁ, DOLEŽAL, 2003). Také příliš vysoký obsah sušiny bez přídavku vhodných inokulantů velmi často redukuje rozsah fermentačního procesu a též vlastní kvasný proces bývá vlivem obtížnějšího dusání často neúspěšný, siláž je aerobně nestabilní a s nižší mikrobiální kvalitou (DOLEŽAL, et al., 2002). 30

31 Faktor kvality řezanky Rozhodujícím faktorem vedle termínu sklizně silážní kukuřice je rovněž optimální délka řezanky silážované hmoty. Při vysokém obsahu sušiny sklízené píce, je nutné délku řezanky zkracovat v závislosti na schopnosti technologicky vytěsnit vzduch ze silážované hmoty a možnosti dokonale uzavřít silážní prostor (JAMBOR, 1998; PAHLOW, HONIG, 1986). S rostoucím obsahem sušiny se klade větší požadavek na kratší řezanku a dodatečné narušení zrna, které jinak prochází zažívacím traktem s minimálním nutričním efektem (DOLEŽAL, 2006). Je nutné současně zohlednit také požadavek na dietetické vlastnosti vyrobeného krmiva z hlediska bachorové fermentace, protože příliš krátká řezanka snižuje obsah strukturní vlákniny (JAMBOR, 1998). Kukuřičné siláže s krátkou řezankou se vyznačují vždy rychlejším a intenzivnějším průběhem fermentace a jsou i aerobně stabilnější. Všeobecně platí zásada, že čím je vyšší sušina silážované kukuřice a ostatních plodin, tím kratší by měla být délka řezanky (ŠUK et al., 1998) Faktor rychlosti naskladnění, dusání a důkladného zakrytí Výše ztrát při fermentaci kukuřice závisí na rychlosti naskladňování a včasném vytvoření optimálních podmínek pro rychlý rozvoj mléčných bakterií. Při pomalém plnění silážního prostoru je píce vystavena přístupu kyslíku, který využívají mikroorganismy k nežádoucím procesům (JAKOBE, et al., 1987). Intenzita dusání výrazně ovlivňuje rychlost acidifikace silážované hmoty, tedy i pokles hodnoty ph. Úspěšnost a intenzita dusání závisí především na obsahu sušiny a na délce řezanky (PROKEŠ, 2005; JAKOBE, et al., 1987; BECK, 1989 a další). Platí obecná podmínka, že čím je vyšší sušina silážované hmoty, o to intenzivněji se musí dusat a to po celou dobu naskladňování. Ukazatelem nedostatečného dusání hmoty, zejména o vyšší sušině, je zvýšení teploty a nízká měrná hmotnost siláží (KOPŘIVA et al., 1992). Vysoký stupeň udusání je nezbytný pro zabránění výměny plynů a tím i druhotnému nežádoucímu kvašení. U siláží s obsahem sušiny 30 % je požadováno udusání minimálně na hodnotu 200 kg sušiny na m 3 (MATHIES, 2002). Doporučuje se, aby doba dusání 1 t hmoty byla alespoň 4 6 minut, resp. aby dusací tlak byl 7 až 10 kn/ m 2 plochy (BOLSEN, 31

32 URIARTE, 2001). Stupeň stlačitelnosti je ovlivněn především výškou hmoty, délkou řezanky, druhem a hmotností použitého prostředku k dusání a dobou dusání (JAKOBE et al., 1987; BOLSEN, URIARTE, 2001; MITRIK, VAJDA, 2009). Dokonalé a včasné zakrytí silážního prostoru významnou měrou ovlivňuje výslednou kvalitu siláží. Prostor, ve kterém má být siláž uložena, musí být po naskladnění dlouhodobě dokonale utěsněn proti vniknutí vzduchu a dešťových srážek (LOUČKA, 1998). Důkladné zakrývání krmiva výraznou měrou ovlivňuje kvalitu fermentačního procesu a tím podstatnou měrou rozhoduje o budoucí produkční účinnosti vyrobených krmiv (PFLAUM, 2008). Také účinnost silážních aditiv je závislá na zabezpečení přísných anaerobních podmínek, o čemž rozhoduje dokonalé uzavření sila (GALLO, 2002). Oxid uhličitý, který vzniká v počáteční respirační fázi kvašení, má velký technologický dopad, neboť napomáhá k vytvoření anaerobního prostředí a snižování ztrát. Oxid uhličitý patří k nejvýznamnějším kvasným plynům a v silážích může být zastoupen v rozmezí od 5 12 % a úzce souvisí s precizním zakrytím silážního žlabu (DOLEŽAL, 2006). Dokonale se musí utěsnit a zatížit i všechny spoje a okraje fólií. Dlouhodobé zajištění dokonalé izolace od vnějšího prostředí je požadavek, jehož splnění bývá v praxi podceňováno. Silážní plachta by měla být zatížena po celém povrchu (KUDRNA, et al., 1998), neboť jedině tak lze zamezit přístupu vzduchu k siláži. Nezakrývání silážních skladů, jako projev špatných úsporných opatření, způsobuje velké ztráty znehodnocením siláže nejen v povrchových vrstvách (vizuálně patrné), ale hnilobné procesy jsou i v hlubších partiích skladu (BOLSEN, BOLSEN, 2010). Obr.2: Zakrytí sila 32

33 Faktor doby skladování Skladování má přímý dopad na celkový obsah kvasinek a plísní v siláži. Skladování po dobu minimálně šesti až osmi týdnů zajistí, že dojde ke snížení počtu kvasinek a plísní tzv. samočištěním. Po ukončení fáze zrání siláže je dosažena i stabilita siláže (MATHIES, 2002). Schopnost krmiva být stabilní nazýváme skladovatelností. Je-li silo řádně utěsněné, dochází v této fázi jen k minimální mikrobiální aktivitě (JAMBOR, 2001; BOLSEN 1993) Způsob odběru siláže a jeho vliv na aerobní stabilitu Vybírání kukuřičných siláží ze sila, jejich úpravy, odvoz a předkládání zvířatům ke krmení musí respektovat určité požadavky. Aby se vyloučil negativní vliv aerobní degradace siláží, musí být zajištěn jejich denní odběr nejméně do hloubky 20 cm v celém odkrytém profilu vybírané siláže ve skladovacím prostoru. Povrchová stěna krmiva musí zůstat po ukončení vybírání relativně rovná, hladká a nezkypřená (ŠUK et al., 1998). Při vysokých teplotách v letních měsících se podstatně zvyšuje rychlost aerobních změn a siláž se velmi rychle kazí, zvláště obsahuje-li zbytkové sacharidy, vysoký počet kvasinek, nebo pokud se siláže vyznačují vyšší porézností a obsahem reziduálního kyslíku (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, 2000; DOLEŽAL, 2006). Rychlost a rozsah těchto změn vlivem okolní teploty je všeobecně znám a k největším ztrátám vlivem nízké stability siláží dochází při teplotách nad 30 C (do 45 C), při kterých jsou mikrobiální procesy nejintenzivnější. Samozáhřevem mikrobiálního původu dochází ke zvýšení teploty až na úroveň 50 až 60 C, při této teplotě jsou většinou zaznamenávány největší ztráty sušiny (až 1,7 % denně). Dochází tak k částečnému až úplnému odbourávání sacharidů a kvasných kyselin (REES, 1982). 33

34 Obr.3: Stěna siláže 2.6. Silážní aditiva a aerobní stabilita siláží Při výrobě siláží je třeba udělat vše pro to, aby došlo k co nejrychlejšímu vytvoření vhodných podmínek pro namnožení bakterií mléčného kvašení a tedy i dosažení dostatečně nízkého ph pro zdárnou konzervaci a uchování píce. Pro podpoření tohoto procesu je možné použít vhodná aditiva. Mnohdy se zdají být přípravky (u lehce silážovatelných pícnin) zbytečné, avšak při jejich užití, je rychlejší kvasný proces a uchovává se více živin v silážované hmotě (TYROLOVÁ, 2006). Je nezbytné zdůraznit, že žádný, tedy ani ten nejlepší konzervační přípravek (biologický či chemický), nemůže současně substituovat nebo eliminovat nedostatky v technologickém postupu, v požadavku na kvalitu a čistotu silážované píce nebo požadavek na dostatečné dusání a zakrytí (DOLEŽAL et al., 2002). Nelze opomenout ztráty vlivem kvasných procesů, závislé především na rychlosti vytvoření vhodných podmínek pro rychlý rozvoj mléčných bakterií. Ztráty s tím spojené jsou ovlivněny kvalitou fermentačního procesu. Vezmeme-li v úvahu množství energie, které se uvolní při spálení 1 kg cukru v kalorimetru (3760 kcal) a zkvašení 1kg cukru na kyselinu mléčnou, vznikne pouze 3615 kcal. To odpovídá 4 % ztrátám vlivem kvasného procesu. Avšak při zkvašení na kyselinu octovou vznikne 3220 kcal, to se rovná 15 % ztrátám a při zkvašení na kyselinu máselnou vznikne 2850 kcal, což je 24 % ztrát (JAMBOR, 1996). Z toho lze odvodit % ztrát kvasným procesem, avšak minimum jsou 4 %. 34

35 Všechna konzervační aditiva je třeba aplikovat rovnoměrně a v plné dávce doporučené technologickým návodem. Strategii a volbu daného silážního prostředku je nutné vždy podřídit povaze a složení silážované hmoty, obsahu sušiny a koncentraci živin (DOLEŽAL et al., 2002) Chemická aditiva a aerobní stabilita siláží Na trhu dostupné komerční chemické preparáty jsou zpravidla odvozeny od kyseliny mravenčí, propionové a jejich solí, které se vyznačují dostatečným antimikrobiálním účinkem. Mají garantovat lepší kvalitu siláží, s menším stupněm rozkladu bílkovin, s příznivějším obsahem a poměrem kvasných kyselin. Dále mají snížit ztráty energie vlivem rychlejší acidifikace silážované hmoty s větším uchováním zbytkových pohotových sacharidů. Celá tato skupina chemických látek patří k inhibitorům fermentace, které redukují kvasný proces, zejména nežádoucí máselné kvašení, inhibují tvorbu alkoholu, amoniaku a další nežádoucí rozkladné produkty bílkovin (DOLEŽAL et al., 2002). Kyselina mravenčí je nejpoužívanější organickou kyselinou, používanou pro konzervační účely. Heterofermentativní bakterie inhibuje silněji než homofermentativní bakterie mléčného kvašení, které jsou vůči kyselině mravenčí více resistentní. Dokladem toho je, že u siláží ošetřených kyselinou mravenčí je vždy výrazná redukce tvorby těkavých mastných kyselin, zejména octové a máselné, zatímco tvorba kyseliny mléčné nebývá zpravidla redukována, resp. její % podíl bývá vyšší. Samotná kyselina mravenčí sice silně redukuje hodnotu ph, tedy působí jako významný inhibitor fermentace, ale kvasinky a plísně, tedy mikroorganismy odpovědné za aerobní nestabilitu siláží, jsou vůči ní velmi tolerantní (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, 2000). Kyselina propionová je pro silážování zřetelně méně účinná než kyselina mravenčí, silněji však potlačuje kvasinky a plísně, což zvyšuje stabilitu proti aerobní zkáze. Většinou se používá ve směsi s kyselinou mravenčí s různým %-ním zastoupením, čímž rozšiřuje antimikrobiální spektrum preparátu při současně nižší použité koncentraci. V této kombinaci je účinnost kyseliny propionové zesílena a směs obou kyselin splňuje oba požadavky úspěšně konzervuje a získaná siláž je dostatečně stabilní. Vedle čisté kyseliny propionové je možné použít také její soli (propionát vápenatý, popř. amonný), které však mají o něco nižší konzervační efekt. Kyselina propionová je pro přežvýkavce přirozenou látkou, protože v bachoru vzniká při řadě biochemických procesů (DOLEŽAL, 2006). 35

36 Podle LOUČKY et al. (1997) minerální kyseliny (sírová, chlorovodíková) nebo jejich soli, okyselují silážovanou píci tak silně, že po jejich aplikaci dochází současně také k potlačení rozvoje bakterií mléčného kvašení. V současné době se již nepoužívají Biologická aditiva posilující fermentační proces a aerobní stabilitu Rozsáhlá sledování dokládají, že přirozený výskyt bakterií mléčného kvašení na krmných plodinách jen zřídka postačuje pro optimální silážování (MATHIES, 2002). Od biologických aditiv se očekává, že umožní účinnější fermentaci a omezí riziko aerobního rozkladu výsledných siláží. Tyto přípravky mají proto nejen stimulovat rychlou acidifikaci silážní hmoty zvýšenou produkcí kyseliny mléčné, ale také účinně bránit růstu a množení škodlivých mikroorganismů (URIARTE, BOLSEN, BRENT, 2001; ILLEK, 2007). Správná souhra vybraných kmenů bakterií mléčného kvašení umožňuje cílené usměrnění kvasného procesu a zabezpečuje kvalitu fermentace (KOŘÍNEK, 2000). Pro řízenou fermentaci je důležité, aby skladba kmenů BMK umožnila nejen vysokou kvalitu kvašení na počátku silážování při vysokém zastoupení epifytní flóry (Lactobacillus plantarum), ale také v okamžiku ve střední oblasti hodnot ph (Pediococcus pentosaceus) v kombinaci s jinými bakteriemi mléčného kvašení (DOLEŽAL, 2006). Homofermentativní mléčné bakterie řídí cíleně průběh kvasného procesu rychlým snížením ph hodnoty a intenzivní tvorbou kyseliny mléčné. Kombinace s heterofermentativními mléčnými bakteriemi, jejichž cílem je kontrolovaná tvorba kyseliny octové, umožňuje intenzivní mléčné kvašení s odpovídajícím obsahem kyseliny octové (MATHIES, 2002). Nastavení optimálního poměru kyseliny mléčné k octové přináší stabilní siláže s nízkými ztrátami způsobenými sekundární fermentací na ploše řezu a zajišťuje energii také po otevření sila (MATHIES, 2000). Podíl kyseliny octové v siláži stoupá při současné tvorbě propandiolu díky kmenu Lactobacillus buchneri. Tvorbou kyseliny octové a propandiolu je dáno silné inhibiční působení proti kvasinkám a plísňovým kmenům, tím významně klesá zatížení mikroorganismy (MATHIES, 2000). V silážních aditivech se proto nejčastěji vyskytují bakterie mléčného kvašení rodu Lactobacillus plantarum a Lactobacillus casei, které usměrňují zkvašování sacharidů více ke vzniku levotočivého izomeru L (+), než bakterie rodu Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus a Lactobacillus pentosus, které produkují při fermentaci větší podíl kyseliny mléčné pravotočivé D ( ). Z 36

37 fyziologicko-nutričního hlediska je žádoucí, aby se v silážích fermentačním procesem tvořilo více L (+) izomeru laktátu než D ( ), protože přežvýkavci v zažívacím traktu lépe metabolizují L (+) formu (DOLEŽAL 2006). Použití biologických aditiv má na aerobní stabilitu siláží rozdílné účinky (MUCK, BOLSEN, 1991; CAI et al., 1999; HARRISON et al., 1999). Příčinou horší aerobní stability některých inokulovaných siláží je skutečnost, že v anaerobních podmínkách vzniká u homofermentativního kvašení pouze kyselina mléčná, která je v porovnání s kyselinou octovou nebo propionovou, fungistaticky slabší kyselinou (DRIEHUIS et al., 1996). OUDE- ELFERINK et al. (1999) uvádějí, že heterofermentativní bakterie mléčného kvašení (Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroide) zlepšují aerobní stabilitu. Podle PIEPERA (1999) je možné s úspěchem používat jen samotný Lactobacillus plantarum, pokud se současně přidá melasa, jako zdroj pohotové energie. V komerčně vyráběných aditivech se objevují i nesporulující fakultativně anaerobní bakterie rodu Propionibacterium shermani a Propionibacterium jensenii. Tyto bakterie jsou sacharolytické, fermentují sacharidy na kyselinu propionovou, která má vztah na posílení aerobní stability siláží. V této souvislosti je třeba poznamenat, že nelze očekávat na trhu preparát, který by jednoznačně prokazatelně zlepšoval fermentační proces a současně posílil aerobní stabilitu, neboť jde o dva relativně samostatné problémy, i když aerobní stabilita je do určité míry ovlivněna také samotnou úrovní fermentace. V rámci vlastní fermentace jde o posílení zejména homofermentativní složky, zatímco preparáty posilující aerobní stabilitu mají za cíl zvýšit produkci kyseliny octové, která má na kvasinky antifungálně silnější účinky (DOLEŽAL et al., 2002). V případě použití biologicko-chemických preparátů, které obsahují vybrané kmeny bakterií mléčného kvašení a soli aromatických kyselin (sorban draselný, benzoan sodný) je využíváno dvojího-rozdílného konzervačního efektu a sice stimulace mléčného kvašení na straně jedné (bakteriemi mléčného kvašení) a inhibice škodlivých skupin mikroorganismů (plísně a kvasinky) na straně druhé (DOLEŽAL, 2006). Biologické konzervační aditiva zvyšují energetickou hodnotu siláží asi o 5 %, protože snižují ztráty kvašením i u snadno silážovatelných pícnin a lze je s úspěchem použít i pro snížení ztrát vlivem sekundární fermentace (SCHMIDT et al., 1974). V posledních letech se na trhu objevily biologické konzervační prostředky v kombinaci s enzymatickou složkou. KUNG (2009) poukazuje na silážní prostředky 37

38 s enzymy obsahující hlavně celulázy, hemicelulázy, glukoso-oxidázy, amylázy, pektinázy a další), které musí vykazovat schopnost hydrolyzovat cukry v rozmezí hodnot ph od 6,0 do 4,3 (optimum při 5,0). Podle LOUČKY a MACHAČOVÉ (1996) by měly enzymy v biologických aditivech vést ke snížení obsahu vlákniny v silážích a zvýšení energetické hodnoty siláže se současným zvýšením stravitelnosti celé krmné dávky. Při aplikaci enzymatických preparátů v odpovídajícím množství dochází ke štěpení buněčné stěny, celulózy, hemicelulózy a tím se zvyšuje obsah fermentovatelného substrátu, čímž také nepřímo napomáhají ke snížení hodnoty ph (NEHRING et al., 1983) Ostatní přísady Močovina (CO(NH 2 ) 2 ) se získává chemickou reakcí dle následujících rovnic: Exotermní reakce CO NH 3 NH 2 COONH 4 Endotermní reakce NH 2 COONH 4 NH 2 CONH 2 + H 2 O Močovina je diamid kyseliny uhličité, tedy pravý amid. Je nebílkovinnou dusíkatou sloučeninou, kterou lze použít také jako konzervační prostředek při silážování sacharidových krmiv chudých na dusíkaté látky, zejména silážní kukuřice. Obsah dusíku v močovině je vysoký 46,6 % ( SCHMIDT, WETTERAU et al., 1974). Močovina jako taková nemá žádný konzervační účinek, neboť reaguje chemicky neutrálně. Konzervační účinky mají jednak amoniak, ale také oxid uhličitý, které vznikají enzymatickou hydrolýzou močoviny. Uvolněný amoniak se váže na kvasné organické kyseliny za vzniku amonných solí těchto kyselin. Stupeň hydrolýzy je závislý zejména na vlhkosti silážované hmoty, aplikační dávce, obsahu sacharidů v píci a ph siláže. Močovina se hydrolyzuje ureázou pokud hodnota ph je vyšší než 4,5 (PIEPER, 1999). Následkem silné alkalizace probíhá tvorba kvasných kyselin v amonizovaných silážích v prvních 3 5 dnech po naskladnění pomaleji než v neošetřených silážích, ale v dalších dnech fermentace dochází k výrazným změnám ve prospěch čpavkovaných siláží (DOLEŽAL, 2006). Podle zjištění BAINTNERA et al. (1985), se tyto amonné soli považují za vhodné nebílkovinné sloučeniny a současně slouží také jako energetický zdroj pro bakterie mléčného kvašení. 38

39 Močovina jako konzervační přísada současně zvyšuje nutriční hodnotu, zejména obsah dusíkatých látek (BAINTNER et al. 1985; BIRNKAMMMER, 1985; O KIELY, 1998) a může jej dokonce i zdvojnásobit. Řepná melasa je používána jako silážní přísada při konzervaci středně a obtížně silážovatelných pícnin a pícnin s nízkým obsahem pohotových sacharidů. Rovněž zředěná vodou se používá ke zvlhčování silážního materiálu kukuřice o vyšší sušině. Melasa je přidávána k silážované rostlinné biomase v ředěném stavu (ředění 1:5 až 1:10) v množství 30 až 50 l/t hmoty (DOLEŽAL, 2006). Je důležité dodržet dávkování a přesnou aplikaci, jelikož hrozí nebezpečí zbytkových sacharidů a následná aerobní nestabilita výsledné siláže. Aplikace takovéhoto množství bývá problematická, proto se z tohoto důvodu od její plošného použití upustilo. Syrovátka je používána jako silážní přísada v tekuté formě nebo jako suchý prášek podporující mléčné kvašení. Sladká syrovátka v tekutém stavu se používá v množství 20 až 30 l/t silážované hmoty, zejména s vyšším obsahem sušiny. Sušená syrovátka je přidávána při silážování obtížně silážovatelných pícnin v množství 2 až 3 kg/t hmoty podle obsahu sušiny. Přídavek syrovátky působí příznivě na kvalitu fermentačního procesu, posiluje mléčné kvašení, zrychluje snižování hodnoty ph, snižuje produkci kyseliny octové, alkoholu a inhibuje tvorbu nežádoucí kyseliny máselné (DOLEŽAL, 2006) Aerobní nestabilita siláží Aerobní znehodnocení siláží zůstává i v současné době velkým technickým problémem. Je snaha o zlepšení aerobní stability siláží spočívající v možnostech inhibice kvasinek a plísní (pomocí organických kyselin nebo biologických inokulantů, které produkují ve větší míře kyselinu propionovou nebo octovou), ale také dodržováním technologických zásad. Rychlá a dostatečná acidifikace je považována za základní předpoklad dobré stability siláží (KIELY, MUCK, 1992; PITT et al., 1991). Je také prevencí proti růstu a množení nežádoucích anaerobních mikroorganismů. Udává se, že aerobní nestabilita je provázena mikrobiálním zahříváním siláže, nárůstem nežádoucí mikroflóry, zvýšenou ztrátou sušiny a produkcí oxidu uhličitého. Nežádoucí aerací siláže v důsledku nesprávného odběru nebo špatným uzávěrem skladu siláže, dochází k nevyhnutelným ztrátám sušiny a ostatních nutričně významných živin (KUNG et al., 1999). Celkové ztráty jsou zvýšeny ještě navíc metabolizací kyseliny mléčné a 39

40 ve vodě rozpustných cukrů. Současně dochází k zahřívání uskladněné biomasy a odkyselování konzervované hmoty (HOLZER et al., 1999: cit. URIATE et al., 2001). Řada autorů se dříve snažila zlepšit aerobní stabilitu siláží usměrněním fermentačního procesu především pomocí chemických aditiv (WOOLFORD, 1975; 1978; KALAČ, 1980; OHYAMA, McDONALD, 1975; WEISSBACH et al., 1991 a další) většinou na bázi organických kyselin. Velká pozornost je v současné době věnována zejména biologickým inokulantům s obsahem Lactobacillus brevis a buchneri, které mají podle výsledků řady prací pozitivní efekt na aerobní stabilitu. Přídavek těchto inokulantů vede nejen ke zvýšení antifungální kyseliny octové, tvorbě 1, 2 propandiolu, ale také ke snížení kvasinek a tím k omezení následné fermentace (DOLEŽAL, 2006). Jeden z prvních laboratorních systémů k posouzení aerobní stability vyvinuli WOOLFORD et al. (1977). Tento systém je založený na vyhodnocení vzájemných vztahů mezi ztrátou sušiny, přírůstky teplot a produkcí CO2. Posouzení aerobní stability siláží s vyhodnocením vlivu biologických inokulantů je možné provést také podle matematického modelu (MUCK et al., 1991) Aerobní nestabilita a spontánní záhřev kukuřičné siláže Druhotná fermentace je nežádoucí, neboť způsobuje degradaci živin (energie, bílkovin a všech oxilabilních složek) a je příčinou silného zahřívání, jehož následkem je výrazné pomnožení nežádoucích aerobních mikroorganismů zhoršujících hygienickou jakost siláží. Silážní kukuřice se ve srovnání s jinými pícninami výrazně liší nejen svým složením (vyšším obsahem sacharidů, vysokou koncentrací škrobu, nízkým obsahem pufrujících látek), ale také kvantitativně a kvalitativně odlišným zastoupením epifytní mikroflóry. V epifytní mikroflóře je oproti jiným pícninám výrazně zastoupena populace kvasinek, které jsou původci zahřívání silážované hmoty a destabilizace již hotové siláže (DOLEŽAL, 2006). Aerobní stabilitu siláží nejvíce ovlivňují podle (BOLSENA, URIARTE, 2001) faktory v následujícím pořadí: teplota obsah sušiny a lehce rozpustných sacharidů stav a složení mikrobiální populace množství a poměr fermentačních produktů v interakci s hodnotou ph technika vybírání siláží a způsob zkrmování. Základním preventivním opatřením proti vzniku druhotné fermentace je zamezit pronikání přítomného vzduchu do siláží a činnosti kvasinek fermentovat zbytkové sacharidy za vzniku sekundárních metabolitů a tepla. 40

41 Nejčastější příčinou zahřívání a následného kažení siláží zejména v teplejším ročním období jsou také malá množství denně odebíraných krmiv a nesprávný způsob odběru. Rozsah znehodnocení siláží vlivem infiltrace vzduchu závisí především na rychlosti pronikání vzduchu do siláže, která je ovlivněna porézností hmoty, tedy kompaktností, úrovní dusání, délkou řezanky, ale také vegetačním stadiem. Také vysoká teplota vnějšího prostředí negativně ovlivňuje aerobní stabilitu. Teplota přes 30 C podporuje aktivitu nežádoucích mikroorganismů. K nežádoucímu rozkladu však může docházet i při relativně nízkých teplotách C (DOLEŽAL, 2006). OHYAMA et al. (1975) zjistili, že siláže, které byly stabilní při teplotách C zpravidla obsahovaly vyšší obsah kyseliny propionové (0,28 0,46 % v sušině), nebo máselné (0,56 0,92 % sušiny). Podle REESE (1982) dochází při zvýšení teploty o 10 C nad hodnotu 21 C ke ztrátám vlivem aerobního kažení siláže až 1,7 % sušiny za den. V neposlední řadě se také uplatňují chemické protiplísňové konzervanty na bázi kyseliny propionové a mravenčí na ošetření stěny siláže. Ty blokují rozvoj nežádoucí aerobní mikroflóry. Aplikují se v dávce 0,5 1 l/m 2, mají však pouze preventivní význam Kvasinky a aerobně nestabilní siláže Kvasinky v porovnání s mléčnými bakteriemi se vyskytují v silážované píci v mnohem větším množství. Zkvašují sacharidy na aromatické alkoholy, organické kyseliny a oxid uhličitý, což má příznivý vliv na vůni a částečně i chuť siláže. Pozitivní efekt kvasinek spočívá pouze v počáteční fázi kvašení, kdy se kvasinky podílejí na rychlejší spotřebě kyslíku v silážovaném materiálu a tím i na vytvoření anaerobního prostředí. Činnost kvasinek má i negativní vlivy, jelikož vážně konkurují mléčným bakteriím. Kvašení je doprovázeno značnou ztrátou hmoty (až 49 %) a silnou tvorbou plynů a tepla (JAKOBE et al., 1987). Zvláštností této skupiny je skutečnost, že několik jejich druhů je uzpůsobeno k látkové přeměně jak v aerobním prostředí, tak i při kvašení v anaerobních podmínkách a tím se mohou vyskytnout i v silážích po otevření (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, 2000). Siláže aerobně nestabilní zpravidla obsahují kvasinky, které se nacházejí již v průběhu fermentační fáze, např. Torulopsis spp., Saccharomyces spp., Hansenula anomala, Cryptococccus lambica a další (McDONALD et al., 1991). Kvasinky jsou velmi tolerantní vůči nízkým hodnotám ph a jsou schopné přetrvávat v latentním stavu ve skladovací anaerobní fázi v uzavřených silech. Pokud se překročí kritická hodnota zárodků kvasinek, pak se kvasinky rychle vyvíjejí a po otevření způsobují 41

42 intenzivním dýcháním zvýšení teploty v siláži. Rychle a přednostně využívají zásoby reziduálních sacharidů za současného vzniku alkoholu, odbourávají již vzniklou kyselinu mléčnou, čímž siláže destabilizují (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, 2000). Jak pravé kvasinky (rod Saccharomyces, Hansenula), tak nepravé kvasinky (Torulopsis, Candida), patří k hlavním původcům následné fermentace siláží po jejich otevření. Má-li v průběhu silážovacího procesu přístup vzduch, dochází k rozvoji jiných populací kvasinek. Jde o kvasinky metabolizující kyseliny (Candida, Hansenula, Pichia a Endomycopsis), zatímco kvasinky rodů Torulopsis fermentují přednostně cukry (WOOLFORD, 1990). Při užití kyseliny mravenčí může být vyrobena velmi nestabilní siláž, pokud v silážované hmotě jsou přítomny velká kvanta kvasinek (OHYAMA, McDONALD, 1975). JONSSON (1989) zjistil po přídavku kyseliny mravenčí stimulaci rozvoje kvasinek, neboť se zvýšil obsah reziduálních cukrů ve výsledné siláži. Již HENDERSON, et al. (1972) pozorovali intenzivnější růst kvasinek v silážích ošetřených kyselinou mravenčí. Rychlá a dostatečná acidifikace je považována za základní předpoklad dobré stability siláží (KIELY, MUCK, 1992; PITT, et al. 1991), ale také za prevenci proti růstu a množení nežádoucích anaerobních mikroorganismů (HENDERSON, et al. 1972; OHYAMA, McDONALD, 1975; URIARTE, et. al. 2001). Výrazným inhibitorem aerobních změn je kyselina propionová, ale její finanční nákladnost neumožňuje její širší použití (WOOLFORD, 1975; BRITT, et al. 1975; CRAWSHAW, et al a další). Za tímto účelem byla vyvinuta četná silážní aditiva, která mají za úkol zdokonalit fermentační proces a zvýšit nutriční hodnotu (WEINBERG, et al. 1993), ale zároveň se také od nich očekává, že omezí riziko aerobního rozkladu (URIATE, et al. 2001). Z tohoto důvodu je velká pozornost v současné době věnována zejména biologickým inokulantům s obsahem heterofermentativních kmenů Lactobacillus brevis a buchneri, které mají podle výsledků řady prací (DRIEHUIS, et al. 1996; PFLAUM, et al. 1999; GALLO, et al a další) pozitivní efekt na aerobní stabilitu. Přídavek těchto inokulantů vede nejen ke zvýšení antifungální kyseliny octové, tvorbě 1, 2 - propandiolu, ale také ke snížení počtu kvasinek a tím k omezení následné fermentace. 42

43 Plísně a toxiny v aerobně nestabilních silážích Plísně jsou zcela nežádoucí mikroorganismy, jejichž vyšší výskyt je spojen s nedostatečnou technologickou kázní a zároveň jsou i signálem nízké hygienické kvality. Plísně jsou přísně aerobní mikroorganismy, proto je jejich vyšší výskyt zaznamenáván vždy v povrchových vrstvách siláží (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, 2000). Plísně vytvářejí vláknité ložiska, nebo povlaky. Rozmnožují se zpravidla vegetativně prorůstáním hyf, nebo spor. Rozvoji plísní lze zabránit dostatečným vytěsněním vzduchu ze silážované píce a dokonalým neprodyšným uzavřením silážního prostoru (VÍTEK, HRABĚ, 1986). K rozvoji plísní dochází běžně v pokročilém stadiu sekundární aerobní fermentace hmoty (HITZGER et al., 2003). Mykotoxiny, zejména aflatoxiny, snižují s bachoru přežvýkavců produkci těkavých mastných kyselin, negativně ovlivňují produkci mléka, konverzi krmiv vlivem poruchy metabolismu inhibují i proteosyntézu, metabolismus lipidů, zvyšují aborty plemenic (MUDŘÍK, DOLEŽAL, KOUKAL et al., 2006). Kontaminaci siláží způsobuje mnoho rodů plísní (Fusarium, Aspergillus, Mucor, Penicillium, Monilla), z nichž některé se množí za vlhkého počasí již na rostlinách ještě před sklizní. PAVLOK et al. (2008) ve své práci stanovoval obsah mykotoxinů v původní silážované hmotě konvenčních hybridů a hybridu GMO Bt kukuřice. Dospěl k závěru, že obsah mykotoxinů na rostlinách je ovlivněn nejen stanovištěm, úhrnem srážek v daném roce, ale i mírou poškození samotných rostlin kukuřice. Jak potvrzuje ve svém pokuse snížením obsahu DON a ZON na rostlinách hybridu Bt kukuřice. Z výsledků výzkumu je známo, že některé druhy plísní (Penicillium roquerti) jsou resistentní i vůči nízkému obsahu kyslíku (WILKINSON, 2005) a mohou se proto vyskytnout i v hotových silážích. Plísním nevadí ani kyselé prostředí a vyskytují se i v silážích s velmi nízkou hodnotou ph. Plísně také metabolizují nejen sacharidy, bílkoviny, ale i již vytvořenou kyselinu mléčnou a patří mezi velmi silné konkurenty bakterií mléčného kvašení. Nežádoucí činností plísní vzniká v silážích řada produktů bazické povahy (amoniak, aminy), čímž dochází k odkyselení siláže a tím i k její destabilizaci (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, 2000). Vyšší výskyt kolonizujících hub v silážích z pomrzlé kukuřice diagnostikovali ČERMÁK a VAČKÁŘ (1987), BARANČIC (1982), BARANČIC a PŘIKRYL (1987), DOLEŽAL a DVOŘÁČEK (1997). Dochází zde k potrhání rostlinných pletiv vlivem mrazu a následně k rychlému napadání plísněmi. 43

44 Vedle negativního dopadu na kvalitu krmiv mají plísně nesporně škodlivý účinek na zdraví chovaných zvířat. Závažná je zejména přítomnost plísní produkujících mykotoxiny (SOMMER et. al., 1994). Metabolity plísní toxiny, mohou přetrvat celý silážní proces. Pravděpodobnější je ale vznik mykotoxinů až při aerobní přestavbě v povrchových vrstvách siláží, respektive po otevření silážních žlabů zvláště u kukuřičných siláží, tedy vlivem následné fermentace (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, 2000). Mykotoxiny jsou toxické látky nebílkovinné povahy produkované patogenními druhy plísní, z nichž nejvýznamnější jsou rody Aspergillus, Penicillium a Fusarium (OSWEILLER, 2000). Je třeba upozornit, že korelační závislost mezi obsahem spor plísní a obsahem mykotoxinů v krmivu, je poměrně malá. Většina mykotoxinů je mimořádně stabilní, persistující dlouhou dobu v substrátu i potom, co vegetativní houby nemusí být již v siláži přítomny. U siláží bylo zjištěno, že vytvořené mykotoxiny mohou přestát celý fermentační proces, aniž by byly inaktivovány. Podle SUCHÉHO a HERZIGA (1998), KALAČE a MÍKY (1997) mohou produkovat různé kmeny téhož druhu více než jeden typ mykotoxinu a naopak jeden typ mykotoxinu může být tvořen různými druhy plísní. Také LEPOM et al. (1990) zjistili schopnost tvorby zearalenonu a trichotecenů typu A u 45 % kmenů rodu Fusarium, izolovaných z kukuřičné siláže. Z uvedeného vyplývá, že siláže, zejména kukuřičné, jsou z pohledu výskytu mykotoxinů, vážným potenciálním rizikem, které je v praxi velmi často podceňováno. Mykotoxiny negativně ovlivňují imunitní systém organismu a některé (např. zearalenon) mají i estrogenní účinek. Zearalenon je lakton kyseliny resorcyklické a je ligandem pro receptory estrogenů v různých cílových tkáních. Metabolity tohoto mykotoxinu mají dokonce několikanásobně vyšší estrogenní účinek, než původní Zearalenon (ILLEK, MATĚJÍČEK, 2002). Podle BOLSENA (1993) jsou závažné ty siláže, ve kterých populace plísní dosáhly počtu CFU/g siláže. Plesnivá krmiva, tedy i siláže by proto zásadně neměla být zkrmována zvířatům, které upravuje (NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) Č. 1126/2007), kterým se upravuje nakládání a likvidace takto znehodnocených krmiv. Přenos mykotoxinů z krmiv do živočišných produktů představuje vážný problém i pro samotnou lidskou populaci. 44

45 Zkrmování aerobně nestabilních kukuřičných siláží Aerobní rozklad siláže je složitý biochemický proces, na který působí celá řada faktorů, nejen kyslík (jak jeho množství, tak také doba expozice), složení mikrobiální populace, typ substrátu (např. obsah živin v siláži), stádium zralosti píce v době sklizně, stupeň zhutnění siláže, teplota vnějšího prostředí, ale i teplota silážní hmoty (URIARTE et al., 2001). Aerobní fermentace vzniká působením kvasinek a plísní. Rozpustné sacharidy, škrob i kyselina mléčná jsou rychle rozkládány, dochází k narušení proteinů i k tvorbě nejrůznějších metabolitů histaminu a mykotoxinů. Energetická hodnota siláží se snižuje, dochází k zahřátí krmiva, ke změně vůně a chutnosti (ILLEK, MATĚJÍČEK, 2002). Aerobně nestabilní siláž působí stresově na průběh trávení v bachoru zvířat, zejména snížením populace bachorové mikroflóry a samotným působením na vlastní průběh trávení. Je popsána výrazná redukce dobrovolného příjmu sušiny krmné dávky s významným dopadem na změny obsahu mléčných složek (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, ZEMAN, 2004). Metabolické poruchy skotu se vyskytují v závislosti na stupni aerobního narušení siláže a době jejího zkrmování. Rovněž musíme přihlížet na celkový obsah kvasných kyselin v siláži. Zpravidla bává zvýšený obsah těchto kvasných kyselin v silážích s nízkým obsahem sušiny, kdy celkový denní příjem kyselin nesmí přesáhnout 2 molů na 100kg živé hmotnosti ( JÄGER, PŘIKRYL, VOJTÍŠEK, 1985). Celkové množství kyselin v molech (K) se vypočítá podle obsahu jednotlivých kvasných kyselin v 1kg siláže dle vzorce: kys. Mléčná (g) kys. Octová (g) kys. Máselná (g) K= Nutností úpravy ph siláže i celých krmných dávek při častém problematickém dodržení struktury krmné dávky se zabýval ČERMÁK (1992). Uvádí, že siláže s ph pod 4,0 při současném zařazení vyššího podílu jádra, dochází k vyplavování bazických látek z těla a tím k ohrožení zdravotního stavu a reprodukčních ukazatelů zvířat. K zajištění požadavku na dobrou hygienickou kvalitu siláží je důležité, aby odebrané siláže byly co možná nejrychleji zkrmeny a zamezilo se dalšímu nežádoucímu meziskladování (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, ZEMAN, 2001). Sekundárně fermentovaná silážní hmota je dále živnou půdou pro plísně. Množení plísní vede ke zvýšení ph hodnoty, čímž se vytváří vhodné podmínky pro rozmnožování dalších patogenů, především Escherichií 45

46 colli, Klostridií, Listerií a dalších (ILLEK, MATĚJÍČEK, 2002). Vedle negativního dopadu na kvalitu krmiv mají plísně nesporně škodlivý účinek na zdraví chovaných zvířat. Závažná je zejména přítomnost plísní produkujících mykotoxiny (HITZGER, et al., 2003). URIATE, BOLSEN, BRENT (2001) uvádějí, že plísně mění chuť a nutriční profil siláží. Jejich působením dochází ke ztrátě sacharidů a k nečekaným změnám v obsahu vitamínů. Nejhorší ekonomický dopad má rozklad bílkovin, který množení plísní doprovází. Pokles příjmu živin a jejich snížený obsah v narušeném krmivu mají negativní vliv na užitkovost zvířat. BARANČIČ, JAKOBE a HARTMAN (cit. KALAČ, 1983) naopak poukazují na zchutňující účinek kukuřičné siláže s obsahem alkoholu do 1%. Avšak v silážích s vysokým obsahem ethanolu dochází k nízké aerobní stabilitě s rychlým zahříváním. Rovněž (DRIEHUIS, GIFFEL, 2009) poukazují na četnost výskytu plísní v kukuřičných siláží. Sledovali 168 vzorků kukuřičných siláží, kde 81% vzorků siláží obsahovalo DON nad krmné doporučení (maximum 969 µg/kg krmiv). Siláže obsahovali také ZEA a to v 46% vzorků (203 µg/kg krmiva). 46

47 3. Cíl práce Cílem disertační práce bylo posoudit a vyhodnotit vliv testovaných mikrobiálních a chemických silážních aditiv na kvalitu fermentačního procesu a aerobní stabilitu modelových siláží z kukuřice seté (Zea mais). Dílčím cílem práce bylo také v modelovém pokuse studovat vliv doby skladování a přídavku silážního inokulantu na dynamiku a kvalitu fermentačního procesu hybridu kukuřice Bt (GMO). K řešení bylo využito finančních prostředků z grantu IGA MZLU v Brně IG /2102/222 Vliv silážních inokulantů na dynamiku fermentačního procesu siláží z Bt kukuřice (GMO). 47

48 4. Materiál a metodika Při řešení této disertační práce byly provedeny čtyři modelové pokusy s využitím silážních aditiv pro konzervaci a posílení aerobní stability výsledných kukuřičných siláží. V prvních třech pokusech byl analyzován výsledný fermentační proces a aerobní strability. Ve čtvrtém pokuse s Bt GMO hybridem kukuřice byl sledován průběh fermentace a její aerobní stabilita Metodický postup v pokusech 1., 2., 3. a 4. Silážní hmota byla homogenně ošetřena aditivy v dávkách doporučené výrobcem a zasilážována do pokusných nádob o objemu 50 l. Do každé pokusné nádoby bylo udusáno stejné množství kukuřičné hmoty na přepočtenou průměrnou objemovou hmotnost 800 kg.m - 3. Homogenně ošetřená silážovaná hmota byla zasilážována ve třech opakováních. Pokusné kvasné nádoby byly anaerobně uzavřeny víkem a uskladněny v místnosti při teplotě C v laboratorních podmínkách na Ústavu výživy zvířat a pícninářství MZLU v Brně. Po 6 měsících byly nádoby otevřeny, z každé varianty odebrány reprezentativní vzorky (6) na analytické posouzení fermentačního procesu. Odběry vzorků siláží a vlastní analýzy byly provedeny podle Vyhlášky č. 214/2007, kterou se stanoví požadavky na odběr vzorků a principy metod laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek premixů a způsob uchovávání vzorků podléhajících zkáze. U takto odebraných vzorků byly stanoveny ztráty organické hmoty a dopočteny ztráty sušiny během fermentace. Výsledky byly statisticky zpracovány metodou jednofaktorové analýzy variance podle SNEDOCORA a COCHRANA (1967) Modelový pokus se silážováním kukuřice hybridu Romario Silážní kukuřice hybrid Romario FAO 250 byla pěstována v zemědělském podniku ZD Radostín, okres Havlíčkův Brod. Zemědělské družstvo se nachází v nadmořské výšce 570 m. n. m., v bramborářské výrobní oblasti. Půdní typ je zde hnědozem, z hlediska půdního 48

49 druhu se tyto půdy řadí mezi hlinito-písčité. Průměrná roční teplota na stanovišti byla 7,1 C a průměrné roční srážky byly 675 mm. Předplodina pro rok 2006 byla ozimá pšenice. Kukuřice byla zaseta po předchozí předseťové přípravě půdy a hnojení Amofos 100 kg pod patu, 52 kg P 2 O 5, síran amonný 20 % N 400 kg/ha a DAM na list 34 % N 170 kg/ha. Rostliny byly preemergentně ošetřeny herbicidními přípravky Merlin 130 g, Tophi 1,2 l a Click 1,0 l v dávce 400 l vody na hektar. Dále byl v průběhu vegetace použit insekticidní postřik Integro 0,7 l v dávce 420 l vody/ha. Sklizeň proběhla pomocí sklízecí řezačky New Holland FX 375 dne Kukuřičný hybrid Romario měl při sklizni průměrný obsah sušiny 265,2 g.kg -1 silážované hmoty. Délka řezanky byla dlouhá v průměru 1,1 cm. V modelovém pokusu byly použity mikrobiální inokulanty: LAL FR a LAC NB a chemické přídavky KEM PL v dávce 1 l/t, KEM PL v dávce 2 l/t a byly porovnány s neošetřenou kontrolní siláží na ukazatele kvality fermentačního procesu a aerobní stability. Mikrobiologickou analýzou byl sledován počet kvasinek, plísní, celkový počet mikroorganismů a počet bakterií mléčného kvašení. Inkubace byla provedena v den odběru a v následujících třech dnech. Po provzdušnění byly u siláží měřeny teploty po dobu 3 dnů Modelový pokus kukuřice hybridu Sabre Kukuřice na siláž hybridu Sabre byla pěstována v zemědělském podniku ZD Zbraslav a.s. okres Brno-venkov. Zemědělské družstvo se nachází v nadmořské výšce 420 m. n. m., v oblasti typické pro pěstování kukuřice na siláž. Půdní typ je zde hnědozem, z hlediska půdního druhu se řadí mezi písčito-hlinité. Průměrná roční teplota na stanovišti byla 7,5 C a průměrné roční srážky byly 635 mm. Předplodina pro rok 2006 byla pšenice jarní. Kukuřice byla zaseta po předchozí předseťové přípravě půdy a hnojení Amofos 100 kg pod patu, 52 kg P 2 O 5, síran amonný 20 % N 400 kg/ha a DAM na list 34 % N 170 kg/ha. Rostliny byly preemergentně ošetřeny herbicidními přípravky Calisto a Guardian v dávce 1,2 l a 1,0 l/ 450 l vody na hektar. Sklizeň proběhla pomocí sklízecí řezačky Claas Jaguar 840 dne Kukuřičný hybrid Sabre měl při sklizni průměrný obsah sušiny 334,9 g.kg -1 silážované hmoty. V modelovém pokuse byly použity chemické konzervanty: MOC v dávce 2,5 kg/t, MOC v dávce 5 kg/t, KOF LQ v dávce 3 l/t a KEM PL v dávce 3,5 l/t v porovnání s neošetřenou kontrolní siláží na ukazatele kvality fermentačního procesu a aerobní stability. 49

50 Mikrobiologicky byl sledován počet kvasinek, plísní, celkový počet mikroorganismů a počet bakterií mléčného kvašení. Inkubace byla provedena v den odběru a v následujících třech dnech. Po provzdušnění byly u siláží měřeny teploty po dobu 3 dnů Modelový pokus se silážováním kukuřice hybridu TXP 939 A-V Kukuřičný hybrid TXP 939 A-V FAO 300 byl pěstován ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby (VÚRV) v Ivanovicích na Hané. Lokalita Ivanovice na Hané se nachází v nadmořské výšce 225 m. n. m., v oblasti typické pro pěstování kukuřice na zrno s pravidelným vysokým výskytem zavíječe kukuřičného. Půdní typ je zde černozem modální, z hlediska půdního druhu se řadí mezi hlinité. Průměrná roční teplota na stanovišti byla 9,2 C a průměrné roční srážky byly 548 mm. Hybrid TXP 939 A-V je geneticky modifikovaná kukuřice s vneseným genem z půdní bakterie Bacillus thuringiensis, který vedle odolnosti vůči zavíječi kukuřičnému vyniká také dobrou odolností proti helmintosporióze a sněti kukuřičné. Předplodina pro rok 2006 byla ozimá pšenice. Kukuřice byla zaseta po předchozí předseťové přípravě půdy a hnojení N/P/K 15/15/15 v dávce 300 kg/ha. Rostliny byly preemergentně ošetřeny herbicidními přípravky s účinnými látkami acetochlor 760 g a dichlormid 128 g v dávce 1,2 l/ 420 l vody, dále pak preparátem s účinnou látkou isoxaflutole 750 g v dávce 130 g/ 420 l vody a posledním herbicidním prostředkem byl přípravek na bázi terbuthylazinu 500 g v dávkování 1 l/ 420 l vody. Sklizeň byla provedena strojem Claas Jaguar 840 dne Kukuřičný hybrid měl při sklizni průměrný obsah sušiny 273,2 g.kg -1 silážované hmoty. Délka řezanky byla v rozmezí 8 15 mm. Byl založen modelový pokus s použitím aditiv: LAC FX, BON SG a KOF LQ, které byly porovnány s neošetřenou kontrolou. Mikrobiologicky byl sledován počet kvasinek, plísní, celkový počet mikroorganismů a počet bakterií mléčného kvašení. Inkubace byla provedena v den odběru a v následujících třech dnech. Po provzdušnění byly u siláží měřeny teploty po dobu 3 dnů Modelový pokus s Bt kukuřicí hybridu Kuratus Silážní kukuřice hybridu Kuratus Bt kukuřice GMO (FAO 260), byla pěstována v zemědělském podniku Agrodružstva Měřín a.s. Lokalita obce Měřín se nachází v nadmořské výšce 510 m. n. m., v oblasti typické pro pěstování kukuřice na siláž. Půdní typ 50

51 je zde hnědozem, z hlediska půdního druhu se řadí mezi hlinito-písčité. Průměrná roční teplota na stanovišti byla 7,8 C a průměrné roční srážky byly 610 mm. Předplodina pro rok 2006 byla řepka ozimá. Kukuřice byla zaseta po předchozí předseťové přípravě půdy a hnojení N/P/K 15/15/15 v dávce 300 kg/ha. Rostliny byly preemergentně ošetřeny herbicidními přípravky Calisto a Guardian v dávce 1,2 l a 1,0 l/ 420 l vody na hektar. Sklizeň proběhla dne pomocí sklízecí řezačky Claas Jaguar 890. Modelový pokus s kukuřičným hybridem Kuratus Bt kukuřice GMO (FAO 260), byl založen v laboratorních podmínkách na Ústavu výživy zvířat a pícninářství MZLU v Brně. Kukuřičný hybrid Kuratus měl při sklizni průměrný obsah sušiny 304,9 g.kg -1. silážované hmoty. V pokusu byl testován vliv silážních aditiv,, LAL 01, BIO PR a,,lac NB na ukazatele kvality fermentačního procesu a aerobní stabilitu ve srovnání s neošetřenou kontrolní variantou. Homogenně ošetřená silážovaná hmota byla zasilážována do skleněných nádob o objemu 5 l. Do každé pokusné nádoby bylo udusáno stejné množství kukuřičné hmoty na přepočtenou průměrnou hmotnost 800 kg.m -3. Pokusné kvasné nádoby byly anaerobně uzavřeny víkem a uskladněny v místnosti při teplotě C. Odběry siláží a hodnocení fermentačního procesu byly provedeny vždy 4., 32., a 64. den od zasilážování a analyzovány na ukazatele fermentačního procesu. Po provzdušnění byly u siláží měřeny teploty a poté posuzována aerobní stabilita následujících 3 dnech. Mikrobiologicky byl sledován počet kvasinek, plísní, celkový počet mikroorganismů a počet bakterií mléčného kvašení. Inkubace byla provedena v den odběru a v následující tři dny. Po provzdušnění byly u siláží měřeny teploty po dobu 3 dnů Pokusný materiál Pokusným materiálem byly vybrané kukuřičné hybridy: 1. Romario (FAO 250) Romario je raný dvouliniový hybrid na siláž i zrno. Je vhodný pro všechny směry užití zejména v řepařské, obilnářské, ale i v bramborářské výrobní oblasti. Má rychlý počáteční růst s rovnoměrně dozrávajícím zbytkem rostliny. Optimální sušina pro silážování %. Flexibilní typ palice až s 600 zrny nám zaručuje až 36 % podíl škrobu v siláži. Špičkový výnos suché hmoty a energie s velmi dobrou stravitelností organické hmoty nám dává 51

52 maximální výnos energie z hektaru. Tento intenzivní hybrid je zároveň velmi tolerantní k agroekologickým podmínkám. Hustota porostu by měla být při sklizni na siláž tisíc rostlin na ha, na zrno 75 tisíc rostlin na ha. 2. Sabre (FAO 230) Sabre (FAO 230) je velmi raný hybrid na siláž i zrno. Na živinově a vláhově jistých stanovištích se může chovat jako hybridy se stay green efektem. Tento hybrid má pevné stéblo s rovnoměrně zrajícím zbytkem rostliny. Je odolný vůči kořenovému polehávání. Pěstuje se v bramborářské a řepařské oblasti, kdy hustota porostu by měla být při sklizni na siláž tisíc rostlin na ha a 75 tisíc rostlin na ha při pěstování na zrno. Optimální sušina pro silážování je %. Poskytuje nám vysoký výnos suché hmoty a energie s velmi dobrou stravitelností organické hmoty. 3. TXP 939 A V (FAO 300) TXP 939 A V (FAO 300) je raný dvouliniový hybrid Bt GMO kukuřice. Je to středně raný hybrid pro sklizeň na siláž i zrno. Vyniká dobrou odolností proti helmintosporióze a sněti kukuřičné. Je určen pro všechny pěstitele, kteří chtějí zdravý a vyrovnaný porost kukuřice. Jeho využití výnosového potenciálu je v kukuřičné a řepařské výrobní oblasti, především na siláž, ale je možné jej sklízet i na zrno. Optimální sušina pro sklizeň na siláž je %. 4. Kuratus (FAO 260) Kuratus (FAO 260) je Bt hybrid. Je odolný vůči zavíječi kukuřičnému Ostrinia nubilalis a proto není nutná chemická ochrana proti tomuto škůdci. Vysoká rostlina poskytuje velmi dobrý výnos silážní hmoty s výbornou stravitelností. Jeho hlavní využití je v obilnářské a řepařské výrobní oblasti, především na siláž, ale je možno jej využít též na zrno. Vyznačuje se efektivním postavením listů s bohatým olistěním. Tento hybrid je tolerantní k občasným přísuškům během vegetace. Na vláhově jistých stanovištích má sklon ke stay green efektu s rovnoměrně zrajícím zbytkem rostliny. Je odolný vůči chladu. Pro snížené riziko výskytu houbových chorob je velmi vhodný pro výrobu siláže. Silážuje se při sušině %. 52

53 4.3. Charakteristika použitých silážních aditiv v pokusech Charakteristika biologických silážních aditiv použitých v pokusech Inokulant MIC EP obsahuje vybrané kmeny homofermentativních a heterofermentativních bakterií mléčného kvašení Lactobacillus plantarum (DSM ,5*10 10 ), Lactobacillus casei (DSM ,5*10 10 ), Enterococcus faecium (DSM ,5*10 10 ), Pediococus pentosaceum (DSM ,5*10 10 ), Lactobacillus buchneri (DSM ,5*10 10 ), ostatní složky sušená syrovátka, sacharóza a laktóza. Koncentrace 1,5*10 5 CFU/g píce. Dávkování přípravku 10 g/t píce. Inokulant LAL 01 obsahuje vybraný kmen homofermentativních bakterií mléčného kvašení Lactobacillus plantarum DSM 18/5U 3,5*10 10 a kmen propionových bakterií Propionibacterium acidipropionici DSM 126/4U 3* Koncentrace 3*10 5 CFU/g píce. Dávkování přípravku 5 g/t píce. Inokulant LAL FR obsahuje vybraný kmen heterofermentativních bakterií mléčného kvašení Lactobacillus buchneri DSM * Koncentrace 3*10 5 CFU/g píce. Dávkování přípravku 5 g/t píce. Silážní aditivum LAC NB obsahuje jako účinnou složku vybrané 4 kmeny homofermentativních bakterií mléčného kvašení ve složení Lactobacillus plantarum (DSM ,67*10 10 ), Lactobacillus lactis (DSM ,67*10 10 ), Enterococcus faecium (DSM ,67*10 10 ), Pediococcus pentosaceus (DSM ,67*10 10 ), ostatní složky celuláza a hemiceluláza 0,078 IU na g/silažované hmoty, benzoan sodný 288g/t silážované hmoty. Koncentrace 2*10 5 CFU/g píce. Dávkování přípravku: bakteriálně enzymatická složka 12 g /t píce, benzoan sodný 288 g/t píce. Inokulant BIO PR obsahuje jako účinnou látku vybraný homofermentativní kmen bakterií mléčného kvašení Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC 705 DSM *10 11 a kmen propionových bakterií Propionibacterium freudenreichii spp. shermanii JS DSM *10 11 CFU/g. Jako nosič slouží sušená syrovátka. Koncentrace 1*10 6 CFU/g píce. Dávkování přípravku je 5 g/t silážované píce. Inokulant LAC FX obsahuje: Lactobacillus plantarum LP 286 a netukovanou syrovátku jako nosič. Koncentrace 4*10 11 CFU/g píce. Dávkování přípravku je 2 g/t silážované píce. 53

54 Inokulant BON SG obsahuje Lactobacillus plantarum DSM *10 11 CFU/g, Pediococcus acidilactici DSM *10 10 CFU/g, Lactobacillus buchneri DSM *10 10 CFU/g. Jako nosič slouží sušená syrovátka. Koncentrace 1*10 6 CFU/g píce. Dávkování přípravku je 2 g/t silážované píce Charakteristika chemických silážních aditiv použitých v pokusech Jako chemické silážní aditivum byl použit konzervační prostředek KEM PL o složení: kyselina mravenčí 43,5 %, kyselina propionová 10 %, kyselina benzoová 2,2 % a mravenčan amonný 30,9 %. Dále byl použit chemický konzervant KOF LQ o složení: benzoan sodný 5,3 %, propionát sodný 25,9 % a voda 68,8 %. Také byla použita močovina jako silážní aditivum MOC s obsahem 46,6 % dusíku Použité laboratorní metody Příprava vzorků pro chemický rozbor Po otevření silážních nádob byly nádoby zváženy pro potřebu bilance ztrát. Z každé siláže byl odebrán homogenní vzorek na stanovení sušiny a pro přípravu výluhů. Zvlášť byla siláž odebrána pro mikrobiologický rozbor Laboratorní sušina Obsah sušiny byl stanoven vysušením při teplotě 103 ± 2 C do konstantní hmotnosti podle Vyhlášky č. 124/2001 Sb Příprava výluhů ze siláží Vodní výluh pro stanovení kvalitativních ukazatelů fermentace byl připraven z 50 g vzorku a 450 ml destilované vody. Homogenát byl po 24 hodinovém luhování zfiltrován přes řídký papírový filtr FILTRAK 388. Tyto výluhy byly použity na níže uvedené analýzy dle AOAC (1990). 54

55 ph Koncentrace vodíkových iontů ve vodním výluhu (ph) byla stanovena elektrometricky na digitálním ph metru (PRECISION DIGITAL ph METER OP 208/1) ve vodním výluhu. Měřič byl kalibrován pufry o hodnotě ph 4,0 a 7, KVV Pro stanovení celkové kyselosti vodného výluhu (KVV) byl filtrát titrován 0,1 N NaOH o známém faktoru až do ph 8,5. Množství spotřebovaného hydroxidu sodného bylo použito pro výpočet KVV dle následujícího vzorce: KVV (mg KOH/100g) = spotřeba NaOH(ml) * 56,108 * f NaOH Množství kvasných kyselin Obsah kyseliny mléčné a těkavých mastných kyselin byl analyzován z vodního výluhu na plynovém chromatografu za podmínek analýzy podle HARTMANA (1974) Množství alkoholu Obsah alkoholu byl stanoven plynovou chromatografií metodou popsanou HARTMANEM (1974) Množství amoniaku Obsah amoniaku byl stanoven mikrodifúzní metodou. Do Conwayových misek bylo odpipetováno 5 ml 2% roztoku H3BO4, dále 10 ml filtrátu, ke kterému byl přidán 1 ml 10% K 2 CO 3. Žlábek s krycím sklem byl utěsněn 0,1 N NaOH. Po 24 hodinách difůze při laboratorní teplotě byl vytěsněný amoniak v roztoku H 3 BO 4 titrován pomocí 0,05 N H 2 SO 4 po přidání 2 3 kapek indikátoru Tashir do světle růžového zabarvení. Procentický obsah amoniaku byl vypočten podle vzorce: % NH 3 = spotřeba 0,05 N H 2 SO (ml) 4 x 0,0918 x f H 2 SO 4 55

56 Teplota Aerobní stabilita byla posuzována na základě průběhu změny teplot u siláže vystavené působení vzduchu při laboratorní teplotě o C. Vývoj teplot v silážích byl zaznamenáván v hodinových intervalech po dobu následujících tří dnů. Obr. Přístroj zaznamenávající teploty Mikrobiologický rozbor Mikrobiologicky byl sledován počet kvasinek a plísní na chloramfenikl glukózovém agaru (Biokar Diagnostics, Francie) při teplotě 25 C a době inkubace 120 hodin. Celkový počet mikroorganismů byl sledován na PCA Plate Count Agar (Biokar Diagnostics, Francie) při 30 C s dobou inkubace 72 hodin. Bakterie mléčného kvašení byly diagnostikovány na MRS agaru (Biokar Diagnostics, Francie) při 37 C s dobou inkubace 72 hodin. 56