ProSpecT TM C. difficile Toxin A/B, stanovení na mikrotitračních destičkách

Transkript

1 ProSpecT TM C. difficile Toxin A/B, stanovení na mikrotitračních destičkách R testů 1 POUŽITÍ destičkách je kvalitativní enzymová imunoanalýza (EIA) pro detekci toxinu A a B C. difficile ve vzorcích lidské stolice pacientů, u nichž existuje podezření na onemocnění vyvolané Clostridiem difficile. Test má sloužit jako pomůcka při stanovení diagnózy onemocnění vyvolaných Clostridiem difficile (CDAD). 2 SHRNUTÍ CZ Clostridium difficile, grampozitivní anaerobní sporulující bakterie, je nejčastěji identifikovatelnou příčinou průjmových onemocnění způsobených antibiotiky 1,2. Toto onemocnění se projeví, když léčba širokospektrými antibiotiky potlačí bakterie v normální střevní flóře a umožní oportunní růst toxigenních kmenů Clostridia difficile. Toxiny produkované Clostridiem difficile, označované jako toxin A a toxin B, mají silné enterotoxické (toxin A) a cytotoxické účinky (toxin B). Závažnost onemocnění se může pohybovat v rozmezí od nekomplikovaného průjmu až po stav známý jako pseudomembranózní kolitida (PMC), pro nějž je charakteristická nevolnost, bolest břicha, vodnatý průjem, dehydratace, subfebrilie a vyvýšené žluté plaky na kolorektální sliznici. Neléčená fulminantní kolitida může být smrtelná. Mohou vzniknout nozokomiální epidemie a recidivy gastrointestinálních onemocnění způsobených Clostridiem difficile 11. Onemocnění lze léčit antibiotiky zaměřenými na Clostridium difficile. Diagnóza je obvykle stanovena detekcí jednoho nebo obou toxinů Clostridia difficile 3,12. Stanovení cytotoxinů z buněčné kultury se považuje za referenční metodu, jeho provedení je však relativně časově náročné. Imunoanalýzy detekující pouze toxin A, nebo toxin A současně s toxinem B se staly osvědčeným nástrojem diagnostiky onemocnění způsobeného Clostridiem difficile 4,5. Existence netoxigenních variant Clostridia difficile podporuje použití testů na bázi stanovení toxinů pro definitivní diagnózu. Experimentálně byla použita stanovení na bázi sondy nukleové kyseliny, která však mohou být komplikována skutečností, že tento organizmus může být přítomen asymptomaticky asi u 50 % kojenců, % hospitalizovaných pacientů a 2-3 % zdravých dospělých jedinců 6,7. Klinický význam stanovení toxinu A i toxinu B ještě nebyl plně pochopen. I když většina kmenů způsobujících onemocnění produkuje oba toxiny, které mohou působit synergisticky, dokumentované případy onemocnění způsobených kmeny Clostridia difficile produkujících pouze toxin B svědčí o tom, že je klinicky důležité provádět stanovení obou toxinů A i B 8,9,10. 3 PRINCIP TESTU destičkách je imunoanalýza na pevné fázi, která slouží pro detekci toxinu A a toxinu B v klinických vzorcích stolice pomocí specifických protilátek. Vzorek stolice lze naředit činidlem pro ředění vzorků nebo ho lze použít přímo, pokud byl předem naředěn v modifikovaném médiu Cary Blair. Vzorky se přidají do odlamovacích jamek mikrotirační destičky, na něž je navázána myší monoklonální protilátka proti toxinu A a králičí protilátka proti toxinu B. Jsou-li toxiny přítomny, jsou zachyceny navázanou protilátkou. Jamky se inkubují a poté se promyjí, aby se odstranil nenavázaný materiál. Přidá se enzymový konjugát (kozí protilátka proti toxinu A značená křenovou peroxidázou a králičí protilátka proti toxinu B značená křenovou peroxidázou). Jamky se inkubují a poté se promyjí, aby se odstranil nenavázaný enzymový konjugát. Při pozitivní reakci navázaný toxin naváže enzymový konjugát na jamku. Přidá se substrát enzymu, 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin (TMB). Při pozitivní reakci enzym navázaný na jamku přemění substrát na barevný reakční produkt. Vznik zbarvení lze detekovat vizuálně nebo spektrofotometricky. Při negativní reakci není toxin přítomen nebo je přítomen v nedostatečném množství, aby mohl navázat enzymový konjugát, a nevytvoří se žádný barevný reakční produkt. 4 DEFINICE SYMBOLŮ Katalogové číslo Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Obsah postačuje pro <n> testů Prostudujte návod k použití Teplotní omezení (skladovací teplota) Číslo šarže (č. šarže) Datum ukončení použitelnosti (datum exspirace) Výrobce Ředěný vzorek 5 OBSAH SOUPRAVY, PŘÍPRAVA K POUŽITÍ A SKLADOVÁNÍ Stanovení ProSpecT C. difficile Toxin A/B na mikrotitračních destičkách obsahuje činidla postačující pro 96 testů. Viz též Upozornění, část 6. Datum exspirace každé soupravy je uvedeno na štítku obalu. Všechny složky uchovávejte při teplotě 2 až 8 C. Před použitím vytemperujte všechna činidla na pokojovou teplotu (20-25 C) a jemně je promíchejte. Po použití vraťte nespotřebovaná činidla do chladničky. Všechna činidla kromě promývacího pufru jsou dodávána v pracovní koncentraci. Činidla lze dávkovat přímo z lahviček s kapátkem nebo je lze odlít pro použití s vícekanálovými pipetami. Pokud jste odlili nadměrné množství činidla, přebytek činidla zlikvidujte. Nelijte přebytek činidla zpět do láhve. Návod k použití Pipety pro přenos roztoků Držák a kryt proužků mikrotitračních destiček Karta s postupem Mikrotitrační destička* (8 jamek/proužek) 12 proužků potažených myší protilátkou proti toxinu A a králičí protilátkou proti toxinu B. Nepoužité proužky mikrotitračních destiček skladujte v plastovém sáčku obsahujícím vysoušedlo zabraňující přístupu vlhkosti. Enzymový konjugát* Jedna lahvička s kapátkem obsahující 25 ml kozí protilátky proti toxinu A značené křenovou peroxidázou, králičí protilátky proti toxinu B značené křenovou peroxidázou s antimikrobiálními látkami. Pozitivní kontrolní vzorek Jedna lahvička s kapátkem obsahující 4 ml supernatantu kultury C. difficile s toxinem A a toxinem B a antimikrobiální činidla. Negativní kontrolní vzorek Jedna lahvička s kapátkem obsahující 4 ml pufrovaného roztoku s červeným barvivem a 0,1 % azidu sodného. Činidlo pro ředění vzorků Jedna lahvička obsahující 120 ml pufrovaného roztoku, červené barvivo a 0,1 % azidu sodného. Promývací pufr Jedna lahvička obsahující 120 ml (10x) koncentrovaného pufrovaného roztoku s antimikrobiálními látkami. Nařeďte 10x koncentrovaný promývací pufr na koncentraci 1x přidáním 1 dílu koncentrátu do 9 dílů destilované nebo deionizované vody. Naředěný promývací pufr je stabilní po dobu 1 měsíce, je-li skladován při teplotě 2-8 C. 1

2 Barevný substrát Jedna lahvička s kapátkem obsahující 25 ml 3,3,5,5 -tetramethylbenzidinu (TMB) v pufru. Barevný substrát uchovávejte v lahvičce chráněné před světlem, v níž se dodává, a k dávkování ho odebírejte z této lahvičky. Pokud z jakéhokoli důvodu z původní lahvičky odeberete alikvotní díl, nevracejte nespotřebovaný barevný substrát do původní lahvičky. Zastavovací roztok Jedna lahvička s kapátkem obsahující 12 ml 0,46 mol/l kyseliny sírové. *Poznámka: Nezaměňujte činidla souprav s různým číslem šarže. 6 UPOZORNĚNÍ Činidla jsou určena pouze pro diagnostické použití in vitro. Určeno pouze pro odborné použití. Informace o potenciálně nebezpečných složkách si laskavě vyhledejte v příslušném bezpečnostním listu a na označení výrobku. ZDRAVOTNÍ A BEZPEČNOSTNÍ INFORMACE 6.1 Činidla jsou připravena z biologických materiálů a je nutné s nimi manipulovat jako s potenciálně infekčním materiálem. Při likvidaci používejte odpovídající postupy pro biologicky nebezpečné materiály. 6.2 Nepipetujte ústy. Při manipulaci se vzorky a provádění stanovení používejte rukavice na jedno použití a prostředky na ochranu zraku. Po skončení práce si důkladně umyjte ruce. 6.3 Vzorky mohou obsahovat potenciálně infekční agens a při manipulaci s nimi je nutné aplikovat stupeň biologické nebezpečnosti 2 podle doporučení příručky CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Biologická bezpečnost v mikrobiologických a biomedicínských laboratořích), 5. vydání. 6.4 Promývací pufr obsahuje látku potenciálně senzibilizující kůži (< 1 % obj.). Zamezte styku s kůží. Používejte jednorázové nitrilové rukavice nebo rukavice z PVC. 6.5 Pro likvidaci použitého promývacího pufru použijte vhodné nádoby určené pro biologicky nebezpečné materiály. 6.6 Činidlo pro ředění vzorků a negativní kontrolní vzorek soupravy obsahují 0,1 % azidu sodného, který je platnými směrnicemi Evropského hospodářského společenství (EHS) klasifikován jako škodlivý (Xn). Platí pro něj tato R-věta: Xn R22 Zdraví škodlivý při požití. Pozor: Azidy mohou reagovat s mědí a olovem v některých potrubích a vytvářet výbušné sole. Množství použitá v této soupravě jsou malá, přesto při likvidaci materiálů obsahujících azid spláchněte tyto materiály relativně velkým množstvím vody. ANALYTICKÉ POKYNY 6.7 Důkladně si přečtěte a dodržujte všechny pokyny uvedené v tomto návodu k použití. 6.8 Kromě koncentrátu promývacího pufru se činidla dodávají v potřebné pracovní koncentraci. Činidla neřeďte kromě případů, které jsou uvedeny v pokynech. 6.9 Nepoužívejte činidla po uplynutí data exspirace. Datum exspirace je vytištěno na štítku každého činidla. Použití činidel po uplynutí data exspirace může ovlivnit přesnost výsledků Následující společná činidla lze používat pro celou řadu výrobků ProSpecT: promývací pufr, barevný substrát a zastavovací roztok Mikrobiální kontaminace činidel může snižovat přesnost stanovení. Při odebírání alikvotních dílů z lahviček s činidly používejte sterilní jednorázové pipety, zabráníte tak mikrobiální kontaminaci činidel Před použitím nechte všechna činidla a vzorky vytemperovat na pokojovou teplotu (20-25 C) Proužky mikrotitračních destiček musejí být skladovány v uzavíratelném plastovém sáčku obsahujícím vysoušedlo, které chrání mikrotitrační destičky před přístupem vlhkosti Vzorky stolice musejí být před zpracováním důkladně promíchány, aby se zajistilo přesné reprezentativní zastoupení vzorku. VZORKY PŘED PROVEDENÍM TESTU NEKONCENTRUJTE Barevný substrát je citlivý na působení světla. Je-li činidlo vystaveno světlu a dojde k zabarvení, činidlo musí být zlikvidováno Osoby, které jsou barvoslepé nebo zrakově postižené, nemusejí být schopny stanovit výsledky testu a měly by pro interpretaci výsledků používat hodnoty zjištěné při spektrofotometrickém měření V průběhu celého testu přidávejte činidla do testovacích jamek ve stejném pořadí. Nedotýkejte se tekutiny v jamkách špičkou kapátka, aby se zabránilo kontaminaci Každou inkubaci provádějte přesně stanovenou dobu. Dobu začněte měřit po přidání činidla do poslední jamky na každé testované mikrotitrační destičce. Nezpracovávejte najednou více než tři destičky o 96 jamkách, aby byla zajištěna přesná doba inkubace. Odchýlení od určeného postupu může mít vliv na průběh stanovení Je důležité, abyste lahvičky s kapátkem drželi svisle, aby se kapka vytvořila na špičce ústí kapátka. Pokud se ústí kapátka namočí, vytvoří se kapka nesprávné velikosti okolo jeho konce a nikoli na jeho špičce; pokud k tomu dojde, nejdříve ústí kapátka otřete a teprve poté pokračujte dále. 7 ODBĚR VZORKŮ STOLICE Standardní postupy pro odběr vzorků stolice a manipulaci s nimi jsou vhodné pro každou laboratoř. ČERSTVÉ VZORKY Nezpracované vzorky skladujte při teplotě 2-8 C a otestujte je do 48 hodin. Čerstvé vzorky ředěné činidlem pro ředění vzorků dodávaným v soupravě lze před testováním uchovávat při pokojové teplotě až po dobu 8 hodin nebo je lze uchovávat v chladničce až 72 hodin. ZMRAZENÉ VZORKY Pokud není možné testovat čerstvé vzorky do 48 hodin, měly by být zmraženy při teplotě -20 C nebo nižší a otestovány do 2 měsíců. Zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování vzorků, které může způsobit degradaci toxinů. MÉDIUM CARY BLAIR Vzorky konzervované v modifikovaném transportním médiu Cary Blair s indikátorem (nebo v ekvivalentním médiu) mohou být před testováním uchovávány až 5 dnů při pokojové teplotě (20-25 C). Vzorky stolice, které byly koncentrovány nebo fixovány 10% formalinem nebo fixačními prostředky SAF nebo PVA, nejsou vhodné pro použití. 8 POSTUP TESTU POTŘEBNÉ DODANÉ MATERIÁLY Viz Obsah soupravy, část 5 DALŠÍ POTŘEBNÉ MATERIÁLY, KTERÉ NEJSOU SOUČÁSTÍ DODÁVKY Nádoby pro odběr vzorků stolice Plastové nebo skleněné jednorázové zkumavky Časovač pro měření času v minutách Střička na promývací pufr Destilovaná nebo deionizovaná voda VOLITELNÉ MATERIÁLY, KTERÉ NEJSOU SOUČÁSTÍ DODÁVKY Čtečka mikrotitračních destiček schopná odečtu při 450/620 nm až 650 nm Aplikační tyčinky s koncem obaleným bavlnou nebo viskózovým hedvábím Mikropipeta na dávkování objemů do 200 µl Míchačka vortex s adaptérem pro destičky nebo třepačka Modifikované transportní médium Cary Blair transport 2

3 POSTUP 8.1 Příprava vzorků: Pro přípravu vzorků použijte jednu ze tří metod uvedených níže. A Tuhá stolice 1. Pro každý vzorek označte jednu zkumavku. 2. Do každé zkumavky přidejte 0,8 ml činidla pro ředění vzorků. 3. Pomocí dřevěného aplikátoru přidejte 0,2 g stolice (kousek o velikosti malého hrášku). 4. Vzorek důkladně vmíchejte do činidla pro ředění vzorku. 5. Vložte pipetu pro přenos vzorku do zkumavky a promíchejte obsah zkumavky tak, že obsah jednou natáhnete do pipety a zase ho vypustíte. 6. Ponechte pipety pro přenos vzorku ve zkumavkách. 7. PŘEJDĚTE KE KROKU 8.2 B Tekutá nebo polotuhá stolice 1. Pro každý vzorek označte jednu zkumavku. 2. Do každé zkumavky přidejte 0,8 ml činidla pro ředění vzorků. 3. Promíchejte vzorky protřepáním odběrových nádob. 4. Pomocí pipety pro přenos vzorku natáhněte 0,2 ml (druhá značka od špičky pipety). 5. Vyfoukněte vzorek do činidla pro ředění vzorků. 6. Promíchejte tak, že obsah jednou nasajete a vypustíte. 7. Ponechte pipety pro přenos vzorku ve zkumavkách. 8. PŘEJDĚTE KE KROKU 8.2 C Stolice v médiu Cary-Blair 1. Několikrát převraťte transportní lahvičku a důkladně ji tak promíchejte. 2. Další ředění vzorku není nutné. 3. PŘEJDĚTE KE KROKU Otevřete plastový sáček, vyjměte z něj potřebný počet proužků mikrotitračních destiček a vložte je do držáku proužků mikrotitračních destiček. Jednu jamku použijte pro negativní kontrolní vzorek a jednu jamku pro pozitivní kontrolní vzorek. Použijete-li méně než 8 jamek, odlomte z proužku potřebný počet jamek a nepoužité jamky vraťte do plastového sáčku s vysoušedlem. SÁČEK OPĚT TĚSNĚ UZAVŘETE, ABYSTE ZABRÁNILI PŘÍSTUPU VLHKOSTI, A VRAŤTE HO DO CHLADNIČKY. 8.3 Přidejte 4 kapky (200 µl) negativního kontrolního vzorku do jamky A1. Přidejte 4 kapky (200 µl) pozitivního kontrolního vzorku do jamky B Pomocí pipet pro přenos vzorků přidejte do příslušných jamek 0,2 ml (druhá značka od špičky pipety) každého vzorku. Poznámka: Vložte otvor pipety pro přenos vzorků do jamky tak, abyste zabránili rozstříknutí do okolních jamek. 8.5 Zakryjte mikrotitrační destičku a inkubujte ji při pokojové teplotě (20-25 C) po dobu 60 minut. Čas začněte měřit po přidání posledního vzorku. 8.6 Obsah jamek vytřepejte nebo odsajte. Promyjte tak, že každou jamku zcela naplníte zředěným promývacím pufrem (cca µl na jamku). Po každém promytí z jamek vytřepejte nebo odsajte veškerou tekutinu. Promývejte celkem třikrát. Po posledním promytí odstraňte obsah a klepněte destičkou na čisté papírové utěrky nebo ji odsajte. Odstraňte maximální možné množství promývacího pufru, ale nikdy nenechte jamky vyschnout. 8.7 Do každé jamky přidejte 4 kapky (200 µl) enzymového konjugátu. 8.8 Zakryjte mikrotitrační destičku a inkubujte ji při pokojové teplotě (20-25 C) po dobu 30 minut. 8.9 Jamky vytřepejte nebo odsajte a každou jamku pětkrát promyjte jako v kroku Do každé jamky přidejte 4 kapky (200 µl) barevného substrátu Zakryjte mikrotitrační destičku a inkubujte ji při pokojové teplotě (20-25 C) po dobu 10 minut Do každé jamky přidejte 1 kapku (50 µl) zastavovacího roztoku. Jemně jamkami poklepejte nebo je promíchejte na míchačce vortex, dokud nebude žluté zbarvení rovnoměrné. Změřte reakce do 10 minut po přidání zastavovacího roztoku. Výsledek stanovte vizuálně nebo spektrofotometricky při 450/620 až 650 nm (dvě vlnové délky). 9 ŘÍZENÍ JAKOSTI Pozitivní a negativní kontrolní vzorky musejí být součástí stanovení při každém testu. Pozitivní a negativní kontrolní vzorky slouží jako kontrola činidel a kontrola postupu stanovení. Kontrolní vzorky jsou určeny pro monitorování závažných chyb činidel. Pozitivní kontrolní vzorek nezajistí přesnost při mezní hodnotě stanovení. Optická hustota (O.D.) negativního kontrolního vzorku by měla být < 0,080 při 450/620 až 650 nm a při vizuálním stanovení by měl být vzorek bezbarvý (na kartě s postupem by měl odpovídat intenzitě zbarvení <1+). Má-li negativní kontrolní vzorek žluté zbarvení, které na kartě s postupem odpovídá intenzitě zbarvení 1+ nebo vyšší, je nutné test zopakovat a věnovat při tom důkladnou pozornost promývacímu postupu. Optická hustota. pozitivního kontrolního vzorku by měla být 0,500 při 450/620 až 650 nm, a při vizuálním stanovení by měla odpovídat intenzitě zbarvení na kartě s postupem 2+ nebo vyšší. Má-li pozitivní kontrolní vzorek žluté zbarvení, které na kartě s postupem odpovídá intenzitě nižší než 2+, požádejte telefonicky o technickou asistenci. 10 VÝSLEDKY Interpretace zbarvení naleznete na přiložené kartě s postupem. VIZUÁLNÍ STANOVENÍ 10.1 Stanovte výsledky testu srovnáním se zbarveními reakce uvedenými na kartě s postupem. Pozitivní: Žluté zbarvení minimálně o intenzitě 1+. Negativní: Bezbarvé Interpretace výsledků vizuálního stanovení: Pozitivní: Pokud v testovací jamce vznikne zbarvení, které na kartě s postupem odpovídá alespoň intenzitě 1+, vzorek obsahuje toxin A nebo toxin B, nebo oba toxiny a test je pozitivní. Poznámka: Testy se slabě žlutým zbarvením (na kartě s postupem odpovídají intenzitě nižší než 1+) je nutné zopakovat. Negativní: Bezbarvá reakce představuje negativní výsledek a indikuje, že testovaný vzorek neobsahuje toxin A ani toxin B nebo je v něm přítomno nedetekovatelné množství toxinu. SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENÍ 10.3 Výsledek stanovte při dvou vlnových délkách (450/620 až 650 nm) Stanovte optickou hustotu (O.D.) negativního kontrolního vzorku. Optická hustota by měla být < 0,080 pro 450/620 až 650 nm. Je-li hodnota optické hustota větší než 0,080, jsou výsledky neplatné a text je nutné zopakovat a věnovat při tom důkladnou pozornost promývacímu postupu Optická hustota pozitivního kontrolního vzorku by měla být 0,500 při 450/620 až 650 nm Naměřené hodnoty výsledků testu: Pozitivní: Optická hustota 0,080 Negativní: Optická hustota < 0, Interpretace výsledků spektrofotometrického stanovení: Pozitivní: Pozitivní na toxin A a/nebo B C. difficile. Pozitivní test nedefinuje přítomnost onemocnění. Při stanovení diagnózy je nutné výsledky použít společně s dalšími klinickými nálezy. Negativní: Negativní na toxin A a/nebo B C. difficile. Infekci nelze vyloučit, neboť ve vzorku může být přítomen toxin v množství nižším než detekční limit testu. *Poznámka: Veškeré jamky, které jsou na pohled čiré, ale jejichž naměřená hodnota optické hustoty neodpovídá vizuální interpretaci, je nutné považovat za rozporný výsledek a zkontrolovat, zda v jamkách nejsou bublinky, drobné částice nebo zda se v dolní části jamky nevytvořila neprůhledná vrstva. Vzniklou vrstvu odstraňte tak, že otřete spodní strany jamek, a znovu stanovte optickou hustotu. Jestliže rozpor mezi vizuálně stanoveným výsledkem a optickou hustotou přetrvává, zopakujte test. 3

4 11 FUNKČNÍ OMEZENÍ TESTU Platnost výsledků získaných pomocí stanovení ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B na mikrotitračních destičkách závisí na tom, zda kontrolní reakce proběhne podle očekávání. Viz Řízení jakosti, část 9. Pozitivní test nedefinuje přítomnost onemocnění. Test detekuje přítomnost toxinu A a/nebo B ve vzorcích stolice. Při stanovení diagnózy je nutné výsledky použít společně s dalšími klinickými nálezy. Negativní výsledek testu nevylučuje přítomnost toxinu A nebo toxinu B C. difficile a může nastat, pokud je hladina toxinu ve vzorku nižší než detekční limit testu. Nebylo dokázáno, že by existovala korelace mezi hladinou toxinu a přítomností nebo závažností onemocnění. Stejně jako u všech diagnostických testů IN VITRO by výsledky testu měl interpretovat lékař s ohledem na klinický nález a/nebo další laboratorní výsledky. Správný odběr a zpracování vzorků je nezbytné pro dosažení optimálního průběhu stanovení. Optimální výsledky testu se získávají ze vzorků testovaných do 48 hodin od odběru vzorků. Viz též Odběr vzorků stolice, část 7. Charakteristiky účinnosti tohoto testu nebyly hodnoceny pro pediatrické populace. 12 OČEKÁVANÉ HODNOTY Kolitida způsobená C. difficile se vyskytuje s podstatně vyšší četností u pacientů, kteří jsou hospitalizováni, a je čtvrtým nejběžnějším nozokomiálním onemocněním hlášeným střediskům pro kontrolu a prevenci onemocnění (Centres for Disease Control and Prevention). C. difficile odpovídá za % průjmů způsobených antibiotiky a více než 90 % pseudomembranózní kolitidy. Výskyt nozokomiálních CDAD se může lišit v závislosti na hospitalizované populaci konkrétní nemocnice a má na něj vliv přítomnost predispozičních faktorů, jako je zvýšený věk pacientů, typ a délka antimikrobiální léčby, závažnost původního onemocnění a délka hospitalizace. C. difficile se vyskytuje u 3-5 % zdravých dospělých, a až 50 % kojenců a mladých dospělých je asymptomatickým nositelem této bakterie i jejích toxinů PRACOVNÍ CHARAKTERISTIKY SROVNÁNÍ SE STANOVENÍM CYTOTOXICITY TKÁŇOVÉ KULTURY Testování bylo provedeno ve třech klinických laboratořích v Severní Americe. Pro všechny hodnocené vzorky činila celková citlivost stanovení ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B na mikrotitračních destičkách ve srovnání se stanovením cytotoxicity tkáňové kultury CTA) 90,3 % (149/165) a celková specifičnost ve srovnání s CTA činila 96,2 % (576/599). Výsledky CTA CELKOVÉ + - Výsledky ProSpecT EIA Celkem ,3 % citlivost (149/165); 95 % CI = 84,7 % - 94,4 % 96,2 % specifičnost (576/599); 95 % CI = 94,3 % - 97,5 % VIZUÁLNÍ INTERPRETACE TESTU Data pro vizuální interpretaci byla shromážděna ve dvou ze třech laboratoří celkem pro 586 vzorků. Celková citlivost ve srovnání s CTA činila 85,0 % a celková specifičnost činila 95,5 %. U vizuálně stanovených výsledků byla zjištěna 99,0% shoda (580/586) se spektrofotometrickými výsledky získanými pro každý vzorek. Výsledky CTA + - Výsledky ProSpecT EIA (vizuálně) Celkem ,0 % citlivost (85/100); 95 % CI = 76,5 % - 91,4 % 95,5 % specifičnost (464/486); 95 % CI = 93,2 % - 97,1 % CHARAKTERISTIKY STANOVENÍ VE SROVNÁNÍ S PREDIKAČNÍMI PROSTŘEDKY destičkách bylo srovnáváno se dvěma komerčně dostupnými enzymovými imunoanalýzami (predikační prostředky). Při srovnání s CTA (při použití stejných vzorků) byly zjištěny následující pracovní charakteristiky stanovení ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B na mikrotitračních destičkách a predikčních prostředků: Pracovní charakteristiky vs. CTA EIA Citlivost Specifičnost # % # % ProSpecT 33/40 82,5 263/268 98,1 Predikční prostř. č. 1 33/40 82,5 260/ ProSpecT 115/124 92,7 302/320 94,4 Predikční prostř. č. 2 98/124 79,0 309/320 96,6 ANALYTICKÁ CITLIVOST destičkách detekuje toxin A v množství 0,20 ng/ml a toxin B v množství 0,61 ng/ml. REPRODUKOVATELNOST Reprodukovatelnost testu byla hodnocena na třech pracovištích tři různé dny pomocí čtyř zaslepených vzorků. Každé pracoviště testovalo každý vzorek v 8 paralelních jamkách každý den testování (n = 288). Vzorky zahrnovaly jeden negativní vzorek a tři pozitivní vzorky s různou úrovní reaktivity. Průměrný variační koeficient (CV) mezi stanoveními, neboli mezi jednotlivými sériemi měření, vzorku ve středním rozmezí reaktivity činil 18,9 %. Průměrný variační koeficient (CV) v rámci jednoho stanovení, neboli v rámci jedné série měření, vzorku ve středním rozmezí reaktivity činil 7,7 %. ZKŘÍŽENÁ REAKTIVITA Stanovením ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B na mikrotitračních destičkách bylo hodnoceno 40 mikroorganizmů. Izoláty bakterií a kvasinek byly testovány v množství 10 8 jednotek tvořících kolonie na ml. Virové izoláty byly testovány v koncentracích 10 4 TCID 50 /ml (infekční dávka tkáňové kultury na mililitr). Nebyla zjištěna zkřížená reaktivita. Nebyla zjištěna zkřížená reaktivita s testovaným kmenem Clostridium sordellii (ATCC 9714). Publikovaná literatura však uvádí, že některé kmeny C. sordellii mohou vytvářet toxiny, jež mohou být zkříženě reaktivní s protilátkami proti toxinům A a B C. difficile. Stanovením ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B na mikrotitračních destičkách byly testovány dále uvedené organizmy. Adenovirus typ 40 Enterobacter cloacae Adenovirus typ 41 Enterococcus faecalis Aeromonas hydrophilia Escherichia coli Bacillus cereus Klebsiella pneumoniae Bacillus subtilis Peptostreptococcus anaerobius Bacteroides fragilis Porphyromonas asaccharolytica Campylobacter coli Proteus vulgaris Campylobacter jejuni Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Rotavirus Clostridium beijerinckii Salmonella choleraesuis Clostridium difficile (netoxigenní) Serratia liquefaciens Clostridium haemolyticum Shigella dysenteriae Clostridium histolyticum Shigella flexneri Clostridium novyi (toxin A) Shigella sonnei Clostridium perfringens (typ A) Staphylococcus aureus Clostridium septicum Staphylococcus aureus (Cowan) Clostridium sordellii Staphylococcus epidermidis Clostridium sporogenes Vibrio cholerae Clostridium tetani Vibrio parahaemolyticus Enterobacter aerogenes Yersinia enterocolitica LÁTKY RUŠÍCÍ STANOVENÍ Stanovením ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B na mikrotitračních destičkách byly testovány dále uvedené látky: vankomycin (12,5 mg/ml), metronidazol (12,5 mg/ml), krev, hlen, tuk ve stolici a následující volně prodejné protiprůjmové prostředky: Pepto-Bismol (léčivá látka: subsalicylát vizmutu) Imodium A-D (léčivá látka: loperamidhydrochlorid), Kaopectate (léčivá látka: attapulgit). Nebylo zjištěno rušení pozitivních ani negativních vzorků. 4

5 14 SEZNAM LITERATURY 1. Bartlett, J.G., N. Engl. J. Med. 346(5): Kelly, C.P. and J.T. LaMont, Ann. Rev. Med. 49: Wilkins, T. and D.M. Lyerly, J. Clin. Microbiol. 41: O Connor, D., P. Hynes, M. Cormican, E. Collins, G. Corbette-Feeney and M. Cassidy, J. Clin. Microbiol. 39: Turgeon, D.K., T.J. Novicki, J. Quick, L. Carlson, P. Miller, B. Ulness, A. Cent, R. Ashley, A. Larson, M. Coyle, A.P. Limaye, B.T. Cookson and T.R. Fritsche, J. Clin. Microbiol. 41: Gumerlock, P.H., Y.J. Tang, J.B. Weiss and J. Silva Jr., J. Clin. Microbiol. 31: Belanger, S.D., M. Boissinot, N. Clairoux, F.J. Picard and M.G. Bergeron, J. Clin. Microbiol. 41: Limaye, A.P., D.K. Turgeon, B.T. Cookson and T.R. Fritsche, J. Clin. Microbiol. 38: Alfa, M.J., A. Kabani, D. Lyerly, S. Moncrief, L.M. Neville, A. Al-Barrak, G.K.H. Harding, B. Dyck, K. Olekson and J.M. Embil, J. Clin. Microbiol. 38: Barbut, F., V. Lalande, B. Burghoffer, H.V. Thien, E. Grimprel and J. Petit, J. Clin. Microbiol. 40: Lyerly, D.M., L.M. Neville, D.T. Evans, J. Fill, S. Allen, W. Greene, R. Sautter, P. Hnatuck, D.J. Torpey, and R. Schwalbe J. Clin. Microbiol. 36: Nicholson, G., and M. Jones Br. J. Biomed. Sci. 56: Mandell, G.L., J.E. Bennett, and R. Dolin Mandell, Douglas, and Bennett s Principles and Practices of Infectious Diseases. 5th ed. Churchill Livingstone. New York, NY. ProSpecT TM je registrovaná ochranná známka. ATCC je registrovaná ochranná známka organizace American Type Culture Collection. Pepto-Bismol je registrovaná obchodní známka společnosti Procter & Gamble, Imodium je registrovaná obchodní známka společnosti McNeil Consumer & Specialty Pharmaceuticals a Kaopectate je registrovaná obchodní známka společnosti Pharmacia & Upjohn Company. Oxoid Ltd Wade Road Basingstoke Hants, RG24 8PW UK Máte-li zájem o technickou asistenci, obraťte se laskavě na místního distributora. IFU X7593, revize provedena 30. října Vytištěno ve Velké Británii. 5