QUIDEL. Objednací kód: A003

Transkript

1 QUIDEL C1-Inhibitor Objednací kód: A003 Quidel BioVendor - Laboratorní medicína a.s. MCKellar Court 10165, San Diego,CA, USA Karásek 1767/1, Brno Tel: Fax: Tel: PRACOVNÍ POSTUP

2 Pracovní postup Quidel C1 - Inhibitor REF A003 Obsah 1. Použití Klinické využití a princip metody Složení soupravy (kitu) Uchovávání, skladování a exspirace Upozornění Získání vzorků, manipulace a uchování Postup stanovení Kontrola kvality Interpretace výsledů Charakteristika. 9 1

3 1. Použití Quidel C1-Inhibitor je enzymoimuno-analytická souprava pro měření množství funkčního C1-Inhibitor proteinu v lidské plasmě nebo v séru. 2. Klinické využití a princip metody C1-Inhibitor (C1-INH) je multispecifický proteázový inhibitor, který je přítomný v normální lidské plazmě a séru a reguluje enzymy komplementu, fibrinolytické a kininové systémy. Enzymy (proteázy) regulované tímto proteinem, obsahují podjednotky C1r a C1s (součásti první aktivované komponenty komplementu), aktivovaný Hagemanův faktor (faktor XIIa), fragmenty Hagemanova faktoru, prekurzor aktivovaného plazmatického tromboplastinu (PTA nebo faktor Xia), kalikrein (Fletcherův faktor) a plasmin. Deficit funkčního aktivního C1-INH může vést k život ohrožujícím angioedémům. Dvě hlavní formy deficience C1-INH jsou: 1. kongenitální forma, nazývaná hereditární angioedém (HAE) a 2. získaná forma, související s rozmanitými nemocemi, zahrnujícími lymfoidní malignity. Hereditární angioedém je charakterizován transientními, ale rekurentními, ataky nepruritických otoků různých tkání v organismu. Symptomatologie závisí na postižených orgánech. Postižení střeva vede k rozmanitým symptomům zahrnujícím bolestivost, křeče, zvracení a průjmy. Nejčastější příčinou smrti je obstrukce dýchacích cest, které je sekundárním příznakem laryngeálního edému rozvíjejícího se v průběhu ataku. Biochemicky lze odlišit dva typy laryngeálního edému. Pacienti s častější formou (85% HAE pacientů) mají nízké hladiny funkčního C1-INH a C1-INH antigenu. Pacienti s druhou formou (15% HAE pacientů) mají nízké hladiny funkčního C1-INH, ale mají normální nebo zvýšené hladiny C1-INH antigenu, souvisejícího s nefunkčním proteinem. Variabilní povaha symptomů v různých stadiích onemocnění znemožňuje stanovení definitivní diagnózy pouze na klinických příznacích. Hereditární (získaný) angioedém může být definitivně prokázán pouze laboratorními testy demonstrujícími výrazné snížení hladin funkčního C1-INH v plasmě nebo v séru. Bylo již popsáno několik metod měřících hladiny funkčního C1-INH nebo antigenu. Mezi tyto metody patří metody založené na enzymové inhibici, radiální imunodifuze, imunoelektroforéza, inhibice imunitní hemolýzy. Každá z těchto metod má své nevýhody. Metody založené na inhibici enzymů se obtížně nastavují a provádějí v rutinní laboratoři. Imunochemické metody, které měří celkový antigen, nedokáží odlišit funkční a nefunkční C1-INH protein, a anti-c1r imunodifuze, která byla vyvinuta k měření aktivity funkčního C1-INH, není kvantitativní. Naše souprava je schopna kvantitativní detekce hladiny funkčního aktivního C1-INH proteinu přítomném v plasmě nebo séru pacientů využitím příjemné, standardizované a reprodukovatelné EIA metodiky. Princip stanovení Quidel C1-Inhibitor je enzymoimuno-analytická souprava o čtyřech krocích pro kvantitativní stanovení funkčního C1-Inhibitor proteinu (proteázové inhibitory) v lidském séru nebo v plazmě. V prvním kroku jsou standardy, kontroly a testované vzorky inkubovány s C1-Inhibitor reaktantem (biotinylovaný, aktivovaný C1s). Funkční aktivovaný C1-INH přítomný ve standardech, kontrolách a testovaném vzorku se během inkubace naváže na C1- Inhibitor reaktant a vytváří komplexy. V druhém kroku je do mikrotitračních jamek pokrytých avidinem přidáno alikvotní množství inkubační směsi obsahující C1- Inhibitor reaktant. C1- Inhibitor reaktant: komplexy C1-INH přítomné ve standardech, kontrolách nebo vzorcích se naváží na avidin, kterým jsou pokryty mikrotitrační jamky. Po inkubaci následuje promývání s vymytím nenavázaného materiálu. Ve třetím kroku je do každé jamky přidán s křenovou peroxidázou (HRP) konjugovaný kozí anti-human C1-INH. Během tohoto kroku je konjugát (s křenovou peroxidázou (HRP) konjugovaný anti-c1-inh) navázán na C1-Inhibitor reaktant: na komplexy C1-INH, které jsou zachyceny na povrchu avidinem pokrytých jamek. Po inkubaci je promytím odstraněn nadbytečný konjugát. Ve čtvrtém kroku je do každé jamky přidán chromogenní enzymový substrát. Navázaný HRP konjugát reaguje se substrátem a vytváří kolorimetrickou reakci zelená barva. Po inkubaci je enzymatická reakce chemicky zastavena a intenzita barvy je spektrofotometricky změřena při vlnové délce 405 nm. Intenzita vzniklé barvy je přímo úměrná koncentraci funkčního C1-INH proteinu přítomného v testovaném vzorku, standardech a kontrolách. 2

4 3. Složení soupravy (kitu) Reagencie a materiál dodávaný se soupravou: A C1-INH Standardy Kat.číslo A4469 A x 1 ml B (lyofilizovaný) Po rozpuštění obsahuje každý známé množství C1-Inhibitoru v lidské plazmě, C PBS, stabilizátory. D E L C1-INH abnormální kontrola (lidská) Kat. číslo A x 1 ml (lyofilizovaná) Po rozpuštění obsahuje lidskou plasmu s nízkou hladinou C1-Inhibitoru, v PBS, stabilizátory. N C1-INH normální kontrola (lidská) Kat. číslo A x 1 ml (lyofilizovaná) Po rozpuštění obsahuje lidskou plasmu s normální hladinou C1-Inhibitoru, v PBS, stabilizátory. 1. Mikrotitrační destička Kat. číslo Osm jamek pokrytých avidinem v proužcích v uzavíratelné plastikové fólii. 2. Stop činidlo Kat. číslo A ml Obahuje 250 mm kyseliny oxalové 3. 20x koncentrát promývacího roztoku Kat. číslo A x 50 ml Po rozpuštění každý obsahuje fosforečnan sodný (PBS), 0,05% Tween-20 TM a thimerosal 0,01 % 4. 5x koncentrát ředícího roztoku vzorku Kat. číslo A ml Po rozpuštění obsahuje PBS, stabilizátory 0,035% ProClin Roztok substrátu Kat. číslo A ml Obsahuje 0,1 M citrátového pufru a 0,05% H2O2. 6. Koncentrát substrátu Kat. číslo A3671 1,5 ml Obsahuje 0,07% 2,2 -Azino-bis (3-ethylbenhiazoline-6-sulfonic acid), diamonná sůl 7. C1- Inhibitor konjugát (100x) Kat. číslo A9525 0,25 ml Obsahuje 100x koncentrovanou s peroxidázu konjugovaný (kozí) anti-human C1-Inhibitor v PBS, stabilizátory, thimerosal 0,01 %. 8. Hydratační činidlo Kat. číslo A ml Obsahuje 0,035% ProClin Ředící roztok konjugátu Kat. číslo A ml Obsahuje PBS, stabilizátory, Thimerosal 0,01 % 10. C1-Inhibitor reaktant Kat. číslo A x 0,5 ml Po rozpuštění každá lahvička obsahuje biotinylovaný (konjugovaný s biotinem), aktivní C1s v PBS, se stabilizátory. Další potřebný materiál (nedodávaný se soupravou) a. Budík ( rozsah 60 minut) b. Kalkulačka nebo jiný výpočetní způsob pro validaci soupravy c. Čisté, nepoužité mikrotitrační destičky a/nebo testovací zkumavky a stojánky d. Nádoba na ředění promývacího roztoku e. Promývací láhev nebo jiný promývací systém f. Nastavitelná multikanálová pipeta (8 nebo 12 kanálů) nebo opakovací dávkovače (volitelné) g. Čisté pipety, 1 ml, 5 ml a 10 ml h. Mikropipety a pipetovací špičky i. Reader na měření optické denzity v rozmezí 0.0 a 2.0 j. Deionizovaná nebo destilovaná voda 3

5 4. Uchovávání, skladování, exspirace Před otevřením soupravu uchovávejte 2-8 o C. Po otevření soupravy mohou být koncentrát promývacího roztoku a hydratační činidlo uchovávány při teplotě 2 30 o C. Po použití vraťte nepoužité reagencie do chladu. Před použitím ponechte reagencie dosáhnout pokojové tepoty (15 30 o C) Indikace nestabilních nebo zkažených reagencií Koncentrát substrátu může být zabarven od bezbarvé do světle až tmavě zelené. Tento stav nemá vliv na provedení. Nicméně, právě připravený roztok substrátu by měl by měl být bezbarvý až světle zelený. Tmavě zelená barva indikuje, že připravený roztok substrátu je zkažený, musí být zlikvidován a v čisté skleněné nádobě připraven nový. Zakalení nebo změna barvy zředěného promývacího roztoku indikuje zkažení reagencie, zlikvidujte tento roztok. 5. Upozornění 1. Tento produkt je určen POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO 2. Při manipulaci s reagenciemi a vzorky pacienta se řiďte všeobecnými pravidly 3. Krabice a nepoužitý obsah soupravy likvidujte podle místních nařízení. 4. Reagencie spotřebuje do data exspirace, uvedeného na obalu. 5. Reagencie uchovávejte jak je uvedeno v návodu. 6. Při přidávání nebo odsávání tekutin z mikrotitračních jamek se nedotýkejte nebo nepoškrábejte dno jamek. 7. Při použití jiné doby inkubace nebo teploty než je uvedeno v postupu stanovení, mohou být získány chybné výsledky. 8. Při testování nenechte mikrotitrační jamky vyschnout. 9. Nepoužívejte mikrotitrační jamky více než na jeden test. 10. Je doporučeno použití multikanálové pipety nebo opakovacího dávkovače, kvůli zachování časového dávkování reagencií. 11. Pro správné měření vzorků, přidávejte vzorky a standardy přesně. Pipetujte pečlivě a používejte jen kalibrované vybavení. 12. Správné odebírání a skladování testovaných vzorků je nezbytné pro získání přesných výsledků. 13. Zamezte kontaminaci vzorků, reagencií nebo materiálu. Při kontaminaci mohou být získány chybné výsledky. 14. Jako konzervans je použit thimerosal. Při kontaktu nebo požití roztoků nebo reagencií obsahující thimerosal může dojít k hypersenzitivní reakci včetně podráždění kůže, očí nebo úst. Při těchto symptomech vyhledejte lékařskou pomoc. Vyvarujte se kontaktu se silnými kyselinami a zásadami. 15. Jako konzervans je použit ProClin 300. Při kontaktu nebo požití roztoků nebo reagencií obsahující ProClin 300 může dojít k podráždění kůže, očí nebo úst. Nevystavujte světlu. Při těchto symptomech vyhledejte lékařskou pomoc. 16. Koncentrát substrátu je citlivý na světlo. Nevystavujte přímému světlu. Uchovávejte reagencie v temnu. 17. Abyste předešli vzniku aerosolu při promývání, používejte nástroj k aspiraci promývacího roztoku do nádoby obsahující domácí bělidlo 18. Teplem inaktivované, lipemické nebo kontaminované vzorky mohou poskytovat chybné výsledky. 6. Získání vzorku, manipulace a uschovávání K provedení testu je potřeba nejméně 10 l séra nebo EDTA plasmy. Všechny vzorky by měly být odebrány sterilně a zpracovány podle platných předpisů. Používejte čerstvě získané, nehemolyzované vzorky. Vzorky EDTA plasmy mohou být uchovány při pokojové teplotě (15-30 o C) max. 24 hodin. Vzorky séra mohou být uchovány při pokojové teplotě maximálně 6 hodin. Pro delší uchování plasmy nebo séra musí být vzorky zamraženy na teplotu 20 o C nebo nižší. Zamezte opakovanému zamražování vzorků. Před provedením testu by měly být ze vzorku centrifugací (malou rychlostí) odstraněny hmotné částice. 4

6 7. Postup stanovení 7.1 Příprava reagencií V tabulce číslo 1 a 2 jsou uvedena množství potřebných reagencií a materiálu. Při odebrání potřebných reagencií a materiálu vraťte nepoužité reagencie na jejich příslušnou teplotu skladování. Před použitím nechte reagencie dosáhnout pokojové tepoty (15 30 o C). Po použití vraťte soupravu do chladničky (2-8 o C). 1. Promývací roztok. Promíchejte 20x koncentrát promývacího roztoku protřepáním lahve. Pokud je 20x koncentrát promývacího roztoku skladován při teplotě 2-8 o C, mohou se vytvořit krystalky. Krystalky rozpustíme ponořením láhve do vodní lázně (37 50 o C), dokud se krystalky nerozpustí. Dobře promíchejte. Promývací roztok připravte rozpuštěním celého obsahu jedné lahvičky 20x koncentrátu promývacího roztoku s jedním litrem destilované nebo deionizované vody. Dobře promíchejte. Promývací roztok je stabilní 30 dní, pokud je uchován v čisté lahvi při 2-8 o C. Zakalení nebo změna barvy zředěného promývacího roztoku indikuje zkažení reagencie, vyřaďte tento roztok. 2. Výběr mikrotitračních proužků. Stanovte počet vzorků k testovaní a přidejte patnáct (15) jamek pro 5 standardů, normální a abnormální kontroly (v dubletech) a jednu jamku prázdnou. Pokud je možné, je doporučeno standardy a kontroly (v dubletech) testovat na odděleném mikrotitračním proužku. Oddělte požadovaný počet proužků. Používejte tyto proužky na rámu destičky. Vraťte nepoužité proužky zpět do skladovacího sáčku, dobře jej uzavřete a skladujte při 2-8 o C. 3. Naředění C1-INH standardů, kontrol a C1-INH reaktantu. Přidejte 1 ml hydratačního činidla do každé lahvičky se standardem (A-E) a do každé lahvičky s kontrolou. Přidejte 0,5 Ml hydratačního činidla do každé potřebné lahvičky s C1-INH reaktantem (jedna lahvička vystačí na cca 25 vzorků). Ponechte zředěné lahvičky rehydratovat alespoň 15 minut při teplotě o C. Dobře promíchejte. Během míchání zamezte vzniku pěny nebo bublinek. Zředěné standardy a kontroly jsou stabilní 30 dní, pokud jsou uchovány při teplotě 2-8 o C. Upozornění: Další ředění zředěných standardů a kontrol před provedením testu není potřeba. Souprava obsahuje 4 lahvičky C1-INH reaktantu, proto je možné provést až 4 stanovení. Zředěný C1-INH reaktant je stabilní až dvacet čtyři (24) hodin při 2-8 o C a až dvě (2) hodiny při o C. 4. Příprava 1x ředícího roztoku vzorků. Ke stanovení potřebného množství 1x ředícího roztoku vzorků postupujte podle tabulky číslo 1. Připravte potřebné množství 1x ředícího roztoku vzorků a smíchejte uvedené množství destilované nebo deionizované vody s 5x koncentrátem ředícího roztoku vzorků. Tabulka 1 1x roztok k naředění vzorku (požadované množství a příprava) Počet proužků 1x roztok k naředění vzorku Objem potřebných reagenicí Potřebné množství (ml) voda (ml) 5x roztok k naředění vzorku (ml) 2 6 4,8 1, ,0 3, ,6 4, ,0 6, ,4 7, ,8 9, ,2 10, ,6 12, ,0 14, ,4 15, ,8 17,2 5. Ředění vzorku. Určete počet (N) vzorků pro stanovení. Označte testovací zkumavky #1 až #N a zaznamenejte si, který vzorek odpovídá které zkumavce. Připravte si 1 ml 1:101 roztoku každého vzorku použitím 1x ředícího roztoku vzorků (10 ul vzorku + 1mL 1x ředícího roztoku vzorků). Dobře promíchejte. Zamezte vzniku pěny nebo bublinek. Neuchovávejte nebo znovu nepoužívejte naředěné vzorky. 6. Příprava 1x konjugátu. Pro každé tři testované proužky přidejte 25 l 100X konjugátu do 2,5 ml ředícího roztoku konjugátu 7. Příprava roztoku substrátu. Připravte přímo před použitím. Nepřipravujte roztok substrátu před dosažením kroku 8 v pracovním postupu. Určete potřebné množství roztoku substrátu podle tabulky 2. Připravte roztok substátu přidáním 50 l koncentrátu substrátu do každého ml roztoku k ředění substrátu. Dobře promíchejte. Pokud se roztok substrátu před použitím zabarví do tmavě zelena, zlikvidujte ho a v čisté nádobě připravte nový roztok. 5

7 Tabulka 2 Roztok substrátu 1x (požadované množství a příprava) Počet proužků roztok substátu Objem potřebných reagenicí Potřebné množství (ml) Diluent substrátu (ml) Koncentrát substrátu l 7.2 Pracovní postup Před provedením testu si pečlivě přečtěte pracovní postup 1. Označte si pozice mikrotitračních jamek odpovídajících vzorkům, standardům a kontrolám. Také si poznačte čísla šarží, které jsou uvedeny na etiketě lahvičky. Pro orientaci si označte jeden roh mikrotitrační destičky. 2. Zpracování standardů, kontrol a testovaných vzorků s C1-INH Reaktantem. a) Přidejte 100 l rozpuštěného C1-INH standardu (A,B,C,D,E) do předem označených mikrozkumavek. b) Přidejte 100 l C1-INH abnormální kontroly a 100 l C1-INH normální kontroly do předem označených mikrozkumavek c) Přidejte 100 l 1:101 zředěného vzorku pacienta (viz ředění vzorku, bod 5 v kapitole Příprava reagencií) do předem označených mikrozkumavek. d) Přidejte 20 l čerstvě rozpuštěného C1-INH Reaktantu do mikrozkumavek obsahujících standardy, kontroly a naředěný vzorek. Intenzivně protřepejte každou zkumavku. e) Inkubujte při o C po dobu 10 minut + 1 minuta. 3. Podle potřeb readru zvolte jednu nebo více jamek jako blank a přidejte do těchto jamek 50 l 1x ředícího roztoku vzorků. 4. Přidejte 50 l každého (s C1-INH reaktantem smíchaného - bod 2) standardu a kontroly do přiřazených jamek v dubletech. Přidejte 50 l (s C1-INH reaktantem smíchaného - bod 2) vzorku do příslušných mikrotitračních jamek. 5. Inkubujte při o C po dobu 10 minut + 1 minuta. 6. Promyjte mikrotitrační jamky následovně: Upozornění: Promývání mikrotitračních jamek je zásadní krok. Řiďte se důkladně těmito instrukcemi: a) Po inkubaci v bodu 5 (nebo v bodu 8) odstraňte obsah všech jamek. b) Naplňte všechny jamky promývacím roztokem (cca 300 l). Použijte promývací láhev nebo jiné plnící zařízení. c) Inkubujte při o C po dobu 1 minuty. d) Odstraňte obsah všech jamek. e) Naplňte všechny jamky promývacím roztokem (cca 300 l). f) Odstraňte obsah všech jamek. g) Opakujte kroky e-f 3x. h) Po pátém promývacím cyklu, obraťte destičku a jemně (2x) odsajte savým papírem zbylou tekutinu. Nenechejte jamky vyschnout! 7. Pomocí multikanálové pipety nebo opakovacího dávkovače napipetujte 50 l naředěného C1-INH konjugátu (viz bod 6) do každé promyté jamky, včetně blank jamek (jamky) 8. Inkubujte mikrotitrační proužky při o C po dobu 60-ti minut + 1 minuta. Během této inkubace připravte roztok substrátu (viz kapitola Příprava reagencií - bod 7) 6

8 9. Po 60-ti minutové inkubaci (bod 8) promyjte jamky tak, jak je popsáno v kapitole Pracovní postup. 10. Okamžitě po promývacím kroku přidejte 100 l čerstvě připraveného roztoku substrátu do každé jamky, včetně blank jamek (jamky). 11. Inkubujte mikrotitrační proužky při o C pro dobu 30-ti minut. 12. Přidejte do každé jamky 50 l stop činidla pro zastavení enzymatické reakce. Stop činidlo by mělo být do jamek přidáváno stejně rychle a ve stejném pořadí jako roztok substrátu. Opatrně potřepávejte mikrotitrační proužky až do dosažení rovnoměrného zbarvení obsahu v jamce 13. Změřte absorbanci při vlnové délce 405 nm (hodnota A405) každé jamky do jedné hodiny po přidání stop činidla (bod 12), a proveďte korekci dle blanku 14. Zlikvidujte zbylé naředěné vzorky, kontroly, substrát, konjugát, C1-INH reaktant a použité mikrotitrační proužky (viz kapitola Upozornění ). Držák proužků a si ponechejte pro další použití. 8. Kontrola kvality Správné laboratorní praktiky doporučují použití kontrol k zaručení správného provedení testu. Každá C1-INH souprava obsahuje normální a abnormální kontroly, které jsou používány za tímto účelem. Tyto kontroly by se měly stanovit alespoň jednou pro každou skupinu vzorků, tj. pro každý jednotlivý test. Při správném použití by kontroly měly poskytovat procentuální vyjádření střední hodnoty v rozmezí uvedeném na jejich etiketách. Protože jsou kontroly zpracovávány a testovány jako vzorky, slouží jako kontroly pro každé jednotlivé stanovení C1-INH. Externí kontroly, připravené Vaší laboratoří, mohou být pro ověření správné funkčnosti metody používány také. Návodem pro tuto metodu je také vyžadováno, aby standardní křivka získaná pomocí standardů A-E splňovala validační kriteria (viz. interpretace výsledků). Standardy by měly být pro každé jednotlivé stanovení měřeny v duplikátech. Jestliže výsledky měření nesplňují výše uvedené požadavky, zopakujte měření nebo kontaktujte dodavatele. 9. Interpretace výsledků Výpočet výsledků Standardní křivka je vytvořena pomocí hodnot získaných readerem pro každý standard (na ose Y) po odečtení hodnoty blanku a odpovídající koncentraci pro každý standard (na ose x). Kalibrační křivka musí splňovat validační kriteria. Většina počítačů či kalkulátorů je schopna spočítat výsledky. Příklad standardní křivky je zobrazen na obr. 1. Procentuální koncentrace pro každý vzorek je vypočítána ze standardní křivky použitím lineární regresní analýzy. Validace Určete sklon, intercept a korelační koeficient vzniklé křivky. Hodnoty musí být v následujícím rozmezí, aby metoda splnila kritéria kontroly kvality: Korelační koeficient: více než 0,95 Sklon: 0,789 až 1,944 y-intercept: (-) až (+) 0,047 Interpretace Koncentrace funkčního C1-INH v daném vzorku je udávána jako procento průměrné hladiny v normálním vzorcích. Na základě testování 100 vzorků touto soupravou třemi laboranty byla stanovena průměrná normální hladina funkčních C1-INH (viz Charakteristika metody, Přesnost). Procento průměrné normální hodnoty pro daný testovaný naředěný (1:101) vzorek je určeno v kapitole výpočet výsledků. Abnormální výsledky: Koncentrace C1-INH menší nebo rovno 40 % průměrného normálu jsou považovány jako podstatně nižší než normální a měly by být považovány za abnormální. Vzorky, které jsou po opakování testu nejasné (viz níže), mohou být také považovány za abnormální. Nejasné výsledky: Koncentrace C1-INH v rozmezí 41% - 67 % průměrného normálu, přestože jsou nižší než předpokládané normální, nejsou podstatně nižší než normální a jsou považovány za nejasné výsledy. Tyto vzorky by měly být znovu otestovány nebo by měl být znovu odebrán vzorek a otestován. Pokud vzorek vyjde znovu jako nejasný, tyto vzorky by měly být považovány jako podstatně nižší než normální a měly by být posouzeny jako abnormální. Normální výsledky: Koncentrace větší nebo rovno 68% průměrného normálu jsou považovány za normální. Příklad standardní křivky 7

9 Omezení Quidel C1-Inhibitor enzymoimuno-analytická souprava byla používána k testování vzorků séra nebo EDTA plazmy. Jiné antikoagulanty (než EDTA) nebyly testovány. Očekávané hodnoty Sto (100) normálních vzorků sér složených ze čtyřiceti devíti (49) dětských a padesáti jedna (51) dospělých osob byly testovány soupravou Quidel C1-INH. Nebyl zaznamenán podstatný rozdíl mezi dětskými a dospělými vzorky. Průměrná koncentrace C1-INH proteinu v těchto vzorcích byla definována 100 % průměrného normálu (standardní odchylka = 15,8 %). Od patnácti (15) normálních dospělých osob byly odebrány párové vzorky EDTA plazma a vzorky séra a testovány touto soupravou. Nebyly zaznamenány podstatné rozdíly mezi těmito typy vzorků. Dále byly testovány touto soupravou vzorky od dvaceti osmi (28) pacientů s různě dokumentovaným deficitem C1-INH. Tyto vzorky byly posbírány z několika zařízení umístěných v různých částech Spojených států. Všech dvacet osm (28) testovaných pacientů mělo podstatně nižší hladinu funkčního C1-INH než je průměrná normální hladina. Tato data jsou uvedena v tabulce 3. Tabulka 3 Číslo pacienta Umístění Procento průměrného Interpretace normálu (%) 1P* A 19 Abnormální 1S* A 37 Abnormální 2** A 0 Abnormální 2** A 6 Abnormální 3 A 0 Abnormální 4 A 17 Abnormální 5 A 0 Abnormální 6 A 0 Abnormální 7 A 56 Abnormální 8 A 61 Abnormální 9 A 8 Abnormální 10 B 0 Abnormální 11 C 28 Abnormální 12 D 14 Abnormální 13 D 32 Abnormální 14 D 21 Abnormální 15 D 45 Abnormální 16 D 3 Abnormální 17 D 24 Abnormální 18 D 0 Abnormální 19 E 0 Abnormální 20 E 2 Abnormální 21 E 13 Abnormální 22 E 17 Abnormální 23 E 19 Abnormální 24 E 4 Abnormální 26 E 3 Abnormální 27 E 44 Abnormální 28 E 0 Abnormální *1S je sérum a 1P je EDTA plazma odebrána od pacienta ve stejný čas. **Dva vzorky od pacienta 2 byly odebrány po třech letech. Při opakování měli tito pacienti nejasný výsledek, proto se považují za abnormální. 8

10 10. Charakteristika Přesnost Za použití modelu lineární regrese byly porovnány koncentrace C1-INH 15 normálních sér získané metodou EIA a porovnány s koncentracemi získanými technikou radiální imunodifuze. Koncentrace C1-INH primárního standardu byly určeny přiřazením hodnoty standardů obsažených v kitu pomocí modelu lineární regrese. Pro ověření přesnosti modelu pro koncentraci primárního standardu byly stanoveny také koncentrace šesti C1-INH standardů pomocí radiální imunodifuze. Tyto dvě metody pro měření C1-INH koncentrací nebyly signifikantně odlišné. Střední hodnota získaná pro 100 normálních sér pomocí Quidel C1-INH EIA byla 182 µg/ml. Tato hodnota velmi dobře souhlasí s publikovanými normálními hodnotami: 180 µg/ml. Správnost Byly vyhodnoceny 3 soupravy různých šarží. Každá šarže byla třikrát testována jiným laborantem. Vzorky byly těmito třemi soupravami dvakrát testovány celkem devíti testy. V tabulce 4 je uvedena variabilita intra-assay a inter-assay výsledků: Tabulka 4 Reprodukovatelnost soupravy Typ Průměr (A405) Intraassay (%CV) Interassay (%CV) Vzorek 1 1, Vzorek 2 0, Vzorek 3 (-) 0, Standard A (-) 0, Standard B 0, Standard C 1, Specifičnost Kozí anti-human C1-INH, použitý na výrobu konjugátu byl porovnán s jinou, komerčně dostupnou FDA prověřenou C1-INH protilátkou. Při imunodifusi byla demonstrována identická linie. Navíc antisérum vyráběné Quidelem bylo potvrzeno jako monospecifické pro C1-INH testovaný v různých koncentracích oproti normálním, čerstvě odebraným lidským sérům obsahujícím 10 mm EDTA testovaným dvojitou imunodifuzí, imunoelektroforézou a jedno- a dvoudimenzionální imunoelektroforézou. Biovendor laboratorní medicína a.s. Poslední aktualizace: leden