Sou asné mo nosti laboratorní diagnostiky stafylokokových infekcí

Transkript

1 Jiho eská univerzita v eských Bud jovicích Zdravotn sociální fakulta Sou asné mo nosti laboratorní diagnostiky stafylokokových infekcí Bakalá ská práce Autor práce: Studijní program: Studijní obor: Lucie Chrtová Specializace ve zdravotnictví Zdravotní laborant Vedoucí práce: MUDr. Magda Balejová Datum odevzdání práce:

2 Abstrakt Laboratorní diagnostika stafylokokových infekcí je zalo ena na p ímém pr kazu, tj. na mikroskopii a kultivaci, p ípadn pr kazu bakteriální DNA. Cílem této práce je posouzení sou asné mo nosti laboratorní diagnostiky infekcí zp sobených koaguláza negativními stafylokoky a porovnání jednotlivých metod pou ívaných k identifikaci v rutinní laboratorní praxi. Úvodní ást práce je v nována popsání rodu Staphylococcus, jeho odli ení od rod Micrococcus a Peptococcus. Následn pak rozd lení rodu Staphylococcus na základ schopnosti enzymaticky koagulovat plazmu do dvou hlavních skupin (stafylokok koaguláza pozitivních a koaguláza negativních). U t chto dvou hlavních skupin je popsána jejich morfologie, kultivace, antigenní struktura, faktory virulence, patogeneze a laboratorní diagnostika. V metodické ásti je zmín ná preanalytická a analytická fáze vy et ení. Preanalytická ást je zam ená na obecné zásady odb ru a transportu materiálu na mikrobiologické vy et ení a samotný odb r materiálu. Metodická ást byla provád na v Laborato i léka ské mikrobiologie na Pracovi ti bakteriologie v Nemocnici eské Bud jovice a.s. V této ásti práce je popsáno rozli ení stafylokok na základ koagulázového testu latexovou aglutinací (PROLEX TM STAPH LATEX KIT) a následn druhová identifikace 52 kmen stafylokok koaguláza negativních, izolovaných z centrálních ilních katétr, hemokultur a jiných klinicky záva ných materiál. Druhová identifikace v ech 52 kmen stafylokok koaguláza negativních byla provedena biochemickou identifikací testem STAPHYtest 16 a paraleln hmotnostní spektrometrií technologie MALDI-TOF systémem VITEK MS. T mito metodami byly kmeny identifikovány s úsp ností 96,2 % u metody hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF a s úsp ností 67,3 % u biochemické identifikace STAPHYtest 16. Nej ast ji byl identifikován druh Staphylococcus epidermidis (64 %), následn Staphylococcus hominis ssp. hominis (10 %), Staphylococcus capitis (6 %), Staphylococcus warneri (6 %), Staphylococcus lungdunensis (4 %), Staphylococcus haemolyticus (4 %), Staphylococcus hominis (4 %),

3 Staphylococcus caprae (2 %). V porovnání obou metod je hmotnostní spektrometrie spolehliv j í, rychlej í a jednodu í metodou vhodnou do rutinní laboratorní praxe. Klí ová slova: biochemická identifikace, centrální ilní katétr, hemokultury, MALDI TOF MS, stafylokoky, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.

4 Abstract Laboratory diagnostics of Staphylococccal infections is based on direct evidence, like microscopy and cultivation, eventually on molecular genetics methods. The objective of this thesis is the presentation of nowadays possibilities in laboratory diagnostics of coagulase negative staphylococcal infections and comparsion of two methods of identification used in the routine laboratory practice. First part of the thesis presents the genus Staphylococcus and the difference between it and the genuses Micrococcus and Peptococcus. The following part of this thesis shows the distribution of genus Staphylococcus in two main groups (Staphylococcus coagulase positive and coagulase negative), based on the ability to coagulate plasma. The description of these two main groups contains their morphological and cultivation features, antigen structure, virulence factors, pathogenesis and laboratory diagnostics. In the methodical part the pre-analytic and analytic phase is mentioned. The focus of the pre-analytic part the general priciples of collection and transport for microbiological analysis and the collection of material itself. The methodical part was performed in the eské Bud jovice Hospital Laboratory of Medical Microbiology Department of Bacteriology. This part of the thesis presents the differentiation of staphylococci by latex agglutination (PROLEX TM STAPH LATEX KIT) and then specific identification of 52 strains of coagulasenegative staphylococci isolated from central venous catheters, hemocultures and other clinical important materials is following. The specific identification of all the 52 strains of coagulase-negative staphylococci was performed by biochemical identification by STAPHYtest 16 (ErbaLachema) and parallel by mass spectrometry MALDI-TOF (system VITEK MS TM ). The correct identification reached 96,2 % by the method of mass spectrometry MALDI-TOF and 67,3 % by biochemical identification STAPHYtest 16. The most frequent species isolated was Staphylococcus epidermidis (64 %), then Staphylococcus hominis ssp. hominis (10 %), Staphylococcus capitis (6 %), Staphylococcus warneri (6 %), Staphylococcus lugdunensis (4 %), Staphylococcus haemolyticus (4 %), Staphylococcus hominis (4 %), Staphylococcus caprae (2 %).

5 The comparsion of both named methods shows the mass spectrometry more reliable, faster and simpler method, and more suitable for routine laboratory work. Keywords: biochemical identification, central venous catheter, hemocultures, MALDI TOF MS, Staphylococci, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.

6 Prohlá ení Prohla uji, e svoji bakalá skou práci jsem vypracoval(a) samostatn pouze s pou itím pramen a literatury uvedených v seznamu citované literatury. Prohla uji, e v souladu s 47b zákona. 111/1998 Sb. v platném zn ní souhlasím se zve ejn ním své bakalá ské práce, a to v nezkrácené podob v úprav vzniklé vypu t ním vyzna ených ástí archivovaných fakultou elektronickou cestou ve ve ejn p ístupné ásti databáze STAG provozované Jiho eskou univerzitou v eských Bud jovicích na jejich internetových stránkách, a to se zachováním mého autorského práva k odevzdanému textu této kvalifika ní práce. Souhlasím dále s tím, aby touté elektronickou cestou byly v souladu s uvedeným ustanovením zákona. 111/1998 Sb. zve ejn ny posudky kolitele a oponent práce i záznam o pr b hu a výsledku obhajoby kvalifika ní práce. Rovn souhlasím s porovnáním textu mé kvalifika ní práce s databází kvalifika ních prací Theses.cz provozovanou Národním registrem vysoko kolských kvalifika ních prací a systémem na odhalování plagiát. V eských Bud jovicích dne Lucie Chrtová

7 Pod kování D kuji vedoucímu MUDr. Magd Balejové za odborné vedení mé bakalá ské práce. Dále d kuji spolupracovník m v Laborato i léka ské mikrobiologie na Pracovi ti bakteriologie v Nemocnici eské Bud jovice a.s. za vst ícnost. V neposlední ad bych ráda pod kovala své rodin za podporu a trp livost.

8 Obsah Seznam pou itých zkratek 1. Teoretický úvod Rod Staphylococcus Koaguláza-pozitivní stafylokoky Staphylococcus aureus Morfologie Antigenní struktura Faktory virulence Povrchové faktory Extracelulární faktory Patogeneze Patogenita Koaguláza-negativní stafylokoky Mikroskopie Kultivace p d a morfologie kolonií Druhová identifikace Patogeneze Obecné zásady odb ru a transportu materiálu na mikrobiologické vy et ení Laboratorní diagnostika Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Cíl práce Metodika Mikroskopie Kultivace Kultivace hemokultur Kultivace centrálních ilních katétr Kultivace tekutého materiálu a výt r /st r Identifikace Kataláza Rozli ení stafylokok koaguláza - pozitivních a stafylokok koaguláza - negativních Druhová identifikace stafylokok koaguláza - negativních Biochemická identifikace Identifikace hmotnostní spektrometrií technologie MALDI- TOF Výsledky Identifikace kmen STKN biochemicky (STAPHYtest 16) Identifikace kmen STKN systémem VITEK MS TM Porovnání identifikace kmen STKN biochemicky ( STAPHYtest 16) metodou MALDI TOF MS systémem VITEK MS TM Zastoupení jednotlivých kmen STKN dle výsledk identifikace metodou MALDI-TOF MS systémem VITEK MS TM Diskuse Záv r Seznam pou ité literatury

9 Seznam pou itých zkratek C K Centrální ilní katétr KNS Koaguláza negativní stafylokoky PBAK Pracovi t bakteriologie MRSA methicilin rezistentní S. aureus STCA Staphylococcus capitis STCP Staphylococcus caprae STEP Staphylococcus epidermidis STHA Staphylococcus haemolyticus STHH Staphylococcus hominis ssp. hominis STHO Staphylococcus hominis STKN Stafylokoky koaguláza negativní STLU Staphylococcus lungdunensis STWA Staphylococcus warneri TSST-1 Toxin syndromu toxického oku 1 9

10 1. Teoretický úvod 1.1. Rod Staphylococcus Zástupci rodu Staphylococcus jsou morfologicky grampozitivní koky o pr m ru 0,5-1,5 m, vyskytující se jednotliv, v párech i v nepravidelných shlucích a netvo ící spóry. Poprvé byly popsány nezávisle na sob Louisem Pasteurem a Sirem Alexanderem Ogstonem v roce Název stafylokok je odvozený z eckého staphylé (hrozen) a cocos (zrna nebo bobule), a vyjad uje práv typické morfologické uspo ádání stafylokok. Zaveden byl skotským chirurgem a amatérským mikrobiologem Sirem Alexanderem Ogstonem, který prokázal, e jsou p vodci hnisavých onemocn ní lov ka. Stafylokok m se morfologicky podobají koky z rodu Micrococcus a Peptococcus, které se v ak odli ují na úrovni DNA, co vylu uje jejich taxonomickou p íbuznost (Bene 2002, Greenwood et al. 1999, Murray et al. 2003). Dal ím rozli ujícím znakem mikrokok od stafylokok je jejich metabolismus. Mikrokoky jsou striktn aerobní, koky z rodu Peptococcus jsou striktn anaerobní. Stafylokoky jsou fakultativn anaerobní a dob e se kultivují v aerobních i anaerobních podmínkách. Jsou pom rn odolné v i vliv m zevního prost edí. Snesou i vyschnutí a vykazují odolnost i k vysoké koncentraci soli (Bene 2002, Greenwood et al. 1999, Murray et al. 2003). Stafylokoky jsou pom rn kultiva n nenáro né mikroorganismy, které dob e rostou i na b ných kultiva ních p dách. K jejich izolaci je vhodný krevní agar s 5 % beraní krví, trypton sojový agar TSA nebo BHI agar s p ídavkem mozkosrdcové infuze. K záchytu stafylokok z kontaminovaných vzork je vhodné u ít selektivní p du, nap. krevní agar s 10 % NaCl (Murray et al. 2003, Votava et al. 2003). Zatímco bakterie rod Micrococcus a Peptococcus se pova ují za ne kodné komenzály, stafylokoky mohou být p vodci ady d le itých i mén významných infekcí lidí a zví at. V sou asné dob je popsáno 54 druh stafylokok (viz tab. 1). Spadají do dvou hlavních skupin na základ schopnosti enzymaticky pomocí koagulázy koagulovat plazmu. Nejvýznamn j ím zástupcem koaguláza pozitivních stafylokok 10

11 je Staphylococcus aureus (Murray et al. 2003, Petrá 2010), který pat í mezi hlavní patogeny rodu Staphylococcus. Stafylokoky ale také b n kolonizují k i lidí a zví at. Asi 30 % zdravých lidí jsou nosi i Staphylococcus aureus a je t vy í je výskyt stafylokok koaguláza-negativních. Stafylokoky koaguláza-negativní jsou v sou asnosti pova ované za významné podmín n patogenní bakterie, které mohou vyvolávat infekce spojené s implantací cizorodých materiál ortopedických i cévních protéz, cévních katétr a jiných implantát (Staphylococcus epidermidis) a infekce mo ových cest (Staphylococcus saprophyticus). Stafylokoky koaguláza-negativní se d íve do úrovn druhu v b né praxi neidentifikovaly, ale dnes, vzhledem k jejich nar stajícímu významu jako mo ných oportunních patogen, se jejich identifikace do druhu, u klinicky významných izolát provádí. Jejich identifikaci usnad ují moderní, rychlé metody, které jsou v sou asné dob k dispozici (Bene 2002, Greenwood et al. 1999, Murray et al. 2003). Tabulka 1: Seznam druh a poddruh rodu Staphylococcus (Murray et al. 2003, Petrá 2010) ROD DRUH PODDRUH ROK objevení Staphylococcus aureus * subsp. aureus 1884 Staphylococcus epidermidis 1916 Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus 1951 Staphylococcus capitis subsp. capitis 1975 Staphylococcus cohnii subsp. cohnii 1975 Staphylococcus haemolyticus 1975 Staphylococcus hominis subsp. hominis 1975 Staphylococcus simulans 1975 Staphylococcus warneri 1975 Staphylococcus xylosus 1975 Staphylococcus intermedius * 1976 Staphylococcus sciuri subsp. sciuri 1976 Staphylococcus hyicus * 1978 Staphylococcus carnosus subsp. carnosus 1982 Staphylococcus auricularis 1983 Staphylococcus caprae 1983 Staphylococcus gallinarum 1983 Staphylococcus lentus 1983 Staphylococcus sacharolyticus 1984 Staphylococcus arlettae

12 ROD DRUH PODDRUH ROK objevení Staphylococcus equorum subsp. equorum 1985 Staphylococcus kloosii 1985 Staphylococcus aureus * subsp. anaerobicus 1985 Staphylococcus chromogenes 1987 Staphylococcus lugdunensis 1988 Staphylococcus schleiferi* subsp. schleiferi 1988 Staphylococcus delphini * 1988 Staphylococcus felis 1989 Staphylococcus schleiferi * subsp. coagulans 1990 Staphylococcus capitis subsp. ureolyticus 1991 Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus 1991 Staphylococcus muscae 1992 Staphylococcus piscifermentans 1992 Staphylococcus pasteuri 1993 Staphylococcus vitulus 1994 Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis 1996 Staphylococcus sciuri subsp. carnaticus 1997 Staphylococcus sciuri subsp. rodentium 1997 Staphylococcus lutrae * 1997 Staphylococcus succinus subsp. succinus 1998 Staphylococcus condimenti 1998 Staphylococcus carnosus subsp. utilis 1998 Staphylococcus hominis subsp.novobiosepticus 1998 Staphylococcus fleurettii 2000 Staphylococcus succinus subsp. casei 2003 Staphylococcus equorum subsp. linens 2003 Staphylococcus nepalensis 2003 Staphylococcus pseudintermedius* 2005 Staphylococcus simiae 2005 Staphylococcus pettenkoferi 2007 Staphylococcus microti 2010 Staphylococcus rostri 2010 Staphylococcus devriesei 2010 Staphylococcus massiliensis 2010 * stafylokoky koaguláza pozitivní Koaguláza-pozitivní stafylokoky Mezi stafylokoky koaguláza-pozitivní pat í mimo jiné Staphylococcus aureus a Staphylococcus pseudintermedius. V humánním klinickém materiálu se vyskytují tém v dy kmeny Staphylococcus aureus ssp. aureus (dal ím známým poddruhem je S. 12

13 aureus subsp. anaerobius, který je p vodcem infekcí u ovcí). Staphylococcus pseudintermedius je izolován velice vzácn. Vyskytuje se obvykle u ps a dal ích druh zví at a byl popsán prof. Hájkem z Olomouce v roce Izolován bývá práv v souvislosti s pokousáním psem (Bedná et al. 1996, Hájek 1976, Lee 1994, Petrá et al. 1998). Z hlediska patogenity má tedy pro lov ka nejv t í význam Staphylococcus aureus zp sobující astá onemocn ní lov ka - od b ných infekcí lokálního charakteru v komunit, po celková onemocn ní spojená i se záva nými klinickými p íznaky, v etn mortality u hospitalizovaných pacient (Peleg et al. 2002) Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus se adí mezi biochemicky nejaktivn j í bakteriální druhy. Produkuje adu komplexních látek bun né st ny, exoenzym a toxin, z nich mnohé se uplat ují jako faktory virulence. Je dob e adaptovaný na kolonizaci k e a sliznic a spolu se streptokoky pat í mezi nej ast j í p vodce pyogenních infekcí nebo intoxikací lov ka i zví at (Bedná et al. 1996) Morfologie Staphylococcus aureus je grampozitivní kok o pr m ru cca 1 µm. Koky jsou uspo ádány typicky do shluk, v patologickém materiálu se mohou vyskytovat v párech nebo i ojedin le. Nesporulují, jsou nepohyblivé a obvykle netvo í pouzdro (Greenwood et al. 1999) Antigenní struktura. Bun ná st na stafylokok obsahuje peptidoglykan, kyselinu teichoovou a protein A. Peptidoglykan ú inkuje podobn jako endotoxin, podn cuje uvol ování cytokin a makrofág, aktivaci komplementu a shlukování krevních desti ek. Hlavní antigenní determinantou v ech kmen Staphylococcus aureus je skupinov specifický polysacharid A. Uplat uje se v adhezi na sliznice. Protein A je hlavní bílkovinnou sou ástí bun né st ny a spole ným skupinovým antigenem v t iny kmen. Jeho d le itou schopností je nespecificky reagovat s Fc-fragmentem imunoglobulin, a tím chránit stafylokoka p ed opsonizací protilátkami, schopnost p sobit proti ú inku 13

14 komplementu a fagocyt. Kapsulární antigeny lze prokázat u n kterých mukoidních kmen. Existují v 11 antigenních typech, v t ina klinicky významných izolát nále í k typu 5 nebo typu 8, které brání fagocytóze (Greenwood et al. 1999, Votava et al. 2003) Faktory virulence Faktory virulence (viz tabulka. 2) lze rozd lit na povrchové a extracelulární. Tabulka. 2: Faktory virulence Staphylococcus aureus (Greenwood et al. 1999) Faktory virulence 1) Polymery bun né st ny peptidoglykan kyselina teichoová povrchové bílkoviny: protein A shlukovací faktor protein vázající se na fibronektin protein vázající se na kolagen 2) Exoproteiny -lyzin -lyzin -lyzin -lyzin leukocidin Panton-Valentine epidermolytický toxin toxin syndromu toxického oku enterotoxiny volná koaguláza hyaluronidáza stafylokináza lipáza fosfolipáza deoxyribonukleáza proteázy Ú inek inhibitor zán tlivé reakce adsorpce fágu; zásoba vázaných dvojmocných kationt reakce s Fc-oblastí Ig G vazba na fibrinogen vazba na fibrinogen vazba na kolagen zm na permeability bun né membrány; cytotoxický ú inek na fagocyty a tká ové bu ky zpuchý ení k e systémový ú inek zvracení a pr jem zm na fibrinogenu na fibrin t pení kyseliny hyaluronové ve vazivu degradace fibrinu t pení lipid t pení fosfolipid t pení DNA t pení bílkovin 14

15 Povrchové faktory Mezi povrchové faktory pat í ji zmi ovaný peptidoglykan, protein A a pouzdro. Dal ím povrchovým antigenem je vázaná koaguláza neboli clumping factor, která vá e fibrinogen, m ní ho na fibrin, a tím vyvolává shlukování stafylokok. Dal í povrchové proteiny se vá ou nap. na elastin, kolagen nebo fibronektin a umo ují stafylokok m adherovat na tkán hostitele (Bene 2002, Votava et al. 2003) Extracelulární faktory Extracelulární faktory d líme na enzymy a toxiny. Mezi enzymy pat í koagulasa, katalasa, hyaluronidasa, lipasy, nukleasy, fibrinolyzin a penicilinasa. Ke stafylokokovým toxin m pat í cytolyziny (hemolyziny), enterotoxiny, toxin syndromu toxického oku a exfoliativní toxiny (Bene 2002, Votava et al. 2003). Takzvaná volná koagulasa na rozdíl od clumping-faktoru reaguje s plasmatickým faktorem za vzniku stafylothrombinu, který katalyzuje zm nu fibrinogenu na fibrin. Hyaluronidasa t pí kyselinu hyaluronovou v mezibun ném tmelu a usnad uje í ení stafylokok ve tkáních. Lipasy pomáhají stafylokok m invadovat mazové lázy a podko ní tká. Nukleasy jsou schopné napadat jádra leukocyt. Fibrinolyzin fibrinové sra eniny rozpou tí. Penicilinasa rozkládá ty lenný beta-laktamový kruh a inaktivuje tak beta-laktamová antibiotika (Bene 2002, Votava et al. 2003). Stafylokokové cytolysiny po kozují povrchovou membránu bun k. Alfa-hemolyzin rovn nazývaný alfa-toxin tvo í v t ina kmen Staphylococcus aureus. Alfa-hemolyzin vyvolává na krevním agaru z ov ích erytrocyt tém úplnou beta-hemolýzu a dokonale rozpou tí králi í krvinky (Bene 2002, Votava et al. 2003). Beta-hemolyzin je sfingomyelinasa C. Pravd podobn zodpovídá i za po kození tkání a tvorbu absces. Na krevním agaru (in vitro) má velice zajímavé ú inky. P esto e nejvíce p sobí na ov í erytrocyty, nerozpou tí je, ale t pí sfingomyelin jejich membrány na ceramid a fosforylcholin. Celistvost erytrocyt z stává zachována, ale zm ní se jejich stabilita a barva. K hemolýze erytrocyt dochází a sekundárn, nap íklad ú inkem chladu, CAMPfaktoru, equi-faktoru nebo stafylokokového delta-hemolyzinu. Antagonisticky p sobí 15

16 beta-hemolyzin v i alfa-hemolyzinu, to znamená, e beta-hemolyzin potla uje hemolýzu vyvolanou alfa-hemolyzinem (Bene 2002, Votava et al. 2003). Gama-hemolyzin je hemolyzin na krevním agaru neprokazatelný, proto e je agarem inhibován. U stafylokokové osteomyelitidy mívají nemocní vy í hladiny neutraliza ních protilátek proti tomuto toxinu (Bene 2002, Votava et al. 2003). Nejvýrazn ji na lidské erytrocyty p sobí delta-hemolyzin. Skoro v echny kmeny Staphylococcus aureus produkují delta-hemolyzin a i jiné druhy stafylokok tvo í stejnou nebo podobnou látku. Ve svém ú inku je inhibován lipoproteiny krevního séra, a proto se mnoho kmen stafylokok m e jevit na krevním agaru jako nehemolytické. Úplná beta-hemolýza vzniká spole ným ú inkem delta-hemolyzinu s beta-hemolyzinem na krevním agaru s ov ími erytrocyty. Zvýrazn ní synergického p sobení t chto toxin, i p sobení alfa-hemolyzinu na beraní erytrocyty, se dosáhne kultivací v mikroaerofilním prost edí (Bene 2002, Votava et al. 2003). Panton v-valentin v leukocidin se skládá ze dvou slo ek (LukS-PV and LukF-PV). V membrán neutrofil a makrofág tvo í póry a vede k lýze t chto bun k. Stafylokoky chrání p ed ú inkem leukocyt a uplat uje se v patogenezi vá ných infekcí k e i plicních zán t (Tristan et al. 2009, Votava et al. 2003). Stafylokokové enterotoxiny (A-E, G-R) je mo né prokázat p ibli n u poloviny kmen Staphylococcus aureus. Stafylokokové enterotoxiny jsou vysoce termostabilní molekuly, snesou p lhodinový var a odolávají ú inku trávicích enzym. Toxiny vyvolávají pr jem a zvracení. Nej ast j ím enterotoxinem u p vodc stafylokokových enterotoxikóz je enterotoxin A. U nemocni ních kmen je nej ast j ím enterotoxinem enterotoxin B, který m e vyvolávat pseudomembranosní enterokolitidu po antibiotické lé b. Kmeny produkující enterotoxiny m ou být p í inou i syndromu toxického oku (Greenwood et al. 1999, Votava et al. 2003). Toxin syndromu toxického oku 1 (TSST-1) je superantigenem, který zvy uje permeabilitu v endotheliích ji p i nepatrných koncentracích a zesiluje letální ú inek endotoxinu. P i syndromu toxického oku zodpovídá za p íznaky a multiorgánové selhání (Votava et al. 2003). Exfoliativní toxiny, exfoliatiny neboli epidermolytické toxiny jsou známy ty i, nejvíce se uplat ují ET-A a ET-B. Exfoliatiny A a B jsou proteolytické a rozpou t jí 16

17 mukopolysacharidovou matrix v epidermis a zp sobují tak infekci, které se íká stafylokokový syndrom opa ené k e (staphylococcal scaled skin syndrome - SSSS). P i této infekci dochází k olupování poko ky ve velkých plochách, mírn j í forma infekce se projevuje jako puchý naté onemocn ní (Bene 2002, Votava et al. 2003) Patogeneze Staphylococcus aureus vyvolává onemocn ní, která jsou nej ast ji hnisavá, p ípadn s celkovými toxickými p ípady nebo jde o otravy z potravin. Predispozicemi ke vzniku stafylokokových infekcí jsou poran ní, popáleniny, opera ní rány, cizí t lesa (implantované pom cky, ale i stehy), virové infekce (stafylokoková bronchopneumonie po ch ipce), diabetes mellitus, malignity, imunodeficity. Benigní ko ní infekce jsou asté, oproti tomu záva né stavy s posti ením vnit ních orgán a sepsí se vyskytují p evá n u disponovaných jedinc (Votava et al. 2003). Stafylokokové infekce se vyzna ují tvorbou ohrani ených zán tlivých lo isek, absces. Absces se plní hnisem, který vzniká z rozpadlých leukocyt a bakterií, stafylokokový hnis má smetanov lutou barvu a je bez zápachu. Pozdní p ecitliv lost v i stafylokokovým antigen m se podílí na vzniku p íznak u chronických stafylokokových infekcí. N kdy se m e stafylokokový hnisavý proces í it i jako flegmóna, která ale bývá spí e zp sobena streptokoky pyogenními (Votava et al. 2003) Patogenita Staphylococcus aureus se nej ast ji vyskytuje na nosní sliznici, na hrázi, v axilách a na vulv. Asi t etina populace jsou nosi i. Nozokomiální infekce zp sobené S. aureus bývají jednou z hlavních p í in morbidity a mortality (Murray et al. 2003, Votava et al. 2003). Nejb n j ími stafylokokovými infekcemi jsou hnisavá (purulentní) onemocn ní k e a jejich adnex, obecn nazývané pyodermie. Nej ast j í stafylokokové pyodermie jsou impetigo, folikulitida, furunkl a karbunkl (viz tab.. 3). Impetigo se vyskytuje typicky u malých d tí. Jsou to puchý e ulo ené jen povrchov v epidermis, obsah puchý e se rychle zakalí hnisem luté barvy, pokrývající se lutohn dou krustou. Folikulitida je hnisavá infekce vlasového folikulu, která za íná v mazové lázce a projevuje se jako 17

18 lutavá pustulka se zarudlým okolím. Sycosis barbae je chronická splývající folikulitida ve vousaté ásti obli eje. Na oku Staphylococcus auerus vyvolává nej ast ji zán t mazové lázky na okraji ví ka, nazývané hordeolum (je né zrno), a zán t ví ka spojený obvykle s hnisavým zán tem spojivky (conjunctivitis). Furunkl je ko ní absces vzniklý roz í ením zán tu foliklu do sousední káry. Mnoho etné furunkly, které se vyskytující p evá n na íji, se nazývají karbunkly. Epidemiologicky významný je zán t mlé né lázy u kojících en. Hnisavý zán t potní lázy se vyskytuje nej ast ji v podpa í. U n kterých jinak zcela zdravých jedinc mají stafylokokové pyodermie sklon probíhat opakovan a chronicky (Bene 2002, Votava et al. 2003). Tabulka. 3: Stafylokokové infekce (Greenwood et al. 1999) Staphylococcus aureus Pyogenní onemocn ní furunkly karbunkly infekce rány abscesy impetigo mastitida sepse osteomyelitida pneumonie Onemocn ní vyvolaná toxinem syndrom opa ené k e pemphingus neonatorum syndrom toxického oku otrava z potravin U stafylokokových sepsí není asto známo primární infek ní lo isko, nebo mohlo jít o zdánliv ne kodnou ranku na k i. Staphylococcus aureus se m e krví dostat do r zných tkání a orgán a v nich mohou vznikat abscesy. Velmi nebezpe nou je akutní stafylokoková endokarditida. Vegetace, které p i ní na srde ních chlopních nar stají, se skládají ze stafylokok obklopených mezibun nou hmotou. Jedná se o typ biofilmu, z kterého se uvol ují stafylokoky a jako septické vmetky jsou rozná eny po t le a vyvolávají vznik metastatických absces v k i, plicích, mozku, ledvinách. Osteomyelitis neboli stafylokokový zán t kostní d en m e vzniknout hematogenn nebo po úrazu. Pokud se vyskytuje v blízkosti kloub, m e se komplikovat hnisavou arthritidou. 18

19 B nými stafylokokovými infekcemi respira ního traktu jsou akutní zán ty vedlej ích dutin nosních a plic (Votava et al. 2003). Syndrom toxického oku je onemocn ní, které bylo objeveno v USA v roce Onemocn ní m e být zp sobeno kmeny, produkujícími p i svém mno ení v míst infekce TSST-1 nebo n který z enterotoxin. Onemocn ní se vyskytuje i v souvislosti s pou íváním menstrua ních tampón, kdy se v pochv, ucpané vysoce absorbujícím tamponem, vytvá ejí vhodné podmínky pro pomno ení stafylokok. Nedostatek cirkulujích protilátek proti TSST-1 je hlavním rizikovým faktorem pro vznik syndromu toxického oku (Greenwood et al. 1999). Hlavním klinickým a epidemiologickým problémem je v sou asnosti výskyt methicilin rezistentních kmen Staphylococcus aureus subsp. aureus (MRSA), které se za aly významn ji í it v 80. letech 20. století. Problém methicilinové rezistence spo ívá v obtí né lé itelnosti infekcí, proto e kmeny MRSA mají rezistenci i k ostatním laktamovým antibiotik m, a v t inou i k makrolid m, linkosamid m, aminoglykosid m, chloramfenikolu, chinolon m a tetracyklinu (Murray et al. 2003) Koaguláza-negativní stafylokoky Koaguláza-negativní stafylokoky tvo í hlavní ást normální mikroflóry sliznice a k e lov ka, a mohou se uplatnit i jako oportunní patogeny. Nej ast j ím a nejd le it j ím druhem koaguláza negativních stafylokok je Staphylococcus epidermidis, mén astými jsou Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis ssp. hominis a Staphylococcus warneri. Staphylococcus hominis ssp. novobiosepticus, poddruh Staphylococcus hominis rezistentní k novobiocinu, který je mnohem vzácn j í ne b ný poddruh Staphylococcus hominis ssp. hominis. U lov ka se vyskytují asi dv t etiny v ech popsaných KNS a jejich zastoupení je velice nerovnom rné (Petrá 1999, Votava et al. 2003). Z dal ích druh KNS rezistentních k novobiocinu je významný Staphylococcus saprophyticus ssp. saprophyticus, který je primárním uropatogenem. Dal í novobiocin rezistentní druhy viz tabulka

20 Tabulka. 4: Novobiocin rezistentní druhy KNS (Petrá 2010) Druhy rezistentní k novobiocinu S. saprophyticus ssp. saprophyticus S. cohnii ssp. cohnii S. xylosus S. lentus S. cohnii ssp. ureolyticus S. vitulinus S. hominis ssp. novobiosepticus S. sciuri ssp. sciuri Mikroskopie Základním diagnostickým barvením u ívaným v bakteriologii je metoda barvení dle Grama. Barvením dle Grama je mo né bakterie rozd lit na dv základní taxonomické skupiny: bakterie grampozitivní (G+) bakterie gramnegativní (G-) Rozd lení mikrób podle barvitelnosti dle Grama není samoú elné, ale odrá í adu anatomických a fyziologických vlastností mikrob, v etn jejich citlivosti na r zná antibiotika. Podstatou rozdíl v barvitelnosti dle Grama je rozdílná stavba bakteriální st ny. P i barvení vzniká v bakteriální bu ce komplex krystalové violeti s jódem, který se u gramnegativních bakterií snadno vyplavuje alkoholem nebo acetonem, u grampozitivních bakterií odbarvování po ur itou dobu vzdoruje. Av ak p i del ím p sobení alkohol a zejména aceton nebo metanol m e za ít odbarvovat i grampozitivní bakterie (Votava et al. 2000). Jednotlivé KNS nejsou mikroskopicky rozli itelné, zále í na stá í kultury (Votava et al. 2003). 20

21 Kultivace p d a morfologie kolonií Na b ných kultiva ních p dách (na krevním agaru) rostou n které KNS v pom rn velkých koloniích, jiné v drobných koloniích. Kolonie jsou pigmentovány bíle nebo bledo ed, u n kterých kmen mívají kolonie porcelánov bílé zbarvení (Staphylococcus epidermidis). Staphylococcus haemolyticus bývá bílý, ale m e r st i v na loutlých koloniích, obklopených hemolýzou a neodli itelných od Staphylococcus aureus. Staphylococcus pasteuri a xylosus mají lut pigmentované kolonie (Votava et al. 2003). Pro Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis ssp. novobiosepticus a Staphylococcus lugdunensis je typická tvorba hemolyzinu, který je dosti blízký hemolyzinu delta u Staphylococcus aureus. Staphylococcus pseudintermedius a oba poddruhy Staphylococcus schleiferi produkují stafylokokový beta-hemolyzin, který se pozná dle chladového efektu po ulo ení kultiva ních p d do chladni kové teploty nebo i del ím ponechání p i pokojové teplot (Votava et al. 2003) Druhová identifikace Druhová identifikace KNS humánního p vodu je zalo ena jednak na r zných biochemických znacích, a jednak na zji t ní citlivosti k novobiocinu. Mezi d le ité biochemické znaky pat í t pení mannitolu, mo oviny, trehalosy, sacharosy, xylosy, ornithinu a tvorba acetoinu, glukosidasy a pyrrolidonylarylamidasy. Základem identifikace stafylokok komer ními soupravami je práv kombinace t chto a dal ích test. Dnes jsou ale k dispozici i nové rychlé moderní metody identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie a identifikace pomocí analýzy DNA, která je dnes zlatým standardem pro za azení bakterií do druhu (Votava et al. 2003) Patogeneze Jako potenciální faktory virulence zástupce KNS, Staphylococcus epidermidis, byly ozna eny peptidoglykan a receptor pro transferin. Peptidoglykan vyvolává uvoln ní TNF-, IL-1 a IL- 6 z monocyt. Jako nejd le it j í adhesin byl popsán kapsulární polysacharid adhesin (PS/A), dal ími adhesiny jsou kyselina teichoová adherující na 21

22 aktivované trombocyty, stafylokokové povrchové proteiny SSP-1 a SSP-2, fibrinogen vázající protein a autolyzin E. Ve tvorb zralého biofilmu se anga ují p edev ím polysacharidový intercelulární antigen (PIA), s akumulací spjatý protein (AAP), se slizem asociovaný antigen (SSA) a extracelulární slizová substance (EES). Staphylococcus saprophyticus, p vodce mo ových infekcí zpravidla u mladých en, má zase na povrchu struktury, jimi adheruje na fibronektin a na epitelie mo ových cest a ty pak po kozuje enzymem ureasou (Bene 2002, Votava et al. 2003,). Koaguláza - negativní stafylokoky vyvolávají u zdravých lidí infekci jen vzácn, v t inou k tomu jako oportunní patogeny vy adují ur ité podmínky. P esto i tyto stafylokoky mohou vyvolat záva ná onemocn ní. Mezi osoby predisponované k infekcím vyvolaným koaguláza-negativními stafylokoky pat í nemocní se zavedenými i implantovanými pom ckami, imunokompromitovaní jedinci nezralí novorozenci s nevyvinutým opsonofagocytárním systémem a neutropenici a intravenózní narkomany závislé na heroinu (Votava et al. 2003). Mezi implantované pom cky, které se nej ast ji stávají zdrojem infekce, pat í intravenózní katétry a vstupy (flexily, porty), cévní protézy, um lé srde ní chlopn, likvorové spojky (shunty), kardiostimulátory (pacemakery) a jejich vývody, katétry k peritoneální dialýze, permanentní mo ové katetry a pom cky z kovu kloubní protézy, ortopedické rouby, fixa ní pom cky. Intravenozní katetr m e být kolonizován z k e podél zevního povrchu katétru, kontaminací vstupu do katétru s následnou migrací stafylokok skrze lumen nebo b hem bakteriémie ze vzdáleného lo iska. Stejn jako u cévních katétr, i na dal ích um lých pom ckách pacienta, m e dojít k jejich kolonizaci hematogenn p i klinicky nevýznamné bakteriémii. Ke kontaminaci um lých srde ních chlopní, kloubních protéz i likvorových shunt KNS dochází p edev ím b hem opera ních výkon. V uchycení na um lých povr ích hraje zásadní roli tvorba biofilmu. Následný infek ní proces probíhá obvykle pomalu a pom rn indolentn, výrazn j í p íznaky se dostavují a po mnoha m sících (Votava et al. 2003). 22

23 1.2 Obecné zásady odb ru a transportu materiálu na mikrobiologické vy et ení Cílem mikrobiologického vy et ení je pr kaz mikroorganism ve vzorcích klinického materiálu, a rychlá a p esná identifikace bakteriálních izolát, která je d le itá v indikovaných p ípadech a pop. stanovení jeho citlivosti k antimikrobiálním látkám. Mikrobiolog by m l zhodnotit význam nálezu daného mikroba a posoudit, zda se jedná o etiologické agens, nebo zda je prokázaný mikrob sou ástí b né mikroflóry, i je nález jen d sledkem ne ádoucí kontaminace. Velmi významným p edpokladem úsp nosti a smysluplnosti mikrobiologického vy et ení je správná volba druhu odebíraného materiálu. D le itým je zárove i správný zp sob odb ru vzorku, a to z d vodu nebezpe í kontaminace vzorku b nou mikroflórou z okolí místa odb ru nebo mikroby ze zevního prost edí. Nemén jsou d le ité i správné podmínky transportu vzork, které zajistí kvalitu vzorku a zabrání jeho znehodnocení ve smyslu fale né negativity vzorku nebo zm n proporciálních pom r bakterií ve vzorku (Votava et al. 1998) Odb r materiálu Vzorek pro bakteriologické vy et ení je nutné odebrat p ed zahájením antimikrobiální lé by. Pokud byla lé ba ji zahájena, je nutné uvést pou ívaná antimikrobiální lé iva v ádance na vy et ení. Odb r by m l být proveden z místa práv probíhajícího infek ního procesu a odpovídající uvedené klinické diagnóze. Odb r by m l být proveden správnou technikou v dostate ném mno ství do vhodné, sterilní odb rové soupravy. Tkán a tekutý materiál jsou vhodn j í ne st ry a výt ry, zejména p i po adavku i na anaerobní kultivaci. Aerobní i anaerobní kultivace se provádí z jednoho vzorku. St ry a výt ry odebírat za pou ití odb rového tampónu s transportním médiem, které zaji uje p vodní kvantitativní slo ení vzorku bez p er stání rychleji rostoucích, asto kolonizujících nebo kontaminujících bakterií. Správn odebraný vzorek by m l být urychlen transportován do laborato e, kde je zpracován pomocí standardních metod, které vedou k izolaci etiologického agens infekce. Je-li infek ní onemocn ní provázeno celkovými známkami infekce (hore ka, zvý ený po et leukocyt a dal ích marker zán tu, atd.) je d le itou sou ástí diagnostiky kultivace krve v hemokultiva ních lahvi kách. 23

24 Odb r krve na hemokulturu se provádí u pacient se septickým stavem. Samotný odb r krve na hemokulturu musí být proveden lege artis, jinak m e dojít k tomu, e výsledek bude fale n pozitivní nebo negativní a mohlo by tak dojít k po kození pacienta. Krev musí být odebrána za p ísného dodr ení zásad asepse. Po et odb r na hemokulturu by m l být minimáln dva, nejlépe t i odb ry, a lépe alespo v hodinových intervalech, ne -li najednou. Krev je nutno odebírat p ed nasazením antibiotik, pokud je pacient ji lé en, je pot eba krev odebrat t sn p ed podáním dal í dávky antibiotik (Votava et al. 1998, Votava et al. 2010) Laboratorní diagnostika Kultiva ní pr kaz koaguláza negativních stafylokok vzhledem k jejich nenáro nosti ne iní zvlá tní problémy. Podrobná identifikace KNS je v sou asnosti nutná u izolát z krve a dal ích za normální situace sterilních míst (likvor). Jako základní test k rozli ení od koaguláza - pozitivních stafylokok je vyu ívána komer ní souprava k pr kazu plazmakoagulázy a následn biochemická identifikace. To v t inou umo ní za adit kmen do p íslu ného taxonu. V sou asné dob se k identifikaci koaguláza negativních stafylokok vyu ívá i hmotnostní spektrometrie technologií MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry; Petrá 2000, Votava et al. 2003) Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight) umo uje stanovení aminokyselinové sekvence specifických cílových protein, ale v rutinní laboratorní praxi je zam ena p edev ím na identifikaci bakteriálních druh (Carbonnelle et al. 2007, Glowalla et al. 2009). Hmotnostní spektrometrie obecn je zalo ena na rozd lení nabitých ástic podle jejich molekulových hmotností v elektrickém/magnetickém poli. Dosavadní zp soby ionizace a detekce umo ovaly analyzovat látky jen s nízkou molekulovou hmotností. Po dvou desetiletích výzkum bylo zji t no, e ke generování iont u látek s vy í molekulovou 24

25 hmotností, je laserem zapot ebí zajistit efektivní a kontrolovatelný p enos energie na vzorek a zárove zamezit jeho tepelnému rozkladu. Ob podmínky jsou spln ny, pokud molekula rezonan n absorbuje p i vlnové délce laseru a tedy energie foton laseru je rovna energii pot ebné k vybuzení dané molekuly a tím i k její ionizaci, a pokud se p enos energie d je ve velmi krátkém ase, ádov v jednotkách a desítkách nanosekund (Havli 1999). Molekuly vzorku jsou ionizovány laserem p ímo, v t inou se v ak t pí ne ádoucím zp sobem. Z toho d vodu se za ala pou ívat matrice. P i p enosu ioniza ní energie laseru na molekuly vzorku p es matrici, je zabrán no jejich t pení. Ionizace laserem p es matrici umo uje m it jiné molekulové hmotnosti v tém e vzorku. Ke stanovení vy ích molekulových hmotností se pou ívá ionizace laserem za p ítomnosti matrice (MALDI, matrix assisted laser desorption/ionization) v kombinaci s detektorem doby letu (TOF, time-of-flight). Detektor umo uje zm it dobu pr letu a z ní lze vypo ítat rychlost ástice (Havli 1999). P i identifikaci je provád na analýza vzorku ( ást bakteriální kolonie) p evrstveného matricí. Matrice absorbuje laserové sv tlo a za vzniku elektrického náboje se spolu se vzorkem odpa í (dojde k ionizaci). Extrak ní desti ky zaji ují vysokonap ová elektrická pole, které ionizované ástice urychlují sm rem vzh ru, do vakuové trubice, kde dochází k jejich rozd lení podle hmotnosti a doby letu (men í a leh í molekuly letí rychleji ne v t í). Výsledky jsou zobrazeny ve form k ivek (pík ), které odpovídají r zným fragment m p vodních molekul ve vzorku. Spektra jsou porovnávána s databází spekter r zných druh bakterií a jsou nabídnuty výsledky druhy a poddruhy mikroorganism, kterými m e vzorek být a procentuální pravd podobnost (spolehlivost identifikace). Zaznamenaný signál je softwarov zpracován a prezentován jako graf intenzity v závislosti na hmotnosti v Daltonech (Da). (biomérieux S.A., 2011). Hlavním p ínosem MALDI-TOF MS technologie pro mikrobiální identifikaci je mo nost získat identifikaci pomocí jediné kolonie, co eliminuje pot ebu subkultury a dal í inkubaci (Anderson et al. 2012, biomérieux S.A. 2011, Garcia et al. 2012, Cherkaoui et al. 2010, Nagy et al. 2011). 25

26 2. Cíl práce Cílem této bakalá ské práce bylo zhodnocení sou asných mo ností laboratorní diagnostiky stafylokokových infekcí a porovnání r zných metod u ívaných k podrobné identifikaci koaguláza negativních stafylokok v rutinní praxi v Laborato i léka ské mikrobiologie, Pracovi ti bakteriologie v Nemocnici eské Bud jovice a.s.. Tato bakalá ská práce se primárn zabývá koaguláza-negativními stafylokoky (KNS). 26

27 3. Metodika Identifikace stafylokok byla provád na v Laborato i léka ské mikrobiologie na Pracovi ti bakteriologie v Nemocnici eské Bud jovice a.s.. Diagnostika stafylokokových infekcí byla provád na pomocí mikroskopického vy et ení a kultivace odebraných vzork na neselektivních i selektivních pevných médií. Základní rozli ení stafylokok koaguláza - pozitivních a - negativních bylo provád no na základ výsledk latexové aglutinace. Následn byla u 52-ti kmen stafylokok koaguláza-negativních (STKN) provedena druhová identifikace. Kmeny STKN byly izolovány z centrálních ilních katétr (C K), hemokultur a jiných klinicky záva ných materiál. Druhová identifikace v ech 52 kmen STKN byla provád na biochemickou identifikací STAPHYtestem 16 (fa. Erba Lachema) a paraleln hmotnostní spektrometrií technologie MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry; systém VITEK MS TM, fa. biomérieux). 3.1 Mikroskopie Na Pracovi ti bakteriologie byl u v ech tekutých vzork, st r a hemokultur zhotoven mikroskopický preparát barvený dle Grama. Jedna a dv kapky tekutého materiálu byly p eneseny na podlo ní sklí ko a byl vytvo en rovnom rný tenký rozt r. Následn byl nát r ponechán do zaschnutí a ofixován nad plamenem. V p ípad st r nebo výt ru na odb rovém tamponu bylo tamponem rolováno po podlo ním skle tak, aby nedo lo k destrukci celulárních element, a poté byl preparát fixován nad plamenem. Manuální barvení preparátu: p evrstvení fixovaného preparátu krystalovou violetí (20 sekund) p elití Lugolovým roztokem (20 sekund) odbarvení alkoholem (dokud stále odtéká zbarvení) opláchnutí vodou barvení karbolfuchsinem (1 minuta) opláchnutí vodou a su ení 27

28 Na pracovi ti PBAK byl k barvení pou íván automatický barvící systém MIRASTAINER II. Postup barvení byl zachován. Po dokon ení barvení byly preparáty vyhodnoceny pod mikroskopem. Jako grampozitivní byly identifikovány bakterie, které jsou v preparátu zbarveny mod e, jako gramnegativní bakterie zbarvené erven. V mikroskopickém preparátu, barveném podle Grama jsou stafylokoky viditelné jako grampozitivní koky, vyskytující se jednotliv, v párech i v nepravidelných shlucích. 3.2 Kultivace Stafylokoky rostou na b ných kultiva ních p dách. Ke kultivaci odebraných klinických vzork v PBAK bylo pou íváno neselektivní médium CSB (krevní agar s 5 % beraní krve, fa. BIO-RAD) nebo selektivní p da pro záchyt grampozitivních bakterií CNA (Columbia agar s kolistinem a kyselinou nalidixovou fa. BIO-RAD). Pevné p dy byly inkubovány a 48 hodin p i 36±1 C v termostatu, nár st STKN byl pozorován jako okrouhlé kolonie o pr m ru 2-3 mm, s hladkým lesklým povrchem. Kolonie byly nepr hledné, v t inou pigmentované (zlato lut, bé ov, smetanov bíle) Kultivace hemokultur Krev je kultivována v uzav eném automatickém systému v tzv. hemokultiva ních nádobkách (hemokulturách) p i 36±1 C. K jejich inkubaci je pou íván automatický systém, který umo uje nep etr ité sledování r stu bakterií, co umo uje rychlé informování klinických léka o jejich pozitivit (La Scola et al. 2009). Na Pracovi ti PBAK je pou íván automatický hemokultiva ní systém BacT/ALERT 3D (fa. biomérieux), který je p ístupný pro zakládání hemokultiva ních lahvi ek 24 hodin. Princip detekce je zalo en na kolorimetrické detekci oxidu uhli itého (CO 2 ). V automatickém systému se projeví r st mikrob zvý ením tenze CO 2 v hemokultiva ní lahvi ce, systém na tuto zm nu reaguje optickým a akustickým signálem obsluze. Lahvi ky jsou ozna eny títkem s identifika ními údaji pacienta (SOP). V p ípad 28

29 jejich pozitivity byly lahvi ky vyjmuty z p ístroje BacT/ALERT 3D. Z média pozitivní hemokultury byl p ipraven mikroskopický preparát, který byl barven dle Grama (viz vý e). Médium z hemokultury poté bylo nao kováno na vhodné pevné kultiva ní p dy (neselektivní krevní agar s 5% beraní krve a selektivní MacConkeyho agar pro gramnegativní bakterie). Kultivace pevného média probíhala hodin p i 36±1 C v termostatu. Po této dob byl hodnocen nár st na kultiva ních médiích, provedena identifikace izolovaných kultur a stanovení testu citlivosti k antibiotik m Kultivace centrálních ilních katétr Distální centrální ilní katétry (C K) o velikosti 5 cm byly asepticky odebrány do sterilních zkumavek a bezprost edn transportovány do laborato e ke kultivaci. Zde jsou katétry kultivovány za pou ití metody dle Makiho (Maki et al. 1977, Patil et al. 2011). Vzorky byly inokulovány na doporu ená základní pevná média a byly kultivovány s cílem záchytu suspektních kolonií patogen. Katétry byly za pou ití sterilní pinzety steriln p eneseny na pevnou kultiva ní p du CSB. Následn byla kanyla opakovan rolována po povrchu média za pomoci sterilní pinzety a steriln p enesena a zcela pono ena do tekuté pomno ovací p dy (thioglykolátová pomno ovací p da fa. Dulab). Kultiva ní p dy byly inkubovány p i teplot 36±1 C, a 48 hodin aerobn v termostatu. Po inkubaci bylo provedeno semikvantitativní hodnocení kultivace. V p ípad nálezu suspektního p vodce byla provedena identifikace (Isenberg 2007) Kultivace tekutého materiálu a výt r /st r Materiál byl do laborato e transportován ve sterilních transportních nádobkách a na výt rových tamponech (suchá výt rovka, sterilní tampón v transportní p d ). Vzorky byly inokulovány na doporu ená základní, selektivní a selektivn -diagnostická média. U tekutého materiálu (punktáty, hnisy) byla posuzována konzistence vzorku. Serózní (pr hledný) materiál byl centrifugován 3 minuty p i 2500 otá kách, supernatant odsán do sterilní sklen né zkumavky (ve zkumavce se sedimentem bylo ponecháno cca 0,5-1 29

30 ml supernatantu) a ponechán pro event. dodate né testy. Sediment byl resuspendován ve zbývajícím supernatantu a inokulován na kultiva ní p dy pro aerobní a anaerobní kultivaci-pevné p dy (CSB, MacConkey agar, Schaedler agar - fa. BIO-RAD) a tekuté pomno ovací p dy (thioglykolátová pomno ovací p da, anaerobní pomno ovací p da s parafínem fa. Dulab). Purulentní (vazký) materiál byl inokulován p ímo, bez centrifugace na kultiva ní p dy. Kultiva ní p dy byly inkubovány p i teplot 36±1 C, a 48 hodin aerobn a hodin p i teplot 36±1 C anaerobn v termostatu. Výt ry/st ry byly inokulovány na pevné kultiva ní p dy (CSB, MacConkey agar) a tekutou pomno ovací p du (thioglykolátová pomno ovací p da). Kultiva ní p dy byly inkubovány p i teplot 36±1 C, a 48 hodin aerobn v termostatu. U v ech materiál byl zhotoven mikroskopický preparát (viz 3.1). Po inkubaci bylo provedeno hodnocení kultivace. V p ípad nálezu suspektního patogenu byla provedena identifikace p íslu nými metodami (Isenberg 2007). 3.3 Identifikace K základní identifikaci bylo vyu íváno zhodnocení morfologie kolonií na pevných p dách, produkce katalázy a latexová aglutinace Kataláza Kataláza slou í k základnímu odli ení od streptokok a enterokok. Enzym kataláza rozkládá peroxid vodíku (H 2 O 2 ) na vodu (H 2 O) a plynný kyslík (O 2 ). Projevem pozitivní reakce je bublání uvoln ného kyslíku. Streptokoky, enterokoky a stafylokoky mohou mít n kdy podobnou makroskopickou morfologii. Stafylokoky jsou kataláza pozitivní, zatímco streptokoky a enterokoky jsou kataláza negativní. Katalázu netvo í pouze jediné dva striktn anaerobní stafylokoky a to Staphylococcus saccharolyticus a Staphylococcus aureus ssp. anaerobius (Petrá 2000). K provedení testu byl pou íván 3% roztok H 2 O 2, který byl p ipraven z ed ním koncentrovaného 30% peroxidu vodíku destilovanou vodou v pom ru 1:10. Na podlo ní 30

31 sklí ko byly p eneseny narostlé kolonie testovaného kmene a zakápnuty 3% roztokem H 2 O Rozli ení stafylokok koaguláza - pozitivních a stafylokok koaguláza - negativních Ke zji t ní produkce vázané koagulázy latexovou aglutinací byl pou íván PROLEX TM STAPH LATEX KIT (fa. PRO-LAB Diagnostic). Tento test umo uje rozli ení stafylokok koaguláza - pozitivních a koaguláza - negativních. Principem testu je detekce vázané koagulázy, tzv. clumping faktoru, proteinu A a kapsulárního polysacharidu Staphylococcus aureus. Na latexových ásticích jsou navázané specifické monoklonální protilátky, a v p ítomnosti homologního antigenu dochází k aglutinaci latexových partikulí (SOP). Na testovací kartu byla kápnuta kapka latexové suspenze Staph Test Latex Reagent. Jednorázovou kli kou bylo p eneseno n kolik kolonií testovaného kmene a smícháno s kapkou latexu. Suspenze byla krou ivým pohybem promíchávána p ibli n 10 sekund a homogenizována jemným kýváním a rotací karty. Výsledek byl viditelný do 30 sekund. V p ípad pozitivní reakce byla provád na negativní kontrola, kterou bylo mo né odli it spontánn aglutinující kmeny a kmeny koaguláza pozitivní. P i pozitivní reakci do lo b hem 30 sekund od za átku homogenizace suspenze k vytvo ení aglutinátu. Kmen koaguláza - pozitivní neaglutinuje s negativní kontrolou. P i negativní reakci nedo lo k vytvo ení aglutinátu Druhová identifikace stafylokok koaguláza - negativních Biochemická identifikace Biochemická identifikaci stafylokok byla provád na pomocí soupravy STAPHYtest 16 (fa. Erba Lachema). Souprava je vyu ívána k identifikaci bakterií rodu Staphylococcus a ostatních grampozitivních kataláza pozitivních kok. Soupravu STAPHYtest 16 je mo né vyu ít k identifikaci edesáti kmen pomocí estnácti biochemických test. T chto estnáct biochemických test je umíst no v jamkách mikrotitra ní desti ky ve 31

32 dvou adách po osmi jamkách. Dal ími testy, kterými bylo mo né doplnit identifikaci, byl pr kaz tvorby acetoinu (VP test), pyrrolidonylarylamidázy (PYRA test) a oxidázy (OXI test; Lachema 2011). K testování byla pou ita istá kultura kmene STKN. N kdy bylo mo né k testování pou ít i primokulturu, v p ípad sm sných primokultur byla nejprve provedena izolace na krevní agar (CSB). istá kultura byla testována na pr kaz produkce katalázy (viz vý e). Pokud byl test pozitivní, grampozitivní, kataláza pozitivní koky byly identifikovány soupravou STAPHYtest 16. Z isté 24 hodin staré kultury byla p ipravena suspenze ve fyziologickém roztoku o hustot 2 stup McFarlanda. Pokud by nebyla suspenze doporu ené denzity, mohla by vést k chybné identifikaci kmene. Pro ov ení istoty inokula bylo stejnou kli kou, kterou byla p ipravena suspenze, provedeno rozo kování na krevní agar (CSB). Agar byl inkubován v termostatu p i 36±1 C. istota kultury byla posuzována po 24 hodinách inkubace. P ipravená suspenze testovaného kmene byla p ed inokulací d kladn homogenizována. 0,1 ml suspenze byl inokulován do jamek p íslu ných dvou ad v desti ce slou ících k testování 1 kmene (viz obrázek. 1) p i inokulaci bylo dbáno na to, aby nedo lo ke kontaminaci sousedních jamek) 32

33 Obr.. 1: Schéma inokulace k jamkám H, G, a F prvé ady (testy ureáza, arginin a ornithin) byly p idány po inokulaci 2 kapky sterilního parafinového oleje do zbytku suspenze o hustot 2 stup McFarlanda (1 ml suspenze) ve zkumavce byl vlo en prou ek VP testu 33

34 byl proveden diskový test citlivosti na novobiocin pro rozli ení rod a druh stafylokok a mikrokok ráme ek s nao kovanými biochemickými testy byl vlo en do inkuba ního sá ku STAPHYtest 16 i zkumavky s VP testem byly vlo eny do termostatu, VP test byl inkubován 1,5 hod., desti ky 24 hodin p i teplot 36±1 C. po 1,5 h inkubaci byla hodnocena reakce ve zkumavce s prou kem VP testu o do zkumavky bylo p idáno po 3 kapkách inidla pro VPT I a inidla pro VPT II, obsah zkumavky byl ádn homogenizován a inkubuje dal ích 30 minut p i 36±1 C o po uplynutí doby inkubace byla VP reakce ode tena. P i hodnocení STAPHYtestu 16 byla pou ita barevná srovnávací stupnice, p ípadn tabulka Interpretace reakcí v návodu výrobce, nebo barevné reakce kontrolních kmen. po 24 hodinách inkubace byly jamky zakapány inidly o ada, jamka B (Nitráty) 1 kapka inidla pro NIT o ada, jamka A (Fosfatáza) 1 kapka inidla pro PHS v echny ode tené testy a výsledky byly zapsány do formulá e pro záznam výsledk (viz obrázek. 2) a byla vyhodnocena identifikace. 34

35 Obr.. 2 Formulá pro záznam výsledk STAPHYtest 16 Identifikace byla provád na pomocí Diagnostického seznamu pro STAPHYtest 16. P i identifikaci byla posuzována kultura komplexn. Byl hodnocen charakter kolonií, pigmentace, hemolýza, mikroskopie, p vod izolátu, dal í znaky. 35

36 Interpretace výsledk byla provád na dle identifika ní tabulky (viz tab.. 5). Tabulka. 5: Interpretace výsledk STAPHYtest 16 (fa. Erba Lachema s.r.o) 36

37 Identifikace hmotnostní spektrometrií technologie MALDI- TOF Mikrobiální identifikace metodou MALDI TOF MS se skládá ze ty krok 1) získání erstvé kultury, 2) analýza hmotnostního spektra, 3) srovnání výsledného spektra s internetovou databází, 4) vyhodnocení výsledk. Pro identifikaci v t iny izolát byla vybrána z pevných kultiva ních médií jedna kolonie a pomocí jednorázové kli ky nanesena p ímo do ter íku na nosi. Na pracovi ti PBAK je pou íván hmotnostní spektrometr VITEK MS TM (fa. biomérieux), pracující metodou MALDI TOF, který umo uje analyzovat 48 a 144 vzork v jedné analýze (Anderson et al. 2012, biomérieux S.A. 2011, Garcia et al. 2012, Cherkaoui et al. 2010, Nagy et al. 2011). Obr.. 3 P ístroj MALDI TOF VITEK MS TM fa. biomérieux (Zdroj: autorka) 37

38 Kmeny STKN z primokultur nebo subkultur byly izolovány na krevním agaru. Vzorky k m ení byly izoláty z erstvé kultury inkubované maximáln 72 hodin. K m ení na hmotnostním spektrometru VITEK MS TM byla krom erstvé kultury m eného vzorku nutná i erstvá kultura kalibra ního kmene Escherichia coli ATCC 8739, který bylo pot eba inkubovat hodin na CSB p i teplot 36±1 C. Jako nosi byl pou íván jednorázový nosi VITEK MS DS se 48 pozicemi na vzorky. Ka dý nosi obsahoval t i m ící skupiny po 16 pozicích, uprost ed ka dé m ící skupiny byla jedna pozice ur ena pro kalibrátor, kam byla aplikovaná erstvá kultura kalibra ního kmene Escherichia coli ATCC 8739 (pozice kalibrátoru xa1, xb1, xc1, viz obr.. 4). Tyto t i pozice slou ily pro kalibraci. Obr.. 4: P íprava nosi e (biomérieux S.A., 2011) Kalibrovanou kli kou o objemu 1 l byla nabrána ást testované kolonie kmene STKN (vzorek) a aplikována do st edu pozice. Vzorek byl rozet en rovnom rn po celé plo e testovací pozice. Na pozici se vzorkem byl následn aplikován 1µl matri ního roztoku HCCA (kyseliny -kyano-4-hydroxy-sko icové). Po zaschnutí vzork na nosi i byl nosi (viz obr.. 4) zalo en do systému. Nosi s nao kovanými vzorky byl do p ístroje vlo en p es na tení árového kódu nosi e te kou. Po na tení árového kódu byl adaptér (viz obr. 5) s nosi em zasunut do p ístroje a systém od erpal vzduch z vakuového systému. Ve chvíli kdy vakuový systém dosáhl provozního tlaku, systém automaticky spustil analýzu. 38

39 Obr.. 5: Adaptér pro ulo ení nosi e se vzorky U ka dé m ící skupiny 16 vzork nejprve do lo k prom ení kontrolního kmene v kalibra ní pozici. Pokud se kalibrace zda ila, analyzátor p e el k první pozici vzorku v dané skupin. Pokud p i kalibraci zm ená spektra neodpovídají spektr m o ekávaným u kontrolního kmene (nap. p i nesprávném nanesení kontrolního kmene na pozici) p ístroj ohlásí chybu a daná skupina vzork nebude zm ena. Po dokon ení m ení je kalibra ní pozice zkontrolována znovu. Pokud se vnit ní kalibrace nezda ila, p ístroj zaslal chybovou zprávu na analytický server. V tomto p ípad nedo lo k zobrazení výsledk ve form spekter, která odpovídala r zným fragment m p vodních molekul ve vzorku (viz obr.. 6). Spektra vzork pak byla porovnána s databází spekter známých kmen v softwaru p ístroje VITEK MS. 39

40 Obr.. 6: Obrazovka systému VITEK MS TM Acquisition Station (biomérieux S.A., 2011) Po porovnání spekter byla vypo ítána procentuální pravd podobnost vypovídající o mí e shody vzorku s typickým spektrem daného mikroorganismu v databázi. P i dokonalé shod byla pravd podobnost 99 %. Za pravd podobn správné ur ení bylo mo né pokládat hodnoty %. Pokud pravd podobnost klesla pod 60 %, byl vzorek pova ován za neidentifikovaný (viz tab.. 6). Pokud nebyl jednozna n ur en jeden druh, systém nabídl seznam mo ných kmen nebo sd lil, e vzorek nebylo mo né identifikovat (biomérieux S.A. 2011). 40

41 Tabulka. 6: Výsledek identifikace (biomérieux S.A., 2011) Spolehlivost identifikace Po et kandidát Dobrá ,9 Pravd podobnost (%) Poznámky Nízké rozli ení 2-4 < 60 Nutno ur it dal ími testy Neidentifikováno Neodpovídá ádnému spektru v databázi 41

42 4. Výsledky Ve své bakalá ské práci jsem provád la druhovou identifikaci 52 kmen stafylokok koaguláza-negativních izolovaných v období od prosince 2012 do b ezna Kmeny byly identifikovány pomocí biochemické identifikace STAPHYtestem 16 (fa. Erba Lachema) a zárove hmotnostní spektrometrií technologií MALDI-TOF systémem VITEK MS TM (fa. biomérieux). V ech 52 kmen STKN bylo izolováno z klinicky záva ných materiál v laborato i Léka ské mikrobiologie Nemocnice eské Bud jovice a.s.. Nejvíce kmen STKN bylo izolováno z hemokultur (25 kmen ), dále pak z centrálních ilních katétr (C K; 17 kmen ), z katétr jiných ne C K (4 kmeny), z punktát (3 kmeny), z hnis (2 kmeny) a z výt r z ran (1 kmen). U v ech 52 kmen byla provedena základní identifikace testem p ítomnosti katalázy a latexovou aglutinací. V echny kmeny STKN pou ité v této práci byly kataláza pozitivní, plasma koaguláza negativní. 4.1 Identifikace kmen STKN biochemicky (STAPHYtest 16) V tabulce. 7 jsou uvedeny výsledky z biochemické identifikace za pou ití STAPHYtest 16 u 52 kmen STKN. Z 52 kmen byla u 25 kmen identifikace výborná (48,1 %), u 8 kmen velmi dobrá (15,4 %), u 2 kmen dobrá (3,8 %). U 5 kmen byla identifikace intermediární (9,6 %). 12 kmen se testem nepoda ilo identifikovat (23,1 %). Celková úsp nost identifikace byla 67,3 %. Tabulka. 7: Výsledky biochemické identifikace Identifikace Po et kmen výborná 25 velmi dobrá 8 dobrá 2 intermediární 5 neidentifikováno 12 Celková úsp nost metody % 67,3 42

43 4.2 Identifikace kmen STKN systémem VITEK MS TM V echny kmeny STKN byly identifikovány systémem VITEK MS TM. Z 52 kmen se nepoda ilo identifikovat 2 kmeny a u 50 kmen byla spolehlivost identifikace s 99,9% pravd podobností. Celková úsp nost identifikace byla 96,2 %. Tabulka. 8: Výsledky identifikace metodou MALDI-TOF Spolehlivost Po et identifikace kmen Pravd podobnost % dobrá 50 99,9 nízké rozli ení 0 neidentifikováno 2 Úsp nost metody % 96,2 4.3 Porovnání identifikace kmen STKN biochemicky ( STAPHYtest 16) metodou MALDI TOF MS systémem VITEK MS TM Identifikace kmen STKN za azených do studie byla provád na paraleln ze shodné kultury. Porovnání obou metod je uvedeno v tabulkách. 9 a. 10. Identifikace byla shodná u 38 kmen a u 2 kmen do lo k rozporu výsledku. Metodou MALDI-TOF MS se nepoda ilo identifikovat 2 kmeny, biochemickou identifikací STAPHYtest 16 se nepoda ilo identifikovat 12 kmen. Tabulka. 9: Porovnání identifikace kmen STKN metodami biochemické identifikace a MALDI-TOF Po et identifikovaných Identifikace kmen STKN shoda 38 rozpor 2 neidentifikováno p ístrojem VITEK MS 2 neidentifikováno testem STAPHYtest

44 Tabulka. 10: Výsledky identifikace jednotlivými metodami Kmen. STAPHYtest 16 MALDI TOF MS 1 STHH STHH 2 STEP STEP 3 STEP neidentifikováno 4 STEP STEP 5 STEP STEP 6 neidentifikováno STCA 7 STEP STEP 8 STEP STEP 9 neidentifikováno neidentifikováno 10 STWA STWA 11 STWA STWA 12 neidentifikováno STEP 13 neidentifikováno STEP 14 neidentifikováno STHA 15 STLU STLU 16 STEP STEP 17 STCA STHA 18 neidentifikováno STEP 19 STEP STEP 20 STHH STHH 21 STLU STLU 22 STHH STHH 23 STEP STEP 24 STEP STEP 25 neidentifikováno STCA 26 STWA STWA 27 STEP STEP 28 neidentifikováno STCP 29 STEP STEP 30 neidentifikováno STHH 31 STEP STEP 32 STEP STEP 33 STEP STEP 34 STEP STEP 35 neidentifikováno STHH 36 STEP STEP 44

45 Kmen. STAPHYtest 16 MALDI TOF MS 37 STEP STEP 38 STEP STEP 39 STEP STEP 40 STEP STEP 41 STEP STEP 42 STEP STEP 43 STEP STEP 44 STEP STEP 45 neidentifikováno STCA 46 STEP STEP 47 STEP STEP 48 STEP STEP 49 STEP STEP 50 STHH STHO 51 neidentifikováno STHO 52 STEP STEP intermediární identifikace Vysv tlivky: STEP Staphylococcus epidermidis, STHH Staphylococcus hominis ssp. hominis, STCA Staphylococcus capitis, STWA Staphylococcus warneri, STHA Staphylococcus haemolyticus, STLU Staphylococcus lugdunensis, STCP - Staphylococcus caprae, STHA Staphylococcus hominis 4.4 Zastoupení jednotlivých kmen STKN dle výsledk identifikace metodou MALDI-TOF MS systémem VITEK MS TM Metodou MALDI-TOF bylo 32 kmen STKN dour eno jako Staphylococcus epidermidis (64 %), 5 kmen Staphylococcus hominis ssp. hominis (10 %), 3 kmeny Staphylococcus capitis a Staphylococcus warneri (6 %), 2 kmeny Staphylococcus lugdunensis a Staphylococcus hominis (4 %), 1 kmen byl dour en jako Staphylococcus caprae (2%). 45

46 Tabulka. 11: Identifikace kmen STKN metodou MALDI-TOF Výsledek identifikace Po et % zastoupení ze kmen skupiny STKN Staphylococcus epidermidis Staphylococcus hominis ssp. hominis 5 10 Staphylococcus capitis 3 6 Staphylococcus warneri 3 6 Staphylococcus lungdunensis 2 4 Staphylococcus haemolyticus 2 4 Staphylococcus hominis 2 4 Staphylococcus caprae 1 2 V grafu. 1 je znázorn no (v %) zastoupení jednotlivých druh stafylokok izolovaných z klinickém materiálu. Graf.1: Zastoupení jednotlivých druh STKN ve sledovaném souboru Staphylococcus epidermidis 6% 4% 4% 4% 2% Staphylococcus hominis ssp. hominis Staphylococcus capitis 6% 10% 64% Staphylococcus warneri Staphylococcus lungdunensis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Staphylococcus caprae 46