IDENTIFIKACE A TYPIZACE STAFYLOKOKŮ METODOU (GTG) 5 -PCR

Transkript

1 IDENTIFIKACE A TYPIZACE STAFYLOKOKŮ METODOU (GTG) 5 -PCR Nováková Dana Česká sbírka mikroorganismů, Masarykova universita, Brno

2 ÚVODEM O REP-PCR PCR = mnohonásobné zmnožení úseků obsahujících fragment komplementární s primerem rep-pcr: amplifikace úseků mezi repetitivními sekvencemi směs amplikonů o různé velikosti jedinečný profil (GTG) 5 laktobacily, enterokoky, ERIC (Enterobacterial repetitive intergenic consensus) G-tyčky, BOX elementy G+ koky (streptokoky) Výhody: rychlost, snadné provedení, levné (mimo přístrojové a softwarové vybavení) vhodná především tam, kde jsou již zavedeny jiné amplifikační metody malé vstupní množství kultury (i několikadenní kultura) výsledek za 48 hod. srovnatelné s konvenčními metodami

3 MATERIÁL A PROVEDENÍ Všech 50 validně popsaných taxonů stafylokoků (celkem 123 izolátů) Typová kultura izoláty, rozmanitý zdroj izolace Kultivace, izolace DNA (alkalická lyze, 20 min) Primer (GTG) 5, tj. tandemově opakovaná polynukleotidová sekvence 5'-GTG GTG GTG GTG GTG-3' Počáteční denaturace 7 min / 95 C 30 cyklů: 1 min / 94 C + 1 min / 40 C + 8 min / 65 C konečná elongace 16 min / 65 C (doba procesu 6 hod) Elektroforéza (1,5% agaróza, 16 hod, přes noc), digitalizace, vyhodnocení (BioNumerics, GelCompar, )

4 VÝSLEDKY ANALÝZY 45 z 50 taxonů (90%) vytvářelo druhově specifické shluky PCR profilů = identifikace do druhu (včetně všech klinicky významných taxonů) hominis, schleiferi, cohnii a capitis poddruhově specifické profily = možná identifikace do poddruhu intermedius, hyicus, kloosii, sciuri subsp. sciuri a carnosus subsp. utilis 2 typy PCR profilů Vnitrodruhová variabilita 40 89% ( aureus a lugdunensis resp.) U všech izolátů prokázán jedinečný PCR profil = různé kmeny

5 ANALÝZA(GTG) 5 - PCR PROFILŮ Podobnost (%) CCM 3834 T CCM 4532 CCM 4313 T CCM 4315 CCM 2271 kloosii kloosii schleiferi subsp. coagulans schleiferi subsp. coagulans schleiferi CCM 4070 T schleiferi subsp. schleiferi CCM 4072 schleiferi subsp. schleiferi CCM 2736 T cohnii subsp. cohnii CCM 2605 cohnii subsp. cohnii CCM 2726 cohnii subsp. cohnii CCM 4770 felis CCM 4198 felis CCM 4196 T felis CCM 2618 intermedius CCM 4710 intermedius CCM 7278 T equorum subsp. linens CCM 7301 equorum CCM 3832 T equorum subsp. equorum CCM 7302 equorum CCM 4068 lugdunensis CCM 4069 lugdunensis CCM 4064 T lugdunensis CCM 4436 lugdunensis CCM 2738 T xylosus CCM 4822 xylosus CCM 2128 xylosus CCM 4657 T sciuri subsp. rodentium CCM 4743 sciuri subsp. rodentium CCM 7041 sciuri subsp. sciuri CCM 4835 T sciuri subsp. carnaticus CCM 4232 sciuri subsp. sciuri CCM 2994 hyicus CCM 2995 hyicus CCM 7521 pettenkoferi CCM 7495 T pettenkoferi CCM 4752 carnosus subsp. utilis CCM 3473 T sciuri subsp. sciuri CCM 2730 T warneri CCM 2604 warneri CCM 2445 warneri CCM 3572 T gallinarum CCM 4506 gallinarum CCM 7221 epidermidis CCM 4505 epidermidis CCM 2124 T epidermidis

6 CCM 3474 T CCM 2732 CCM 2733 CCM 4786 T CCM 4747 CCM 4748 CCM 7194 T CCM 7313 CCM 7314 CCM 7157 T CCM 7230 CCM 7229 CCM 7213 T CCM 3991 T CCM 3992 CCM 883 T CCM 2682 CCM 4410 T CCM 2728 CCM 7045 T CCM 7317 CCM 2433 CCM 3830 T CCM 3831 CCM 2705 T CCM 4938 CCM 3583 CCM 4411 CCM 3472 T CCM 2599 CCM 2436 CCM 3835 CCM 4345 T CCM 4346 CCM 4753 T CCM 4789 CCM 5757 CCM 4890 CCM 2286 CCM 3823 T CCM 3824 CCM 885 T hominis subsp. hominis hominis subsp. hominis hominis subsp. hominis hominis subsp. novobiosepticus hominis subsp. novobiosepticus hominis subsp. novobiosepticus succinus subsp. casei succinus subsp. casei succinus succinus subsp. succinus simiae simiae simiae auricularis auricularis saprophyticus subsp. saprophyticus saprophyticus subsp. saprophyticus saprophyticus subsp. bovis saprophyticus subsp. saprophyticus nepalensis nepalensis nepalensis arlettae arlettae simulans simulans simulans simulans lentus lentus lentus kloosii piscifermentans piscifermentans condimenti piscifermentans aureus aureus subsp. anaerobius subsp. anaerobius

7 CCM 885 CCM 5739 T CCM 4681 T CCM 4115 T CCM 4184 CCM 3385 CCM 3386 CCM 3387 T CCM 7315 T CCM 4539 CCM 2110 CCM 4295 CCM 4294 T CCM 4389 T CCM 4788 CCM 4390 CCM 7101 CCM 2368 T CCM 4511 T CCM 4481 CCM 4894 CCM 7296 CCM 2729 CCM 2737 T CCM 4175 T CCM 4176 CCM 4178 CCM 4838 T CCM 4579 CCM 7085 CCM 3539 CCM 6144 CCM 2734 T CCM 2735 CCM 4291 T CCM 4293 CCM 4922 T intermedius lutrae delphini delphini chromogenes chromogenes chromogenes pseudintermedius pseudintermedius cohnii subsp. urealyticum cohnii subsp. urealyticum cohnii subsp. urealyticum pasteuri pasteuri pasteuri vitulinus hyicus vitulinus vitulinus haemolyticus haemolyticus haemolyticus haemolyticus muscae muscae muscae carnosus subsp. carnosus carnosus subsp. carnosus carnosus subsp. utilis saccharolyticus saccharolyticus capitis subsp. capitis capitis subsp. capitis capitis subsp. ureolyticus capitis subsp. ureolyticus fleurettii

8 SHRNUTÍ 1. Na základě podobnosti (GTG) 5 -PCR profilů lze stafylokoky identifikovat do druhu -Tvoří dobře odlišitelné shluky CCM 2736 T CCM 2605 CCM 2726 CCM 4770 CCM 4198 CCM 4196 T cohnii subsp. cohnii cohnii subsp. cohnii cohnii subsp. cohnii felis felis felis

9 SHRNUTÍ 2. U některých taxonů zařazení až do poddruhu -Tvoří poddruhově specifické, dobře rozlišitelné shluky CCM 2734 T CCM 2735 CCM 4291 T CCM 4293 capitis subsp. capitis capitis subsp. capitis capitis subsp. ureolyticus capitis subsp. ureolyticus

10 SHRNUTÍ 3. Umožňuje typizaci kmenů Výhoda oproti konvenčním metodám -je kmen identický s dřívějším nálezem pacienta? (opakovaný nález?, skryté ložisko?, více pacientů s totožným kmenem?) CCM 5757 CCM 4890 CCM 2286

11 SHRNUTÍ 4. V případě, že jeden taxon vytváří více vizuálně odlišných typů profilů, nutno doplnit dalšími testy, posoudit správnost dřívější identifikace

12 ZÁVĚR (GTG) 5 -PCR je vhodná jak pro identifikaci většiny stafylokoků (včetně všech klinicky významných druhů), tak pro typizaci kmenů Spolehlivost identifikace je podmíněna kvalitou databáze (čím Spolehlivost identifikace je podmíněna kvalitou databáze (čím více dobře charakterizovaných referenčních kmenů obsahuje, tím lépe)

13 Děkuji za pozornost Práce byla podpořena projektem MSM Metodika vychází z publikací: Gevers et al., Applicability of rep-pcr fingerprinting for identification of Lactobacillus species. FEMS Microbiology Letters 205, Švec et al., Evaluation of (GTG) 5 -PCR for rapid identification of Streptococcus mutans. Antoine Van Leeuwenhoak, 94,