Suché roztěry, naočkování myši, kryoprezervace prvoků

Transkript

1 Parazitologické laboratorní techniky No 1. Suché roztěry, naočkování myši, kryoprezervace prvoků Úkoly: 1. krevní roztěr- Trypanosoma brucei -odebrat vzorek z ocásku, pozorovat v nativu -krevní roztěr, každý alespoň dva perfektní roztěry, které se nabarví dle (a) Giemsy-Romanovského (b) pomocí Dade Diff-Quik 2. krevní roztěr a tlustá kapka- Plasmodium berghei -krevní roztěr, každý alespoň dva perfektní roztěry, které se nabarví dle (a) Giemsy-Romanovského, (b) Dade Diff-Quik -tlustá kapka, NEFIXOVAT, barvit dle Giemsy-Romanovského 3. barvení připravených roztěrů -dle Giemsy-Romanovského (lx T brucei, lx P. berghei) 5 min MetOH, 15 min Giemsa -tlustá kapka (lx P. berghei)- Giemsa -pomocí Dade Diff-Quik (T brucei, P. berghei) 4. manipulace s myší, naočkování Trypanosoma brucei -do injekční stříkačky (2ml, sterilní) natáhnout asi 0,5 ml sterilmbo fyziologického roztoku, z ocásku nasát 3-5 kapek infikované krve - dobře promíchat - intraperitoneálně injikovat cca 0,2 ml inokula - zkontrolovat přítomnost trypanosom v krvi po 2 dnech, dle počtu trypanosom přeočkovat každý 2-3 den infekce. 5. zmražování kultur do kapalného dusíku (demonstrace) - odebrat krev z oční cévy infikované myši - smíchat se sterilním 10% glycerolem ve fyz. roztoku 1: 1 - rozplnit do zmražovacích ampulí umístit do par dusíku (nebo do -70 C- Mr. Frosty)

2 Ba vcní k cvnich a tkúiíových pnroldi na suchých oztč1 cch Krevní roztčry, tkáňové oti!:iky a ~uché roztčry z rí:tzného biologického n!ateriúlu a z kultur zhotovujeme na dobře odmaštčná podložní!:ikla. Roztčry mu!:ií být rovnomčrné a tenké. K barvení používáme ri'tzných modilikací metody Romanow!:ikého (Giemsa, Leishmann, Wright, J>appenhcim aj.), které umoži'lují barevné rozligcní krvinek a jiných bunl:':k hostitele, parazitických protozoí a jejich organel. V podstatč jsou tyto barvící roztoky polychromní smc::sí, nejčastc::ji mcthylenové modře, azuru A, azuru 13 a cosinu. Suché roztl:':ry obvykle barvíme na barvícím mí:tstku, přímým nakapúvúním roztoků na preparút, připadni:: barvíme v kyvetách. Mikroskopujeme zpravidla nemontované nátčry, imersním objektivem po nakapání imersního oleje přímo na preparút. Pokud chceme preparúty zamontovat pod krycí sldo, musíme použít neutrálních médií (Cacdax, E.uparal aj.) Odma~tění skel: Umy tú skla ponořit do roztoku etanolu a etheru ( 1:1) a utřít či!:itým sepraným hadříkem Zhotovení krevního roztčru: kapičku krve umístit do středu podložního skla, asi 1/4 jeho délky druhé podložní sklo pi iložit tak, aby se kapka roztáhla po jeho zadní hranč kapku okamžitč roztahnout, sklon podložního skla určuje tlouštku roztčni

3 Barvení dle Giemsy-Romanowského 1. Suchý roztěr fixoval methylalkoholem 3-5 minul. Poté opatrně osušil fíl'tt ačním papírem <_l nechal zaschnout. Pro urychlení ::;ušení lze použít ťén. 2. Barvil zředěným roztokem Giem::;y-Romanowského minul. Během barvení nesmí roztok barviva na rozlčru za::;chnout. Zásobní roztok barviva ředit vždy pl-cd barvením fo::;rútovým pufrem (obvykle l :9). K ředční lze použít i vodovodní vodu (de::;tilovanú voda je zcela nevhodnú), avšak kvalita barvení značnč kolísú dle kvality vody. 3. Oplúchnoul pod tekoucí vodou a nechat za::;chnout ve ::;vi::;l~ poloze Složení ťo::;ťátového puťru: l(l -12P0.,... 0,25 g Na2l lpoo~ I,7 g (Na2HP0" ~ ,4 g) dc::;tilovanú voda ml p\ ,4 Nová Giemsa Sigma se ředí 20 x kvalitní destilovanou nebo redestilovanou vodou!

4 .. Metoda tlusté kapky Tato metoda je dllležitou diagn~stickou metodou pro :t:iištční parazitl! v krvi pl'i ni:/.ší parazitémii. L:t.e jí použít pouze u hostitel ll s bezjadernými červenými krvi;1kami. Postup: Odebranou kapku krve roztáhneme hvčzdicovitč do včtší plochy, necháme zaschnout, NEFIXU.IEME a pl ímo barvíme roztokem Giemsy-Romanowského, ředčným jako pro krevní roztčr. Při mikroskopování pátráme po parazitech na okrajích kapky. Ryc I 1 I e t 1arvcm Dat 1 c (lilo ll.,.- o lil k(m) Toto barvení dúvú obdobné výsledky, jako klasické barvení dle Pappenheima. Je však velmi rychlé, tj. ml'1žc býtuskutečnčno bčhem 15 vteřin. 1. Barvící roztoky nalít do kyvet 2. Suchý roztčr 5x ponořit do roztoku č. I. (roztok metanolu a útsl grccn) 3. Nadbytcčné barvivo odsál filtračním papírem a roztčr ponořit 5x do roztoku č.2. (roztok cosinu ve losťútovém puťru) 4. Nadbytečné barvivo odsát filtračním papírem a roztčr ponořit 5x do roztoku č.3. (roztok thizinového barviva ve fosfátovém pufru) 5. Krátce oplúdmou vodovodní vodou a nechal usuijit ve svislé poloze. Dodává Eurcx Mcdica s.r.o., kat. č

5 I, / ; Konzervace p1 volul hlubokým zmnr~ením Paraz.ilick~ prvoky lze uchov~tval hlubokým zmraž.ením v m~diích, která obsahují!úlky s kryoproleklivním účinkem (např. glycerol, dimethylsulťoxid). Zpravidla se používú dvoustupi'lovl!ho procesu zmražování, kdy se zmražuje rychlostí I oc za minutu do -30 C a pak prudce domrazíme až k teplotě kapalného dusíku ( -196 C). Pro postupné zmraž.ov~mí biologického materiúlu byla vyvinuta řada nákladných automatickických zal'ízení. Lze však využít i improvizovanou metodu ph které lze vystačil s upravenou polyelyknovou nádobkou (asi 50 ml), kterou obalíme izolační vrstvou pastelíny o síle asi I cm (viz. Obr.) í'.mra:l.ovúní trichomonúd I. K dobře narostl~ kultuře lrichomonád přidáme S'Yu climcthylsulloxidu (DtvlSO), promícháme a sleriln~ rozplníme asi po 1 ml do 2 ml sklcnčných ampulí nebo I,5 ml plastikových zkumavek pro zmražování. 2. Ampulky dobře označíme lixcm (např. Cenlroťix), klcr~ se nc::;mývají při dalších manipulacích 3. Ampulky okamžitč vložíme do zmražovací nádoby, uzavřeme víčkem a uložíme do súčku z PVC, který pcvnč uvážeme do hrdla kontcincru s kapalným dusíkem a ponech[unc v paraúch dusíku přes noc. 4. Druhý den vysypeme ampulky do polystyrénové nádoby s kapalným dusíkem a po schlazení uložíme v kryobance. Zmntžovúní J>/osnwdiun1 hcrghei I. Infikovanou krev (20-30% parazitémic, přítomné gamctocyty) odebrat z oční cévy sterilní Pasteurovou pipetou zvlhčenou heparinem. 2. Krev smíchal I: I s I 0% glycerolem ve fyziologickém roztoku 3. Rozplnil do plastikových kryoprcservačních zkumavek, uložil do -20 C a nechal přes noc. 4. Druhý clen zkumavky schladit v kapalném dusíku a uložil v kryobance. Dlouhodobč lze uchovúvat i při -~ooc.