In the beginning, there were algae, but there was no oil Then, from algae came oil. Now, the algae are still there, but oil is fast depleting In

Transkript

1 In the beginning, there were algae, but there was no oil Then, from algae came oil. Now, the algae are still there, but oil is fast depleting In future, there will be no oil, but there will still be algae So, doesn t it make sense to explore if we can again get oil from algae?

2 Lipidy nepolární Nejběžnějšími zásobními tuky řas jsou triglyceridy (neutrální lipidy) 3 fatty acid (acyl) groups + glycerol Zásobní produkty energetická rezerva, produkce ovlivňována faktory prostředí, TAG skladovány v lipidových tělískách

3 Volné MK

4 PUFAs - polyunsaturated fatty acids -3 mastné kyseliny -6 mastné kyseliny alfa linolenová 18:3n-3 linoleová 18:2n-6 eikosapentanová 20:5n-3 gama linolenová 18:3n-6 arachidonová kys. 20:4n-6

5 PUFAs - polyunsaturated fatty acids -3 mastné kyseliny -6 mastné kyseliny alfa linolenová linoleová eikosapentanová gama linolenová arachidonová kys.

6 fosfolipidy Polární glykolipidy esenciální složkou buněčných membrán thylakoidní membrány

7 Obsah tuků v různých skupinách sinic a řas

8 Faktory ovlivňující produkci lipidů a jejich složení teplota zvýšení počtu nenasycených vazeb při nižších t, zkracování řetězců MK světlo stimulace produkce biomasy = stimulace produkce MK, membránových lipidů, nadměrné osvětlení inhibice růstu vyšší produkce lipidů nedostatek N, P snížení růstové rychlosti, zvýšení produkce TAG živiny CO2 - stimulace produkce biomasy a produkce PUFA mixotrofie (organický zdroj C) stimulace růstu i produkce lipidů kolísání během životního cyklu, během dne a noci

9 Syntéza MK a lipidů FAS fatty acid synthase Malonyl-ACP (acyl carring protein) redukce, dehydrogenace, redukce 4C butyryl-acp (po odštěpení ACP muže MK (butyrát) opustit chloroplast

10 Biopaliva z řas alternativa fosilním palivům řasy nezabírají zemědělskou půdu některé řasy lze pěstovat na mořské nebo odpadní vodě řasy mají vysokou růstovou rychlost biodiesel metan etanol, butanol rostlinný olej = crude vegetable oil

11 2012 Obama's Energy Plan -- Algae (CNSNews.com) - "The American people aren't stupid," President Obama said on Thursday -- as he insisted that drilling for more oil on U.S. territory is "not a strategy to solve our energy challenge." The president's solution? Algae, for one.

12

13 Produkce biopaliv

14 Utah State University Typy produkce řas (sinic) South Australian Research and Development Institute

15

16 Transesterifikace Transesterification: alcohol + ester different alcohol + different ester methylestery MK ethylestery MK = biodiesel (typicky produkován z rostlinných olejů) triglycerid + EtOH katalyzátor NaOH/KOH glycerol + ethylester

17 Akumulace lipidů v buňkách řas a produkce bionafty Některé rozsivky (např. Amphora, Navicula, Nitzschia) přeměňují značnou část fixovaného C na lipidy (až 72 % sušiny) Produkce lipidů může zvýšena pokud jsou řasy vystaveny stresu (nedostatek N; příp. kombinace nedostatku N a Si u rozsivek 2-3násobné zvýšení obsahu lipidů). Další pokusy byly dělány na Isochrysis (Haptophyta=Primnesiophyta). Produkce lipidů ve venkovní velkoplošné kultivaci představovala 6 g. m -2. d -1. Pokus probíhal 45 dní. Pokud by bylo možné udržet produkci celý rok, výtěžek by představoval 21 tun. ha -1. rok -1. Amphora Isochrysis Navicula

18 Produkce biopaliv z rostlinných olejů - transesterifikace biopaliva Kniha: Jak si vyrobit biopalivo doma Making Algae Biodiesel at Home Do it your self You tube video TC9h78b2RM4

19 Řasy jako obnovitelný zdroj energie Využívání obnovitelných zdrojů fotosynteticky vzniklé biomasy. C se vlastně využívá v uzavřeném cyklu. Každá molekula CO 2, která vznikne spalováním paliv, byla nedávno využita fotosyntetizujícím organismem, nedochází tedy k absolutnímu zvyšování koncentrace CO 2 v ovzduší. Produkce metanu z řasové biomasy: 1) termální zplynování 2) katalytická hydrogenace 3) biologické zplynování (gasifikace) Produkce metanu Anaerobní rozklad biomasy smíšeným společenstvem mikroorganismů. Hlavní konečné produkty metan a CO 2.

20 Dvoustupňový proces: 1) hydrolýza komplexních biomolekul na MK (C 1 C 6 ), CO 2, H 2 H 2 S, NH 3. Z MK převažuje kys. octová tento krok vede k výraznému poklesu ph acid-forming stage, katalyzován nemetanogenními bakteriemi 2) methan-forming stage metanogenní bakterie mění meziprodukty na metan a CO 2. (buď přeměnou MK na CH 4 a CO 2 nebo reakcí mezi CO 2 a H 2 CH 4 a H 2 O. Metanogenní bakterie rostou pomalu, nesnáší kyslík a kolísání ph. Tolerují ph mezi 6,0 7,5 (optimum 7).

21 Přeměna meziproduktů metabolismu na metan vyžaduje energii

22 Biomethanizace Pokusy byly prováděny jak s makro-, tak s mikrořasami (např. Spirulina maxima, Sargassum muticum, Kappaphycus alvarezii ). Řasy většinou poskytovaly vyšší výtěžek methanu než cévnaté rostliny % dostupného C bylo přeměněno na metan. Sargassum muticum Spirulina maxima

23 Fermentace degradace molekuly karbohydrátu (glukoza) na 2 nebo více menších molekul (pyruvát) bez přístupu molekulárního kyslíku tvorba ATP pyruvát není degradován v mitochondrii, ale v cytosolu produkty fermentace jsou většinou exkretovány z buňky Fermentation production of ethanol from sugar crops and starch crops

24 Fermentace indukovaná Chlorococcum minutum Chlamydomonas reinhardtii Chlorella pyrenoidosa (vulgaris nebo sorokiniana) Chlorococcum minutum experimentálně pěstovány v dusíkaté atmosféře za nepřístupu O 2 (ve tmě) produkty fermentace: acetát, etanol, formát (kys. mravenčí), glycerol, laktát, butandiol + plyny H 2 a CO 2 Chlamydomonas reinhardtii

25 Fermentace v přírodních podmínkách sinice tvořící silné nárosty (microbial mats) často v extrémních podmínkách den fotoautotrofní metabolismus noc chemofrofní metabolismus O 2 dýchání anoxie rozklad glykogenu fermentace O. limnetica - hypolymnion hypersalinního jezera homolaktická fermentace (2 mol. laktátu) O. terebriformis - nárosty v termálních pramenech O. limosa - mořské nárosty, heterolaktická fermentace (laktát, etanol, CO 2 ) Microcoleus chthonoplastes - nárosty v moři a hypersalinních jezerech smíšená fermentace (acetát, etanol, formát, laktát, H 2 ) Oscillatoria limnetica Oscillatoria limosa Oscillatoria terebriformis

26 Přímá produkce energeticky bohatých látek Etanol z glycerolu Za optimálních růstových podmínek může halofytní zelený bičíkovec Dunaliella vyprodukovat až 8 g glycerolu. m -2. d -1. Glycerol jako takový nepředstavuje vhodné kapalné palivo. (teplo získané spálením 1 g glycerolu je 4,3 kcal, spálením 1 g benzínu získáme 11,4 kcal). Glycerol může být přeměněn na energetičtější palivo bakteriální fermentací Paliva vzniklá fermentací mají vyšší obsah energie (etanol 7,1 kcal. g 1 ). Dunaliella

27 Přeměna glycerolu na kapalná paliva bakteriální fermentací

28 Produkce vodíku 1) využitím enzymu nitrogenázy u sinic fixujících vzdušný N 2 Nitrogenázová aktivita byla zjištěna u více než 125 kmenů sinic. Enzym nitrogenáza normálně katalyzuje ATP řízenou redukci molekulárního N 2 na amoniak, H 2 vzniká jako vedlejší produkt. Aktivita nitrogenázy je ovlivněna kultivačními podmínkami. Pokud nemá substrát (N 2 ), soustředí se zcela na produkci molekulárního H 2. Problémy: a) produkce amoniaku a vodíku je kompetitivní b) reversní hydrogenáza (hydrogen uptake enzym) vzniklý vodík reoxiduje na vodu. Pravděpodobně byl tento mechanismus vyvinut jako ochrana proti ztrátě redukčních ekvivalentů 2) využitím hydrogenázové aktivity, kterou má většina řas obrovská spotřeba energie U Anabaena variabilis izolován mutant, kde exprese nitrogenázy není inhibována přítomností amonných a dusičnanových iontů.

29

30 Produkce vodíku využitím hydrogenázové aktivity Absorpce světelného kvanta, světelná energie umožňuje oxidaci vody a endergonický transport elektronů na ferredoxin. Ferredoxin slouží jako donor elektronů pro Fe-hydrogenázu, ta spojuje elektrony s protony a generuje H 2.

31

32 U Chlamydomonas reinhardtii se podařilo časově oddělit produkci O 2 a H 2. Médium bez S - klesá rychlost fotosyntézy, ale mitochondriální dýchání není ovlivněno. Výsledek: spotřeba veškerého kyslíkuanaerobióza podmínky pro tvorbu H 2 bublinky H 2 Médium obsahující S - probíhá normální oxygenní fotosyntéza Opakované použití přepínače (přítomnost a absence S v médiu) umožňuje řasám střídat produkci O 2 a H 2

33 Koordinace fotosyntézy a mitochondriálního dýchání při produkci H 2. Fotosyntetický e - transport dopravuje e - získané fotolýzou vody až k Fe-reduktáze - fotofosforylace, produkce H 2.Takto vzniklý O 2 je využit při oxidativní fosforylaci během mitochondriálního dýchání. Elektrony [4e] jsou získávány štěpením endogenních substrátů (v dýchacím řetězci), vznik redukčních ekvivalentů a CO 2. Uvolňování H 2 z chloroplastu pomáhá udržovat elektronový transport a tudíž vznik protonového gradientu, který je nutný pro tvorbu ATP.

34 Hypotéza: tvorba kerogenů selektivním zachováním algenanových BS (Derenne et al. 1991) Pokud jsou kerogeny v zemské kůře zahřáty na správnou teplotu, mohou se z nich uvolnit uhlovodíky, které daly vzniknout ropě a zemnímu plynu

35 Algenany alifatické uhlovodíkové řetězce, které jsou vzájemně zesíťovány Keratococcus bicaudatus: TLS, vznik TLS splýváním trilaminárních destiček A, B elektronmikroskopické snímky Nannochloropsis salina. C, extrahované BS. D, algenan

36 Sporopollenin x algenan

37 Final structure of the pollen wall, with the pectocellulosic Intine (In), the sporopollenin Exine (Ex) and later deposited membrane like structure which may contain recognition proteins (arrows). L. Boavida et al. 2005

38 Fosilizované BS řas

39 3 typy algenanů: 1) Chlorophyta: základní stavební bloky se skládají z lineárních řetězců C 22 C 34. Na několika místech jsou funkční skupiny, které spojují monomery etherovou nebo esterovou vazbou Tetraedron minimum, Scenedesmus communis 2) Botryococcus braunii: nenasycené alifatické aldehydy a nenasycené uhlovodíky s průměrným počtem C 40. Monomery spojené acetálovou nebo esterovou vazbou A race

40 3 typy algenanů: 3) Eustigmatophyta: stavební bloky C 28 C 36. Monomery spojené esterovou vazbou. Nannochloropsis salina Algenanové stěny musí obsahovat póry pro výměnu látek s vnějším prostředím. Přesto působí jako efektivní bariéra pro extracelulární enzymy a detergenty. Odpočívající stádia řas (cysty) chrání algenany v BS před vysušením (během vzdušného transportu nebo během období sucha, např. Haematococcus pluvialis).

41 Dinosporiny recentních obrněnek Dinosporin je definován jako makromolekulární odolná organická látka, která tvoří uzavřené nebo částečně uzavřené BS cyst obrněnek, chemická struktura dinosporinu nebyla dosud zjištěna. Složení BS cyst se liší na podle způsobu výživy: Group I - fototrofní druhy: cellulose-like glucan Group II - heterotrofní druhy: nitrogen-rich glycan (chitin like??) This constitutes the first empirical evidence nutritional strategy is related to different dinocyst wall chemistries. Our results indicated phylogeny was less important for predicting composition than the nutritional strategy Lingulodinium polyedrum

42 Group I - fototrofní druhy Group II - heterotrofní druhy Bogus et al. 2014

43 Basic aspects of dinoflagellate cell construction and life cycle. The vegetative form with a cellulosic theca (wall) is encountered in many free-living dinoflagellates. Almost all fossil dinoflagellates represent the encysted phase, which may be quite different in appearance from the thecal form from which it derives.

44 Late Triassic and Jurassic dinoflagellate cysts. Although Paleozoic dinoflagellate cysts have been reported, none of the claims has been substantiated. The known range of dinoflagellate cysts is late Triassic to present. The Triassic forms are somewhat unusual, in comparison to modern dinoflagellate cysts, but most of the Jurassic forms represent trends not greatly different from those of extant taxa.

45 Uhlovodíky z řas Biomolekuly podobné uhlovodíkům: 1) molekuly vzniklé izoprenovou biosyntetickou dráhou 2) molekuly vzniklé biosynt. dráhou MK Mezi nejproduktivnější patří Botryococcus braunii, 85 % sušiny tvoří uhlovodíky.

46 Akumulace lipidů v buňkách řas a produkce bionafty Botryococcus braunii pohárky matrix impregnované lipidy, z nich 35% tv. uhlovodíky Mastné kyseliny, triacylglyceridy palmitová oleová

47 Botryococcus braunii

48 Phase contrast and fluorescence microscopy of B. braunii strains stained with Nile red. Scanning EM of B. braunii Hegedus et al. 2016, Algal Research

49 Botryococcus Vodní květ Kinaret, Izrael koloniální zelená řasa (Trebouxiophyceae), velikost kolonií 30µm 2mm. Typická organizace kolonií. Buňky usazeny uvnitř pohárků matrix, která je inpregnovaná lipidy (až 85% sušiny) z toho uhlovodíky tvoří (až 35 %), součástí olejových břidlic - Ordovik.

50 Uhlovodíky z Botryococcus braunii A-race n-alkeny 2-3 dvojné vazby, alkadieny alkatrieny acyklické botriococceny B-race triterpenoidy (izoprenoidní biosyntetická dráha) C30-37 cyklické (cyklobotryococceny) L-race lycopadien (izolován z kmenů žijících v tropech) C 40 H 78 (tetraterpenoidy - izopren. biosynt. dr.) lycopadien S-race C20 saturated n-alkane

51

52

53 Botryococcus - karotenoidy stacionární fáze růstu - akumulace karotenoidů (především u B a L race) Izoprenoidy botriococceny lycopadien exponenciální fáze růstu

54 botryaly (A race) Neobvyklé lipidy dlouhé uhlíkaté řetězce α-rozvětvených aldehydů MK. Uhlíkaté skelety jsou složeny ze stejného počtu uhlíků, obsahují vždy 3 dvojné vazby epoxibotryaly (A race) non-isoprenoid x B a L races epoxidy isoprenoidní povahy epoxidová skupina

55 Etherové lipidy Tyto látky nesou kyslíkové můstky (O-alkyl etherové můstky) mezi dlouhými alkylovými řetězci. Bylo popsáno více než 20 chemických sloučenin. Uvedené příklady A race; B race produkuje jiné typy etherových lipidů, lycopaneroly alkoxy etherové lipidy fenoxy etherové lipidy součástí etherového můstku je fenolická látka Algenany

56 95% uhlovodíků ve vnější BS; strukturní elementy - houba (algenany?) max. produkce - exp. fáze není schopný katabolizovat vlastní uhlovodíky Proč roste tak pomalu? v současnosti nejstudovanější mikrořasa

57 Výroba paliva z Botryococcus braunii -botryococceny (izoprenoidy) chemická přeměna na palivo krakování = pyrolýza dlouhé uhlovodíky + organické molekuly (kerogeny) jsou štěpeny na prekurzory (C-C vazba)

58

59 Solazyme 2011 ve spolupráci s U.S Navy, which 100% palivo z řas bylo použito pro plavbu 300 m dlouhé nákladní lodě ze Sev. Evropy do Indonésie (plavba trvala měsíc) Jet fuel, Solajet(R) HRJ-5, v helikoptéře MH-60S Seahawk testovací let - 50/50 smícháno palivo s benzínem

60 Geneticky modifikovaná Chlorella pěstována v bioreaktoru heterotrofně na médiu obsahujícím jednoduché cukry

61 Syntéza lipidů v řasové buňce Enzymy účastnící se produkce tuků lze ovlivňovat tak, aby byly produkovány požadované typy tuků ty pak mohou být transestrifikovány (biofuel) nebo krakovány na letecký benzín (biojet fuel) FAT = acyl-acp thioesterase uvolnění MK z cyklu Různé typy FAT z různých organismů specifické pro MK určité délky využity pro změnu délky řetězce 16:0 kys. palmitová 14:0 kys. myristová Řasové mastné kyseliny C nejčastěji 16:1, 16:0 a 18:1. Naopak ideální MK pro produkci biopaliva 12:0 a 14:0.

62 začlenění genů ze světlice barvířské (Carthamus tinctorius) produkce oleje v semenech 1) overexprimace určitých genů, účastnících se produkce lipidů 2) blokování metabolických drah vedoucí k akumulaci energeticky bohatých zásobních látek (škrob) 3) omezení katabolismu lipidů utlumení genů, účastnících se oxidace MK 4) FAT lze zvýšit kvalitu lipidů (ovlivnit délku řetězce a stupeň desaturace)