Speciální metody v histologii

Transkript

1 Speciální metody v histologii 147

2 Metody v histologii studium buněk a tkání Světelná mikroskopie Elektronová mikroskopie - transmisní, prozařovací - skenovací, rastrovací Fluorescenční mikroskopie

3 Nejběžnější metodou/technikou užívanou v histologii je příprava histologických preparátů pro světelnou mikroskopii

4 Příprava histologických preparátů Odběr Fixace Zalévání Krájení Barvení Trvalý preparát

5 Odběr Odběr tkání a buněk: Ze živého organismu (BIOPSIE) Z mrtvoly (NEKROPSIE) Je nutno provést fixaci, jinak se tkáň vlivem vlastních enzymů a působením bakterií rozloží (AUTOLÝZA) Blok tkáně pro fixaci ve světelné mikroskopii nemá být větší než 1cm 3 v elektronové mikroskopii 1mm 3

6 Fixace Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením, nebo denaturací enzymů. Fyzikální metody: Teplo (mikrovlnná trouba) Zmražení (tekutý dusík 170 o C) Chemické metody: Imerzní (ponoření do fixační tekutiny) Perfuzní (nástřik cév)

7 Chemická fixace Aldehydy Alkoholy Formaldehyd, 4% pro SM glutaraldehyd pro EM Methanol, ethanol Kyseliny Soli těžkých kovů Kyselina octová, trichloroctová, pikrová Chlorid rtuťnatý, oxid osmičelý,dvojchroman draselný

8 Nejčastější fixativa pro SM a EM Světelná mikroskopie: Formaldehyd 4% Bouinova tekutina trinitrofenol(kys.pikrová)+formol+kys.octová SUSA chlorid rtuťnatý + kys.octová+ kys.trichloroctová+ formol Zenkerova tekutina Chlorid rtuťnatý + dvojchroman draselný + síran sodný+ kys.octová Carnoy Etanol + chloroform + kys.octová Elektronová mikroskopie: Glutaraldehyd 1-4%

9 Zalévání a krájení Pro krájení je nutno tkáň zpevnit zalitím do zalévacích médií (parafin, celloidin). Protože tato media nejsou mísitelná s vodou, je nutno vodu z tkání odstranit vzestupnou řadou alkoholů (odvodnění) a poté prosytit rozpouštědlem zalévacího media (xylen, toluen, aceton), který tkáň projasní.

10 Krájení Pro SM je třeba tkáň nakrájet na řezy o tloušťce jedné vrstvy buněk, tedy m. Tkáň je pak průhledná a dobře čitelná Přístroje, které se k tomu užívají, se jmenují mikrotomy. Nakrájené řezy se dávají na podložní sklo, kde se teplem natáhnou. K přilepení se používá bílek-glycerin

11 Mikrotomy

12 Barvení Umožňuje rozlišení jednotlivých součástí buněk a tkání. Barviva jsou rozpustná ve vodě, proto je třeba z řezu odstranit parafin. Po obarvení se řez montuje do pryskyřic. Tak vzniká trvalý preparát, který se prohlíží v mikroskopu.

13 Přehledná Barvení Hematoxylin eosin Massonovy trichromy Weigert van Gieson Heidenhainův železitý hematoxylin Selektivní Weigert resorcin fuchsin Impregnace stříbrem

14 Trvalý preparát Po obarvení se z tkáně znovu odstraní voda Trvalý preparát se připraví přilepením krycího skla pomocí kanadského balzámu nebo umělých pryskyřic (mají stejný lom světla jako sklo) Po zaschnutí vznikne TRVALÝ PREPARÁT

15 Hematoxylin - eosin Hematoxylin barví kyselé součásti buňky (bazofilní struktury) DNA, RNA, tj. jádro, jadérko, ribozomy a granulární endoplasmatické retikulum Eosin barví zásadité struktury buňky (acidofilní, eosinofilní) což jsou hlavně proteiny, tj. cytoplasmu, mitochondrie, hladké endoplasmatické retikulum a kolagen v mezibuněčné hmotě

16 Hematoxylin - eosin

17 Výsledky barvicích metod Barvení Barvivo Jádro Kolagen Elastika Svaly Poznámka Hematoxylin-eosin Hematoxylin Eosin modré až černé růžový růžové Weigert van Gieson Weigertův hematoxylin Saturnová červeň Trinitrofenol hnědé červený žluté místo Saturnové červeni se používá také kyselý fuchsin, žluté -vše kromě kolagenu AZAN Azokarmín Anilínová modř Oranž G červené modrý oranžově červené červené - erytrocyty modrý - mucin Modrý Massonův trichrom Hematoxylin Kyselý fuchsin Anilínová modř modré až černé modrý červené červené - erytrocyty modrý - mucin Žlutý Massonův trichrom Hematoxylin Erytrosin Šafrán modré až černé žlutý červené červené erytrocyty možno použít i kyselý fuchsin a Tuchecht gelb Zelený Massonův trichrom Hematoxylin Kyselý fuchsin Světlá zeleň modré až černé zelená červené červené - erytrocyty Weigertův resorcinfuchsin Resorcin Fuchsin fialová Impregnace Ag AgNO 3 hnědý šedo-černé retikulární vlákna - černá Heidenhainův železitý hematoxylin HŽH Heidenhainův železitý hematoxylin hnědé až černé šedo-černé

18 Azokarmín barví jadra červeně Anilínová modř barví kolagenní vlákna a mucin modře Oranž G barví cytoplasmu buněk a svaly oranžově AZAN Erytrocyty jsou červené

19 Zelený Massonův trichrom Hematoxylin barví jádra modře až černě Kyselý fuchsin barví svalovinu červeně Světlá zeleň barví kolagenní vlákna zeleně. Erytrocyty jsou červené

20 Weigert resorcin - fuchsin Selektivní barvení na elastiku Resorcin fuchsin barví elastická vlákna fialově

21 Heidenhainův železitý Heidenhainův železitý hematoxylin barví nejen jádra, ale i cytoplasmu, šedo-černě. hematoxylin Používá se pro barvení svalů a v parazitologii na průkaz parazitů (červů) v tkáních

22 Impregnace stříbrem Stříbro barví kolagenní a retikulární vlákna hnědě až černě. Impregnace stříbrem se používá i pro barvení neuronů a glie v neurohistologii.

23 Rozlišovací schopnost rozlišovací schopnost je nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, při které je ještě dovedeme rozlišit jako dva samostatné objekty. rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 m když chceme studovat objekty menší než jsou buňky a bakterie použijeme elektronový mikroskop

24 Elektronová mikroskopie TEM RS 0,2 nm

25 Rozlišovací schopnost, zvětšení, kontrast rozhodují o kvalitě pozorovaného objektu SM RS : 0,2 um Zvětšení: 1 500x limitem je vlnová délka světelného záření Kontrast: barvení EM RS : 0,2 nm Zvětšení: x Kontrast: barvení /kontrastování solemi těžkých kovů

26 Metody elektronové mikroskopie Metoda ultratenkých řezů Metoda negativního barvení Metoda mrazového lámání

27 Metoda utratenkých řezů Odběr Fixace (glutaraldehyd, paraformaldehyd a oxid osmičelý) Zalévání (epoxidové, polyesterové a akrylátové pryskyřice) Polymerace Krájení - síla řezu 50-60nm Kontrastování (osmium, uran, wolfram) Prohlížení, hodnocení

28 EM

29 Metoda negativního barvení Obklopení částice elektrondenzním materiálem kyselina fosfowolframová nebo octan uranylu = temné pozadí, objekty světlé Užití virologie

30 Metoda mrazového lámání objekt se prudce zmrazí na -80 st C, ve vakuu se rozlomi a povrch se pokoví replika povrchu preparátu na mřížce EM

31 SEM-řádkovací elektronový mikroskop Umožňuje zobrazení povrchu studovaných objektů Má menší rozlišovací schopnost než TEM : nm

32 Histochemie Využívá chemické a biochemické reakce pro detekci anorganických a organických sloučenin v tkáních: Histochemie Katalytická histochemie Afinitní histochemie

33 Průkaz anorganických látek Prvky: Hg, Pb, Fe, Ca, Zn a jejich soli Perlsova reakce průkaz Fe 2+ Fe 2+ (HCl) a ferrokyanid draselný, vznikne Berlínská modř

34 Průkaz organických látek Cukry: polysacharidy (glykogen) glykoproteiny a proteoglykany, glykolipidy = PAS reakce oxidace kys.jodistou HIO 4 + barvení Schiffovo reagens, kt reagují s aldehydovámi skupinami) Lipidy v tucích rozpustná barviva Sudan IV, olejová červeň

35 Katalytická histochemie Umožňuje detekci enzymů (enzymatické aktivity) v tkáních a buňkách Užití: Výzkum: určení lokalizace enzymů v buňce Diagnostika: např. celiakie Slouží jako markery pro visualizaci v afinitní histochemii

36 Katalytická histochemie 1. histochemická reakce Tkáň s enzymem + Substrát = Produkt 2. reakce vizualizace Z bezbarvého produktu první reakce vznikne barevná a nerozpustná sloučenina

37 Afinitní histochemie Imunohistochemie slouží k průkazu proteinů (glykoproteinů) pomocí specifické vazby mezi protilátkou a antigenem Lektinová histochemie umožňuje průkaz mono-, di-, tri-, i polysacharidů v komplexních molekulách vazbou mezi lektinem a cukrem In situ hybridizace slouží k průkazu specifické sekvence nukleotidů v DNA nebo m-rna vazbou komplementárního řetězce - sondy

38 Imunohistochemie - IHC Imunoglobulin se váže na určité místo epitop, na proteinu Protilátky polyklonální monoklonální

39

40 Villin cytoskeletární protein kartáčového lemu

41 Imunohistochemie DAB + peroxidása Průkaz keratinu v epitelových buňkách Průkaz insulinu v B buňkách pankreatu

42 Užití Diagnostika nádorů a jiných onemocnění v patologii: Nejdůležitější antigeny: Intermediární filamenta, CD antigeny, hormony, estrogenní a progesteronový receptor, melanomové antigeny, S-100 protein, PSA (prostatický specifický antigen), proliferační antigeny např. PCNA, p53 protein, KI-67 Výzkum