Histologie - cvičení. Laboratorní zpracování tkání a orgánů pro světelnou a elektronovou mikroskopii

Transkript

1 Histologie - cvičení Laboratorní zpracování tkání a orgánů pro světelnou a elektronovou mikroskopii

2 HISTOLOGIE Nauka o stavbě normálních, tj. zdravých buněk, tkání a organů na mikroskopické a submikroskopické úrovni - obecná histologie + cytologie - speciální histologie = mikroskopická anatomie (stavba orgánů jednotlivých systémů) význam histol. Vyšetření v klinické praxi: onkologie, chirurgie, hematologie, patologie a soudní lékařství

3 Zpracování tkání a orgánů pro účely histologického vyšetření ve světelném mikroskopu (příprava trvalého histologického preparátu) ODBĚR vzorků FIXACE tkání PRANÍ ZALÉVÁNÍ (parafinové bločky) KRÁJENÍ NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ řezů BARVENÍ řezů MONTOVÁNÍ trvalé preparáty

4 ODBĚR MATERIÁLU velikost odebraného vzorku tkáně 5 10 mm 3, fixace následuje bezprostředně! biopsie z ţivého organizmu (v průběhu chirurgických zákroků; neinvazivní odběr stěr z povrchu sliznice) - excise (vyříznutí) - punkce dutou jehlou (jaterní nebo ledvinný parenchym, kostní dřeň) - kyretáž (např. endometrium) nekropsie z mrtvého organizmu (pitva); laboratorní zvíře

5 Pomůcky k odběru: trokar dutá jehla s mandrenem kyreta

6 FIXACE Cílem fixace je zachování struktury buněk a tkání ve stavu, který je co nejpodobnější tomu, v němţ se vyskytují zaţiva - šetrné usmrcení buňky s minimem artefaktů Fixace předchází vysoušení, svraštění a autolýze tkáně. Zastaví metabolické děje jejich zpomalením (v případě zmrazení) či inaktivací enzymů a dalších proteinů (denaturace = změna konformace) Poţadavky na fixační činidlo zachovat strukturu rychle prostoupit tkáň neovlivňovat výsledek barvení

7 fyzikální FIXACE - vysokou teplotou (var, ţíhání nad plamenem) - nízkou teplotou (lyofilizace, mrazová substituce - kryoprezervační látky) chemická - roztoky organických a anorganických látek - imerze ponoření do fixativa - perfuze promývání (intravenózní aplikace fixativa)

8 Chemická fixativa Organická Aldehydy formaldehyd (SM) glutaraldehyd (EM) Alkoholy etanol % (absolutní etanol) methanol, aceton Organické kyseliny led. octová, pikrová, trichloroctová Anorganická Anorganické kys. chromová, Soli těţkých kovů HgCl2, oxid osmičelý (OsO4) Směsi: FLEMMING (OsO4), ZENKER, HELLY, SUSA (HgCl2), BOUIN (kys. pikrová), CARNOY (alkohol) Postup fixace vzorek přelít násobným mnoţstvím fixačního činidla (1 cm 3 : ml), hodin při pokojové teplotě

9 PRANÍ a ZALÉVÁNÍ odstranění fixačního činidla ze vzorku; výběr vypíracího roztoku závisí na fixaci: voda nebo alkohol (70-80%) Prosycení, zalévání příprava vzorků pro krájení (tvrzení) Zalévací média prosycují (prostupují) vzorek a tvrdnou - ve vodě rozpustná: ţelatina, celodal (polymer močoviny a formolu) - ve vodě nerozpustná: parafin, paraplast (vzorky se musí odvodnit vzestupná alkoholová řada)

10 Zalévání do parafinu Odvodnění odvodnění fixovaných vzorků vzestupnou řadou etanolu (50%, 70%, 90%, 96% kaţdá lázeň 2 6 hodin) Projasnění vytěsnění alkoholu mediem, které se mísí s parafinem benzen nebo xylen Prosycení rozpuštěným parafínem (bod tání 56 C) Zalití plastové, papírové nebo kovové komůrky - komůrky jsou rychle ochlazeny ponořením do studené vody

11 KRÁJENÍ Mikrotomy světelný mikroskop - tloušťka řezů 1 10 μm Ultramikrotomy elektronová mikroskopie 100 nm Rotační mikrotom nůž je fixní, držák s bločkem se pohybuje vertikálně Sáňkový mikrotom blok je upevněný v držáku, nůž se pohybuje horizontálně

12 ZAMRAŢENÍ - Alternativa k zalévání nativní i fixovaný vzorek - Kryostat zmrazení na -20 a méně ºC - Kryotom mrazicí rotační mikrotom (0-60 ºC)

13 NAPÍNÁNÍ ŘEZŮ Napínání: na hladině teplé vody (45ºC) se řezy narovnají a vypnou Lepení: z vody jsou řezy přeneseny na podloţní skla s adhezivním filmem (ţelatina nebo směs glycerin-bílek) a uloţeny do termostatu (37º C). Před barvením se z řezu na skle musí odstranit zalévací medium, které by bránilo průniku barviv. Např. parafin deparafinace rozpustidlem parafinu, obvykle xylénem.

14 BARVENÍ Pro zviditelnění struktur v řezu buňka a její součásti vykazují různou afinitu k barvivům: chromofilní (chromatofilní) x chromofobní Nejčastěji barvení na základě ph struktury zásaditá (bazická) barviva ( jaderná ) reagují s kyselými strukturami buňky a tkání (NK v jádře aj.) bazofilie bazofilní struktury kyselá barviva ( cytoplazmatická ) reakce se zásaditými strukturami acidofilie acidofilní struktury v buňce polychromatofilní (heterofilní) afinita k oběma druhům barviv

15 ORTOCHROMAZIE- bunečné struktury se barví stejnou barvou, jakou má barvivo (HE) METACHROMAZIE- bunečné struktury se barví jinou barvou, jakou má barvivo Př. toluidinovou modří se v ţírných buňkách barví jádra modře (ortochromaticky) a granula červenofialově (metachromaticky)

16 TYPY BARVENÍ rutinní, přehledná HE, AZAN - demonstrují všechny základní sloţky speciální vizualizace vybraných struktur, cytologické Massonovy trichromy: ţlutý - HEŠ, modrý - AZAN, zelený trichrom (kolag.vlákna) orcein, aldehydový fuchsin (elast.vlákna) aj. Imunohisto- a imunocytochemické metody impregnační AgNO 3 (nervová nebo retikulární vlákna)

17 HEMATOXYLIN EOSIN (HE) Hematoxylin zasaditý Eosin kyselý Postup: Odstranění parafinu xylenem Rehydratace sestupnou řadou alkoholů (100% 96% 80% 80%) Barvení hematoxylinem jádra - modro-fialová Diferenciace kys. alkoholem a vodou (odstranění přebytku barviva) Barvení eosinem růţová - cytoplazma, vazivo, svaly Praní ve vodě (odstranění přebytku barviva) Dehydratace vzestupnou řadou alkoholů (80% 96%) Projasnění v xylenu

18 HEMATOXYLIN EOSIN (HE) deparafinace zavodnění praní barvení diferenciace xylen I xylen II 100% 96% H 2 O hematoxylin kyselý etanol etanol etanol projasnění odvodnění praní barvení praní xylen IV xylen III 100% 96% H 2 O eosin H 2 O etanol etanol

19 Hematoxylin a eosin (HE) cytoplazma jádra kolagenní vazivo

20 Pomůcky pro barvení kyveta nosič skel (košíček)

21 Autotechnikon,barvící automat (automat pro barvení) řada boxů (kyvet) s barvicími medii

22 Leica ST 4040 Lineární barvící automat - velkokapacitní barvení vzorků jedním programem (např. H&E až 1000 skel). Modulární systém. Během barvícího procesu je uživatel chráněn aktivním odsáváním skrz uhlíkový filtr (lze napojit na centrální odtah v laboratoři ).

23 odběr 2, 3 fixace 4 zalévání 5 krájení 6,7 napínání řezů 8 - barvení

24 MONTOVÁNÍ uzavření preparátu kapkou montovacího media a krycím sklíčkem trvalý preparát Montovací media: rozpustná v xylenu kanadský balzám rozpustná ve vodě glycerin-ţelatina, arabská guma

25 Trvalé histologické preparáty ke studiu v SM

26 Výsledky barvení: HE = Hematoxylin Eosin jádra modro-fialová cytoplazma a kolagenní vlákna růţová svalová tkáň červená HEŠ = Hematoxylin Eosin Šafrán kolagenní vlákna ţlutá AZAN = AZokarmín Anilinová modř oranž G jádra červená erytrocyty oranţové svalová tkáň červená kolagenní vlákna modrá

27 Hematoxylin a eosin (HE)

28 basofilní x acidofilní cytoplazma fundus ventriculi

29 Hematoxylin, eosin a šafrán (HEŠ) chrupavka kolagenní vlákna žlutá

30 Azokarmín a anilin. modř (AZAN) ledvina kolagenní vlákna modrá

31 Zelený trichrom kolagenní vlákna zelená

32 Cytologická barvení podle Heidenhaina kosterní svalová tkáň železitý hematoxylin

33 Cytologická barvení podle Heidenhaina mitochondrie v hepatocytech

34 Impregnace stříbrem slezina retikulární vlákna cerebellum nervová vlákna

35 Barvicí metody: přehledné AZAN, HE demonstrují všechny sloţky tkání speciální zdůrazňují určité buněčné nebo tkáňové sloţky impregnační soli Ag, Au nebo Os

36 Zpracování tvrdých tkání (zub, kost) dekalcifikace (odvápňování) převedení nerozpustných vápenatých solí do roztoku pomocí kys. mravenčí nebo chelatonu (EDTA), časově náročné dny aţ týdny výbrusy tenké ploténky (50 70 μm) zhotovené postupným zbrušováním materiálu (brusky, matné sklo, pasty, prášky) nelze barvit Výbrus zubu SKLOVINA DENTIN

37 Zpracování krve krevní nátěr Kapka krve rozetřená do tenké vrstvy na podloţním skle -dvě směsi barviv - podle May-Grünwalda (eozinát azuru II. rozpuštěný v metanolu) a Giemsy-Romanowskeho (eozinát metylenové modři a eozinát metylenazuru rozpuštěný ve směsi stejných dílů metanolu a glycerolu). - Imerze - nahrazení vzduchové mezery mezi čelní čočkou objektivu mikroskopu a preparátem vrstvou imerzní tekutiny index lomu>1 = NA

38 Histochemické metody lokalizace chemických látek v buňce - průkaz proteinů (detekce NH2 nebo COOH konce) - DNA, RNA (reakce pentóz) Feulgenova metoda (DNA ) - metylová zeleň a pyronin (DNA i RNA ) - sacharidů PAS reakce (oxidace OH na aldehyd) - lipidů např. lyzochromy (barviva rozpustná v tucích) - pigmentů přímo - anorg. látek (Fe, Ca, Zn) postupy analytické chemie

39 Imunocyto- a imunohistochemie detekce pomocí vazby značené protilátky Ag-Ab Ab komplexy (přímý důkaz) nebo Ag-Ab-Ab (sekundární nepřímý důkaz) Značení: - fluorochromy rodamin, texaská červeň - enzymy křenová peroxidáza, AF, acetylcholinesteráza - radioizotopy (jódu)

40 Detekce GFAP - astrocyty Imunocytochemická metoda

41 Elektronová mikroskopie Elektronový mikroskop - Obraz je tvořen elektronovým paprskem ve vakuu - čočky elektromagnety - projekce na fluorescenční stínítko Transmisní (prozařovací) el. mikroskop - TEM - Snímán průchod elektronového paprsku, rozlišení 0,2-0,3 nm (reálně 5 nm) Rastrovací (řádkovací, scan) el. mikroskop SEM - Snímán odraz elektronového paprsku, rozlišení nm

42 Zpracování tkání pro elektronovou mikroskopii (EM) Poţadavky na pracovní podmínky: ph všech roztoků (medií) 7,2 7,4. (pufry kakodylátový nebo fosfátový) bezprašnost roztoky (media) šetrné působení na tkáně (! minimum artefaktů)

43 POSTUP ODBĚR okamţitá fixace, velikost tkáňového bločku do 1 mm 3 FIXACE glutaraldehyd (vazba aminoskupin) + OsO 4 (vazba lipidů) dvojitá fixace PRANÍ kakodylátový pufr DEHYDRATACE alkohol, aceton ZALÉVÁNÍ vzorky se vkládají do ţelatinových kapslí nebo forem z plastu vyplněných zalévacím mediem. Pouţívají se epoxidové pryskyřice (Epon, Durcupan, LR White, LR Gold, Araldite) ve vodě nerozpustná media

44 Zalévací komůrky: želatinové (1), plastové (2) 1 2 nosiče (držáky) kapslí (3) ploténky s komůrkami (4, 5) 3 4,5 bločky připravené pro krájení

45 Úprava pyramidy (trimování) Odstranění přebytku tvrdého zalévacího media a zhotovení pyramidy s minimální řeznou plochou (0.1 mm 2 ). Minimum tkáně (černý shluk) ve vrcholu pyramidy

46 KRÁJENÍ po odstranění přebytku media (trimming) a vytvoření pyramidy se z malé plošky (0.1 mm 2 ) krájí jednotlivé ultratenké řezy ( nm) ultramikrotomy pouţívají se skleněné nebo diamantové noţe s vaničkou řezy splývají na hladinu vody ve vaničce a odtud jsou přeneseny na síťky (Cu)

47 Ultramikrotomové nože: skleněný diamantový

48 Krájení, nosné síťky Síťka se třemi řezy typy sítěk

49 KONTRASTOVÁNÍ princip odlišení struktur různý rozptyl svazku elektronů v závislosti na denzitě struktur; elektronová barviva směsi těţkých kovů: uranylacetát nebo citrát olovnatý Na kapce barviva je položena nosná síťka tak, aby ultratenké řezy byly vystaveny působení barviva.

50

51 Rozdíly mezi SM a EM SM EM Odběr 1 cm 3 Fixace minuty formaldehyd hod. 1 mm 3 sekundy glutaraldehyd 1 3 hod. Zalévání parafin epoxid. pryskyřice (Durcupan) Krájení Tloušťka řezů Barvení (LM) Kontrastování (EM) mikrotom 5 10 m barviva (hematoxylin eosin) ultramikrotom nm těžké kovy (uranylacetat, citrát Pb) Montování Výsledek histologický preparát foto z fluoresc. stínítka - elektronogram

52 Trachea řasinkový epitel SM SEM TEM

53 Co byste určitě měli znát: Fáze zpracování tkání a orgánů pro účely světelné mikroskopie -Odběr materiálu, fixace a fixační činidla -Zalévání a zalévací média -Mikrotomy krájení, lepení parafinových řezů -Barvení parafinových řezů hematoxylinem a eozinem (co je zbarveno a jak) Postup při vyšetření v prozařovacím elektronovém mikroskopu