Sigma-Aldrich-aktuáně

Transkript

1 Sigma-Aldrich-aktuáně

2 Sigma-Aldrich

3 Katalogy

4 The Reporter for Europe, Analytix Bezplatně SPE, SPME GC, HPLC Standardy Činidla Mikrobiologie Akce platí v ČR i SR 4

5 5

6 6 Speciální akce - únor

7 7

8 8

9 9

10 10

11 11 Brožury SPE

12 12 3M Empore Products

13 13 SupelMIP Solid Phase Extraction

14 SPME SPME CD Nové odkazy 14

15 15 Air Monitoring

16 Aktivní vzorkování Desorpce rozpouštědlem LpDNPH pro vzorkování aldehydů a ketonů ORBO ORBO PUF emisní vzorkovací trubičky pro rtuť Termální desorpce trubičky pro Dynatherm, Gertsel, Perkin Elmer, Tekmar Trubičky s barevným indikatorem (MSA/Auer) Vzorkovací pytle a myši 16

17 Trubičky LpDNPH Orbo PUF Trubičky pro termální desorpci Trubičky pro desorpci rozpouštědly Detekční trubičky Tedlar vaky Skleněné odběrové nádoby Další příslušenství 17

18 Pasivní vzorkování radiello Analyt Aldehydy (chemisorpce na 2,4-DNPH) VOCs/BTEX CS 2 chem. des. (aktivní uhlí) VOCs/BTEX tepelná desorpce (grafitický uhlík) NO 2 /SO 2 /HF (chemisorpce na triethanolamin) O 3 (chemisorpce na 4,4 -dipyridylethylen) H 2 S (chemisorpce na octan zinečnatý) NH 3 (chemisorpce na kys. fosforečnou) HCl (adsorpce na silikagel) Anestetika (adsorpce na aktivní uhlí/mol. síto) Stanovení Chromatografie Chromatografie Chromatografie fotom. / IC / Ion sel. elektroda Fotometrie Fotometrie Fotometrie Ion Chromatography TD/GC 18 Detaily jsou v radiello CD

19 19 GC

20 GC KOLONY 20

21 21

22 22 HPLC

23 Brožury HPLC 23

24 Laboratorní chemikálie Organická rozpouštědla,pufry, kyseliny, báze, soli, etc..

25 Nová generace GC kolon na bázi iontových kapalin RNDr. Dana Procházková

26 26 SUPELCO

27 Aplikace v plynové chromatografii Petrochemie plyn, ropa, produkty po rafinaci, bionafta Biochemie, farmacie, soudní chemie FAME, zbytková rozpouštědla, drogy, požářiště Potraviny a nápoje FAME, barviva a vůně, pesticidy,. Životní prostředí pitná,odpadní a povrchová voda, odpady, půdy Sledování ovzduší sledování vnitřních a venkovního ovzduší, kontrola emisí Chemie kontrola jednotlivých kroků syntéz 27

28 GC stacionární fáze Polysiloxanové polymery Začínají v na počátku 50. let, mnohokrát vylepšovány Nejběžnější fáze: -1, -5, -20, -1701, -35, -50, -2330, -2380, Polyethylenglykoly Začínají v polovině 50. let, několikrát vylepšovány Nejběžnější fáze : obsahují wax nebo PEG v názvu R 1 R 3 HO Si O Si O H O CH2 CH2 n 28 R 2 R 4 x R = metyl, fenyl, fluoropropyl, a/nebo cyanopropyl x,y = procento v celkovém složení polymeru y n = počet opakujících se monomerových jednotek v polymeru např. Carbowax 20M (nejčastěji užívaný) má MW

29 Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita 360 C C C Wax (PEG) 275 C 250 C 145 C TCEP Non-Polar Intermediate Polar Polar Highly Polar GC kolony stupnice polarity 0 = squalane (nejméně polání GC stacionární fáze) 100 = TCEP (1,2,3-tris(2-cyanoethoxy)propane (nejpolárnější GC stacionární fáze) 29

30 Omezení konvenční 1D-GC Nedostatečná separace/citlivost při stanovení analytů u komplexních vzorků Složky aroma (např. aroma kávy: sloučenin) Kontaminanty (PCB: 209 kongenerů, pesticidy) Chybná / nemožná identifikace analytů Nadhodnocení / podhodnocení výsledků Rešení Multidimensionální systém (heart-cut, kompletní dvourozměrná GC) Nové detekční techniky 30

31 Kompletní dvourozměrná GC (GC GC) Dvě kolony s odlišnou selektivitou spojeny modulátorem Injektor Modulátor Detektor 31 Primární kolona Obvykle narrow bore (nepolární) kolona (30 m 0,25 mm 0,25 µm) Sekundární kolona Obvykle microbore (polární) kolona (1 m 0,10 mm 0,10 µm)

32 KOMPLETNÍ DVOUROZMĚRNÁ GC Modulátor přenáší v pravidelném intervalu část efluentu z 1. kolony Kryogenicky zaostřené části jsou přeneseny na 2. kolonu Rychlá separace na 2. koloně Modulace (kryogenní zaostření) 32 Efluent z 1. kolony Efluent z 2. kolony

33 TVORBA GC GC CHROMATOGRAMU 1D chromatogram (výstup z první kolony) MODULACE Základní 2D chromatogram (výstup z druhé kolony) TRANSFORMACE 2D chromatogramy naskládané vedle sebe 33 Vrstevnicový půdorys 2D chromatogramu VIZUALIZACE

34 VÝHODY GC GC vs. 1D-GC Zvýšení kapacity píků Zlepšení detekce Tvorba strukturovaných chromatogramů 34

35 VÝHODY GC GC vs. 1D-GC Zvýšení kapacity píků (n c ) Maximální počet chromatografických píků, které je možné uspořádat za sebou do separačního prostoru (chromatogramu) zvýšení separační účinnosti 1. Dimenze 2. Dimenze Konvenční kapilární kolona n = n c (celk) = n c (kolona 1) n c (kolona 2) GC GC (kolona druhé dimenze: n = 25) n = =

36 Strukturované chromatogramy 36 Doplňující se separační mechanismy na obou kolonách GCxGC chromatogramy vykazují uspořádanost (přítomnosti charakteristických skupin) Specifické interakce Separace podle polarity Systém: nepolární polární kolony Separace podle bodu varu Tlak par (Těkavost)

37 aniont CF 3 O=S=O N - O=S=O CF 3 GC kolony s fází na bázi iontových kapalin cation linkage cation N + N N + N anion CF 3 O=S=O N - O=S=O CF 3 1,9-bis(3-vinylimidazolium)nonan-bis(trifluormethansulfonamidát) anorganické soli s teplotou tání nižší než pokojová teplota málo těkavé, stabilní až do 380 C určené pro analyty s širokým rozsahem polarit 37

38 Stanovení polarity GC kolon s iontovými kapalinami 38 P (Polarity) = sum of the first 5 McReynolds Constants. P.N. (Polarity Number) = Polarity (P) normalized to SLB-IL100 (set at 100). sigma-aldrich.com/il-gc

39 Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita -Octyl 280 C C C C C C C C PAG 220 C PEG 280 C C C C TCEP 145 C Non- Polar Intermediate Polar Polar Highly Polar Extremely Polar SLB-IL C SLB-IL C SLB-IL C SLB-IL C SLB-IL C 39 sigma-aldrich.com/il-gc

40 Mastné kyseliny a jejich methylestery Biochemie, farmacie, soudní chemie 1950 A.J.P. Martin laboratoře the National Institute for Medical Research at Mill Hill, Londýn G. Popjak studuje metabolismus mastných kyselin A.J.P. Martin a A.T. James navazují na poznatky z roku 1941 (Martin, Synge) separace mastných kyselin (C1-C12) až do C22 problém je nízká stabilita stacionárních fází při vyšších teplotách 1958 stacionární fáze Reoplex 400 (polyesterové změkčovadlo) 1959 první kapilární kolony a FID separace cis-trans izomerů nenasycených mastných kyselin aplikace potraviny (falšování rostlinných olejů) identifikace bakterií analýza FAME z buněčných stěn (knihovna 1500) přímá analýza triglyceridů klastry píků 40

41 41 FAME na náplňové koloně

42 Omegawax 320

43 FAME Mix Omegawax 250 column: Omegawax 250, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.25 µm (24136) 43 oven: 50 C (2 min.), 4 C/min. to 220 C (15 min.) inj.: 250 C det.: FID, 260 C helium, C injection: 1 µl, 100:1 split sample: Supelco 37-Component FAME Mix (47885-U), analytes at concentrations indicated in methylene chloride

44 SLB-IL Component FAME Mix Shows the great selectivity for FAMEs by degree of unsaturation, allowing for increased resolution cis/trans isomer separations possible 44 column: SLB-IL100, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.20 µm (28884-U) Low bleed and a oven: 50 C, 3.0 C/min. to 240 C stable baseline inj.: 240 C det.: FID, 240 C carrier gas: helium, 40 cm/sec constant injection: 1 µl, 50:1 split sample: Supelco 37-Component FAME Mix (47885-U), analytes at concentrations indicated in methylene chloride

45 Brožury HPLC 45

46 Obsah HPLC nosiče Silikagel Trendy vývoje Totálně porézní silikagel versus povrchově porézní silikagel Zmenšování velikosti častic sorbentu a problematika nárůstu tlaku Převod metod Stacionární fáze C18 - nejpoužívanější stacionární fáze Alternativní stacionární fáze k C18 Problematika MF s nízkých obsahem organické složky LC-MS Péče o kolony Závěr 46

47 Typy HPLC nosičů HPLC nosiče Anorganické oxidy Polymery Uhlík Silikagel Alumina Titania Zirconia (oxid křemičitý) (oxid hlinitý) (oxid titaničitý) (oxid zirkoničitý) PS/DVB PVA Polymetakrylát 47

48 Silikagel SiO SiO vlastnosti vlastnosti Hodnota 2 Hodnota 2 Hustota (g/ml) 2 Hustota (g/ml) 2 Plocha povrchu (m 2 /g) Plocha povrchu (m 2 ~ /g) ~ Velikost pórů (Å) ~ Velikost pórů (Å) ~ Porozita (ml/g) 0.9 Porozita (ml/g) 0.9 Velikost částic (µ) sub 2, 3, 5, 10 Velikost částic (µ) sub 2, 3, 5, Nejčastěji používaným nosičem jsou porézní, sférickéčástice silikagelu. Amorfní síť polymerního oxidu křemičitého. Výhody: mechanicky stabilní, reaktivní, velká plocha povrchu. Nevýhody: reaktivní zbytkové silanolové skupiny, rozpustný při vysokém ph, při nízkém ph hrozí hydrolýza vazby u chemicky vázané fáze.

49 Historie vývoje HPLC nosičů 49 Majors R. E.: Fast and Ultrafast HPLC on Sub-2µm Porous Particles, LC-GC Europe June 2006

50 Vývoj v oblasti HPLC nosičů na bázi silikagelu 70s 80s 90s současnost 10µ 5µ 3µ sub-2µ nebo Fused-Core Proč se zkoušejí stále menší částice? snaha o dosažení vyšší účinnost separací lepší rozlišení díky uzším a vyšším píkům 50

51 Zmenšov ování častic přin ináší rychlejší nárůst tlaku než nárůst účinnosti a rozlišen ení P 1 2 d p N 1 d p 51 Lze dosáhnout stejné účinnosti jakou poskytují sorbenty sub-2µm za tlaku do 400 barů?

52 Vysokoúčinn inná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography vysokoúčinn inná (vysoce vysoceúčinn inná) kapalinová chromatografie 3-10 µm různ zné,, tlak do 400 barů RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography rychle rozlišovac ovací kapalinová chromatografie 1,8 µm - porézn zní směsn sné,, tlak do 600 barů UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography extrémn mně účinn inná kapalinová chromatografie UPLC: sub 2 µm - porézn zní unif., tlak do 1500 barů UHPLC Ultra High Pressure Liquid Chromatography vysokotlaká kapalinová chromatografie 1,0 µm neporézn zní,, tlak do 5000 barů 52

53 Povrchově porézn zní částice versus zcela porézn zní částice stice: 0.5 µm Difuzní vrstva 1.5 µ 2.7 µm 1.7 µm 53 Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology Inc. Ascentis is a trademark of the Sigma-Aldrich Corp.

54 Ascentis Express Fused-Core tm specifikace Sorbent: vysoce čistý silikagel 1.7 µ neporézní jádro a 0.5 µ porézní vrstva jsou type B Velikost částic: 2.7 µ Distribuce velikosti částic: 2.7 +/ µ (6% standardní odchylka*) Velikost pórů: 90 Å Velikost povrchu: 150 m²/g ( m²/g efektivní) ph rozsah: 2 9 (minimálně) Limitní tlak: 600 barů (testováno na UHPLC) LC-MS: vysoce kompatibilní 54 * Typický rozsah pro malé totálně porézní částice je 15-20% standardní odchylka.

55 Distribuce částic 55

56 Účinnost versus velikost částic Columns: All C18, All 150 x 4.6mm Flow: 1.8mL/min Detection: 254nm Temp: 30 C Injection Vol: 5µL Analytes: 1. o-xylene (0.04mg/mL 2. p-xylene (0.01mg/mL µm µm Fused-Core 5µm 20 10µm

57 57 Výhody silikagelových častic s pevným jádrem

58 58 Výhody silikagelových častic s pevným jádrem

59 59 Výhody silikagelovýchčástic s pevným jádrem

60 Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace H = A + B/u + Cu P = 1000FηL P = πr 2 d 2 p 16, ,000 14, µm ,000 HETP (µm) Tlak (psi) 10,000 8,000 6, µm FC ,000 3 µm µm Ascentis Express 2, Průtoková rychlost MF (mm/sec) Průtoková rychlost MF (mm/sec) 60

61 Ascentis Express UHPLC na klasických HPLC chromatografech Zpětný tlak versus průtoková rychlost Maximální limit Pressure drop (bar) Limit tradičních HPLC systemů N = >30, Flow rate (ml/min) Experimentáln lní zavislost celkového zpětn tného tlaku jako funkce průtokov tokové rychlosti pro C18, 15 cm x 4.6 mm, 2.7 m Ascentis Express kolony při různých teplotách ch.. MF: 30:70 voda:acetonitril 61 Autor Prof. Luigi Mondello University of Messina

62 Rozlišen ení Velikost částic a maximální N Kolony s částicemi menší než 2-µm zvyšují 1.55 x rozlišení a 8 x tlak vzhledem k 5 µm sorbentům U kolon Ascentis Express 2,7-µm je zvýšení rozlišení také 1.55 x ale zvýšení tlaku 4 x vzhledem k 5 µm sorbentům Délka kolony dp N Rs faktor Tlak (psi) Tlak (bar) 10cm 5µm cm 3µm , cm 2.7µm FC , cm 1.7µm ,

63 Zpětný tlak na kolonách Ascentis Express Ascentis Express kolony mají obecně poloviční zpětný tlak než kolony se sub-2µm částicemi ale jaký zpětný tlak můžeme ve skutečnosti očekávat? Ascentis Express se mohou používat, jak pro tradiční HPLC, tak i pro UHPLC chromatografy. Nicméně otázkou zůstavá, do jakého tlaku se dá na klasických (600-bar) přístrojích měřit a kdy už by měl analytik přejít na UHPLC? Na následujících dvou obrázcích budou uvedeny tlaky, které můžete při určitém složení MF očekávat. 63

64 Podmínky testování Ascentis Express C18 kolony v různých rozměrech byly instalovány do klasického HPLC chromatografu (400-bar). Zpětný tlak byl zaznamenávám při jednotlivých průtokových rychlostech, a to se dvěma MF(40% acetonitrile) a vysoce viskozní MF(60% metanol). Zpětný tlak byl měřen na výstupu z kolony. Data byla měřena při pokojové teplotě. Uvedená data jsou uvádějí celkový tlak; tlak systému se neodečítá. Zpětný tlak je uváděn v barech. 64

65 Zpětný tlak MF: 40% acetonitril 40% Acetonitril ml/min: ID L > > > > system: < 480 bar 480 bar 540 bar Zelená barva označuje tlaky do 80% tlakového limitu přístroje, oranžová 80 % nebo lehce nad 80% limit; červená 90% nebo lehce nad 90% tlakového limitu přístroje (600 bar). Pokud se tlak dostene nad tuto hodnotu, je doporučeno přejít UHPLC system.

66 Zpětný tlak MF: 60% metanol 60% Metanol ml/min: ID L > > > > > >600 system: < 480 bar 480 bar 540 bar Zelená barva označuje tlaky do 80% tlakového limitu přístroje, oranžová 80 % nebo lehce nad 80% limit; červená 90% nebo lehce nad 90% tlakového limitu přístroje (600 bar). Pokud se tlak dostene nad tuto hodnotu, je doporučeno přejít UHPLC system.

67 Převod metod 67

68 Rychlá LC versus tradiční HPLC (3 mm vnitřní průměr) 5 µ porézní Column: 5µ C18; 3 x 150 mm Flow: 0.4 ml/min Mobile Phase: 20:80, water : acetonitrile Inj: 1.5 µl Temp: 35 C Pressure: 885 psi (61 bar) N (naphthalene) : ~11000 k (naphthalene) : ml celkový objem Time (min) elution order: Fused-Core (zelená chromatografie) uracil, phenol, acetophenone, benzene, toluene, naphthalene Column: Ascentis Express C18; 3 x 50 mm Flow: 0.6 ml/min Mobile Phase: 31:69, water : acetonitrile Inj: 0.5 µl Temp: 35 C Pressure: 1750 psi (121 bar) N (naphthalene) : ~11000 k (naphthalene) : 1.75 Rs (acetophenone) : ml celkový objem Time (min) 4x rychlejší analýza, 3x menší spotřeba rozpouštědel

69 Ascentis Express Fused-Core tm Stacionární fáze: C18 C8 RP-Amide Phenyl-hexyl HILIC (silikagel) F5 ES-C18 Kolony: Vnitřní průměr 2,1; 3,0; 4,6 mm Délka 3; 5; 7,5; 10; 15 Kapilární kolony: 75 µ x 50 mm 100 µ x 50 mm 200 µ x 50 mm 300 µ x 50 mm 75 µ x 150 mm 100 µ x 150 mm 200 µ x 150 mm 300 µ x 150 mm 69

70 Fázov zové systémy v kapalinové chromatografii Rozdělovací: normální (klasická x HILIC) reverzní fáze (klasická x semipolární) iontově párová (na reverzní fázi) Iontově výměnná (IE) katex, anex Chirální cyklodextrinové fáze Afinitní 70

71 Fázov zové systémy v kapalinové chromatografii Chromatografie v systémech s normálními fázemi <1% Chromatografie v systémech s obrácenými fázemi 75% Chromatografie iontové výměny 4% Chromatografie stérické výluky (gelová chromatografie) 7% Afinitní chromatografie <1% Chirální chromatografie 1.5% Source: HPLC in the Life Sciences. The 1997/8 US MSPPSA Series, Phortech International, Inc. (a) SEC and GPC not separated in this report 71

72 Stacionárn rní fáze C18 C8 Fenylové F5 RP-Amide CN HILIC (silikagel) 72

73 RP-HPLC C18 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 10 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 10 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 CH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH Si CHCH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH Si CHCH 2 CH 3 O OH OH OH O Silikagel 73

74 C18 s odstíněnými silanolovými skupinami Si OH O Si O Si O O Si Si O OH Si C18 Ligand O Si Odstínění O Volné silanolové skupiny 74

75 Odstínění zbytkových silanolových skupin Hydrofobní (Van der Waalsovy) interakce mezi analytem a stacionární fází Si OH Si σ = 1.07 Si Si OH H 2 N σ = Sekundární 75 interakce (vodíková vazba) s nezreagovanými silanolovými skupinami

76 Kde C18 nestačí? Vyhovuje (50%) Mezní Nevyhovuje Problémy: Selektivita Překrývající se píky, eluce v pořadí nevhodném pro spolehlivou kvantifikaci Retence Malá, analyt eluuje téměř v mrtvém čase kolony. Nestabilní separace; nízké smočení stacionární fáze vlivem MF s nízkým obsahem organické složky. Tvar píků chvostující nebo s rozmytým čelem. Příliš vysoká retence a selektivita (použití gradientu). 76

77 77 Alternativnířešení v případech, kde C18 fáze nestačí

78 Mechanizmus zhroucení fáze C18 Si O Si O Si O H O Si O Si O Si O Si H 2 O H 2 O ACN ACN ACN H 2 O ACN 100% H 2 O Si O Si O Si O H O Si O Si O Si O Si H 2 O H 2 O H 2 O 78

79 Alternativy k C18 fázi Fáze s vloženou polární skupinou (PEP*, EPG**) Fenylové fáze Pentafluorofenylová fáze (PFPP) *PEP polar embedded alkyl phases 79 **EPG embedded polar group

80 Discovery a Ascentis TM F HS C18, C18 Si O Si CH 3 CH 3 (CH 2 ) 17 CH 3 HS F5 CH 3 Si O Si CH 3 F F F F RP-Amide Cyano CH 3 CH 3 Si O Si (CH 2 ) 3 CN Si O Si (CH 2 ) 3 NHCO(CH 2 ) 14 CH 3 CH 3 C8 CH 3 CH 3 Phenyl Phenyl-hexyl Si O Si (CH 2 ) 7 CH 3 80 CH 3

81 Retenční mechanism echanismy C18/C8 RP Amide Fenyl F5 Silikagel Hydrofobní/dispersní interakce Vodíkové můstky (donor/akceptor) Dipól-dipólová interakce π π donor π π akceptor Hydrofilní/iontová výměna? 81

82 Fenyl ylov ové fáze L Si L 19.5% C L Přítomnost aromatického jádra umožňuje π π interakci s dalšími aromáty π-donor Fáze s podobným chromatografickým chování jako fáze alkylové nebo EPG Je vysoce stabilní, vhodná pro všechny typy HPLC detektorů včetně MS 82

83 π π intera nterakce na fenylové fázi NO 2 π-π interakce způsobí významný rozdíl v selektivitě a retenci pro analyty, které obsahují aromatické jádro. Např. nitro skupina způsobí, že benzenové jádro se chová jako π-akceptor. Nitrobenzen Si Fenyl enylov ová fáze 83

84 π π interakce u analytů obsahujících ch různý počet NO 2 - skupin Ascentis Phenyl Kolona: : 150x4.6 mm 5 µm MF: : 50 % Metanol anol,, 50 % voda Průtokov toková rychlost: : 1.0 ml/min Detekce kce: : 254 nm 84 Teplota: : 40ºC Ascentis RPA Ascentis C8 Ascentis C18 π π interakce na fenyl enylov ové fázi mají významný vliv na selektivitu pro nitro skupiny. S rostoucím počtem skupin roste jejich retence. 1. Močovina ovina 2. Nitrobenzen 3. 1,4-dinitrobenzen 4. 1,3,5-trinitrobenzen

85 Pentafluorofenylová fáze Pentafluorofenylpropylová fáze (PFPP) Pracuje v obou módech RP a NP/ANP Retenční mechanismy Disperzní Dipole-dipole p-p interakce H-můstky - akceptor iontová výměna O Si δ - F δ - F δ + F δ - F F δ - δ - Discovery HS F5 85

86 Discovery HS F5 Pentafluorofenylpropyl fáze je fáze s mnohostranným využitím, s retenčním profilem ve tvaru písmene U a charakteristickou selektivitou. F F Si O Si F F F 86

87 Discovery HS F5 retenční profil RP NP Retence F5 C % organického modifikátoru v MF

88 Discovery HS F5 retenční profil F5- Retention vs % Organic Retention Time RP NP tr-methcathinone tr-ephedrine O OH N H H N % MeCN 88 Column: 15cm x 2.1mm 3µm Discovery HS F5;. Mobile Phase: 10mM NH4 Acetate, ph 6.8 : ACN; 0.2mL/min; Detection: 35 C; esi, pos.

89 Discovery HS F5 Co-elution Methcathinone Ephedrine C18 Ephedrine Impurity F5 Discovery HS F5 a HS C18, 15cm x 2.1mm, 3µm; CH3CN:octan amonný, ph 6.8 (70:30); 200µL/min; 35 C; esi (+) detekce, 2µL, koncentrace každého analytu 25µg/mL 89

90 Struktura hydrocortisonu a prednisolonu 90

91 F5 versus C18 91

92 Povrchově porézn zní versus porézn zní sorbent 92

93 RP-Amid Amidov ová fáze 19.5% C CH 3 (CH 2 ) 14 NH O L Si L L RP-Amide obsahuje 18 uhlíkových atomů + jeden v amido skupině Jednokroková připrava eliminuje přítomnost residuálních aminů Fáze je vysoce stabilní, vhodná pro všechny typy HPLC detektorů včetně MS 93

94 Porovnání retence a selektivity fází C18 a RP-Amide Ascentis Express 100x4.6mm, 35%ACN 65%water, 0.2% formic acid 1.8 ml/min, 230nm, 35C, 5uL, Ascentis Express C Phenols: 1. p-methoxyphenol 2. phenol 3. p-cyanophenol 4. p-fluorophenol 5. p-methylphenol 6. p-nitrophenol 7. p-chlorophenol Ascentis Express RP-Amide Time (min) 94

95 Vodíkov ková vazba versus hydro ydrofob obní reten etence 1. Nordoxepin 2. Protriptyline 3. Nortriptyline C O N CH 3 CH N CH 3 C N CH 3 Vodíkov ková vazba; větší retence na RP Amide H H H Ascentis RP-Amide N Větší retence na C18 N CH 3 CH 3 N CH 3 CH 3 4. Impramine 5. Amitriptyline Ascentis C cm x 4.6 mm; 25 mm NH 4 H 2 PO 4, ph 7: CH 3 OH (30:70); 254 nm; 1.0 ml/min;10 µl

96 Co je ANP? Aqueous normal phase chromatography (ANP)je chromatografická technika, která přes změnu složení mobilní fáze spojuje RPLC a NPLC. Povrch silikagelových nosiců je většinou tvořen primárními silanolovými skupinami (-Si-OH), které mohou být dále modifikovány např. uhlovodíky s dlouhým řetězcem. Mobilní fáze v ANPC je složena z organických rozpouštědel metanol nebo acetonitril) s malým obsahem vody. Mobilní fáze tedy obsahuje vodnou složku a zároveň i složku, která je méně polární než stacionární fáze. Polární analyty jsou tedy silně zadržovány. S rostoucím procentem vody v mobilní fázi jejich retence klesá. Skutečná ANP stacionární fáze musí být schopna pracovat v obou módech od 100% vodné až po čistě organickou. (.J. Pesek, M.T. Matsyka, J. Sep. Sci. 28 (18): ). 96

97 Co je HILIC? Chromatografie hydrofilních interakcí - HILIC (HydrophILic Interaction Chromatography or Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) je jednou z verzí NPLC. Poprvé toto označení použil ve své publikaci roku 1990 Dr. Andrew Alpert (J. Chromatogr. 499 (1990) 177) Jedná se o kapalinovou chromatografii v módu, kde stacionární fáze je relativně polární a mobilní fáze relativně nepolární. Mobilní fáze je složena z 60-95% organického rozpouštědla ve vodě nebo pufru. Používá se acetonitril, metanol nebo další s vodou mísitelná rozpouštědla Typické složení 70-90% acetonitrilu v 10 mm octanu amonném 97

98 Ascentis Si NP separace v tucích rozpustných vitamínů alpha tocopherol (100 µg/ml) (E) 2. menadione (150 µg/ml) (K3) 3. gamma tocopherol (200 µg/ml) (E) 4. chlolecalciferol (100 µg/ml) (D) Time (min) 98 column: Ascentis Si, 15 cm x 4.6 mm I.D., 5 µm particles ( U) mobile phase: A Hexane, B Ethylacetate gradient: time %B flow rate: 1.0 ml/min. temp.: 30 C det.: UV at 290 nm

99 LC/MS: Ascentis RP-Amide 1 Low bleed: good sensitivity and no interferences Ascentis RP-Amide HO HO H Ascentis C HO 1. Cannabidiol (m/z 315.5) HO O H TetrahydroCannabinol (m/z 315.5) HO H Time (min) O 2. Cannabinol (m/z 311.4) O H TetrahydroCannabinol (m/z 315.5) Ascentis C18 & Ascentis RP-Amide, 5µm: 15 cm x 4.6 mm; Mobile Phase: 25:75, 10mM ammonium acetate (ph: 4.5) / CH 3 CN 1 ml/min; 35 ºC; ESI(+), SIR mode; 10 µl (100 µg/ml each in mobile phase) 99

100 Separace peptidů s TFA Fáze C18 používá se TFA pro lepší tvar píků; TFA - iontová suprese v LC-MS. 100x4.6mm, A: Water w/ 0.1% TFA, B: Acetonitrile w/ 0.1% TFA, 1% - 30% B in 15 minutes,1.5ml/min, 210nm, 35ºC, 1µL (0.5mg/mL sample) Ascentis Express C / 5 1. Gly-Tyr 2. Val-Tyr Tyr-Val 3. Met enkephalin 4. Angiotensin II 5. Leu enkephalin Ascentis Express RP-Amide

101 Separace peptidů s kyselinou mravenčí Kyselina mravenčí je vhodná pro LC-MS. 100x4.6mm, A: Water (0.1% formic acid), B: Acetonitrile (0.1% formic acid), 1% - 30% B in 15 minutes, 1.5mL/min, 210nm, 35ºC, 1µL (0.5mg/mL sample) / Gly-Tyr 2. Val-Tyr Tyr-Val 3. Met enkephalin 4. Angiotensin II 5. Leu enkephalin Ascentis Express C Ascentis Express RP-Amide

102 Péče o kolony a prodloužen ení jejich životnosti Nová kolona je dodávána ve směsi ACN/H 2 O. Skladování kolon Krátkodobé (3-4 dny) v MF Nahrazení pufru stejným podílem H 2 O Dlouhodobé 100 % ACN Prodloužení životnosti kolony Doporučené je filtrování MF a vzorku Používání in-line filtrů Používání předkolon Problematika ucpaných frit a odstranění silně zadržovaných látek Obrácený průtok MF 95/5 Dichlorometan/metanol 102

103 Příslu slušenstv enství chromatografických kolon HPLC kolony se sorbenty 5; 3 jsou uzavřeny ocelovými fritami s porozitou 2 µm robustnější, odolnější k ucpání HPLC kolony se sorbenty < 2µm jsou uzavřeny ocelovými fritami s porozitou 0,2 µm V každém případě je třeba odstranit z MF pevnéčástice 103

104 Filtrování mobilní fáze Velikost pórů filtrů o velikosti 47 mm 0, 20µm 0, 45µm 104

105 Frity a filtry 105

106 OPTI-SOLV EXP Pre-Column Filter 106

107 Předkolony 107

108 Systém předkolon předkolony 2 cm a vnitřní rozměr 2,1 mm 3,0 mm 4,0 mm pro analytické kolony 4,0 a 4,6 mm sorbent 3 a 5 µm 108

109 Speciální UHPLC spojky Ferrule jsou přesně přizpůsobeny fittingům Určeny pro tlak do 103,4 MPa Dotažení prsty Finger tight 109

110 Závěr Ascentis Express kolony s povrchově porézním sorbentem Mají lepší rozlišení než kolony se sorbenty 5µ a 3µ se stejnou délkou. Vzhledem k nižšímu zpětnému tlaku lze použít kolony 2x delší než kolony se sub-2m částicemi, takže mají minimálně stejné rozlišení. Lze je použít v tradičních HPLC chromatografech. Vzhledem k vyšší účinnosti se dají použít kratší kolony, čímž se zkrátí doba analýzy a ušetří rozpouštědla. Díky k úzké distribucičastic sorbentu mají kolony frity s porozitou 2 µm - menší pravděpodobnost ucpání. Alternativní fáze Zkuste využít pro problematické separace Prodlouženíživotnosti kolon filtrování MF a vzorků, použití in-line filtrů předkolony 110

111 111 Děkuji za pozornost