Bc. Eva Vaněčková. Využití tuhých elektrod na bázi uhlíku k elektrochemické oxidaci acikloviru

Transkript

1 U N I V E R Z I T A K A R L O V A V P R A Z E P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a Studijní program: Chemie Studijní obor: Analytická chemie Bc. Eva Vaněčková Využití tuhých elektrod na bázi uhlíku k elektrochemické oxidaci acikloviru Utilization of carbon-based solid electrodes to electrochemical oxidation of acyclovir D i p l o m o v á p r á c e Vedoucí diplomové práce: RNDr. Karolina Schwarzová, Ph.D. Praha 2014

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne 25. srpna

3 Ráda bych poděkovala v prvé řadě své školitelce paní RNDr. Karolině Schwarzové, Ph.D. za ve všech směrech profesionální vedení, ochotu, podporu a vřelý přístup při vypracovávání mé závěrečné práce. Dále bych chtěla poděkovat také panu Prof. RNDr. Jiřímu Ludvíkovi, CSc. za poskytnuté cenné odborné rady a panu RNDr. Jakubovi Hraníčkovi, Ph.D. za všestrannou pomoc a podporu. 3

4 Obsah 1 Úvod 1.1 Cíl práce Aciklovir Metody stanovení Elektrochemické voltametrické metody Pracovní elektrody Elektroda ze skelného uhlíku Borem dopovaná diamantová elektroda Experimentální část 2.1 Reagencie a příprava zásobních roztoků Aparatura Pracovní postupy Stálost zásobního roztoku acikloviru Výsledky a diskuse 3.1 Oxidace acikloviru na GC elektrodě Vliv ph na elektrochemické chování acikloviru na GC elektrodě Vliv rychlosti polarizace GC elektrody Studium elektrochemického chování acikloviru pomocí rotující diskové GC elektrody Kalibrační závislosti na GC elektrodě Oxidace acikloviru na BDD elektrodě Cyklická voltametrie a pasivace BDD elektrody Optimalizace aktivace BDD elektrody Vliv ph na elektrochemické chování acikloviru na BDD elektrodě Vliv rychlosti polarizace BDD elektrody Porovnání voltamogramů acikloviru ve vybraných kyselinách Kalibrační závislosti na BDD elektrodě Stanovení acikloviru v tabletě Zovirax

5 3.3 Porovnání voltamogramů acikloviru na vybraných elektrodových materiálech Závěr Literatura

6 Abstrakt Studie elektrochemického chování acikloviru na elektrodě ze skelného uhlíku (GC) a na borem dopované diamantové elektrodě (BDD) ukázala, že aciklovir poskytuje jeden výrazný oxidační signál, jehož výška i poloha je závislá na ph. V oblasti ph = 2,0 až 9,0 se objevuje i druhý nevýrazný signál. Pro obě elektrody byly optimalizovány podmínky stanovení. Kalibrační závislost na GC elektrodě v prostředí B R pufru o ph = 6,0 je lineární pouze v rozmezí koncentrací 2 až 10 µmol l 1 pro DCV s limitem detekce 0,47 µmol l 1 a pro DPV lineární není. BDD elektrodu bylo nutné aktivovat mezi jednotlivými záznamy 15 s při vloženém potenciálu +2,4 V pro zabránění pasivace povrchu. Opakovatelnost výšky píků acikloviru (c = mol l 1 ) je pak charakterizována relativní směrodatnou odchylkou 0,9 % (n = 20). Metodami DCV a DPV byly nalezeny lineární kalibrační závislosti na BDD elektrodě v 0,1 mol l -1 kyselině dusičné a v B R pufru o ph = 6,0. Nejnižší meze detekce i stanovitelnosti bylo dosaženo metodou DCV v prostředí B R pufru o ph = 6,0 (LOD = 0,47 µmol l 1 a LOQ = 1,55 µmol l 1 ), kdy měla kalibrační závislost také nejvyšší citlivost a nejširší lineární rozsah 0,6 až 100 µmol l 1. Obsah acikloviru v tabletě Zovirax byl stanoven metodou standardního přídavku na BDD elektrodě za zvolených optimálních podmínek. Stanovené množství acikloviru odpovídá 101,1 ± 2,3 % množství udávaného výrobcem pro metodu DCV a 98,8 ± 2,2 % pro metodu DPV, tj. v obou případech se dobře shoduje s údajem, který udává výrobce. 6

7 Abstract Electrochemical oxidation of acyclovir at glassy-carbone electrode and boron-doped diamond electrode gives one ph-dependent oxidation signal; the corresponding electrode reaction is controlled by diffusion. It is followed by a second indistinctive signal in the ph range 2,0 9,0. Further, optimization of conditions was carried out for determination of acyclovir using DC and DP voltammetry. The calibration dependence on GC electrode in B R buffer (ph = 6,0) is linear only in the concentration range from 2 to 10 µmol l 1 for DCV with limit of detection 0,38 µmol l 1 ; for DPV it is not linear. BDD electrode has to be activated to prevent its passivation. Anodic activation at +2,4 V for 15 s with simultaneous stirring of solution results in relative standard deviation of 0,9% for acyclovir concentration of mol l 1. Using DCV and DPV methods linear concentration dependences were obtained in 0,1 mol l -1 nitric acid and in ph 6,0 B R buffer. The lowest limit of detection and limit of quantification (LOD = 0,47 µmol l 1 a LOQ = 1,55 µmol l 1 ) and linear range from 0,6 to 100 µmol l 1 was reached in ph 6,0 B R buffer. Further, standard addition method was used to quantify acyclovir in Zovirax tablets. Satisfactory recoveries of 101,1 ± 2,3 % using DCV and 98,8 ± 2,2 % using DPV at BDD (compared with the teoretical amount of acyclovir in the tablet given by the manufacturer) revealed applicability of the developer methods in pharmaceutical analysis. 7

8 Předmětová hesla Analytická chemie Elektrochemie Klíčová slova borem dopovaná diamantová elektroda elektroda ze skelného uhlíku aciklovir voltametrie oxidace Objective Words Analytical Chemistry Electrochemistry Key Words boron-doped diamond electrode glassy carbon electrode acyclovir voltammetry oxidation 8

9 Seznam použitých zkratek CV cyklická voltametrie DCV direct current voltametrie DPV diferenční pulzní voltametrie BDD borem dopovaný diamant GC skelný uhlík RDE rotační disková elektroda B R pufr Brittonův Robinsonův pufr c molární koncentrace E p I p i p s s r n L 1,2 LOD LOQ R rpm ω potenciál píku či vlny proudová odezva píku či vlny proudová hustota směrodatná odchylka relativní směrodatná odchylka počet opakovaných měření interval spolehlivosti mez detekce mez stanovitelnosti korelační koeficient počet otáček za minutu úhlová rychlost 9

10 1 ÚVOD 1.1 Cíl práce Cílem této práce je nalézt vhodné podmínky pro jednoduché, rychlé a zároveň přesné voltametrické stanovení množství acikloviru v tabletě Zovirax a pokusit se o objasnění elektrochemických dějů na BDD a GC elektrodě v přítomnosti acikloviru. 1.2 Aciklovir Aciklovir je syntetický analog purinového nukleosidu guanosinu. Systematický název acikloviru je 9-2-hydroxyethoxymethyl-guanin 1. Poprvé byl syntetizován v roce 1974 a v průběhu deseti let po jeho objevení se stal v medicíně standardem pro léčbu infekcí způsobených některými herpetickými viry, a to konkrétně Herpes simplex viry (typů 1 a 2) a Varicella zoster virem 2. Jde o DNA viry z čeledi Herpesviridae způsobující infekce nervového systému (herpetická encefalitida), kůže (plané neštovice, herpes zoster, herpes lapalis), sliznic (herpetická gingivostomatitida) a rovněž generalizované systémové infekce (např. u imunokompromitovaných jedinců). Typické pro viry z čeledi Herpesviridae je schopnost dlouhodobého latentního přetrvávání v infikovaném organismu 3. Protivirovou aktivitu nevykazuje však aciklovir samotný, nýbrž jeho aktivní metabolit, aciklovirtrifosfát. Fosforylace na tento aktivní metabolit je iniciována virovou tymidin kinázou, vzniká nukleosidový analog aciklovir monofosfát, který je dále metabolizován již pomocí buněčných enzymů na výsledný produkt aciklovir trifosfát 1, 4, 5. Vysoká selektivita účinku vůči virovému replikačnímu cyklu a nízká buněčná toxicita je dána faktem, že tymidin kináza obsažena v savčích buňkách nevyužívá aciklovir jako substrát 1, 4. Aciklovir trifosfát slouží jako kompetitivní falešný substrát virové DNA polymerázy, po začlenění aciklovir trifosfátu do řetězce virové DNA dochází k ukončení replikace viru 1, 4, 5. Aciklovir se vyrábí v lokální léčivé formě (mast, gel) a ve formách pro systémové použití, tablet pro perorální užití a prášku pro přípravu infuze pro nitrožilní podání (ve formě sodné soli Aaciclovirum natricum) 1, 3. Aciklovir má výbornou biologickou dostupnost, terapeutických koncentrací dosahuje ve tkáních i tělních tekutinách, včetně mozkomíšního moku. Po perorálním podání se částečně vstřebává ze střeva 1, 4, 5. Aciklovir se z organismu vylučuje glomerulární filtrací a tubulární sekrecí, jeho biologický poločas je při normálních 10

11 ledvinných funkcích 2 až 3 hodiny. Do moči je vylučován převážně v nezměněné formě, pouze asi z 10 až 15 procent je v moči přítomen jeho metabolit 9-karboxymetoxymethylguanin 1, 4. Aciklovir, strukturním názvem 2-amino-9-[(2-hydroxyethoxy)methy]-1,9-dihydro- -6Hpurin-6-on, je bílý nebo téměř bílý krystalický prášek 6. Je těžce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v dimethylsulfoxidu, velmi těžce rozpustný v lihu 96%. Rozpouští se ve zředěných roztocích minerálních kyselin a alkalických hydroxidů. Fyzikálně-chemické vlastnosti acikloviru jsou shrnuty v tabulce 1.1. Tab 1.1 Fyzikálně-chemické vlastnosti acikloviru 7. Molekulární hmotnost 225,21 g mol 1 Bod tání C Disociační konstanty pk a1 = 2.27; pk a2 = 9.25 Rozpustnost ve vodě 1,620 mg l 1 při 25 C Rozpustnost v alkoholu 0.2 mg l Metody stanovení acikloviru Nalézání efektivnějších metod ke stanovení koncentrace acikloviru z farmaceutických výrobků je stále aktuální, jelikož na trh vstupují nová generika obsahující tuto účinnou látku. Snaha o optimalizaci metod stanovení má ekonomický i praktický důvod. Existuje řada metod pro stanovení acikloviru (viz tab. 1.2). Stanovení acikloviru se studuje z několika úhlů, jak detekce koncentrace v samotných léčivech, tak stanovení léku v biologických materiálech, konkrétně v krvi a moči. Zjištěná data přispívají k objasnění farmakokinetiky léku. Nejnižší limit detekce z metod uvedených v tabulce je pro metodu RIA (0,7 ng ml 1 ). Dle Českého lékopisu je doporučený postup stanovení obsahu acikloviru potenciometrickou titrací vzorku rozpuštěného v bezvodé kyselině octové kyselinou chloristou 6. Dle dostupných zdrojů byl voltametricky stanovován obsah acikloviru v tabletě například: - Metodou DPV v prostředí fosfátového pufru o ph = 7,4 na fullerenem modifikované elektrodě ze skelného uhlíku 8. 11

12 - Metodou DCV v citrátovo-fosfátovém pufru o ph = 7,36 na GC elektrodě 9 pokryté filmem z mnohostěnných nanotrubiček a dihexadecyl-hydrogenfosforečnanu (MWNTs-DPH; multi wallcarbonnanotubes dihexadecyl hydrogen phosphate). - Metodou SWV ( square wave voltametrie) ve fosfátovém pufru o ph = 7.0 na zlaté elektroděmodifikované2-mercaptobenzothiazolem a [5,10,15,20-tetrakis (3-methoxy- 4-hydroxyphenyl)porphyrinato]Cu 2+ komplexem (MBZ/TMHPPCu 2+ ) Metodou DPV v acetátovém pufru o ph = 5,0 na polyvinylpyrrolidonem (PVP) modifikované uhlíkové pastové elektrodě 11. Přehled kalibračních závislostí a dosažených s r voltametrických stanovení je shrnut v tabulce 1.3. Předpokládaný mechanismus oxidace acikloviru vychází z analogie s guaninem a byl studován na GC elektrodě 8. Oxidační proces je lokalizován na guaninovém skeletu molekuly, elektrochemická oxidace acikloviru zahrnuje přenos dvou elektronů a dvou protonů za vzniku 8-oxoacikloviru. Ten je analogický s produktem elektrochemické oxidace guaninu. Schéma mechanismu oxidace je vyobrazeno na obrázku 1.1. Obr. 1.1 Mechanismus oxidace acikloviru na GC elektrodě 8. Upraveno na záklaladě konzultace s prof. Jiřím Ludvíkem z Ústavu fyzikální chemie Jaroslava Heyrovského. 12

13 Tab. 1.2 Přehled metod stanovení acikloviru. Matrice Léková forma tablety Léková forma tablety Lidská plazma Léková forma injekční Lidské sérum Léková forma tablety, krém Lidská moč Plazma Lidská plazma Léková forma tablety Léková forma tablety, suspenze Moucha Bodalka (Glossina morsitans, Tse Tse ) (Předpříprava) Metoda Obsah acikloviru (%) LOD LOQ Lineární rozsah s r (%) Cit. UV-VIS 89,8 100,66 25,39 µg ml 1 84,63 µg ml µg ml 1 0,937 Spektrofluorimetrie 98,82 100,66 0,0209 µg ml 1 0,0699 µg ml 1 0,25 22,5 µg ml 1 0,630 FIA-ECL , mol l 1 7, mol l 1 7, , mol l 1 1,6 HPLC >80 10 ng ml 1 25 ng ml ng ml 1 není uvedena FIA-CL 99,8 104,5 0,06 mg l 1 není uveden 0,2 80 ng ml 1 3,7 (LLE) HPLC 90±8 4 ng ml 1 10 ng ml ng ml 1 1,04 12,83 TLC 100,2 101,5 36 ng spot 1 není uveden ng spot 1 < 2 (Mini-SPE) HPLC 91,6 103,3 8,1 ng ml 1 26,9 µg ml 1 0,5 15 µg ml 1 < 4,0 (SPE) HPCE 102,9±14,2 5,5 ng ml 1 20 ng ml ng ml 1 2,2 14,8 RIA ,7 ng ml 1 0,7 ng ml 1 není uveden < 8 HPLC 96,64 99,53 0,80 µg ml 1 1,50 µg ml 1 1,98 59,4 µg ml 1 < 1 Spektrofotometrie 96,71 102,16 5,68 µg ml 1 18,95 mol l µg ml 1 < 2 LC-MSMS 76, ,0625 µg g 1 0,2 µg g 1 0,45 4,5 µg g 1 0,7 6, Význam použitých zkratek: CL chemiluminiscence ECL elektrochemiluminiscence FIA průtoková injekční analýza HPCE vysokoúčinná kapilární elektroforéza HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie LC kapalinová chromatografie LLE extrakce kapalinou (org.rozpouštědlem) MSMS tandemová hmotností spektrometrie SPE extrakce tuhou fází RIA radioimunologická analýza TLC tenkovrstvá chromatografie UV-VIS absorpční spektrometrie v ultrafialové a viditelné oblasti záření

14 Tab. 1.3 Parametry kalibračních závislostí a s r voltametrických stanovení acikloviru v tabletách. Metoda s r (%) LOD Lineární rozsah Cit detekce (n,c)* DPV 1, mol l 1 9, , mol l 1 2,68 (n=5, c neuvedena) DCV mol l mol l 1 2,86 (n=10, c=10 5 mol l -1 ) SWV mol l mol l 1 1,17 (n=6, c=10 5 mol l 1 ) DPV 2, mol l mol l 1 < 4 (n=3, c neuvedena) * Počet opakovaných měření n při předpokládané koncentraci c roztoku acikloviru připraveného z tablety Elektrochemické voltametrické metody Voltametrie je elektroanalytická metoda, při které je sledován proud procházející elektrochemickým článkem v závislosti na potenciálu vkládaném na pracovní elektrodu, který je proměnný s časem. Elektrochemický článek se skládá z elektrod ponořených do analyzovaného roztoku. Často je realizován v tříelektrodovém uspořádání, jehož výhodou oproti dvouelektrodovému je, že potenciál vkládaný na pracovní elektrodu je přesně znám, může být tedy snadno kontrolován. Ve tříelektrodovém uspořádání jsou zapojeny elektrody pracovní (indikační), pomocná a referenční. Pracovní a pomocná elektroda jsou polarizovatelné a referenční elektroda je nepolarizovatelná. Při voltametrické elektrolýze v tříelektrodovém uspořádání je vkládáno napětí na pracovní a pomocnou elektrodu, mezi nimiž je měřen proud a napětí na pracovní elektrodě je měřeno mezi pracovní a referenční elektrodou v bezproudovém stavu. Rozdíl mezi vloženým a měřeným napětím je způsoben ohmickým úbytkem napětí v článku. Existuje mnoho voltametrických technik, které se vzájemně liší svým potenciálovým programem, kdy vkládaný potenciál na pracovní elektrodu je funkcí času. Při DCV se potenciál pracovní elektrody mění s časem lineárně.dpv je metoda, při níž jsou n lineárně s časem měnící se potenciál vkládány pravoúhlé napěťové pulzy konstantních 14

15 parametrů (amplituda, čas, frekvence pulzů). Proud je vzorkován vždy těsně před vložením a na konci pulzu. Výsledný voltamogram je závislostí rozdílu těchto proudů na potenciálu a voltametrická křivka má tvar píku s vrcholem při půlvlnovém potenciálu depolarizátoru. Tento způsob měření potlačuje vliv nabíjecího proudu, který je nežádoucí a metoda je citlivější než klasický způsob voltametrických měření. Cyklická voltametrie slouží především pro objasnění mechanismů elektrodových procesů a podává názorný přehled elektrochemického chování systému v širokém rozsahu potenciálů. Z cyklických voltamogramů je možné posuzovat např. reverzibilitu systému či odhalit přítomnost nových produktů při opakování cyklů Pracovní elektrody Volba elektrodového materiálu pracovní elektrody je jedním z hlavních faktorů, které ovlivňují výsledky elektrochemické analýzy. Obecně při používání pevných elektrod, bývá problémem pasivace elektrody způsobená adsorpcí meziproduktů či produktů elektrodové reakce na povrchu elektrody, či jiných složek z roztoku. Tento negativní vliv je možné často eliminovat mechanickým (broušením, leštěním) či elektrochemickým čištěním elektrody (např. vkládáním střídavě kladných a záporných potenciálů). Při výběru pracovní elektrody pro voltametrickou analýzu je nutné posoudit její vhodnost pro danou analýzu. Musí mít dostatečně široký využitelný potenciálový rozsah, nízký šum, měla by poskytovat reprodukovatelné výsledky a dostatečně velkou proudovou odezvu na analyt. Všechny tyto parametry jsou pro konkrétní elektrodu specifické v daném prostředí. V neposlední řadě hraje roli dostupnost na trhu, pořizovací náklady a životnost elektrody Elektroda ze skelného uhlíku Skelný uhlík je připravován opatrným zahříváním například polymerního fenolformaldehydu v inertní atmosféře 25. Karbonizace probíhá velmi pomalu v rozsahu teplot kolem 300 až 1200 C a zajišťuje odstranění vázaného kyslíku, dusíku a vody. 15

16 Struktura GC obsahuje tenké neuspořádané zesíťované řetězce podobné grafitové kostře. Díky velké hustotě a velmi malé velikosti pórů není nutné skelný uhlík dále impregnovat. Nicméně GC elektrodu je nutné před použitím čistit pro vytvoření aktivního a reprodukovatelného povrchu. Čištění je obvykle prováděno leštěním malými částicemi oxidu hlinitého. Pro zlepšení vlastností GC elektrody se také přidává aktivační krok, například aktivace laserem, teplem, nebo elektrochemicky. Struktura skelného uhlíku závisí na mnoha faktorech (např. typ použitého prekurzoru, teplota pyrolýzy) a byla již studována v mnoha pracích. Jedna z teorií je založena na předpokladu, že molekulární orientace výchozího polymerního materiálu se ukládá do určité míry do paměti po karbonizaci 26. To znamená, že struktura má částečnou podobnost ke svému prekurzoru. Tento názor je poměrně široce přijímaný, ale zdá se, že je v řadě hledisek nedostatečný. Výhodou GC elektrod je jejich mechanická i chemická odolnost, nepropustnost vůči rozpouštědlům, široké potenciálové okno, malý zbytkový proud a oproti kovovým elektrodám nemají tendenci oxidovat Borem dopovaná diamantová elektroda Diamant se vyznačuje mimořádnou mechanickou i chemickou stabilitou. Je jedním z nejlepších přírodních izolátorů a pro jeho elektroanalytické využití je nutné jej dopovat atomy jiných prvků 27. Dopován je nejčastěji atomy boru a podle koncentrace dopantu lze získat diamant s polovodivými nebo polokovovými vlastnostmi. Ve struktuře borem dopovaného diamantu jsou sp 3 hybridizovanéuhlíkové atomy diamantu 28. Na povrchu jsou vazby terminovány nejčastěji vodíkem, tudíž povrch má strukturu obdobnou alkanům a vůči adsorpci polárních látek je rezistentní. Borem dopovaná diamantová elektroda je nejčastěji vyráběna ve formě tenkého polykrystalického filmu na křemíkové destičce s nízkým odporem 29. Obvykle je film připravován chemickou depozicí par směsi methanu a vodíku při použití žhavených vláken nebo mikrovlnného ohřevu a přidáváním diboranu do směsi plynů jako zdroje boru, za vysokých teplot a tlaků. 16

17 Elektrochemické vlastnosti jsou ovlivněny mnoha faktory koncentrací dopantu, krystalovou strukturou a jejími defekty, krystalickou orientací, množstvím grafitického uhlíku a terminací povrchu elektrody 27. Hlavními výhodami BDD jsou široký využitelný potenciálový rozsah, velké přepětí vodíku a kyslíku, malý kapacitní proud, nízký šum, hydrofobní povrchový charakter, chemická i mechanická odolnost. Díky všem těmto vlastnostem je BDD možno elektrodu využít pro stanovení velkého množství látek. Možnosti jejich využití v elektroanalýze organických sloučenin jsou intenzivně studovány a v poslední době bylo publikováno několik přehledných referátů dokumentujících jejich možnosti v této oblasti 28, 30, 31, včetně využití pro stanovení farnakologicky významných látek

18 2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 2.1 Reagencie a příprava zásobních roztoků Zásobní roztok standardu acikloviru o koncentraci mol l 1 byl připraven navážením 0,02252 g standardní látky acikloviru (Fluka Analytical, Missouri, USA) a rozpuštěním ve 100ml odměrné baňce v deionizované vodě za pomoci ultrazvukové lázně. Roztoky nižších koncentrací byly připravovány přesným naředěním tohoto zásobního roztoku v B R pufru, v kyselinách nebo ve vodě. Tablety Zovirax 800 mg (Glaxosmithkline Pharmaceuticals, Poznaň, Polsko), standard acikloviru i zásobní roztoky z nich připravené byly uchovávány v lednici při teplotách v rozmezí 4 až 8 C. Brittonovy Robinsonovy tlumivé roztoky požadovaného ph byly připraveny smícháním kyselé a zásadité složky na požadované ph. Kyselá složka obsahovala tři kyseliny, každou o molární koncentraci 0,04 mol l 1. Pro její přípravu bylo odpipetováno 2,70 ml koncentrované kyseliny trihydrogenfosforečné (85%, Lachema, Brno, ČR), 2,31 ml koncentrované kyseliny octové (99%, Lach-Ner, Neratovice ČR), naváženo 2,74 g kyseliny borité (Lachema, Brno, ČR) a vše bylo rozpuštěno v 1 litru vody. Zásaditá složka o koncentraci 0,2 mol l 1 byla připravena navážením 4,0 g hydroxidu sodného (Lach-Ner; Neratovice, ČR) a rozpuštěním v 0,5 litrech vody. Další použité chemikálie: Chlorid draselný (Lach-ner Neratovice, ČR) Kyselina dusičná (Penta, Chrudim, ČR) Kyselina sírová (Penta, Chrudim, ČR) Kyselina chloristá (Lach-ner Neratovice, ČR) Oxid hlinitý (velikost částic 0,3 µm) Pro přípravu všech vodných roztoků byla používána deionizovaná voda (Millipore, Billerica, USA). Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. 18

19 2.2 Aparatura Pro CV, DCV a DPV měření byl použit analyzátor Eco-Tribo Polarograph (Eco- Trend Plus, Praha, ČR), ovládaný softwarem PolarPro verze 5.1 (Eco-Trend Plus, Praha, ČR). Software pracoval v operačním systému Windows XP. Všechna měření probíhala v tříelektrodovém zapojení s referenční argentochloridovou elektrodou (10-20 polaro+, 3 mol l 1 KCl) a pomocnou platinovou drátkovou elektrodou (obě Elektrochemické detektory, Turnov, ČR). Jako pracovní byla používána elektroda ze skelného uhlíku o průměru disku 2 mm (Metrohm, Švýcarsko) ve skleněném těle, nebo borem dopovaná diamantová elektroda o průměru disku 3 mm (Windsor Scientific, Slough Berkshire, UK) a platinová o průměru disku 2 mm (Metrohm, Švýcarsko) v těle z polyetheretherketonu. Měření s rotační diskovou elektrodou bylo prováděno s pracovní elektrodou ze skelného uhlíku o průměru disku 2 mm (Metrohm, Švýcarsko), s referenční argentochloridovou elektrodou (3 mol l 1 KCl, Elektrochemické detektory, Turnov, ČR) a s pomocnou platinovou plíškovou elektrodou (Metrohm, Švýcarsko). Měření bylo řízeno pomocí softwaru EcoChemie NOVA, verze 1.7 (EcoChemie, Nizozemí) na osobním počítači s operačním systémem Windows 7 (Microsoft Corporation, USA). Vkládané napětí bylo ovládáno potenciostatem AUTOLAB PGSTAT 10 (EcoChemie, Nizozemí). Hodnota ph byla měřena digitálním ph-metrem s kombinovanou skleněnou elektrodou (Jenway, Staffordshire, Velká Británie). Absorpční spektra byla měřena na přístroji Agilent Technologies 8453 UV-Visible Spectrophotometer s programem UV-Visible ChemStation verze 9.01 v křemenných kyvetách (vše od Agilent Technolgies, Santa Clara, USA). 2.3 Pracovní postupy Postup měření UV-VIS spekter Měření absorpčních spekter bylo prováděno v křemenné kyvetě o měrné tloušťce 10 mm, metodou UV-VIS spektrofotometrie. Pro dosažení absorbance menší než jedna, bylo nutné zásobní roztok acikloviru naředit. Do 10ml odměrné baňky bylo 19

20 napipetováno 0,5 ml zásobního roztoku acikloviru (c = mol l 1 ) a doplněno ionizovanou vodou po rysku. Roztok byl tímto postupem zředěn dvacetkrát na výslednou koncentraci c = mol l 1. Pro účely zjištění stálosti zásobního roztoku bylo v určený den měření opakováno pětkrát. K vyhodnocení byl použit medián absorpčního maxima acikloviru. Příprava pracovních roztoků ze zásobního standardního roztoku acikloviru Do 10ml odměrné baňky bylo odpipetováno množství zásobního roztoku acikloviru (c = mol l 1 ) odpovídající požadované koncentraci vzorku a objem byl doplněn po rysku B R pufrem požadovaného ph, či vybranou (viz kap ) zředěnou kyselinou. Roztok základního elektrolytu byl připraven obdobně, ale místo zásobního roztoku acikloviru bylo do odměrné baňky odpipetováno stejné množství deionizované vody. Takto připravené roztoky byly kvantitativně převedeny do voltametrické nádobky. Postup měření voltamogramů na GC elektrodě Skleněná uhlíková elektroda před započetím měření voltamogramů mechanicky čištěna na textilii napuštěné suspenzí oxidu hlinitého rychlým třením (ve tvaru osmiček) po dobu cca jedné minuty. Do voltametrické nádobky bylo nalito 10 ml roztoku základního elektrolytu a do něho byly ponořeny elektrody, všechny řádně opláchnuté deionizovanou vodou a lehce osušené buničitou vatou. Pak byl proměřen cyklický voltamogram při rychlosti polarizace GC elektrody 100 mv s 1 v rozsahu celého potenciálového okna a byla tím ověřena čistota elektrody i roztoku. Při záznamu voltamogramů byl vždy nejdříve proměřen roztok základního elektrolytu v anodické oblasti do konce potenciálového okna (alespoň třikrát) a pak za stejných podmínek pracovní roztok acikloviru opakováním šesti záznamů. Počáteční potenciál byl volen přibližně v oblasti proudové nuly. Elektroda byla v průběhu měření mechanicky čištěna vždy po šesti naměřených voltamogramech acikloviru deset vteřin suspenzí oxidu hlinitého (viz výše). Mezi každým měřením byl roztok 15 s míchán. Do vyhodnocení nebyla zahrnuta první měření, která se vždy nezanedbatelně lišila. 20

21 Postup měření voltamogramů na BDD elektrodě Na začátku každého dne byla BDD elektroda aktivována pět minut v čerstvě připraveném B R pufru o ph = 6,0 při vloženém potenciálu +2,4 V za současného míchání roztoku. Pak se v 10 ml základního elektrolytu nechala voltametrická křivka ustálit cyklickou voltametrií v rozsahu potenciálů od 0 V až do úniku základního elektrolytu v anodické oblasti při rychlosti změny vkládaného potenciálu 100 mv s 1 na BDD elektrodu. Mezi jednotlivými cykly byla elektroda elektrochemicky čištěna 30 s při vloženém konstantním potenciálu +2,4 V za současného míchání základního elektrolytu. Při delší přestávce během dne byl tento postup v základním elektrolytu opakován. Každý nový den před měřením křivka přestala klesat asi po 20 cyklech a v průběhu dne, když byla elektroda delší dobu v klidu, asi po 7 cyklech. Záznam voltamogramu metodou DCV a DPV byl vždy nejdříve proveden v základním elektrolytu (alespoň třikrát) od počátečního nulového potenciálu až do úniku základního elektrolytu v anodické oblasti a pak byl za stejných podmínek měřen roztok acikloviru. Voltametrická křivka analytu byla vždy alespoň pětkrát zopakována, přičemž elektroda byla mezi jednotlivými scany čištěna 15 s při vloženém konstantním potenciálu +2,4 V za současného míchání roztoku pokud není uvedeno jinak (viz kap ) Všechna měření probíhala za laboratorní teploty. Získané voltamogramy (měřené na GC i BDD elektrodě) byly vyhodnoceny v programu Polar Pro 5.1 (EcoTrend Plus, Praha), opakovaná měření byla statisticky vyhodnocena v programu Microsoft Excel a grafy vytvořeny v programu OriginPro verze 8 (Originlab, USA). Parametry pracovních programů Cyklické voltamogramy byly měřeny od záporného, nebo od méně kladného potenciálu k více kladnému a zpět. Rychlosti scanu a přesný rozsah potenciálů je uveden v konkrétních kapitolách (viz kap a kap ) Vliv ph na elektrochemické chování acikloviru byl zkoumán metodou DCV na GC elektrodě (viz kap ) a na BDD elektrodě (viz kap ) při rychlosti polarizace pracovní elektrody 100 mv s 1. Všechna ostatní měření touto metodou byla 21

22 měřena při rychlosti polarizace pracovní elektrody 50 mv s 1, pokud není uvedeno jinak (viz kap a kap ). Pro metodu DPV byla zvolená rychlost polarizace pracovní elektrody 20 mv s 1. Na tento lineárně s časem rostoucí potenciál byly vkládány pulzy o výšce 50 mv a šířce 100 ms. Proud byl vzorkován 20 ms před vložením pulzu a na jeho konci. Pulz byl vkládán jednou za 150 ms. Voltametrické křivky měřené na RDE byly měřeny při rychlosti polarizace pracovní elektrody 100 mv s 1. Postup stanovení množství acikloviru v tabletě metodou standardního přídavku Pro analýzu tablety Zovirax ((Glaxosmithkline Pharmaceuticals S.A., Poznaň, Polsko)) byl nejprve připraven zásobní roztok vzorku tablety o koncentraci ca mol l -1. Pět zvážených tablet bylo rozdrceno v třecí misce, z toho bylo odváženo 0,02966 g a rozpuštěno ve 100ml odměrné baňce za pomoci ultrazvukové lázně. V jedné tabletě Zovirax je deklarované množství acikloviru 800 mg a průměrná hmotnost jedné tablety z pěti zvážených je 1,05162 g. Ze zásobního roztoku vzorku acikloviru (cca mol l 1 ) bylo odebráno 0,1 ml supernatantu a naředěno v odměrné baňce B R pufrem o ph = 6,0 na celkový objem 10 ml (tj. výsledná koncentrace cca mol l 1 ). Analyzovaný roztok byl kvantitativně převeden do voltametrické nádobky a byl zaznamenán voltamogram vzorku. Následně bylo do roztoku se vzorkem přidáno dvakrát po 0,05 ml standardního roztoku acikloviru (c = mol l 1 ), s každým přídavkem tedy vzrostla koncentrace acikloviru o mol l 1. Pro každý přídavek bylo provedeno pět opakovaných měření. Vyhodnocení voltamogramů Způsob vyhodnocení voltametrických křivek byl volen dle účelu použití výstupních dat. Pro zjištění výšky proudové odezvy I p v závislosti na koncentraci analytu byly při DCV metodě píky či vlny vyhodnoceny prodloužením lineární části záznamu před náběhem odezvy a ve vrcholu byla odečtena výška signálu I p na svislé ose (obr. 2.1a). 22

23 Píky získané metodou DPV byly odečítány od spojnice minim po jeho stranách (obr. 2.1b). Pro zjištění skutečné proudové odezvy náležející analytu v závislosti na proměnných veličinách (ph, rychlost polarizace elektrody), kde se změnou tohoto parametru se posouvá i potenciálové okno základního elektrolytu, je nutné tento vliv eliminovat odečtením proudu základního elektrolytu. To se týká obzvláště případů, kdy je pík či vlna posazena již na úniku základního elektrolytu (obr. 2.1c). Pro účely kvantitativní analýzy, kde je výška signálu odečítána od prodloužené lineární části záznamu, lze rozdíl mezi skutečnou odezvou od analytu a odečítanou hodnotou zanedbat, jelikož v parametrech lineární regrese se promítne tento rozdíl pouze do úseku na proudové ose. Potenciál píku E p byl odečítán při odpovídajícím proudu I p. a b c Obr. 2.1 Způsoby vyhodnocení voltamogramů měřených metodou DCV (a, c) a DPV (b). Statistické vyhodnocení dat Pro vyjádření přesnosti analytických výsledků byla data získaná z opakovaných měření statisticky zpracována. Postup statistického hodnocení byl volen dle počtu opakovaných analýz. Pro pět opakovaných měření byl pro odhad použit medián, odhad směrodatné odchylky s byl vypočítán vynásobením rozpětí (R = x max x min ) tabelovaným koeficientem pro pět měření k n=5 = 0,4299 (cit. 33 ) a interval spolehlivosti L 1,2 byl vypočítán ze součinu rozptylu R a koeficientu K n=5 = 0,51 (cit. 33 ). Pro větší počet opakovaných měření byl odhad střední hodnoty vyjádřen aritmetickým průměrem, směrodatná odchylka s a interval spolehlivosti byly vygenerovány programem Microsoft Excel na hladině významnosti α = 0,05. 23

24 Určení LOD a LOQ Limity detekce a stanovitelnosti byly určeny následujícím způsobem: Pro nejnižší vyhodnotitelnou koncentraci acikloviru byl desetkrát změřen voltamogram, byly vyhodnoceny proudové odezvy I p, z nichž byla vypočtena směrodatná odchylka s Ip pro deset opakovaných měření. Z kalibrační závislosti proudové odezvy na koncentraci analytu byla odečtena hodnota směrnice a. Mez detekce a mez stanovitelnosti byla vypočítaná ze vztahu: LOD = (3 s Ip ) / a, LOQ = (10 s Ip ) / a Určení oblasti linearity V případech, kdy kalibrační závislost v rozsahu měřených koncentrací analytu nebyla lineární (viz kap ), byla hledána oblast linearity logaritmickou analýzou. Lineární závislost je obecně vyjádřena vztahem: I = a c x +b. Při splnění podmínek linearity je exponent x roven jedné. Oblast linearity byla určena logaritmickou analýzou, kde se exponent x pohyboval v rozmezí hodnot 0,98 až 1,02 (cit. 34 ). 2.4 Stálost zásobního roztoku acikloviru Stálost zásobního roztoku acikloviru (c = mol l 1 ) ve vodě byla sledována měřením absorpčních spekter roztoků naředěných na koncentraci c = mol l 1. Získaná absorpční spektra jsou vyobrazena v grafu na obrázku 2.2. Aciklovir má absorpční maximum při vlnové délce λ = 252 nm. Měřena byla absorpční spektra čerstvě připraveného roztoku acikloviru, pak po 12 a po 36 dnech. Po 12 dnech poklesla absorbance acikloviru o 0,93 % a po 36 dnech byl pokles absorbance 3,70 %. Ze zjištěného poklesu absorbancí vyplývá, že stabilita zásobního roztoku je dostatečná pro jeho použití v průběhu tří měsíců. 24

25 A (a.u.) 0, ,6 0,4 0,2 0, (nm) Obr. 2.2 Absorpční spektrum roztoku acikloviru (c = Čerstvý roztok (1), roztok po 12dnech (2) a roztok po 36 dnech (3). mol l 1 ) ve vodě. 25

26 3 VÝSLEDKY A DISKUSE 3.1 Oxidace acikloviru na GC elektrodě Vliv ph na elektrochemické chování acikloviru na GC elektrodě Vliv ph na elektrochemické chování acikloviru (c = mol l 1 ) byl zkoumán metodou DC voltametrie v prostředí B R pufru v rozmezí ph = 2,1 až 13,0, při rychlosti polarizace pracovní GC elektrody 100 mv.s 1. Zaznamenané voltametrické křivky jsou na obrázku 3.1. Pro zobrazení křivek a vyhodnocení parametrů píků byl použit vždy třetí scan pro každou hodnotu ph. Je zřejmé, že studovaná látka poskytuje v celém studovaném rozsahu ph jeden pík, který je v oblasti ph = 3,0 až 9,0 doprovázen nevýrazným druhým píkem. Závislost potenciálu prvního výrazného píku E p acikloviru na ph je vynesena na obrázku 3.2. Potenciál píku E p se posouvá k méně pozitivním potenciálům se vzrůstajícím ph, což popisuje rovnice lineární regrese: E p (mv) = 41,5 ph (korelační koeficient = 0,999) V literatuře je uváděna směrnice 48 mv ph 1 (cit. 9 ), kdy oxidace acikloviru probíhala na MWNTs-DPH (multi-wall carbon nanotubes-dihexadecyl hydrogen phophate) filmem pokryté GC elektrodě v rozmezí ph = 3,5 až 9,0 a směrnice 46,3 mv ph 1 pro rozsah ph = 3,0 až 11,0 (cit. 8 ), kdy pracovní elektrodou byla fulleren-c 60 modifikovaná GC elektroda. V obou pracích jsou uvedené hodnoty považovány za blízké 59 mv ph 1, tj. hodnotě, při které je usuzováno na stejný počet vyměněných elektronů a protonů při oxidaci acikloviru. V oblasti ph = 3,0 až 9,0 se na křivce objevuje nevýrazný druhý pík, který se v závislosti na ph posouvá souběžně s prvním píkem. Při ph = 7,0 a 8,0 je nejzřetelnější a při ph = 2,1 je již pravděpodobně za únikem základního elektrolytu, tudíž ve voltamogramu není zaznamenán. Závislost proudové hustoty i p acikloviru na ph je vynesena v grafu na obrázku 3.3. V kyselé oblasti v rozmezí ph = 2,1 až 7,0 dosahuje proudová hustota i p podobných hodnot, cca 150 µa cm 2, což je přibližně dvojnásobek hodnot i p v oblasti bazické. 26

27 E p (mv) i p ( A/cm 2 ) I (na) Pro další experimenty na GC elektrodě byl použit BR pufr ph = 6,0 díky stabilním a maximálním hodnotám proudu píku v oblasti ph 5,0-7, ph = 2,1 ph = 3,0 ph = 4,0 ph = 5,0 ph = 6,0 ph = 7,0 ph = 8,0 ph = 9,0 ph = 10,0 ph = 11,0 ph = 12,0 ph = 13, E (mv) Obr. 3.1 Voltamogramy acikloviru (c = mol l 1 ) měřené metodou DCV na GC elektrodě v prostředí B R pufru o ph = 2,1 až 13,0 při rychlosti polarizace pracovní elektrody 100 mv s ph ph Obr. 3.2 Závislost potenciálu píku E p acikloviru (c = mol l 1 ) na ph B R pufru. Měřeno metodou DCV na GC elektrodě. Obr. 3.3 Závislost proudové hustoty i p acikloviru (c = mol l 1 ) na ph B R pufru. Měřeno metodou DCV na GC elektrodě. 27

28 I p ( A) Vliv rychlosti polarizace GC elektrody Vliv rychlosti polarizace v GC elektrody na proudovou odezvu I p acikloviru (c = mol l 1 ) byl studován metodou DC voltametrie v rozsahu rychlostí polarizace 20 až 320 mv s 1 v B R pufru o ph = 2,1 až 13,0. Voltamogramy pro B R pufr o ph = 6,0 je na obrázku 3.5. Výsledné lineární závislosti výšky píku I p acikloviru na druhé odmocnině rychlosti polarizace v 1/2 je na obrázku 3.4. Parametry lineární regrese jsou shrnuty v tabulce 3.2. Pro zobrazení křivek a vyhodnocení parametrů píků byl použit vždy třetí záznam pro každou rychlost polarizace. Pro elektrodové děje kontrolované difúzí obecně platí, že závislost limitního proudu na druhé odmocnině rychlosti polarizace je lineární a zároveň úsek regresní přímky na proudové ose je blízký nule. Tyto podmínky jsou nejlépe splněny pro ph = 9,0; 10,0 a 11, ,1 az 6,0 O 7, ,0 10,0 8,0 2 11,0 12,0 13, v 1/2 (mv/s) 1/2 Obr. 3.4 Závislost výšky píku I p acikloviru (c = mol l 1 ) na druhé odmocnině rychlosti polarizace v 1/2 GC elektrody při ph = 2,1 až 13,0 (čísla u křivek) B R pufru. 28

29 I ( A) Tab. 3.2 Parametry regresní přímky závislosti výšky píku I p acikloviru (c = mol l 1 ) na druhé odmocnině rychlosti polarizace v 1/2 GC elektrody při ph = 2,1 až 13,0 B R pufru. ph úsek směrnice (µa) (µa mv 1/2 s 1/2 ) R 2,1 1,197 0,587 0,998 3,0 0,94 0,561 0,999 4,0 0,954 0,562 0,998 5,0 1,089 0,588 0,999 6,0 1,086 0,575 0,996 7,0 0,877 0,544 0,999 8,0 0,601 0,428 0,999 9,0 0,089 0,286 0,999 10,0 0,012 0,241 0,999 11,0 0,121 0,208 1,000 12,0 0,388 0,179 1,000 13,0 0,429 0,186 0, E (mv) Obr. 3.5 Voltamogramy acikloviru (c = mol l 1 ) měřené metodou DCV při rychlostech polarizace GC elektrody v (plná čára): 20 (1), 40 (2), 80 (3), 160 (4) a 320 mv/ s 1 (5) v B R pufru o ph = 6,0; a základního elektrolytu (přerušovaná čára) při těchto rychlostech. 29

30 3.1.3 Studium elektrochemického chování acikloviru pomocí rotující diskové GC elektrody Na obrázku 3.6 jsou voltamogramy acikloviru (c = mol l 1 ) získané na rotační diskové GC elektrodě při rychlostech 500 až 3000 otáček za minutu a při rychlosti scanu 100 mv s -1. S rostoucí rychlostí otáček se posouvá potenciál vlny E p k vyšším kladným hodnotám. To znamená, že limitního proudu I p je při rychlejších otáčkách elektrody dosaženo až při vyšších potenciálech. Při potenciálu E p při nejnižší rychlosti otáček, kdy je dosaženo limitního proudu se oxiduje maximální množství molekul za daných podmínek. Při vyšších otáčkách se při tomtéž potenciálu k elektrodě dostane více molekul, ale jsou v kontaktu s elektrodou kratší dobu. Pokud by přenos elektronu byl dostatečně rychlý, pak by při tomto potenciálu také protékal elektrodou limitní proud. V tomto případě tomu tak není, což naznačuje, že reakce přenosu náboje na elektrodě je pomalá a limitního proudu je dosaženo až při vyšších potenciálech, kdy je elektrodový děj urychlen. Závislost výšky proudové odezvy I p na druhé odmocnině úhlové rychlosti rotující elektrody popisuje rovnice: I lim (µa) = (0,289 ω 1/2 (rad 1/2 s 1/2 )) + 3,491 (korelační koeficient = 1,000) Z toho lze vyvozovat, že děj je řízen konvektivní difúzí a obecně není ovlivněn povrchovými vlastnostmi elektrody. 30

31 I ( A) I lim ( A) /2 (rad/s) 1/ ,6 0,8 1,0 1,2 1,4 E (V) Obr. 3.6 Voltamogramy acikloviru (c = mol l 1 ) měřené metodou DCV na GC rotující diskové elektrodě v B R pufru o ph = 6,0 pro počet otáček za minutu 500 (1), 1000 (2), 1500 (3), 2000 (4), 2500 (5) a 3000 (6); a základního elektrolytu při 500 rpm (0). Ve vloženém grafu je vynesena závislost limitního proudu I lim na druhé odmocnině úhlové rychlosti ω 1/2 rotující elektrody Kalibrační závislosti na GC elektrodě Pro zjištění kalibrační závislosti byly měřeny voltamogramy na GC elektrodě v B R pufru o ph = 6,0 v rozsahu koncentrací 2 až 100 µmol l 1 acikloviru, při rychlosti polarizace pracovní elektrody 50 mv s 1 metodou DCV a při rychlosti polarizace pracovní elektrody 20 mv s 1 metodou DPV. Na obrázcích 3.7 a 3.8 jsou zobrazeny vždy třetí zaznamenané křivky pro každou koncentraci acikloviru. Ve vložených grafech jsou vyneseny závislosti proudových odezev I p na koncentraci acikloviru, kde je použit medián I p. V tabulce 3.3 jsou shrnuty parametry kalibračních závislostí. Logaritmickou analýzou bylo zjištěno, že kalibrační závislost je lineární v rozmezí koncentrací 2 až 10 µmol l 1 pro DCV, při vyšších koncentracích dochází k zakřivení 31

32 I ( A) I p ( A) kalibrační závislosti. Dosažená mez detekce metodou DCV je 0,38 µmol l 1 a mez stanovitelnosti je 1,25 µmol l 1. Závislost výšky signálu I p na koncentraci, při DPV lineární není. Z toho vyplývá, že tento způsob měření nelze použít pro stanovení acikloviru metodou standardního přídavku. Mez detekce určená ze směrnice kalibrační závislosti v rozsahu koncentrací 2 až 8 µmol l 1 je 0,71 µmol l 1. Hodnota exponentu x pro posouzení linearity byla 0,94 pro tento rozsah koncentrací (viz kap. ). 3,0 2,5 2,0 1,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 100 mol.l , c ( mol.l -1 ) ,5 0,0 0,6 0,8 1,0 1,2 E (V) Obr. 3.7 Voltamogramy acikloviru o koncentracích 2 až 100 µmol l 1 metodou DCV v B R pufru o ph = 6,0 při rychlosti polarizace GC elektrody 50 mv s 1 a základního elektrolytu (0). Čísla u křivek odpovídají koncentracím v jednotkách µmol l 1. Závislost proudové odezvy I p na koncentraci acikloviru je ve vloženém grafu. 32

33 I ( A) I p ( A) 2,0 1,5 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 100 mol.l , c ( mol.l -1 ) , ,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 E (V) Obr. 3.8 Voltamogramy acikloviru o koncentracích 2 až 100 µmol l 1 metodou DPV v B R pufru o ph = 6,0 při rychlosti polarizace GC elektrody 20 mv s 1 a základního elektrolytu (0). Čísla u křivek odpovídají koncentracím v jednotkách µmol l 1. Závislost proudové odezvy I p na koncentraci acikloviru je ve vloženém grafu. Tab. 3.3 Parametry kalibračních závislostí acikloviru v B R pufru o ph = 6,0 při rychlosti polarizace GC elektrody elektrody 50 mv s 1 metodou DCV a 20 mv s 1 metodou DPV. Metoda c (µmol l 1 Směrnice LOD LOQ ) Úsek (na) (na µmol 1 R l) (µmol l 1 ) (µmol l 1 ) DCV 2 až 10-10,99 39,72 1,000 0,38 1,25 DPV 2 až 8 0,71 33

34 I (na) I p ( A) 3.2 Oxidace acikloviru na BDD elektrodě Cyklická voltametrie a pasivace BDD elektrody Cyklické voltamogramy acikloviru (c = mol l 1 ) v B R pufru o ph = 6,0 v rozsahu potenciálů +0,2 až +1,4 V při rychlosti polarizace pracovní elektrody 100 mv s 1 jsou na obrázku 3.9. Na voltamogramech je jedna výrazná irreverzibilní anodická vlna při potenciálu +1,1 V, která se mírně posouvá k více pozitivním potenciálům s počtem opakovaných cyklů. Z cyklických voltamogramů je zřejmé, že v průběhu měření dochází k pasivaci povrchu BDD elektrody. Závislost proudové odezvy I p acikloviru na počtu opakování cyklu N je ve vloženém grafu na obrázku 3.9. Již při prvním opakování cyklu výška vlny prudce klesá, při čtvrtém pak téměř na polovinu původní hodnoty a následuje další mírný pokles. Po dvaceti cyklech už dosahuje výška vln pouze 30 % původní hodnoty. Pasivace je zřejmě způsobena meziprodukty a produkty elektrochemické oxidace, které zůstávají na povrchu elektrody a svou přítomností znemožňují přístup dalším elektroaktivním látkám, včetně látky studované. Elektroda se pasivuje a proto je nutné ji před každým měřením čistit N E (mv) Obr. 3.9 Cyklické voltamogramy acikloviru (c = mol l 1 ) v B R pufru o ph = 6,0 při rychlosti polarizace BDD elektrody 100 mv s 1, měřené bez čištění elektrody a bez míchání roztoku mezi následnými cykly. Ve vloženém grafu je vynesena výška vlny I p v závislosti na počtu opakování cyklu N (1 až 20). 34

35 3.2.2 Optimalizace aktivace BDD elektrody Vzhledem k pasivaci elektrodového povrchu při opakovaných měřeních bylo nutné nalézt režim jeho aktivace pro metodu DCV a DPV, které byly použity pro vývoj analytické metody stanovení acikloviru.. V případě, že měření následovala hned po sobě, dochází během prvních čtyř scanů k rychlému poklesu signálu v důsledku pasivace BDD elektrody (viz obr a, d). Metodami DCV a DPV byl zkoumán vliv míchání roztoku a elektrochemického čištění BDD elektrody na vývoj proudové odezvy. Měření proběhlo v roztoku acikloviru (c = mol l 1 ) v B R pufru o ph = 6,0 při rychlosti polarizace pracovní elektrody 20 mv s 1 opakováním deseti záznamů. Vliv čištění elektrody je zřejmý z obrázku Byly testovány tyto režimy pro aktivaci povrchu: míchání roztoku po dobu 30 s, elektrochemické čištění při 2.4 V po dobu 30 s za současného míchání roztoku a elektrochemické čištění při +2.4 V po dobu 5 až 45 s za současného míchání roztoku. Je-li po každém záznamu roztok 30 s míchán, pak je v případě DCV signál vyšší než při DPV, s počtem opakování však při DCV odezva stále mírně klesá (viz obr b, e). Signál po čištění při 2,4 V se zcela vytratil a voltametrická křivka byla pro hodnocení nepoužitelná. Nejlepších výsledků z hlediska opakovatelnosti bylo dosaženo elektrochemickým čištěním elektrody při +2,4 V, za současného míchání roztoku, kdy zároveň dochází ke zvýšení výšky signálu oproti režimům bez vloženého kladného potenciálu. Doba čištění byla prověřena v rozmezí 5 až 45 s, přičemž 15 s bylo vyhodnoceno jako dostačující. Za těchto podmínek bylo dosaženo uspokojivé opakovatelnosti výšek píku, jak je patrné z obr c, f a tabulky 3.4, kde je statisticky vyhodnoceno dvacet opakovaných měření voltamogramů acikloviru (c = mol l 1 ) v B R pufru o ph = 6,0 měřených metodou DCV při rychlosti polarizace BDD elektrody 50 mv s 1. Relativní směrodatná odchylka výšky píku je 0,9 %. Anodická oxidace povrchu BDD elektrody při vysoce kladných potenciálech je často používaným přístupem pro její aktivaci 30. Je-li vložen na BDD elektrodu potenciál, při kterém dochází k anodickému rozkladu vody, jsou na jejím povrchu ve vodném prostředí generovány velmi reaktivní hydroxylové radikály, které mohou reagovat s produkty oxidace na povrchu elektrody, a tím ji čistit. 35

36 I p (na) I p (na) a b c d e f N N N Obr Proudová odezva I p acikloviru (c = mol l 1 ) v B R pufru o ph = 6,0 pro deset opakovaných měření při rychlosti polarizace BDD elektrody 20 mv s 1. Měřeno metodou DCV v horním (a, b, c) a DPV v dolním řádku (d, e, f): bez čištění elektrody a bez míchání roztoku (a, d); před každým záznamem byl roztok 30 s míchán (b, e); s elektrochemickým čištěním elektrody 15 s při +2,4 V před každým záznamem za současného míchání (c, f). Tab. 3.4 Statistické vyhodnocení proudové odezvy I p acikloviru (c = mol l 1 ) v B R pufru o ph = 6,0 pro dvacet opakovaných měření metodou DCV s elektrochemickým čištěním BDD elektrody 15 s při +2,4 V před každým scanem za současného míchání při rychlosti polarizace elektrody 50 mv s 1. I p (na) (na) s s r % L 1,2 (na) 18 25,27 0,

37 3.2.3 Vliv ph na elektrochemické chování acikloviru na BDD elektrodě Vliv ph na elektrochemické chování acikloviru (c = mol l 1 ) byl zkoumán metodou DCV v prostředí B R pufru v rozmezí ph = 2,1 až 13,0, při rychlosti polarizace pracovní BDD elektrody 100 mv s 1. Zaznamenané voltametrické křivky jsou zobrazeny na obrázku 3.11, kde je použit vždy třetí záznam pro každou hodnotu ph. Potenciál hlavního anodického píku E p se posouvá k méně pozitivním potenciálům se vzrůstajícím ph. To svědčí o tom, že před krokem určujícím rychlost elektrodové reakce dochází k deprotonizaci, která je v bazickém prostředí usnadňována. Reakce proto probíhá při nižších hodnotách potenciálů. V silně zásaditém prostředí (ph = 13,0 až 11,0) je na voltamogramech zřejmý jeden výrazný oxidační pík. Při ph = 10,0 je pík zploštěn, je neostrý a dále přechází ve vlnu, jejíž výška se snižujícím ph roste. V rozmezí ph = 8,0 až 6,0 se výška vlny nemění, ale objevuje náznak druhé vlny, která je dále v kyselé oblasti viditelnější. Tato druhá vlna se také posouvá k více pozitivním potenciálům s klesajícím ph, ale ve větší míře a od první vlny se s klesajícím ph vzdaluje. První vlna při nižším ph přechází opět v ostrý pík, který je vyšší a strmější, než v oblasti zásadité. Závislost potenciálu píku E p acikloviru na ph je graficky znázorněna na obrázku 3.12 A. Na rozdíl od GC elektrody, kde je závislost lineární v rozsahu ph = 2,1 až 13,0 nevykazuje tato závislost na BDD elektrodě linearitu v celém měřeném rozsahu, ale pouze v jednotlivých úsecích. Pro ph = 2,1 až 9,0 má závislost sigmoidální tvar. Výraznější změna je pozorována při ph = 9,0, což by mohlo souviset s hodnotou pk a2 acikloviru (pk a2 = 9,25) 35. V rozmezí ph = 9,0 až 11,0 je zjištěná regresní rovnice závislosti potenciálu píku E p na ph: E p (mv) = 55,0 ph (korelační koeficient = 0,999) Hodnota směrnice 55,0 mv/ph zhruba odpovídá teoretické hodnotě 59 mv pro elektrodový děj, ve kterém se vyměňuje stejný počet elektronů a protonů. Závislost proudové hustoty i p acikloviru na ph je vynesena do grafu na obrázku 3.12 B, v němž je zobrazen medián z pěti záznamů pro každou hodnotu ph s příslušným intervalem spolehlivosti. Nejvyšší signál byl zaznamenán při ph = 5,0. Statistické vyhodnocení pro pět opakovaných měření pro ph = 2,1 až 13,0 je shrnuto v tabulce 3.5. Ve srovnání s ph závislostí na GC elektrodě (viz kap ) zde není tak velký rozdíl v proudových odezvách mezi kyselou a zásaditou oblastí. Také posun potenciálu E p s ph je na GC elektrodě větší a má lineární charakter oproti BDD. Na obou elektrodách je tato závislost spojitá, z čehož lze usuzovat, že oxidace acikloviru probíhá v celé měřené oblasti ph 37