Stanovení vybraných enzymů. Roman Kanďár

Transkript

1 Stanovení vybraných enzymů Roman Kanďár

2 Takže prvně malé opakování ENZYM Protein (RNA) s katalytickou aktivitou Protein (RNA) kofaktor (prosthetická skupina, koenzym) Jaký je vlastně rozdíl mezi prosthetickou skupinou a koenzymem? Prosthetická skupina stabilní součástí enzymu Koenzym snadno disociuje

3 Příklady kofaktorů: NAD, NADP, FMN, FAD, lipoát, benzochinony (CoQ 10 ), biopterin, hem, glutathion, PLP, koenzym A, TPP, biotin, THF, methylkobalamin, SAMe, ATP, PAPS, Ac-CoA, To je zkratek, takže připomenout, zopakovat Musíme umět vzorce těch kofaktorů? Netřeba, ale poznat byste je měli! Takže zkuste si to

4 A B C D E

5 G F H

6 I J K L M N

7 O P Q

8 Nyní k diagnosticky významným enzymům ACP ALT ALP AMS AST CHS HBD CK LD LPS Princip stanovení? Využíváme reakcí, které katalyzují Je však zapotřebí, aby substrát nebo produkt významně absorbovaly v blízké UV nebo Vis Nyní si jednotlivé reakce, katalyzovány námi stanovovanými enzymy, probereme

9 ALT, AST Jedná se o aminotransferasy, vzpomeňte na odbourávání aminokyselin Hlavně se ty reakce neučte nazpaměť, pak to pletete Je to jednoduché, nejdříve obecně Aminokysel ina 2 Oxokyselin a Aminotrans ferasa 2 Oxokyselin a Aminokysel ina ALT (alaninaminotransferasa) L Alanin 2 Oxoglutarát Alaninaminotransferasa Pyruvát L Glutamát

10 Žádný z produktů ani substrátů významně neabsorbuje v blízké UV nebo Vis oblasti! Proto následuje další reakce, kde buď substrát, produkt nebo třeba kofaktor absorbuje. Zde je to redukovaná forma NAD (NADHH ), silně absorbuje kolem 340 nm! Ve výsledku je aktivita ALT úměrná poklesu absorbance NADHH Pyruvát Laktátdehydrogenasa NADH H Laktát NAD

11 AST (aspartátaminotransferasa) L Apartát 2 Oxoglutarát Oxalacetát NADH H Aspartátaminotransferasa Oxalacetát Malátdehydrogenasa Malát NAD L Glutamát Jak vidíte, jedná se o analogickou reakci, jako při stanovení ALT, z aspartátu vzniká odpovídající 2-oxokyselina (oxalacetát), ten je pak za katalýzy malátdehydrogenasy redukován na odpovídající 2-hydroxykyselinu (malát) a opět sledujeme úbytek NADHH ALP (alkalická fosfatasa) 4 Nitrofenylfosfát ALP H2 O 4 Nitrofenol Fosfát ALP katalyzuje hydrolýzu esterů kyseliny fosforečné Zde je použit 4-nitrofenylfosfát, protože produkt (4-nitrofenol) významně absorbuje kolem 405 nm!

12 CK (kreatinkinasa) Kreatinkinasa Kreatinfosfát ADP Kreatin ATP ATP Glukosa Glukosa 6 fosfát NADP Hexokinasa Glukosa 6 fosfát ADP Aktivita CK je úměrná přírůstku absorbance NADPHH Zde můžeme použít i obrácenou reakci, tedy: Kreatin ADP Fosfoenolpyruvát Pyruvát NADH H Zde naopak je aktivita CK úměrná poklesu absorbance NADHH Nyní k jednotlivým reakcím: Reakce katalyzována hexokinasou je prvním krokem glykolysy Reakce katalyzována glukosa-6-fosfátdehydrogenasou je prvním krokem pentosového cyklu Reakce katalyzována pyruvátkinasou je posledním krokem glykolysy Reakce katalyzována laktátdehydrogenasou je reakcí anaerobní glykolysy Je třeba se něco učit? Glukosa 6 P dehydrogenasa Kreatinkinasa ATP Kreatinfosfát Pyruvátkinasa Pyruvát Laktátdehydrogenasa Laktát 6 Fosfoglukonát NADPH H ADP ATP NAD

13 LD (laktátdehydrogenasa) Pyruvát Laktátdehydrogenasa NADH H Laktát NAD To už tu několikrát bylo, že?

14 No a jak to budeme měřit? Kineticky! Tudíž to má něco společného s časem Neměříme tedy okamžitou absorbanci, ale její změnu v čase (nejčastěji za minutu, tedy A/min) V jakých jednotkách jsou uváděné výsledky? kat/l (tedy spíše µkat/l nebo nkat/l) Jedná se tedy o katalytickou koncentraci U některých enzymů se uvádí hmotnostní koncentrace (např. µg/l), co to znamená? To znamená, že neměříme aktivitu toho enzymu, ale jeho množství pomocí imunochemických metod (specifická protilátka proti bílkovinné části enzymu) A co je vlastně ten katal? Definice:» Enzym má katalytickou aktivitu 1 kat, pokud je schopen při nasycení substrátem za definovaných podmínek (teplota, ph, složení, koncentrace) za přítomnosti aktivátorů a nepřítomnosti inhibitorů proměnit 1 mol substrátu za 1 sekundu» Tedy rozměr v SI jednotkách je mol/s

15 Jaké přístroje k měření lze použít? Míněny ty, které jsou na KBBV Tento spektrofotometr nelze, poněvadž nemá vyhřívaný (37 C) kyvetový prostor Navíc je zapotřebí stopek, a to už se dostáváme někam do hodně daleké minulosti Velmi drahý spektrofotometr s diodovým polem, vhodný spíše pro výzkumné účely Devítikanálový fotometr LabSystem, náš favorit

16 Biochemické analyzátory Cobas Mira Plus a Olympus AU640 Samozřejmě nejvhodnější, ale k výukovým účelům méně vhodné

17 Ještě několik poznámek Neříkejte, že enzym stanovujeme enzymaticky Kromě kinetického měření lze použít i tzv. end-point metodu O co se jedná? Neměříme změnu absorbance v čase, ale konečnou absorbanci produktu, tudíž reakce se zastaví Příklad: ALT L Alanin 2 Oxoglutarát Pyruvát H 2,4 DNPH Hydrazon L Glutamát