PapilloCheck PapilloCheck high-risk

Transkript

1 Síla pro vaše zdraví HPV DNA-Chip Čip DNA HPV PapilloCheck PapilloCheck high-risk Návod k použití Diagnostická souprava určená pro genotypizaci lidského papilomaviru typu 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73 a 82 (PapilloCheck ) nebo typu 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68 (PapilloCheck high-risk) u vzorků děložního čípku Pro diagnostické použití in vitro pouze odborným laboratorním pracovníkem NEBEZPEČÍ 48

2 INFORMACE O AUTORSKÝCH PRÁVECH Návod k použití testovací soupravypapillocheck Síla pro vaše zdraví Copyright 2015 Greiner Bio-One,, Tel.: +49 (0) , Fax: +49 (0) info@de.gbo.com, Poznámka Všechna práva vyhrazena. Informace obsažené v tomto dokumentu mohou být kdykoli změněny bez předchozího oznámení. Kopírování nebo přetisk tohoto dokumentu v jakékoli formě nebo formátu je zakázáno bez písemného souhlasu společnosti Greiner-Bio-One GmbH. Ochranné známky Použité značky jsou vlastnictvím příslušného vlastníka. Důležité informace pro uživatele Abyste testovací soupravu PapilloCheck používali správně, je nutné pečlivě přečíst a dodržovat tento návod k použití. Výrobce nepřebírá žádnou odpovědnost za jakékoli použití tohoto testovacího systému, které není popsáno v tomto dokumentu, nebo za modifikace provedené uživatelem tohoto testovacího systému. URČENÉ POUŽITÍ PapilloCheck je diagnostická souprava určená k použití pro kvalitativní detekci a genotypizaci 24 typů lidského papilomaviru v preparátech DNA z lidských cervikálních stěrů. Souprava je určena k použití pouze kvalifikovaným personálem. PapilloCheck high-risk je diagnostická souprava určená k použití pro kvalitativní detekci a genotypizaci 14 typů vysoce rizikových papilomavirů lidského genitálu (hrhpv) v preparátech DNA z lidských cervikálních stěrů. Souprava je určena k použití pouze kvalifikovaným personálem. Testovací souprava PapilloCheck splňuje požadavky diagnostických zdravotnických prostředků in vitro (98/79/ES), a proto je označena značkou shody CE. Jakýkoli diagnostický výsledek generovaný pomocí testu PapilloCheck by měl být interpretován v kombinaci s dalšími klinickými nebo laboratorními nálezy. Testovací soupravy PapilloCheck jsou určeny pouze pro laboratorní použití, nikoli pro testování léčiv, domácí použití nebo jiné účely. Tyto produkty jsou určeny pouze pro profesionální uživatele, jako jsou techničtí pracovníci nebo lékaři vyškolení v technikách molekulární biologie. Není-li uvedeno jinak, používá se v tomto návodu k použití označení PapilloCheck pro obě varianty, PapilloCheck a PapilloCheck high-risk. 2

3 Síla SLOVNÍK pro vaše zdraví SYMBOLŮ en Batch code Do not reuse Use by date Consult Instructions for Use Catalogue Number Manufacturer Not to be used in case package is damaged Temperature limit Contents sufficient for <n> tests GHS pictograms with signal words DANGER or WARNING cs Číslo šarže Nepoužívejte opakovaně. Přečtěte si návod k použití. Datum exspirace Katalogové číslo Výrobce Nepoužívejte v případě poškození balení. Teplotní limit Obsah vhodný pro <n> testy/ů Piktogramy GHS se signálními slovy NEBEZPEČÍ nebo VAROVÁNÍ IVD! en CE marks In vitro diagnostic medical device Store in the dark Important Note cs Značky CE Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Uchovávejte v temnu. Důležitá poznámka 3

4 Síla OBSAH pro vaše zdraví 1. OBSAH SOUPRAVY POŽADOVANÝ MATERIÁL, VYBAVENÍ A HARDWARE PŘEPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ BEZPEČNOSTNÍ POKYNY LIKVIDACE ODPADU ÚVOD Další informace Typy HPV detekovatelné pomocí testu PapilloCheck Princip stanovení Schéma čipu PapilloCheck Uspořádání čipu PapilloCheck Kontroly na čipu POSTUP PROVEDENÍ TESTU PAPILLOCHECK 7.1 Všeobecné pokyny Oddělení místností Varování a bezpečnostní opatření Prevence kontaminace Pokyny pro manipulaci s čipy Obecná předběžná opatření Bezpečný způsob práce POSTUP PAPILLOCHECK Odběr vzorku a extrakce DNA Odběr vzorku Extrakce DNA Polymerázová řetězová reakce (PCR) Nastavení termocykléru Náprava pomocí uracil-n-glykosylázy (UNG) Průběh reakce PCR Hybridizace a promývání Příprava a průběh Hybridizace Promývání a sušení Skenování a vyhodnocení čipu PapilloCheck 9. ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ TECHNICKÁ PODPORA

5 Síla pro vaše zdraví 11. FUNKČNÍ VLASTNOSTI SOUPRAVY PAPILLOCHECK Analytická výkonnost soupravy PapilloCheck Analytická citlivost Analytická specifičnost typy HPV Analytická specifičnost organizmy bez přítomnosti HPV Opakovatelnost (intra-reprodukovatelnost) Reprodukovatelnost Odolnost Klinická výkonnost soupravy PapilloCheck KRÁTKÝ PROTOKOL PAPILLOCHECK 12.1 Místnost 2: Příprava reakční směsi pro PCR Místnost 2: Přidání templátu DNA pro PCR / reakce PCR Místnost 3: Hybridizace příprava / hybridizační reakce Místnost 3: Promývání a sušení / skenování a vyhodnocení

6 Síla 1. pro OBSAH vaše zdraví SOUPRAVY Testovací souprava PapilloCheck a PapilloCheck high-risk 1 Obsah Množství PapilloCheck (REF ) PapilloCheck PCR MasterMix 1x PapilloCheck PCR MasterMix 2 1 x µl PapilloCheck Slidebox, 4 x 12 čipů 1x box na kazety PapilloCheck se 4 čipy 3 PapilloCheck po 12 čipech, pro 48 vzorků 1 PapilloCheck Hyb.-Buffer 2X hybridizační pufr PapilloCheck 2 x µl PapilloCheck BUF A conc. 2x promývací pufr A PapilloCheck, koncentrát 2 x 40 ml PapilloCheck BUF B conc. 1x promývací pufr B PapilloCheck, koncentrát 1 x 15 ml Přípravná zkumavka k ředění UNG Voda upravená pro PCR 1 x 995 µl Přípravná zkumavka MasterMix (k použití pouze v kombinaci s automatizací) prázdná 1 Leták Návod k použití ke stažení 1 PapilloCheck high-risk (REF ) PapilloCheck high-risk PCR MasterMix 1x PapilloCheck high-risk PCR MasterMix 2 1 x µl PapilloCheck high-risk Slidebox, 4 x 12 čipů 1x box na kazety PapilloCheck se 4 čipy 3 PapilloCheck high-risk po 12 čipech, pro 48 vzorků 1 PapilloCheck high-risk Hyb.-Buffer 2x hybridizační pufr PapilloCheck high-risk 2 x µl PapilloCheck high-risk BUF A conc. PapilloCheck high-risk BUF B conc. 2x promývací pufr A PapilloCheck high-risk, koncentrát 1x promývací pufr B PapilloCheck high-risk, koncentrát 2 x 40 ml 1 x 15 ml Přípravná zkumavka k ředění UNG Voda upravená pro PCR 1 x 995 µl Přípravná zkumavka MasterMix (k použití pouze v kombinaci s automatizací) prázdná 1 Leták Návod k použití ke stažení 1 1 Jedna testovací souprava PapilloCheck nebo PapilloCheck high-risk je dostatečná pro analýzu 48 vzorků. 2 Obsahuje veškeré součásti nutné pro PCR kromě Taq DNA polymerázy a uracil-n-glykosylázy. 3 Jeden čip PapilloCheck obsahuje 12 mikročipů PapilloCheck. V tomto návodu k použití jsou slova čip(y) a kazeta(kazety) používána jako synonyma. 6

7 Síla 2. pro POŽADOVANÝ vaše zdraví MATERIÁL, VYBAVENÍ A HARDWARE PapilloCheck se doporučuje používat v kombinaci s uvedeným spotřebním materiálem, vybavením a hardwarem, a to pouze odbornými pracovníky. Spotřební materiál Greiner Bio-One, č. kat. Množství Testovací souprava PapilloCheck 1 souprava pro 48 reakcí Testovací souprava PapilloCheck high-risk souprava pro 48 reakcí Sběrná souprava PapilloCheck souprava pro 50 vzorků Souprava pro extrakci DNA / Samostatná kolona ocheck Příprava souprava pro 50 příprav Sterilní špičky s filtrem pro mikropipetu bez přítomnosti DNázy 4 0,5 µl 10 µl 0,5 µl 20 µl 10 µl 100 µl 10 µl 200 µl 100 µl µl 50ml polypropylenová zkumavka 5 1,5ml reakční zkumavka Plastové pipety k pipetoru Pipeta 10 ml Pipeta 25 ml Pipeta 50 ml nebo nebo nebo /960 96/960 96/960 96/960 60/600 25/ /4000 1/200 1/200 1/200 4 Některé z výše uvedených velikostí špiček jsou volitelné v závislosti na dostupných mikropipetách. 5 Nutná pouze tehdy, není-li centrifuga na kazety k dispozici. 7

8 Síla pro vaše zdraví Spotřební materiál Greiner Bio-One, č. kat. Množství CheckScanner CheckReport Software Basic CheckReport Software PapilloCheck plugin CheckReport Software PapilloCheck high-risk plugin PC včetně softwaru CheckReport Software a pluginu PapilloCheck nebo PapilloCheck high-risk plugin Startovací balíček CheckScanner (CheckScanner, PC, CheckReport Software, plugin PapilloCheck nebo PapilloCheck high-risk plugin) Hybridizační komora s držákem kazet ocheck Magnetická rukojeť pro držák kazet Promývací box ocheck Požadované enzymy Taq polymeráza: DNA polymeráza HotStarTaq 5 U/μl (Qiagen; , , , ) Uracil-N-glykosyláza: Uracil-DNA glykosyláza 1 U/µl (Thermo Scientific; #EN0361, #EN0362) Další požadovaný materiál Voda upravená pro PCR Čištěná voda Rukavice na jedno použití DNA Away (Thermo Scientific; #7008, #7009, #7010) Používejte pouze vhodné pásy a pásy PCR pro 8 zkumavek, jednotlivé zkumavky nebo destičky doporučené výrobcem určitého použitého cykléru. Kvůli optimalizaci pracovního postupu se doporučuje používat pásy pro 8 zkumavek. Další požadované vybavení Mikrocentrifuga pro 1,5ml a 2ml reakční zkumavky Centrifuga pro 50ml polypropylenové zkumavky Mikrocentrifuga pro jednotlivé 0,2ml reakční zkumavky nebo pásy PCR pro 8 zkumavek Termocyklér PCR: systém GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems); termocyklér Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems); peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH). Vodní lázeň (50 C) Mikropipety (odlišné rozsahy od μl) 8kanálová multipipeta (rozsah: 5 50 μl), např. Brand Transferpette -8 (Brand) Pipetor na skleněné a plastové pipety Vortexový mixér Stojany pro různé reakční zkumavky Časovač Nádoba na odpad Další požadovaný hardware Počítač (systémové požadavky naleznete v návodu k použití skeneru CheckScanner a softwaru CheckReport Software) 6 K promývání testu PapilloCheck jsou vyžadovány tři promývací boxy ocheck. 8

9 Síla 3. pro PŘEPRAVA vaše zdravía UCHOVÁVÁNÍ Přeprava testovací soupravy PapilloCheck probíhá při teplotě okolního prostředí. Souprava musí být ihned po převzetí skladována při teplotě 4 až a chráněna před světlem. Box na kazety s čipy PapilloCheck uchovávejte vždy v uzavřeném obalu na zip s vysoušedlem. Všechny součásti musí být uloženy v originálním balení, aby se zabránilo smíchání šarží. Správně skladovaná testovací souprava PapilloCheck a její součásti lze použít do vypršení uvedeného data exspirace. Za těchto podmínek se trvanlivost produktu neodvozuje od data exspirace po prvním otevření soupravy a jejích součástí. Skladování testovací soupravy PapilloCheck při 4 až může vést k tvorbě sraženin solí v hybridizačním pufru a v pufru B. Sraženiny musí být před použitím rozpuštěny pokojovou teplotou (18 až 25 C) a promícháním a provířením zkumavky/lahvičky. Produkt Testovací souprava PapilloCheck Testovací souprava PapilloCheck high-risk Skladování 4 až, chráněno před světlem 4 až, chráněno před světlem 9

10 Síla 4. pro BEZPEČNOSTNÍ vaše zdraví POKYNY Testovací souprava PapilloCheck je určena pouze pro laboratorní použití, nikoli pro testování léčiv, domácí použití nebo jiné účely. Čipy DNA musí být používány v bezprašném prostředí. Usazený prach a jiné částice na kazetách mohou mít za následek neuspokojivé nebo neplatné výsledky.! Vždy noste vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle a dodržujte bezpečnostní pokyny uvedené v této části. Regulační informace: Následující součásti testovací soupravy PapilloCheck obsahují škodlivý nebo nebezpečný obsah: Součást soupravy Množství Nebezpečný obsah Klasifikace podle nařízení (ES) č. 1272/2008 Piktogram GHS a signální slovo Výstražné a bezpečnostní pokyny Hybridizační pufr PapilloCheck, guanidin thiokyanát, %, CAS č akutní toxicita, perorální (kategorie 4), akutní toxicita, inhalační (kategorie 4), chronická toxicita pro vodní prostředí (kategorie 3), žíravost pro kůži (kategorie 1c) NEBEZPEČÍ H302 H332 H314 H412 P273 P280 P305+ P351+P338 Škodlivý při požití. Zdraví škodlivý při vdechování. Způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí. Škodlivý pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. Používejte ochranné rukavice / ochranný oděv / ochranné brýle / obličejový štít. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. EUH032 Doplňkové informace o nebezpečí (EU): Uvolňuje velmi toxický plyn při styku s kyselinami. Pufr B PapilloCheck, dodecylsíran sodný, < 20 %, CAS č podráždění kůže (kategorie 2), závažné poškození očí (kategorie 1) NEBEZPEČÍ H315 H318 P280 P305+ P351+P338 Způsobuje podráždění kůže. Způsobuje vážné poškození očí. Používejte ochranný oděv / ochranné brýle / obličejový štít. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. Aktuální verzi bezpečnostního listu pro tento produkt lze stáhnout na internetových stránkách společnosti Greiner Bio-One: Know-How & Services Download-Center 10

11 Síla 5. pro LIKVIDACE vaše zdravíodpadu Po promytí a osušení čipu PapilloCheck mohou být promývací roztoky I a II zlikvidovány bez použití jakýchkoli speciálních opatření. Zlikvidujte použitý čip PapilloCheck, nepoužité součásti soupravy, jakož i nepoužitou hybridizační směs s laboratorním chemickým odpadem. Dodržujte všechny národní, státní a místní předpisy pro likvidaci. 11

12 Síla 6. pro ÚVOD vaše zdraví 6.1 Další informace Přetrvávající infekce karcinogenním lidským papilomavirem (HPV) se vyskytuje prakticky ve všech případech rakoviny děložního čípku druhého nejčastějšího onemocnění žen na celém světě. 7 K dnešnímu dni bylo identifikováno více než 100 typů HPV, z nichž přibližně 40 typů je sexuálně přenosných a infikuje sliznici genitálií. Cervikální typy HPV jsou klasifikovány jako vysoce rizikové (vysoce rizikový HPV, hrhpv) a nízkorizikové (nízkorizikový HPV, lrhpv). Zatímco vysoce rizikové typy HPV jsou spojeny se zvýšeným rizikem vývoje rakoviny děložního čípku, nízkorizikové typy HPV jsou většinou důsledkem benigních genitálních bradavic. 8 V rámci skupiny vysoce rizikových typů však relativní riziko vzniku rakoviny nebo cervikální intraepiteliální lézí (CIN) také závisí na daném typu viru. 9 Přibližně 70 % všech případů rakoviny děložního čípku je spojeno s přetrvávající infekcí HPV 16 nebo 18. Nejvíce převládající typy s nízkým rizikem jsou HPV 6 a 11. Na základě téměř absolutního etiologického vztahu mezi karcinogenním HPV a rakovinou děložního čípku je nyní testování hrhpv považováno za primární screening rakoviny děložního čípku Typy HPV detekovatelné pomocí testu PapilloCheck Test PapilloCheck umožňuje identifikaci 18 vysoce rizikových a 6 nízkorizikových typů lidského papilomaviru (HPV) (Tabulka 1), zatímco test PapilloCheck high-risk umožňuje identifikaci 14 vysoce rizikových typů lidského papilomaviru (hrhpv) (Tabulka 2). Tabulka 1: Typy HPV detekovatelné pomocí testu PapilloCheck HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6 HPV 18 HPV 51 HPV 66 HPV 11 HPV 31 HPV 52 HPV 68 HPV 40 HPV 33 HPV 53 HPV 70 HPV 42 HPV 35 HPV 56 HPV 73 HPV 43 HPV 39 HPV 58 HPV 82 HPV 44 / HPV 55* * Test PapilloCheck neodhaluje rozdíl mezi HPV 44 a HPV 55. Tabulka 2: Typy hrhpv detekovatelné pomocí testu PapilloCheck high risk HPV 16 HPV 51 HPV 18 HPV 52 HPV 31 HPV 56 HPV 33 HPV 58 HPV 35 HPV 59 HPV 39 HPV 66 HPV 45 HPV 68 7 Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9., Sexually Transmitted Infections 76: Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16: Bosch F.X. et al. (2008.) Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specific implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K Meijer, C.J. et al. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. 124(3):

13 Síla 6.3 pro vaše Princip zdraví stanovení PapilloCheck je testovací souprava založená na mikročipech určená k detekci a genotypizaci fragmentu genu E1 z genomu lidského papilomaviru (HPV). Postup stanovení je přehledně znázorněn na Obrázek 1. Před provedením analýzy pomocí testu PapilloCheck musí být DNA extrahována ze vzorku cervikálního stěru. Odběr vzorku a extrakce DNA nejsou součástí testovací soupravy PapilloCheck. Speciální produkty pro odběr vzorků (sběrná souprava PapilloCheck ) a extrakci DNA (souprava pro extrakci DNA ocheck ) lze objednat od společnosti Greiner Bio-One a musí být zakoupeny samostatně (viz informace o objednávání v kapitole 2). Po extrakci virové a lidské genomové DNA z cervikálního vzorku se fragment 350 bp virového genu E1 amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za přítomnosti sady specifických primerů HPV. Tou samou reakcí se fragment lidského genu ADAT1 v jediné kopii (lidská trna-specifická adenosin deamináza1) amplifikuje za účelem sledování přítomnosti lidského biologického materiálu v cervikálním vzorku (kontrola vzorku) a templát pro interní kontrolu přítomný v rámci testu PapilloCheck PCR MasterMix se amplifikuje za účelem sledování výkonnosti PCR (kontrola PCR). Navíc test PapilloCheck PCR MasterMix obsahuje dutp. Tak může být potenciální přenosová kontaminace z předchozích reakcí PCR odstraněna pomocí uracil-n-glykosylázy (UNG) (viz kapitola 8.2.2). Produkty PCR se poté hybridizují ke specifickým sondám DNA a čipovým kontrolám připojeným k povrchu čipu PapilloCheck. Každý čip obsahuje 12 DNA mikročipů, které umožňují simultánní analýzu 12 cervikálních vzorků. Během hybridizace je navázaná DNA fluorescenčně značena a nenavázaná DNA je odstraněna během následujících kroků promývání. Účinnost hybridizace je sledována (kontrola hybridizace). Nakonec je čip PapilloCheck automaticky naskenován, analyzován a vyhodnocen pomocí skeneru CheckScanner a softwaru CheckReport Software (viz informace o objednávání v kapitole 2). Skener CheckScanner je dvoubarevný laserový snímač (vlnové délky excitace 532 nm a 635 nm), který umožňuje detekci fluorescenčního signálu generovaného přítomností specifických amplifikačních produktů HPV a kontrol (viz kapitola 6.4.2). Software CheckReport Software umožňuje vizualizaci, analýzu a vyhodnocení výsledků a automaticky zobrazuje odpovídající hodnoty obou detekovaných typů HPV a kontrol v detailní zprávě. Zpráva jasně značí přítomnost nebo nepřítomnost jednoho nebo více z 24 detekovatelných typů HPV nebo 14 detekovatelných typů hrhpv a komplexních kontrol na čipu, což činí analýzu vysoce spolehlivou. 13

14 Síla pro vaše zdraví 1. Reakce PCR 2. Hybridizace 3. Promývání a sušení nebo 4. Skenování a analýza Obrázek 1: Postup testu PapilloCheck 1. Reakce PCR: Po extrakci DNA se fragment 350 bp virového genu E1 a fragmenty dvou kontrolních cílů amplifikují pomocí PCR. Produkty amplifikace se poté hybridizují na komplementární sondy DNA na čipu. 2. Hybridizace: Každý typ HPV je detekován specifickou sondou DNA přítomnou v pěti opakováních. Během hybridizace se využívá fluorescenční značení. 3. Promývání a sušení: Nenavázaná DNA je odstraněna během následujících kroků promývání. 4. Skenování a analýza: Čip PapilloCheck je naskenován, analyzován a vyhodnocen pomocí skeneru CheckScanner nebo Frickenhausen více detekovatelných typů HPV. a softwaru CheckReport Software. Zpráva je vytvořena tak, aby jasně značila přítomnost nebo nepřítomnost jednoho 14

15 Síla 6.4 pro vaše Schéma zdraví čipu PapilloCheck Uspořádání čipu PapilloCheck Každý čip PapilloCheck nebo PapilloCheck high-risk obsahuje 12 mikročipů navržených jako jamka A1 B6. V každé jamce se nachází jednotlivé mikročipy obsahující různé sondy. Každý jednotlivý mikročip je ohraničen vyvýšeným okrajem. Každá sonda je zanesena v pěti opakováních. Uspořádání mikročipu je znázorněno na Obrázek 2. Tyto popsané kontroly na čipech jsou dále vysvětleny v kapitole kontrola orientace kontrola PCR a) červený kanál (635 nm) HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 b) kontrola hybridizace kontrola vzorku kontrola orientace kontrola PCR c) zelený kanál (532 nm) HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 kontrola hybridizace HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 kontrola vzorku Obrázek 2: Schéma čipu PapilloCheck a) Schematické znázornění čipu PapilloCheck. b) a c) Obrázky zobrazené softwarem CheckReport Software pro dvě různé vlnové délky excitace použité pro skenování (b) červený kanál: 635 nm; (c) zelený kanál: 532 nm a schematické znázornění uspořádání mikročipu PapilloCheck. Sondy specifické pro daný typ HPV a kontroly na čipu jsou uvedeny. 15

16 Síla pro vaše zdraví Kontroly na čipu Schéma čipu DNA PapilloCheck zahrnuje komplexní kontroly na čipu. Několik kontrolních systémů monitoruje všechny kritické kroky testování i zpracování čipu, včetně kvality vzorků a extrakce DNA (kontrola vzorků), kvality reakce PCR (kontrola PCR), účinnosti hybridizace (kontrola hybridizace), jakož i místní homogenity a kvality tisku (kontrola orientace a kontrola tisku). Navíc kromě přítomnosti nebo nepřítomnosti typů HPV software CheckReport Software automaticky zobrazuje odpovídající hodnoty kontrol a detekované typy HPV v detailní zprávě. Ke čtení různých kontrol se používají obě vlnové délky excitace skeneru CheckScanner. V případě kontroly výkonnosti testování (kontrola vzorku a kontrola PCR) se používá červený kanál (vlnová délka excitace 635 nm), zatímco kvalita hybridizace a čipu (kontrola hybridizace, orientace a tisku) je vyhodnocována v zeleném kanálu (vlnová délka excitace 532 nm). Kontrola vzorku PapilloCheck monitoruje kvalitu vzorku a/nebo extrakce DNA pomocí amplifikace fragmentu lidského genu ADAT1 v jediné kopii (lidská trna-specifická adenosin deamináza1). Je-li lidská DNA přítomna v dostatečném množství extrahované DNA z cervikálního vzorku, pak je na kontrolních místech vzorku generován fluorescenční signál. Pokud nedojde k žádné nebo nedostatečné amplifikaci genu ADAT1, software CheckReport Software označí kontrolu vzorku jako neúspěšnou. To má dva různé důsledky, a to v závislosti na signálu patogenních specifických míst. Pokud je vzorek pozitivní pro HPV, analýza zůstává platná. V tomto případě je neúspěšná kontrola vzorku přímým výsledkem kompetice mezi doprovodnou DNA a nadbytkem cílové DNA během PCR. Pokud je naopak vzorek negativní pro HPV, software CheckReport Software označí analýzu jako neúspěšnou z důvodu špatného odběru vzorků (nedostatečné množství buněk ve vzorku) a/nebo neefektivní extrakce DNA. V tomto případě se doporučuje opakovat analýzu počínaje extrakcí DNA nebo v případě potřeby odebrat nový vzorek (viz kapitola 9). Kontrola PCR PapilloCheck také monitoruje výkonnost PCR. Amplifikace templátu interní kontroly přítomného v PapilloCheck PCR MasterMix generuje signál na kontrolních místech PCR na čipu PapilloCheck. Výsledek amplifikační reakce je také automaticky vyhodnocen pomocí softwaru CheckReport Software. Je-li výkonnost PCR pod předem stanovenou prahovou hodnotou, software CheckReport Software označí kontrolu PCR jako neúspěšnou a analýzu je nutné opakovat (viz kapitola 9). Pokud je množství DNA HPV ve vzorku velmi vysoké, fluorescenční signál kontrolních míst PCR může být nízký nebo zcela nepřítomný z důvodu kompetice během reakce PCR. V tomto případě musí fluorescenční signál pro alespoň jednu specifickou sondu HPV překročit předem stanovenou prahovou hodnotu, aby byl test považován za validovaný. Kontrola hybridizace PapilloCheck monitoruje účinnost hybridizace pomocí fluorescenčně značené sondy v hybridizačním pufru PapilloCheck, který hybridizuje se specifickými sekvencemi DNA na čipu PapilloCheck. Vyhovující účinnost hybridizace má za následek fluorescenční signály na každém místě čipu. Výsledky z pěti kontrolních míst hybridizace na čipu PapilloCheck jsou také vyhodnocovány softwarem CheckReport Software. 16

17 Síla pro vaše zdraví Kontrola orientace a tisku Kontrolní místa orientace na čipu PapilloCheck generují fluorescenční signály bez ohledu na účinnost hybridizačního procesu. Tato místa jsou používány softwarem CheckReport Software jako vodítko pro nalezení správného místa, které je předpokladem pro správnou analýzu signálů. Kontrola tisku na čipu PapilloCheck monitoruje přítomnost a hybridizaci jednotlivých míst. Kvalita tisku je navíc monitorována přítomností zeleného fluorescenčního signálu na každém místě čipu (tisková kontrola). 17

18 Síla 7. pro POSTUP vaše zdraví PROVEDENÍ TESTU PAPILLOCHECK Následující popis pracovního postupu je stejný pro produkty PapilloCheck a PapilloCheck highrisk. Dle pracovního postupu pro test PapilloCheck postupujte pouze se součástmi testovací soupravy PapilloCheck. Dle pracovního postupu pro test PapilloCheck high-risk postupujte pouze se součástmi testovací soupravy PapilloCheck high-risk. 7.1 Všeobecné pokyny Při implementaci v současnosti nejmodernějších používaných technik molekulární biologie v laboratoři je nutné pro zajištění maximální bezpečnosti pro pracovníky laboratoře a vysoce kvalitní výsledky zohlednit následující pokyny. Provádění technik molekulární biologie, jako je například extrakce, amplifikace a detekce DNA amplifikačních produktů, vyžaduje dostatečně kvalifikovaný personál. Navíc je zapotřebí čistý a dobře strukturovaný pracovní postup, aby se zabránilo chybným výsledkům, které vznikají například degradací nebo kontaminací DNA amplifikačními produkty. K tomu je nutné oddělit oblasti extrakce, amplifikace a detekce způsobem, který je popsán v kapitole 7.2. Jednotlivé oblasti by měly být vybaveny vlastním vybavením, spotřebním materiálem, laboratorními plášti a rukavicemi. Nikdy nepřemisťujte laboratorní pláště, rukavice ani vybavení z jedné oblasti do jiné. 7.2 Oddělení místností Obrázek 3 ukazuje, jak lze laboratoř rozdělit do tří různých částí. Jedna je určena pouze pro extrakci DNA, další pro přípravu a průběh reakcí PCR a poslední je určena pro hybridizaci a analýzu. Každá místnost se používá výhradně pro aplikaci nebo techniku sloužící k prevenci kontaminace vzorku. Použití barevného kódování by mohlo být přínosem v zabránění náhodné výměně vybavení a spotřebního materiálu mezi jednotlivými oblastmi. Místnost 1 Místnost 2 Místnost 3 Obrázek 3: Oddělení místností pro manuální zpracování Místnost 1: Celý postup extrakce DNA musí být proveden v této místnosti. Místnost 2: V této místnosti se připraví reakční směs pro PCR a alikvotuje se (optimálně v rámci pracovní stanice PCR). Přidání vzorků DNA extrahovaných v místnosti 1 musí být provedeno v odděleném prostoru, v místnosti 2. Místnost 3: V třetí laboratorní místnosti se provádí kroky hybridizační reakce, promývání a sušení čipu. Pro výslednou analýzu testu PapilloCheck se navíc využívá Skener CheckScanner ve spojení se softwarem CheckReport Software.! Zařízení ani spotřební materiál by se neměly vyměňovat mezi různými laboratorními místnostmi a prostory. Zdvojení vybavení a spotřebního materiálu je proto nutností a mělo by být vzato v úvahu při vybavování laboratoře. 18

19 Síla 7.3 pro vaše Varování zdraví a bezpečnostní opatření Prevence kontaminace Laboratorní pláště je nutné nosit po celou dobu postupu a v každé laboratorní místnosti je vyžadována jiná sada laboratorních plášťů. Laboratorní čistota: Pracovní místo musí být dekontaminováno před prací a po ní pomocí dekontaminantu DNA-AWAY (Thermo Scientific) nebo jakéhokoli jiného čisticího roztoku. Rukavice je nutné nosit během každého kroku analýzy a musí být pravidelně vyměňovány, zejména během extrakce DNA. Zkumavky na vzorky: Nikdy se nedotýkejte vnitřní strany víčka zkumavky. Abyste zabránili vzájemné kontaminaci, vždy ve stejném čase otevírejte pouze jednu zkumavku. Pipetování: Musí být použity vhodné špičky s filtrem a aerosolovou bariérou pro mikropipetu (sterilní, bez přítomnosti DNázy, RNázy a lidské DNA). Špičky pro pipety by měly být vždy vyměněny mezi jednotlivými přenosy tekutin Pokyny pro manipulaci s čipy Čipy DNA je nutné používat v bezprašném prostředí. Je třeba zabránit usazování prachu a jiných částic na povrchu čipu. Nedotýkejte se hybridizační zóny na povrchu čipu. Pro hybridizaci je určena pouze označená strana čipu. K identifikaci čipů DNA nepoužívejte žádná popisovací pera; mohlo by to vést k nespecifické fluorescenci na čipu. Čipy DNA jsou určené pouze k jednomu použití. Čipy, u kterých proběhla hybridizace, nelze použít opakovaně. Nepoužité čipy uchovávejte vždy v originálním boxu uvnitř dodaného obalu na zip s vysoušedlem Obecná předběžná opatření Po doručení zkontrolujte, zda nejsou součásti soupravy poškozené. Pokud je některá ze součástí poškozená (např. lahve s pufrem), obraťte se na místního distributora společnosti Greiner Bio-One. Poškozené součásti soupravy nepoužívejte. Jejich použití může vést k nesprávné činnosti soupravy. Nepoužívejte soupravu po uplynutí doby exspirace. Nesměšujte reagencie z různých šarží. Nepoužívejte reagencie po uplynutí data exspirace. Používejte pouze reagencie/vybavení dodané se soupravou a doporučené výrobcem. Pro veškeré vybavení, např. cykléry PCR nebo pipety, je nutná pravidelná kalibrace/údržba. Pipetování malého množství kapaliny v mikrolitrovém rozsahu může být náročné. Proto dbejte na to, aby bylo pipetování co nejpřesnější. Abyste zabránili mikrobiální kontaminaci, buďte opatrní při odstraňování alikvot z reakčních zkumavek. Nespotřebované reagencie a odpadní materiál musí být zlikvidovány v souladu s federálními a národními předpisy. 19

20 7.3.4 Bezpečný způsob práce Vždy používejte vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle! Tyto soupravy jsou určeny pouze pro diagnostické použití in vitro a měly by být používány výhradně osobami vyškolenými v laboratorní diagnostické praxi in vitro. Při manipulaci s lidskými vzorky s potenciálně lidským infekčním materiálem buďte opatrní. Za účelem minimalizace rizika infekce z potenciálně infekčního materiálu se doporučuje pracovat za laminárního proudění vzduchu až do té doby, kdy je dokončena lýza vzorku. Se všemi biologickými vzorky nakládejte a provádějte jejich likvidaci, jako kdyby byly schopné přenášet infekční agens. Vyhněte se přímému kontaktu s biologickými vzorky, jakož i jejich rozstříknutí nebo rozprášení. Při práci s lidskými vzorky používejte vždy laboratorní plášť, rukavice a ochranné brýle. Nikdy nepipetujte roztoky pomocí úst. V pracovních prostorech nekonzumujte žádné potraviny, nápoje, nekuřte ani nepoužívejte kosmetické prostředky. Po manipulaci se vzorky a reagenciemi si důkladně umyjte ruce. Aktuální verzi materiálového bezpečnostního listu pro tento produkt lze stáhnout na internetových stránkách společnosti Greiner Bio-One: Know-How & Services Download-Center 20

21 8. POSTUP PAPILLOCHECK Následující kapitola podrobně popisuje různé kroky pracovního postupu, které ve výsledku vedou k vytvoření detailní zprávy značící přítomnost nebo nepřítomnost jednoho nebo více typů HPV detekovatelných v každém analyzovaném cervikálním vzorku. Obrázek 4 znázorňuje přehled nezbytných kroků pracovního postupu. Označuje také příslušnou podkapitolu, která popisuje specifický krok testování. Kroky pracovního postupu musí být provedeny v pořadí uvedeném v této kapitole. Každý krok je označen modrou šipkou.! Odběr vzorku, extrakce DNA a analýza pomocí softwaru CheckReport Software nejsou součástí testovací soupravy PapilloCheck. Popis těchto pracovních kroků je proto v rámci této kapitoly pouze stručný. Podrobnější informace naleznete v odpovídajícím návodu k použití, např. pro sběrnou soupravu PapilloCheck, souprava pro extrakci DNA ocheck a pro software CheckReport Software. 8.1 Odběr vzorku a extrakce DNA Odběr vzorku Odběr vzorku není součástí testovací soupravy PapilloCheck. K dispozici je také odpovídající sběrná souprava cervikálních vzorků (sběrná souprava PapilloCheck ) od společnosti Greiner Bio-One (viz informace o objednávání v kapitole 2). Souprava PapilloCheck byla validována za použití DNA připravené pomocí soupravy pro extrakci DNA ocheck z lidských cervikálních stěrů odebraných jedním z následujících sběrných systémů nebo médií: sběrná souprava PapilloCheck (Greiner Bio-One, Frickenhausen, ); PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA); Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, USA); STM (Qiagen, Hilden, ); Easyfix (VWR, Radnor, PA, USA); Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, Francie). Chcete-li více informací o vhodných transportních médiích či systémech pro extrakci DNA, obraťte se na místního distributora společnosti Greiner Bio-One nebo se podívejte na internetové stránky společnosti Greiner Bio-One: Know-How & Services Download-Center 21

22 Kapitola Extrakce DNA Souprava pro extrakci DNA ocheck Kapitola 8.2 PCR Kapitola Hybridizace Kapitola Promývání a sušení nebo Kapitola 8.4 Skenování a vyhodnocení Obrázek 4: Přehled různých kroků pracovního postupu se soupravou PapilloCheck 22

23 8.1.2 Extrakce DNA Extrakce DNA není součástí testovací soupravy PapilloCheck. Extrakce DNA musí být provedena před analýzou pomocí soupravy PapilloCheck za použití soupravy pro extrakci DNA ocheck, která je také poskytnuta společností Greiner Bio-One (viz kapitola 2). Při použití soupravy pro extrakci DNA ocheck postupujte opatrně dle návodu k použití. Pro extrakci DNA pomocí soupravy pro extrakci DNA ocheck je nutné použít 250 µl roztoku vzorku. Vzorky lidského cervikálního stěru, které se shromažďují: pomocí sběrné soupravy PapilloCheck (Greiner Bio-One, Frickenhausen, ); ve sběrném médiu PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA); v médiu Easyfix (VWR, Radnor, PA, USA) nebo Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, Francie) lze zpracovat přímo. Cervikální vzorky, které se shromažďují ve: sběrném médiu Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, USA), musí být před použitím promyty: centrifugujte 250 μl vzorku po dobu 5 minut při zrychlení g a resuspendujte pelet v 250 μl destilované vody. Následně lze 250 μl zpracovat pomocí soupravy pro extrakci DNA ocheck. Cervikální vzorky, které se shromažďují ve: sběrném médiu STM (Qiagen, Hilden, ), musí být naředěny: použijte 100 μl vzorku a přidejte 150 μl destilované vody. 250 μl naředěného vzorku lze zpracovat pomocí soupravy pro extrakci DNA ocheck. Obecně platí, že pokud se jeví vzorek cervikálního stěru příliš koncentrovaný a je již agregovaný, musí se vzorek před zahájením extrakce DNA zředit a zhomogenizovat! Vzorky cervikálního stěru, které jsou příliš naředěné a neobsahují viditelné buňky, je nutné zkoncentrovat, aby bylo dosaženo většího výtěžku buněk pro extrakci DNA: centrifugujte až µl vzorku po dobu 5 minut při zrychlení g a resuspendujte pelet v 250 µl destilované vody. Následně lze 250 μl zpracovat pomocí soupravy pro extrakci DNA ocheck.! Tento krok zvyšující koncentraci je vhodný pouze pro vzorky cervikálního stěru, které byly odebrány pomocí sběrné soupravy PapilloCheck, do sběrných médií PreservCyt, Easyfix a Cyt-All nebo do sběrného média Surepath. Pokud bylo použito sběrné médium STM, zvýšení koncentrace pomocí centrifugace není možné. 8.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR je velice citlivá metoda, která dokáže detekovat extrémně malé množství DNA. Je třeba dodržovat zvláštní opatření, aby se zabránilo kontaminaci reakcí (viz kapitola 7). Nutné je použití polymerázy HotStarTaq a uracil-n-glykosylázy, které však nejsou poskytovány spolu s testovací soupravou PapilloCheck a musí být zakoupeny samostatně (viz kapitola 2).! Testovací souprava PapilloCheck byla validována pomocí polymerázy HotStarTaq od společnosti Qiagen a uracil-n-glykosylázy od společnosti Thermo Scientific (viz kapitola 2). Chcete-li dosáhnout požadované výkonnosti, je nutné tyto enzymy používat. 23

24 8.2.1 Nastavení termocykléru Testovací souprava PapilloCheck byla validována pomocí následujících termocyklérů: systém GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems); termocyklér Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems); peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH).! Chcete-li dosáhnout požadované výkonnost, je nezbytně nutné používat některý z výše uvedených termocyklérů. Program termocykléru soupravy PapilloCheck PCR je přehledně uveden v Tabulka 3. Tabulka 3: Program termocykléru soupravy PapilloCheck PCR Čas Teplota C Počet cyklů 20 min 37 C 1 15 min 95 C 1 30 s 25 s 45 s 30 s 45 s 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C Čekejte 10 C Pro každý termocyklér musí být navíc nastaveny následující provozní parametry. Popis nastavení těchto parametrů naleznete v návodu k použití k danému termocykléru. Systém GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) Nastavte reakční objem na 26 µl, rychlost ohřevu na 9600 a teplotu víka na 103 C. Termocyklér Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) Chcete-li vstoupit do programu PapilloCheck PCR, použijte metodu Convert termocykléru Veriti 96-Well Thermal Cycler a zvolte režim emulace 9600 Emulation Mode (9600 emulační režim). Nastavte reakční objem na 26 µl a teplotu víka na 103 C. peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH) Použijte přednastavený program PapilloCheck PCR označený jako PapilloCheck.js, který je poskytován spolu s termocyklérem. Tento program lze obvykle otevřít následující odkazem: local/scripts/greinerbioone/papillocheck.js Náprava pomocí uracil-n-glykosylázy (UNG) PapilloCheck PCR MasterMix obsahuje dutp, který je začleněn do amplifikačních produktů během testu PapilloCheck PCR, což činí produkty PCR citlivé na degradaci pomocí UNG. UNG štěpí produkt PCR v místech, kde byly začleněny zbytky deoxyuridylátu. Štěpné produkty PCR nebudou v následné reakci amplifikovány. Náprava pomocí UNG může být tedy použita k odstranění přenosové kontaminace z předchozích reakcí PCR Objednávka soupravy PapilloCheck podléhá omezené licenci na základě patentů v USA pod čísly ; ; ; ; a a odpovídajících cizích patentů. 24

25 Nařeďte uracil-n-glykosylázu v poměru 1 : 200 s vodou upravenou pro PCR. Abyste dosáhli tohoto ředění uracil-n-glykosylázy, můžete použít vodu upravenou pro PCR z přípravné zkumavky k ředění UNG, která je součástí testovací soupravy PapilloCheck. Pro každou reakci PapilloCheck PCR použijte čerstvě naředěnou UNG (viz kapitola 8.2.3). Naředěnou UNG nepoužívejte opakovaně. Naředěnou UNG opatrně buď promíchejte po dobu 2 sekund a poté ji převraťte směrem dolů, nebo ji několikrát převraťte nahoru a dolů při pipetování. Původní koncentrace uracil-n-glykosylázy je 1 U/µl. Koncentrace naředěného roztoku je poté 0,005 U/µl.! Testovací souprava PapilloCheck byla validována pomocí uracil-n-glykosylázy od společnosti Thermo Scientific (viz kapitola 2). Abyste dosáhli požadované výkonnosti, je nutné tento enzym používat. Přidejte 1 µl tohoto naředěného roztoku ke každé reakci PapilloCheck PCR (viz kapitola 8.2.3, Tabulka 4). Toto množství je dostatečné k odstranění přenosové kontaminace PCR. Dejte pozor, abyste nepoužili koncentrovanější roztok UNG. Mohlo by to mít vedlejší účinek na výkonnost PCR, což by mohlo vést ke snížené citlivosti testu PapilloCheck. Obecně platí, že při nápravě pomocí UNG se reakční směs pro PCR inkubuje po dobu 20 minut při teplotě 37 C. Následně je UNG inaktivována pomocí dalšího inkubačního kroku, který trvá 15 minut a probíhá při teplotě 95 C. Tyto dva kroky jsou již začleněny do PapilloCheck PCR a odpovídají prvním dvěma krokům programu termocykléru (viz Tabulka 3). Během druhého kroku (po dobu 15 minut při teplotě 95 C) dochází k inaktivaci uracil-n-glykosylázy a zároveň k aktivaci polymerázy HotStarTaq.! Začleněný systém UNG testu PapilloCheck PCR pouze odstraní přenosovou kontaminaci a produkty PCR z předchozích reakcí PCR. Jiné druhy kontaminace, například během přípravy vzorku, extrakce DNA nebo při přidání templátu PCR, nelze odstranit. Proto je po celou dobu nutné dodržovat pokyny a zvláštní opatření, aby bylo zabráněno kontaminaci popsané v kapitole Průběh reakce PCR S výjimkou polymerázy HotStarTaq a uracil-n-glykosylázy již PapilloCheck PCR MasterMix obsahuje všechny složky potřebné pro reakci PCR (pufr PCR, MgCl 2, dntp, primery, kontrolní templát PCR). Obecně lze nastavení reakce PapilloCheck PCR rozdělit na dvě části: příprava výsledného mastermixu přidáním enzymů do PapilloCheck PCR MasterMix a příprava konečné reakce PCR přidáním extrahované DNA jako templátu.! Testovací souprava PapilloCheck byla validována pomocí polymerázy HotStarTaq od společnosti Qiagen (viz kapitola 2). Abyste dosáhli požadované výkonnosti, je nutné tento enzym používat. Optimální prostředí pro přípravu výsledného mastermixu je v chráněném prostředí, např. v pracovní stanici PCR, aby se zabránilo kontaminaci reakcí. 25

26 Připravte výsledný mastermix (sestávající z PapilloCheck PCR MasterMix, polymerázy HotStarTaq a uracil-n-glykosylázy) v množství požadovaném pro reakce PCR, jak je uvedeno v Tabulka 4. Pro analýzu více vzorků by měl být výsledný mastermix připraven v jedné dávce (v množství požadovaném pro všechny analýzy). Úpravou objemu během pipetování se doporučuje zvýšit počet reakcí (n) o 1 pro každý čip (= n+1), např. má-li být testováno 12 vzorků, připravte objem výsledného mastermixu tak, aby odpovídal 13 amplifikačním reakcím (viz Tabulka 4).! Doporučuje se zahrnout negativní kontrolu pro každou šarži připraveného výsledného mastermixu. Jako negativní kontrolu lze použít eluční pufr DNA z příslušné soupravy pro extrakci DNA nebo vodu upravenou pro PCR. Výsledný mastermix důkladně buď promíchejte po dobu 2 sekund a poté jej převraťte směrem dolů, nebo jej několikrát převraťte nahoru a dolů při pipetování. Výsledný mastermix rozdělte do alikvot, a to napipetováním 21 μl do 0,2ml tenkostěnné reakční PCR zkumavky pro každou reakci PCR. Přidání templátu DNA proveďte v jiném samostatném pracovním prostoru, než probíhá příprava výsledného mastermixu (viz kapitola 7.2). Reakční směs připravíte přidáním 5 µl extraktu DNA do každého výsledného mastermixu buď mícháním po dobu 2 sekund a poté převrácením směrem dolů, nebo několika převráceními nahoru a dolů při pipetování. Celkový objem jedné reakce PCR je 26 μl. Reakční zkumavky umístěte do termocykléru a spusťte reakci PCR pomocí programu termocykléru popsaného v kapitole (Tabulka 2 3).! Po dokončení reakce PCR by měly být amplifikační produkty ihned použity pro hybridizaci nebo uchovány v temnu při teplotě 20 C po dobu až jednoho týdne. Tabulka 4: Průběh reakce PapilloCheck PCR 1 reakce 13 reakcí (1 čip) 26 reakcí (2 čipy) 39 reakcí (3 čipy) 52 reakcí (4 čipy) PapilloCheck PCR MasterMix DNA polymeráza HotStar- Taq (5 U/µl) Uracil-N-glykosyláza (ředění v poměru 1 : 200, 0,005 U/µl) Celkový objem před přidáním vzorku DNA (výsledný mastermix) Extrakt DNA z cervikálního vzorku (templát DNA) Celkový objem před reakcí (konečná reakce PCR) 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1 029,6 µl 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl 1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl µl 5 µl 26 µl 26

27 8.3 Hybridizace a promývání Příprava a průběh S nezbytnými přípravami pro kroky hybridizace a promývání začněte alespoň 30 minut před zahájením hybridizačního procesu, aby bylo zajištěno, že všechny potřebné složky budou mít pokojovou teplotu. Případné sraženiny v hybridizačních a promývacích pufrech rozpustíte tak, že je ponecháte po dobu 30 minut při pokojové teplotě a před použitím je dobře promícháte. Uchovávání testovací soupravy PapilloCheck při teplotě 4 až může mít za následek vysrážení SDS v hybridizačním pufru a v pufru B. Roztoky ponechejte tak, aby měly pokojovou teplotu, a potom zkumavku promíchejte nebo protřepejte lahvičku, dokud se vzniklá sraženina nerozpustí. Připravte hybridizační komoru ocheck : Vložte navlhčený papírový ubrousek do hybridizační komory a uzavřete víko, abyste vytvořili prostředí s vysokou vlhkostí. Aby se zabránilo odpaření malého objemu hybridizační směsi použité na čipu, je nezbytné provést hybridizaci v prostředí s vysokou vlhkostí. K dispozici je také odpovídající hybridizační komora pro analýzu PapilloCheck od společnosti Greiner Bio-One (viz kapitola 2). Inkubujte potřebné množství čipů PapilloCheck v připravené hybridizační komoře při pokojové teplotě po dobu nejméně 10 minut.! Magnetická rukojeť pro držák kazet z hybridizační komory obsahuje magnet pouze na jedné ze dvou koncových částí. Jsou-li paralelně hybridizovány méně než čtyři čipy PapilloCheck, dbejte na to, aby byla rukojeť pro držák kazet naplněna čipy PapilloCheck ze strany bez přítomnosti magnetu. V opačném případě by čipy PapilloCheck nebyly během procesu promývání překryty tekutinou. Připravte promývací roztoky I, II a III podle následujících pokynů. Příprava promývacích roztoků I, II a III: Připravte promývací směs z promývacích roztoků I, II a III vhodnou pro počet čipů PapilloCheck, který bude analyzován, jak je ukázáno v Tabulka 5. Směs promývacího roztoku rozdělte do alikvot na tři stejné objemy do tří oddělených promývacích boxů ocheck a označte je jako promývací roztok I, II a III. Každý promývací box ocheck obsahuje vyrytou stupnici, která značí přesné množství promývacího roztoku potřebného až pro 4 čipy. Zkontrolujte množství pufru pomocí této stupnici. Promývací roztok II před použitím předem zahřejte ve vodní lázni na teplotu 50 C a kontrolujte teplotu po dobu alespoň 20 minut. Ujistěte se, že hladina vodní lázně odpovídá úrovni hladiny promývacího roztoku II. Tabulka 5: Příprava směsi promývacího roztoku Počet čipů PapilloCheck Složky Čištěná voda 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml Pufr A PapilloCheck 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml Pufr B PapilloCheck 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml Celkový objem 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml 27

28 ! Promývací roztoky nikdy nepoužívejte opakovaně. Mohlo by to vést k akumulaci omytých produktů PCR, které by mohly interferovat s výsledky v rámci soupravy PapilloCheck. Pro každé stanovení použijte nové promývací roztoky. Připravenou směs promývacího roztoku lze uchovávat po dobu až jednoho týdne při pokojové teplotě. Zkontrolujte, zda nedošlo k vysrážení SDS. Pokud ano, směs promývacího roztoku zahřívejte, dokud se sraženina nerozpustí, a nechte teplotu klesnout na pokojovou teplotu. Poté se připravte na další hybridizační zkoušku Hybridizace Hybridizace musí být provedena při teplotě okolního prostředí mezi 20 a 25 C. Princip pracovního postupu hybridizace produktů PCR reakce PapilloCheck PCR na čipu PapilloCheck jsou uvedeny na Obrázek 5. Před použitím promíchejte produkty PCR. Rychlým pohybem je přetočte směrem dolů.! Pokud byly produkty PCR skladovány při teplotě 20 C až do provedení hybridizace, před promícháním nechejte produkty PCR nejdříve rozmrazit a poté je zpracujte tak, jak je popsáno. Před použitím promíchejte hybridizační pufr. Rychlým pohybem je přetočte směrem dolů. Přeneste 30 μl hybridizačního pufru PapilloCheck do nové reakční zkumavky s 8 pásy PCR. Je-li to vhodnější, lze použít novou jamku na destičce PCR. Přidejte 5 μl produktu PCR k hybridizačnímu pufru a promíchejte buď provířením, nebo několika převráceními nahoru a dolů při pipetování. Rychlým pohybem je přetočte směrem dolů. Přeneste 25 μl hybridizační směsi do každé jamky čipu pomocí šesti kanálů vícekanálové pipety. Zabraňte tvorbě vzduchových bublin! Doporučuje se paralelně zpracovat šest vzorků pomocí 8kanálové multipipety a 8 pásů PCR (viz Obrázek 5). To zvyšuje účinnost a rychlost manipulace, čímž se snižuje riziko odpařování. Pokud je současně zpracována více než jedna kazeta, je použití multipipety povinné, aby bylo dosaženo správné doby hybridizace.! Zabraňte tvorbě bublin! Je-li to možné, proveďte hybridizaci všech 12 jamek čipu. V případě zpracování méně než 12 vzorků, ponechejte nepoužité jamky prázdné. Nepoužité jamky na zpracovaném čipu nemohou být pro vzorky v budoucnu použity.! S čipem zacházejte opatrně, abyste zabránili rozlití hybridizační směsi. Rozlití může vést ke křížové kontaminaci vzorků a falešně pozitivním výsledkům. Inkubujte čip přesně po dobu 15 minut při teplotě okolního prostředí mezi 20 a 25 C v připravené hybridizační komoře v temném prostředí s vysokou vlhkostí. Během hybridizace dejte pozor, abyste hybridizační komorou nepohybovali.! Nikdy nezaměňujte inkubační dobu nebo teplotu hybridizační reakce. Mohlo by to způsobit ztrátu intenzity fluorescenčního signálu nebo zvýšení nespecifické fluorescence. Nevystavujte hybridizované čipy přímému slunečnímu záření. 28

29 Připravte prostředí s vysokou vlhkostí v hybridizační komoře. Inkubujte potřebné množství čipů PapilloCheck v hybridizační komoře při pokojové teplotě (viz kapitola 8.3.1). Promíchejte 30 μl hybridizačního pufru PapilloCheck do 0,2ml reakční zkumavky s pásem PCR obsahujícím 5 μl produktu PCR. Důkladně promíchejte. Přeneste 25 μl hybridizační směsi do každé jamky čipu PapilloCheck pomocí vícekanálové pipety. Uzavřete hybridizační komoru a inkubujte čip PapilloCheck přesně po dobu 15 minut při teplotě okolního prostředí mezi 20 a 25 C. Obrázek 5: Pracovního postup hybridizačního procesu 29

30 8.3.3 Promývání a sušení Speciální vybavení dodané společností Greiner Bio-One umožňuje paralelní promývání až čtyř čipů PapilloCheck (viz kapitola 2). Dodatečné vybavení potřebné pro zpracování čipů PapilloCheck sestává ze tří promývacích boxů ocheck a magnetické rukojeti pro držák kazet hybridizační komory. Různé kroky pracovního postupu jsou znázorněny na Obrázek 6. Opatrně vyjměte magnetickou rukojeť pro držák kazet obsahující hybridizační kazety z hybridizační komory. Nasaďte držák kazet obsahující kazety přímo do promývacího boxu ocheck obsahujícího promývací roztok I. Ujistěte se, že magnetická strana směřuje nahoru. Připojte rukojeť ocheck k držáku kazet a zahajte první ze tří kroků promývání. Promývejte čip při pokojové teplotě v promývacím roztoku I pomocí rychlého pohybu nahoru a dolů po dobu 10 sekund. Čipy musí zůstat po celou dobu překryté promývacím roztokem. Promývejte čip po dobu 60 sekund v promývacím roztoku II při teplotě 50 C pomocí rázného pohybu rukojetí nahoru a dolů. Promývejte čip při pokojové teplotě v promývacím roztoku III pomocí rychlého pohybu nahoru a dolů po dobu 10 sekund. Okamžitě odstraňte veškerou kapalinu z povrchu čipu pomocí centrifugace. Je-li použita speciální mikrocentrifuga pro mikročipy, centrifugujte po dobu 1 minuty. Je-li použita centrifuga vhodná pro 50ml zkumavky, umístěte každý promytý čip PapilloCheck do 50ml zkumavky a centrifugujte při pokojové teplotě po dobu 3 minut při zrychlení 500 g. Čip PapilloCheck je nyní připraven ke skenování. Toto skenování čipu by mělo být provedeno ihned. Při čištění promývacích boxů ocheck boxy několikrát propláchněte vodou po ukončení každého procesu promývání a sušení. 30

31 První krok promývání Opatrně vyjměte magnetickou rukojeť pro držák kazet z hybridizační komory. Rychle nasaďte držák kazet do promývacího boxu ocheck s promývacím roztokem I. Připojte rukojeť ocheck. Promývejte čip(y) PapilloCheck v promývacím roztoku I při pokojové teplotě pomocí pohybu rukojetí nahoru a dolů po dobu 10 sekund. Druhý krok promývání Promývejte čip(y) PapilloCheck v promývacím roztoku II ve vodní lázni s teplotou 50 C pomocí pohybu rukojetí nahoru a dolů po dobu 60 sekund. Třetí krok promývání Promývejte čip(y) PapilloCheck v promývacím roztoku III při pokojové teplotě pomocí pohybu rukojetí nahoru a dolů po dobu 10 sekund. Sušení Ihned odstraňte veškerou kapalinu z povrchu čipu PapilloCheck pomocí centrifugace. nebo 3 minuty 500 g 1 minuta max. rychlost Obrázek 6: Pracovní postup promývání Různé kroky procesu promývání a sušení před analýzou čipu PapilloCheck pomocí skeneru CheckScanner a softwaru CheckReport Software. 31

32 8.4 Skenování a vyhodnocení čipu PapilloCheck Umístěte čip(y) PapilloCheck do skeneru CheckScanner a pokračujte ve skenování, jak je podrobně popsáno v uživatelské příručce softwaru CheckReport Software. Podrobnější informace o instalaci skeneru CheckScanner a softwaru CheckReport Software, jakož i o požadavcích na počítačový systém naleznete v odpovídajícím návodu k použití skeneru CheckScanner a softwaru CheckReport Software. Kdykoli při analýze dat pomocí softwaru CheckReport Software se ujistěte, že je na vašem počítači nainstalována verze softwaru CheckReport Software, která odpovídá verzi pro zrovna používanou soupravu PapilloCheck. Pokud tyto verze neodpovídají, aktualizujte software CheckReport Software. Poslední verzi softwaru lze stáhnout na internetových stránkách společnosti Greiner Bio-One: Know-How & Services Download-Center 32

33 9. ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ Pokud se během skenování čipu nebo při neúspěšné analýze PapilloCheck po specifických kontrolách na čipu objeví jedna z následujících chybových zpráv, postupujte dle pokynů uvedených níže. Máte-li jakékoli dotazy nebo potíže ohledně používání soupravy PapilloCheck, neváhejte se obrátit na místního distributora společnosti Greiner Bio-One. Při řešení problémů týkajících se jiných kroků testování, např. extrakce DNA, najdete další informace v příslušném návodu k použití. PROBLÉM a příčina Připomínky a návrhy CHYBOVÁ ZPRÁVA COULD NOT READ BARCODE (NELZE PŘEČÍST ČÁROVÝ KÓD) Poničený čárový kód Čip nebyl správně vložen Zkontrolujte, zda není čárový kód poškozený. Pokud se zobrazí příslušné okno, zadejte čárový kód ručně. Zkontrolujte orientaci čipu a naskenujte čip ve správné orientaci. CHYBOVÁ ZPRÁVA MISSING SPOTS (CHYBĚJÍCÍ MÍSTA), KONTROLA TISKU BYLA NEÚSPĚŠNÁ NEBO KONTRO- LA ORIENTACE BYLA NEÚSPĚŠNÁ Prach na čipu Vzduchové bubliny při přenosu tekutiny na čip Opakujte hybridizaci produktů PCR na jiném čipu. Opakujte hybridizaci produktů PCR na jiném čipu. Pipetujte opatrně tak, abyste zabránili tvorbě vzduchových bublin. KONTROLA HYBRIDIZACE BYLA NEÚSPĚŠNÁ Nesprávná teplota promývacího roztoku II Nesprávná teplota vodní lázně Nesprávná příprava hybridizační směsi Druhý krok promývání musí být proveden při teplotě 50 C. Ujistěte se, že je promývací roztok II zahřátý na teplotu 50 C. Druhý krok promývání musí být proveden při teplotě 50 C. Zkontrolujte teplotu vodní lázně. Ujistěte se, že je teplota vodní lázně nastavena na 50 C. Je-li to nutné, ověřte teplotu pomocí teploměru. Opakujte přípravu hybridizační směsi se správnými objemy a proveďte hybridizaci produktů PCR na jiném čipu. 33

34 Síla pro PROBLÉM vaše a příčina zdraví Připomínky a návrhy KONTROLA PCR BYLA NEÚSPĚŠNÁ Nebyla přidána DNA polymeráza HotStarTaq do PapilloCheck PCR MasterMix Opakujte analýzu PapilloCheck od přípravy reakce PCR. Byla přidána nesprávně fungující DNA polymeráza HotStarTaq do PapilloCheck PCR MasterMix Opakujte analýzu PapilloCheck od přípravy reakce PCR. Byla přidána nenaředěná uracil- N-glykosyláza do PapilloCheck PCR MasterMix Nedostatečné promíchání výsledného mastermixu Inhibitory PCR jsou přítomny ve vzorku Hybridizace byla provedena bez přidání produktu PCR Nedostatečné promíchání výsledné hybridizační směsi Problémy s termocyklérem Opakujte analýzu PapilloCheck od přípravy reakce PCR. Opakujte analýzu PapilloCheck od spuštění reakce PCR. Pečlivě promíchejte reakční směs. Opakujte extrakci DNA a analýzu PapilloCheck. Opakujte hybridizaci. Opakujte hybridizaci. Používejte pouze prověřené termocykléry v kombinaci se soupravou PapilloCheck. KONTROLA VZORKU BYLA NEÚSPĚŠNÁ K výslednému mastermixu nebyl přidán vzorek DNA Příprava DNA byla neúspěšná Nedostatek materiálu vzorku Opakujte analýzu PapilloCheck od spuštění reakce PCR. Opakujte extrakci DNA. Odběr vzorků nebyl úspěšný. Vzorek je velmi čirý. Koncentrujte vzorek dle popisu v kapitole 8.1 a opakujte extrakci DNA nebo opakujte odběr vzorku. KONTROLA PCR A/NEBO VZORKU BYLA ÚSPĚŠNÁ, AVŠAK UDÁVÁ HODNOTU SNR ROVNU 0 Tento výsledek je považován za platný, pokud software CheckReport Software detekuje alespoň jeden typ HPV ve vzorku se signálem nad předem stanovenou prahovou hodnotou. Kontrola PCR a/nebo vzorku může pak vykazovat nízké, nebo dokonce chybějící fluorescenční signály v důsledku kompetice v průběhu PCR. 10. TECHNICKÁ PODPORA Máte-li jakékoli dotazy, potíže či problémy týkající se produktů společnosti Greiner Bio-One, neváhejte se obrátit na místního distributora společnosti Greiner Bio-One nebo oddělení technické podpory na stránkách support.dx@gbo.com, kde pracují zkušení odborníci s rozsáhlými praktickými a teoretickými zkušenostmi v oblasti molekulární biologie. 34

35 Síla 11. pro FUNKČNÍ vaše zdraví VLASTNOSTI SOUPRAVY PAPILLOCHECK 11.1 Analytická výkonnost soupravy PapilloCheck Analytická citlivost Za účelem vyhodnocení analytické citlivosti byl stanoven limit detekce (LoD95 = nejnižší počet kopií cílové DNA, který lze detekovat u 95 % případů) pomocí referenčních plazmidů specifických pro jednotlivé detekovatelné typy HPV obsahující oblast E1, na kterou je cílena souprava PapilloCheck. Pro analýzu genotypu HPV byly v transportním médiu ohraničeny specifické plazmidy, a to včetně buněk z lidské buněčné linie (buňky HEK) jako pozadí. Z každého vzorku byla extrahována DNA a následně byla analyzována pomocí soupravy PapilloCheck. LoD95 byl vypočten individuálně pro každý genotyp HPV pomocí 2 nezávislých řad ředění a probitové analýzy. Definovaný LoD95 byl ověřen pomocí třetí řady ředění pro každý genotyp HPV. Limity detekce pro různé genotypy HPV jsou přehledně uvedeny v Tabulka 6. Tabulka 6: Analytická citlivost soupravy PapilloCheck Genotyp HPV* Limit detekce (LoD95) pro soupravu PapilloCheck [kopie/pcr]** Greiner Bio-One. Limit detekce (LoD95) pro soupravu PapilloCheck [kopie/extrakce]*** HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV * Specifický plazmid genotypu HPV s 10 4 lidskými buňkami HEK jako pozadím v médiu PreservCyt (Hologic). ** LoD95 pro reakci PCR vypočítaný z hodnoty LoD95 pro extrakci. (viz ***) *** LoD95 založený na probitové analýze včetně doporučeného systému pro extrakci DNA ocheck od společnosti 35

36 Analytická specifičnost typy HPV Síla pro vaše zdraví Souprava PapilloCheck byla testována na analytickou specifičnost s použitím referenčních plazmidů specifických pro genotyp HPV. Následující genotypy HPV byly testovány s využitím 10 5 kopií/reakce PCR: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 71, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85. Byly zaznamenány následující zkřížené hybridizace: HPV 55 poskytuje signál na sondu HPV 44. Výsledkem je, že software CheckReport Software zobrazuje kombinovaný výsledek HPV 44 / HPV 55. HPV 13 může zkříženě reagovat se sondou HPV 11; nevede to však k falešně pozitivnímu signálu, protože HPV 13 není v cervikálních vzorcích přítomen Analytická specifičnost organizmy bez přítomnosti HPV Souprava PapilloCheck byla testována na analytickou specifičnost s použitím následujících organizmů bez přítomnosti HPV (reakce 1ng genomové DNA/PCR): Bacteroides ureolyticus, Bacteroides uniformis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Chlamydia trachomatis, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter faecium, Enterobacter durans, Enterobacter faecalis, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Proteus hauseri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Trichomonas vaginalis, Candida albicans Soupravou PapilloCheck nebyly detekovány žádné nespecifické signály Opakovatelnost (intra-reprodukovatelnost) Opakovatelnost měří odchylky ve výkonnosti mezi různými cykly v rámci jedné laboratoři. Za účelem vyhodnocení opakovatelnosti testu byla DNA extrahována ze 4 vzorků, z nichž každý obsahoval odlišný templát HPV (HPV 16, HPV 18, HPV 31 nebo HPV 45), na pozadí lidských buněk, a to s použitím ruční soupravy pro extrakci DNA ocheck a poté analýzou pomocí soupravy PapilloCheck. Každý vzorek byl analyzován v 6 nezávislých opakováních a ve 3 různých cyklech. Za účelem vyhodnocení opakovatelnosti bylo testováno 18 opakování každého vzorku a celkem tedy 72 vzorků. Všechny vzorky byly testovány tím samým uživatelem se stejným vybavením a pomocí soupravy jedné šarže. Popsané vyhodnocení opakovatelnosti bylo navíc provedeno na 3 testovacích pracovištích. Celkem tedy bylo uskutečněno 216 analýz. V rámci každého ze 3 testování opakovatelnosti bylo dosaženo 100% shody (viz Tabulka 7). Tabulka 7: Výsledky z testování opakovatelnosti pomocí soupravy PapilloCheck Testovací pracoviště Shoda Testovací pracoviště % Testovací pracoviště % Testovací pracoviště % 36

37 Síla 11.3 pro vaše Reprodukovatelnost zdraví Reprodukovatelnost měří odchylky ve výkonnosti mezi různými cykly v rámci různých laboratoří. Za účelem vyhodnocení reprodukovatelnosti testu byla opět extrahována DNA ze 4 vzorků, z nichž každý obsahoval odlišný templát HPV (HPV 16, HPV 18, HPV 31 nebo HPV 45), na pozadí lidských buněk, a to s použitím ruční soupravy pro extrakci DNA ocheck a poté analýzou pomocí soupravy PapilloCheck. Postup byl proveden paralelně na 3 odlišných testovacích pracovištích. Každý vzorek byl analyzován v 6 nezávislých opakováních a ve 3 různých cyklech v rámci každého testovacího pracoviště. Na jednom testovacím pracovišti bylo testováno 18 opakování každého vzorku a celkem tedy 72 vzorků. V rámci každého testovacího pracoviště bylo používáno různé vybavení (cyklér PCR, skener CheckScanner ) a soupravy různých šarží. Celkem bylo testováno 216 vzorků. Mezi různými testovacími pracovišti byly dosaženy 100% shodné výsledky Odolnost Za účelem vyhodnocení odolnosti různých testovacích systémů PapilloCheck byly posouzeny následující parametry: hybridizační teplota; doba hybridizace; teplota promývání. Všechny testy byly provedeny ve 3 opakováních s vysokou koncentrací templátů (10 5 kopií/reakci PCR referenčního plazmidu HPV) a s hodnotou koncentrace templátů blízkou limitu detekce (koncentrace závislá na genotypu HPV). Tyto testy byly provedeny pro jednotlivé genotypy HPV, které lze detekovat pomocí soupravy PapilloCheck. Rozsah hodnot parametrů stanovených u souprav, u kterých je detekce odolnosti HPV možná, je přehledně uveden v Tabulce 8. Tabulka 8: Odolnost soupravy PapilloCheck Parametr Rozsah Hybridizační teplota C Doba hybridizace minut Teplota promývání C 37

38 Síla 11.5 pro vaše Klinická zdraví výkonnost soupravy PapilloCheck Pro stanovení klinické výkonnosti testů PapilloCheck a PapilloCheck high-risk z hlediska klinické citlivosti a specifičnosti byla provedena srovnávací studie pomocí soupravy PapilloCheck a testu GP5+/6+-PCR EIA. 12 V případě této studie bylo analyzováno vzorků od zastoupených žen s běžnou cytologií (kontrolní skupina) ve věku nad 40 let (medián věku, 49 let; věkové rozmezí, 40 až 60 let) a 192 vzorků od zastoupených žen (medián věku, 34 let; 30 až 60 let) s histologicky potvrzenými lézemi CIN3+ (experimentální skupina). Všechny vzorky použité v této studii byly původně shromážděny během základního kola od žen z intervenční skupiny randomizované kontrolované implementační studie POBASCAM. 13 Po omezení analýzy PapilloCheck na 14 typů hrhpv cílených pomocí testu GP5+/6+-PCR- EIA a nové soupravy PapilloCheck high-risk měla souprava PapilloCheck klinickou citlivost pro CIN3 o hodnotě 95,8 % (184/192; 95% CI 92,8 98,8) a klinickou specifičnost pro CIN2 o hodnotě 96,7 % (95% CI 95,7 97,7). Pro srovnání byly tyto hodnoty 96,4 % (185/192, 95% CI: 93,9 98,9) a 97,7 % (95% CI: 96,9 98,5), pro GP5+6+- PCR-EIA (viz Tabulka 9 a 10). Tabulka 9: Porovnání výsledků soupravy PapilloCheck (14 typů hrhpv cílených pomocí soupravy PapilloCheck high- -risk) a testu GP5+/6+ PCR-EIA rozdělených dle kontrol a případů. PapilloCheck (14 typů hrhpv) GP5+/6+-PCR/EIA Celkem Kontroly - + celkem (96,5 %) 18 (1,3 %) (97,7 %) 4 (0,3 %) 29 (2,0 %) 36 (2,3 %) (96,7 %) 47 (3,3 %) Případy - + celkem 4 (2,1 %) 3 (1,6 %) 7 (3,6 %) 4 (2,1 %) 181 (94,3 %) 185 (96,4 %) 8 (4,2 %) 184 (95,8 %) 192 Tabulka 10: Klinická citlivost a specifičnost soupravy PapilloCheck a testu GP5+/6+-PCR-EIA (výsledky pro jeden nebo více ze 14 typů hrhpv: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, nebo 68). 14 hrhpv PapilloCheck GP5+/6+ Klinická citlivost CIN3 95,8 % 96,4 % Klinická specifičnost CIN2 96,7 % 97,7 % 12 Comparison of the clinical performance of PapilloCheck human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+-PCRenzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, PolRP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol Mar;48(3): Epub 2009 Dec Bulkmans, N. W., L. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.H. Verheijen, K. Groningen, M. E. Boon, H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule, and C. J. Meijer POBASCAM, a population-based randomized controlled trial for implementation of high-risk HPV testing in cervical screening: design, methods and baseline data of 44,102 women. Int. J. Cancer 110:

39 Síla pro vaše zdraví Pro posouzení reprodukovatelnosti testu PapilloCheck na základě klinických vzorků byla v roce 2012 provedena studie v Nizozemsku a Německu. V této studii byly použity cervikální vzorky získané z kohorty žen, které se účastnily pravidelného screeningu cervikální cytologie v provincii Utrecht v Nizozemsku. Pomocí definovaného souboru o počtu 550 předem testovaných vzorků souprava PapilloCheck prokázala 97,6% shodu pro intralaboratorní reprodukovatelnost a 94% shodu pro interlaboratorní reprodukovatelnost. Soubory dat vyhodnocení reprodukovatelnosti jsou přehledně uvedeny v Tabulce 11 a 12. Tabulka 11: Intralaboratorní reprodukovatelnost PapilloCheck time 1 poz PapilloCheck time 1 neg PapilloCheck time 2 poz PapilloCheck time 2 neg Výsledky: Reprodukovatelnost [%]: 97,3 Nižší míra spolehlivosti [%] = 96,3 Kappa = 0,941 Tabulka 12: Interlaboratorní shoda PapilloCheck time 1 poz PapilloCheck time 1 neg PapilloCheck time 2 poz PapilloCheck time 2 neg Výsledky: Reprodukovatelnost [%]: 94 Nižší míra spolehlivosti [%] = 92,1 Kappa = 0,842 39

40 PCR 12. KRÁTKÝ PROTOKOL PAPILLOCHECK 12.1 Místnost 2: Příprava reakční směsi pro PCR Místnost 2 Nařeďte uracil-n-glykosylázu v poměru 1 : 200 s vodou upravenou pro PCR Opatrně promíchejte naředěnou UNG. Připravte výsledný mastermix v množství požadovaném pro reakce PCR. PapilloCheck PCR MasterMix Polymeráza HotStar Taq (5 U/µl) Uracil-N-glykosyláza (ředění v poměru 1 : 200 0,005 U/µl) Celkový objem před přidáním vzorku DNA 1 reakce 13 reakcí (1 čip) Výsledný mastermix opatrně promíchejte. 26 reakcí (2 čipy) 39 reakcí (3 čipy) 52 reakcí (4 čipy) 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1 029,6 µl 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl 1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl µl Výsledný mastermix rozdělte do alikvot: přidejte 21 µl reakční směsi do 0,2ml reakční PCR zkumavky na pásu PCR pro každou reakci PCR. 40 K R Á T K Ý P R O T O K O L

41 PCR 12.2 Místnost 2: Přidání templátu DNA pro PCR / reakce PCR Místnost 2 Přidejte 5 µl templátu DNA pro každou reakci PCR. Důkladně promíchejte. Spusťte reakci PCR pomocí připraveného programu termocykléru. Čas Teplota C Počet cyklů 20 min 37 C 1 15 min 95 C 1 30 s 25 s 45 s 95 C 55 C 72 C 40 K R Á T K Ý 30 s 45 s 95 C 72 C Čekejte 10 C P R O T O K O L

42 12.3 Místnost 3: Hybridizace příprava / hybridizační reakce Hybridizace a promývání Místnost 3! Začněte s přípravou nejméně 30 minut před hybridizací. Rozpusťte případné sraženiny v hybridizačních a promývacích pufrech a dostatečně je promíchejte. Připravte směs promývacího roztoku pro počet čipů PapilloCheck, který bude analyzován. Počet čipů PapilloCheck Složky Destilovaná/deionizovaná voda 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml Pufr A PapilloCheck 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml Pufr B PapilloCheck 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml Celkový objem 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml Rozdělte směs promývacího roztoku do alikvot do tří promývacích boxů ocheck. Promývací roztok II předem zahřejte ve vodní lázni na teplotu 50 C. K R Á T K Ý Inkubujte odpovídající počet čipů PapilloCheck, který má být analyzován v připravené hybridizační komoře při pokojové teplotě. Produkty PCR promíchejte a rychlým pohybem přetoče směrem dolů. Hybridizační pufr promíchejte a rychlým pohybem přetočte směrem dolů. Promíchejte 30 μl hybridizačního pufru PapilloCheck s 5 μl produktu PCR. Důkladně promíchejte a rychlým pohybem přetočte směrem dolů. Přeneste 25 μl hybridizační směsi do každé jamky čipu PapilloCheck pomocí vícekanálové pipety. Zabraňte tvorbě vzduchových bublin. Inkubujte čip PapilloCheck přesně po dobu 15 minut za při teplotě okolního prostředí mezi 20 a 25 C. P R O T O K O L 42

43 Hybridizace a promývání 12.4 Místnost 3: Promývání a sušení / skenování a vyhodnocení Místnost 3 Vyjměte magnetickou rukojeť pro držák kazet z hybridizační komory. Nasaďte držák kazet do promývacího boxu ocheck s promývacím roztokem I. Připojte rukojeť ocheck. Promývejte čip(y) PapilloCheck v promývacím roztoku I při pokojové teplotě po dobu 10 sekund. Promývejte čip(y) PapilloCheck v předem zahřátém promývacím roztoku II ve vodní lázni s teplotou 50 C po dobu 60 sekund. Promývejte čip(y) PapilloCheck v promývacím roztoku III při pokojové teplotě po dobu 10 sekund. K R Á T K Ý P Odstraňte veškerou kapalinu z povrchu čipu PapilloCheck pomocí centrifugace. R Naskenujte čip(y) PapilloCheck pomocí skeneru CheckScanner. Proveďte skenování a analýzu, jak je popsáno v uživatelské příručce softwaru CheckReport Software. Vygenerujte zprávy. 3 minuty 500 g nebo 1 minuta max. rychlost O T O K O L 43