Charakterizace tkáňových nosičů. Jana Horáková

Transkript

1 Charakterizace tkáňových nosičů Jana Horáková

2 Materiál kovy, keramika, polymery, gely Chemické složení polární x nepolární struktura, náboj, reaktivita Morfologie hladká, drsná, vzorování povrchu Uspořádání krystalické x semikrystalické x amorfní Okolní prostředí vliv vlhkosti, teploty, enzymů

3 Definice 1986 European Society for Biomaterials Biomateriál neživý materiál (zdravotnický prostředek=zp) interagující s živým systémem Implantát ZP určený pro implantaci dovnitř lidského těla Umělý orgán ZP nahrazující částečně nebo plně funkci selhávajícího orgánu Biokompatibilita schopnost materiálu vykonávat vhodnou funkci na daném místě v organismu bez vedlejších negativních účinků

4 Typy materiálů 1. Kovy: anorganické materiály, kovové vazby mezi atomy (Ti, nerezová ocel, slitiny Co a Cr) 2. Keramika: anorganické materiály, kovalentní/iontové vazby (Al 2 O 3, ZrO 2, kalcium fosfát, bioaktivní sklo) ortopedické implantáty 3. Polymery: organické materiály, kovalentní vazby mezi monomerními jednotkami, různorodé vlastnosti

5

6 Interakce materiálu s organismem Nekompatibilní uvolnění toxických látek, rejekce implantátu Biotolerantní uvolnění látek v nízkých koncentracích, které nejsou cytotoxické, enkapsulace materiálu (opouzdření) Bioinertní neuvolňující toxické látky (žádný materiál není 100% inertní viz HMWPE) Bioaktivní napomáhající regeneraci organismu

7 Interakce buněk s materiálem

8 Arg (R)-Gly (G)-Asp (D)

9 Adhezní molekuly Fibronektin GP (440 kda) vyskytující se na povrchu buněčných membrán, v ECM (nerozpustný) a volně v tělních tekutinách (rozpustný, plazma 300 µg/ml) Nerozpustný produkován např. fibroblasty Rozpustný produkován hepotocyty Může se vázat na kolagen, fibrin, proteoglykany (heparan sulfát), aktin, integriny vliv na buněčnou adhezi, proliferaci, diferenciaci, hojení ran, embryogenezi

10 Vitronektin GP (75 kda) Nachází se v séru a v ECM (obsahuje RGD sekvence vazba na vitronektinový receptor na povrchu buněk) Laminin GP Hlavní protein bazální laminy (jedna z vrstev bazální membrány) Vazba na kolagen, fibronektin, integriny Vliv na buněčnou adhezi, migraci, diferenciaci

11

12 Integriny Fce: vazba na proteiny ECM (RGD sekvence adhezních molekul) Patří do skupiny CAM (cell-adhesion molecules) společně s cadheriny a selektiny Proteiny lokalizované na membráně buněk (transmembránové receptory) Intracelulární část interaguje s cytoskeletem, extracelulární s ECM (heterofilní vazba) vazba na kolagen, fibrinogen, fibronektin, vitronektin, laminin

13 Cell-matrix adhesion Fokální adheze Proteinové komplexy (více než 100 proteinů) zajišťující spojení mezi cytoskeletem buňky a proteiny ECM

14 Zpět k materiálům

15 Bulk vs surface properties

16 Bulk Material Surface Layer of Material Adsorbed layer of water, ions & proteins Cells in biological fluid

17

18 Chemické složení povrchu Interakce buněk a materiálu závisí na fyzikálních a chemických parametrech scaffoldu Optimální buněčná adheze na mírně hydrofilní povrchy s kladným nábojem díky adsorpci adhezních molekul (vitronectin, fibronectin) ve správné konformaci dostupnost specifických AK sekvencí, které jsou přístupné integrinům na povrchu adherujících buněk Povrchy s vysokou hydrofilitou neumožňují adsorpci proteinů, popř. je vážou slabě Povrchy hydrofobní váží adhezní proteiny v rigidní, popř. v denaturované formě

19 Chemické složení ovlivňuje energii, polaritu a smáčivost povrchu Funkční skupiny s obsahem kyslíku zvyšují energii, polaritu a smáčivost povrchu podporují buněčnou adhezi a proliferaci Smáčivost měření kontaktního úhlu s kapalinami různé polarity

20 Smáčivost povrchu Nejčastěji charakterizována měřením kontaktního úhlu Schopnost kapaliny udržovat kontakt s pevným povrchem, vyplývá z mezimolekulární interakce Stupeň smáčení je určen projevem adhezních a kohezních sil, což jsou přitažlivé a odpudivé síly mezi částicemi povrchových vrstev dvou stýkajících se látek

21 V soustavě existují tři různé stykové plochy na rozhraní fází mezi: pevná látka plyn, kapalina plyn a kapalina pevná látka. Každému mezifázovému rozhraní odpovídá příslušné povrchové napětí γ LS (kapalina tuhá látka), γ GS (plyn tuhá látka) a γ LG (kapalina plyn). Křivka, ve které se stýkají všechna fázová rozhraní, se nazývá linie smáčení. Úhel smáčení (kontaktní úhel) θ, který leží mezi mezifázovými rozhraními kapalina tuhá látka a kapalina plyn se nazývá úhel smáčení

22 Vztah mezi úhlem smáčení θ a jednotlivými mezifázovými rozhraními je dán Youngovou rovnicí γ GS γ LS = γ LG cos θ Předpoklad ideálně hladkého homogenního povrchu

23 Ideální smáčivost povrchu scaffoldu Testovány scaffoldy hydrofobní (θ>80 ), středně hydrofilní (θ = ) a hydrofilní (θ<35 ) měřena adheze proteinů a proliferace fibroblastů (Faucheux et al, 2004) Extrémně hydrofilní a hydrofobní materiály neumožňovaly adhezi proteinů a proliferaci fibroblastů Arima et al, 2007 vliv smáčivosti na adhezi endotelových a epitelových buněk lepší adheze se zvyšující se hydrofilicitou povrchu (ideálně θ = )

24 A - Schéma adsorpce proteinů na extrémně hydrofilní povrchy (adsorpce téměř žádná nebo jen velmi slabá), nedochází k tvorbě fokálních adhezí B podobná situace na materiálech, které se snadno deformují (dochází k vazbě proteinů, ale materiál se zhroutí po vazbě buněk) Bacakova et al, 2011

25 Modifikace povrchů Polymery používané v biomedicínských aplikacích bývají příliš hydrofobní (kontaktní úhel > 100 ) modifikace: 1) Iontové záření ionty kyslíku, dusíku, halogenů, vzácných plynů, netoxických kovů (Ti, Au), modifikace do hloubky 10 nm 100 µm, rozrušení vazby C-C a C-H štěpení makromolekul, dehydrogenace, karbonizace (relativní zvýšení zastoupení uhlíku), rce s kyslíkem za vzniku karbonylových, karboxylových, esterových skupin 2) UV záření 3) plazma

26 Modifikace povrchů Smáčivost povrchu lze modifikovat (plasma, UV záření) funkcionalizace povrchu vazbou biomolekul/nanočástic apod. Zmíněné modifikace mají za následek tvorbu reaktivních míst (radikály, konjugované dvojné vazby) další možnosti modifikace (vazba Gly-Ala-Leu, RGD-sekvence: Arg-Gly-Asp, BSA, PEG, nanočástice zlata) PCL vascular grafts - plasma treatment - RGD sekvence

27 Rhomboid smooth muscle cells were cultured on untreated (A) or plasma treated (B) electrospun polycaprolactone patches. There was a clear difference in cell morphology when cultured on the two different surfaces, as shown here after 3 days of culture. The nuclei were stained in blue, the a-smooth muscle actin in green, and the S100A4 in red. (Scale bars = 20 lm). The vascular implantation of untreated and plasma treated grafts showed that plasma treatment improves the cell invasion in the graft wall (A, B). The densely cellularized area (C) as well as the number of capillaries in the graft wall (D) show the significant improvement of the tissue regeneration in plasma treated grafts. De Valence et al. Plasma treatment for improving cell biocompatibility of a biodegradable polymer scaffold for vascular graft applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 85 (2013).

28 Smooth muscle regeneration and ECM production at 4 weeks after implantation. AeF, Immunofluorescence staining of cross-sections of PCL grafts, PCL-RGD grafts, and native artery with a-sma antibody; GeI, H&E staining of post-implanted grafts to demonstrate the neointima formation; JeL, Verhoeff-Van Gieson staining of the elastic fibers. Zheng W. et al. Endothelialization and patency of RGD-functionalized vascular grafts in a rabbit carotid artery model. Biomaterials 33 (2012).

29 Drsnost a morfologie povrchu Parametr R A = střední aritmetická odchylka profilu, necharakterizuje tvar!!! Obvykle měřeno metodou AFM (mikroskopie atomárních sil)

30 AFM Umožňuje 3D zobrazení povrchů (rozdíl oproti SEM 2D zobrazení) Detekce pohybu zkoumajícího hrotu nad vzorkem Zobrazení nevodivých povrchů

31 Drsnost povrchu Makrodrsnost (rozlišení okem, > 100 µm) neovlivňuje buněčnou adhezi, pouze uchycení scaffoldu Mikrodrsnost (1-100 µm) ovlivňuje adhezi (velikost buněk v suspenzi µm průměr, po adhezi spreading area stovky až tisíce µm 2 ), vliv rozporuplný v různých studiích (neúplná charakterizace)

32 Submikronová drsnost (100 nm- 1 µm) ovlivnění buněčné adheze, převládá pozitivní vliv Nanodrsnost (< 100 nm) pozitivní vliv na adhezi a proliferaci buněk díky adsorpci adhezních molekul ve správné konformaci potvrzen vliv na několika buněčných typech (MSC, kostní buňky, endotelové buňky)

33 Elektrický náboj a vodivost Lepší adheze na pozitivně nabité povrchy (adhezní molekuly jsou negativně nabité) Výjimky: -COOH (dvojí efekt, negativní náboj x hydrofilní skupina zlepšující buněčnou adhezi) Vodivost důležité např. pro kultivaci kardiomyocytů, nervových buněk Vodivé materiály podporují adhezi buněk (i bez stimulace elektrickým, elektromagnetickým polem) Použití vodivých materiálů nebo následná modifikace povrchu (Polypyrrol PPy, Polyanilin PANI)

34 Elektrický náboj a vodivost Vodivost v jednotkách až desítkách S cm -1 Syntéza chemická ( nižší vodivost) x elektrochemická ( depozice tenkého filmus kontrolovanou tloušťkou v řádu nm a morfologií) Kompozitní materiály (PDLLA+Ppy, PET+Ppy; PANI+PCL cardiac tissue regeneration), electrospinning (blend PPy/PANI+PEO/PS, coating of fibers), hydrogely (PPy/PANI+polyakrylamid, PPy+p(HEMA)

35 composite material of polypyrrole and polycaprolactone fumarate (PCLF) for application as nerve guidance tubes in nerve regeneration Polypyrrol Biokompatibilní, chemicky stabilní Použití pro náhrady nervové tkáně (vodivost za fyziologických podmínek) Snadná syntéza při pokojové teplotě, dobrá rozpustnost Možnost přípravy různě porézních struktur Snadná modifikace inkorporace bioaktivních látek Křehkost

36 3 typy dle stupně oxidace Emeraldine nejstabilnější, největší vodivost Není biodegradabilní chronické záněty Polyanilin

37 Funkcionalizace vodivých polymerů Adsorpce závislé na ph a okolních podmínkách snadné uvolnění Uzavření do molekuly polymeru mix molekul bioaktivní látky s monomerem a rozpouštědlem před vlastní syntézou využíváno pro velké molekuly (enzymy, DNA), aplikace: biosensory (Glukoso-oxidasa Glc sensory) Kovalentní vazba stabilnější, nehrozí uvolnění molekuly x snížení vodivosti

38 Krystalinita Schopnost dosáhnout určitého stupně uspořádanosti a vykazovat určitou nadmolekulární strukturu Amorfní polymery: makromolekuly zaujímají zcela nahodilou pozici Semikrystalické: řetězce makromolekul jsou pravidelně uspořádány

39 Krystalinita Souvisí s pravidelností geometrické stavby polymerních řetězců statistické kopolymery amorfní Ve skutečnosti však nedochází k úplné krystalizaci existují vedle sebe oblasti krystalické i amorfní w k stupeň krystalinity, udává se v % Obecně vzniká krystalická struktura tím snadněji, čím je molekula symetričtější, řetězce hladší a pravidelnější

40 Semikrystalické polymery - houževnaté - vysoká tažnost - pevnost se zvyšuje s rostoucí krystalinitou - v organických rozpouštědlech se rozpouštějí špatně nebo vůbec (v závislosti na chemickém složení) - mléčně zakalené až bílé Polytetrafluorethylene Polyethylene terephtalate Polycaprolactone

41 - tvrdé a křehké - malá tažnost - průhledné Amorfní polymery - dobře rozpustné v organických rozpouštědlech (amorfní fáze rozpustná lépe než krystalická) Statistické kopolymery (náhodné): kopolymer polylaktidu a polykaprolaktonu (PLC)

42 Krystalinita polymerů Vliv na mechanické vlastnosti, rychlost degradace, termické vlastnosti (zpracovatelnost, sterilizace) Vlastnosti přírodních polyhydroxyalkanoatů

43 Stanovení krystalického podílu semikrystalických polymerů Měření hustoty - větší hustota krystalických polymerů než amorfních: polyamide 6 (nylon) ρ c = 1.24 g/cm 3 Kalorimetrie (DSC) ρ a = 1.08 g/cm 3 Rentgenografie (XRD) integrace peaků a halo IR, NMR

44 XRD Proložení difraktogramů polynomem tak, aby část nad polynomem (černá čárkovaná křivka pro vzorek 10% PLC a červená čárkovaná křivka pro vzorek 22% PLC) odpovídala krystalické fází či krystalickým fázím. Vzorek Global area Reduced Krystalinita, Amorfní area hm% podíl,hm% 10% PLC 722,4 9,9 1,4 98,6 22% PCL 663,9 149,8 22,6 77,4

45 Termické vlastnosti T g teplota skelného přechodu Pod ní se polymer nachází ve stavu sklovitém je tvrdý, křehký, má vysoký modul pružnosti Nad ní je ve stavu kaučukovitém (i malá napětí způsobují deformace až o několik set %) V přechodové oblasti se modul mění až o 3 řády Pod teplotou T g postačuje tepelná energie makromolekul pouze k jejich vibracím, polymer je tvrdý a křehký Při T g se uvolňuje pohyb segmentů molekul a hmota nabývá kaučukovitého charakteru

46 Tepelné chování amorfních polymerů Termomechanická křivka

47 Tepelné chování amorfních polymerů Molekuly více vzdáleny než v krystalických strukturách Sklovitý stav pod T g, segmenty se nepohybují, tepelný pohyb realizován vibrací, rotací a oscilací atomů, křehkost materiálu Viskoelastický stav mezi T g a T f, pružnost (vratná deformace materiálu) Viskozní stav nad T f o T g - významná změna fyzikálních vlastností (modul pružnosti změna až o 3 řády)

48 Tepelné chování krystalických polymerů

49 Metody termické analýzy Termogravimetrická analýza (TG) Diferenční termická analýza (DTA) Diferenční skenovací kalorimetrie (DSC)

50 Diferenční skenovací kalorimetrie udržení stejné teploty studovaného a referenčního vzorku, které jsou zahřívány současně vedle sebe. Udržení nulového teplotního rozdílu se dosahuje buď dodáním energie do vzorku (pokud v něm probíhá endotermní děj) nebo do referenční látky (ve vzorku probíhá exotermní děj)

51 Diferenční skenovací kalorimetrie Příklad DSC křivky a určení charakteristických teplot Typická DSC křivka organického polymeru

52 DSC křivka semikrystalického PCL

53 DSC křivka amorfního kopolymeru PLC

54 Degradabilita V posledních letech posun od inertních materiálů k biodegradabilním Rychlost degradace závisí na mnoha faktorech: složení a morfologie scaffoldu, místo implantace, Přírodní polymery degradují převážně enzymaticky Syntetické polymery degradují převážně hydrolyticky

55

56 Degradabilita

57 a) Povrchová eroze b) Bulk degradation c) Bulk degradation + autokatalyzátor

58 PCL degradation mechanism

59 Enzymatické štěpení polyesterů

60 Y. Kodama: Biodegradation of Hazardous and Special Products, Enzymatické štěpení polyesterů Mass retention variation versus degradation time, enzymatic method, of samples: ( ) PCL; ( ) PLLA; ( ) PCL:PLLA 20:80 (w:w); ( ) composite with 5% of untreated fiber; ( ) composite with 10% of untreated fiber; ( ) composite with 5% of acetylated fiber; and ( ) composite with 10% of acetylated fiber, of non-irradiated samples.

61 Rigidita a flexibilita Obvykle opomíjené vlastnosti Extrémně měkké materiály (gely) neumožňují tvorbu vazeb mezi buňkami a mezi buňkami a materiálem vznik dysbalance mezi těmito silami (buňky vytváří určité síly na materiál po adhezi) Pevnost, elasticita ovlivnění diferenciace kmenových buněk (měkké materiály neurony; pevnější gely svalové buňky; velmi pevné materiály osteoblasty)

62 Tahové zkoušky Mechanické vlastnosti

63 Tahové zkoušky

64 Inženýrské napětí, σ [MPa] Tahové zkoušky PCL Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek Poměrná deformace, ε [%]

65 Inženýrské napětí, σ [MPa] Tahové zkoušky PLC Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek Poměrná deformace, ε [%]

66 Cyklické zatěžování

67 Metody sterilizace 1. Autoklávování 121 C, 23 min, 101,5kPa Sterilizace kovů, keramiky, polymerů s T m 121 C 2. Radiační sterilizace γ záření o dávce 25kGy 3. Plazmová sterilizace - Plazma ve vysokofrekvenčním elektromagnetickém poli ve vakuu působí na peroxid vodíku nebo jiné látky, převede je na reaktivní radikály, 50 C, 20 min

68 Metody sterilizace 4. Chemická sterilizace a) formaldehyd - plynná směs formaldehydu a vodní páry při C Nedostatečná likvidace choroboplodných zárodků b) ethylen oxid C, vhodné pro termolabilní předměty, karcinogenita ethylen oxidu

69 Metody sterilizace Všechny metody mohou mít vliv na vlastnosti biomateriálů!!!! Testování vlastností scaffoldů musí být vždy prováděno za stejných podmínek jako při klinickém použití Výběr vhodné sterilizační metody je klíčový Problémy: aktivní látky (růstové faktory), tepelná a chemická stabilita polymerů, reaktivita koncových skupin, změna smáčivosti povrchu

70 Metody sterilizace Mass retention variation versus degradation period, enzymatic method, PLLA samples non irradiated and irradiated with EB, radiation doses of 50 kgy and 100 kgy