Charakterizace tkáňových nosičů. Jana Horáková

Transkript

1 Charakterizace tkáňových nosičů Jana Horáková

2 Typy biomateriálů Buněčná adheze Vlastnosti povrchu x bulku Smáčivost povrchu Drsnost povrchu Vodivost Krystalinita Termické vlastnosti Degradabilita Mechanické vlastnosti Metody sterilizace Obsah přednášky

3 Materiál kovy, keramika, polymery, gely Chemické složení polární x nepolární struktura, náboj, reaktivita Morfologie hladká, drsná, vzorování povrchu Uspořádání krystalické x semikrystalické x amorfní Okolní prostředí vliv vlhkosti, teploty, enzymů

4 Definice 1986 European Society for Biomaterials Biomateriál neživý materiál (zdravotnický prostředek=zp) interagující s živým systémem Implantát ZP určený pro implantaci dovnitř lidského těla Umělý orgán ZP nahrazující částečně nebo plně funkci selhávajícího orgánu Biokompatibilita schopnost materiálu vykonávat vhodnou funkci na daném místě v organismu bez vedlejších negativních účinků

5 Typy materiálů 1. Kovy: anorganické materiály, kovové vazby mezi atomy (Ti, nerezová ocel, slitiny Co a Cr) 2. Keramika: anorganické materiály, kovalentní/iontové vazby (Al 2 O 3, ZrO 2, kalcium fosfát, bioaktivní sklo) ortopedické implantáty 3. Polymery: organické materiály, kovalentní vazby mezi monomerními jednotkami, různorodé vlastnosti

6

7 Interakce materiálu s organismem Nekompatibilní uvolnění toxických látek, rejekce implantátu Biotolerantní uvolnění látek v nízkých koncentracích, které nejsou cytotoxické, enkapsulace materiálu (opouzdření) Bioinertní neuvolňující toxické látky (žádný materiál není 100% inertní viz HMWPE) Bioaktivní napomáhající regeneraci organismu

8 Interakce buněk s materiálem

9 Extracelulární matrix (ECM) Mezibuněčná hmota Složena z proteinů (kolagen, elastin) a glykosaminglykanů (heparan sulfát, chondroitin sulfát, kyselina hyaluronová) a glykoproteinů (laminin, fibronektin) Fce: uchycení buněk, zajištění mezibuněčné komunikace, pružnost tkáně, podíl na diferenciaci buněk a vývoji embrya Zdroj: decelularizované tkáně

10

11 Adhezní molekuly Fibronektin GP (440 kda) vyskytující se na povrchu buněčných membrán, v ECM (nerozpustný) a volně v tělních tekutinách (rozpustný, plazma 300 µg/ml) Nerozpustný produkován např. fibroblasty Rozpustný produkován hepotocyty Může se vázat na kolagen, fibrin, proteoglykany (heparan sulfát), aktin, integriny vliv na buněčnou adhezi, proliferaci, diferenciaci, hojení ran, embryogenezi

12 Vitronektin GP (75 kda) Nachází se v séru a v ECM (obsahuje RGD sekvence vazba na vitronektinový receptor na povrchu buněk) Laminin GP Hlavní protein bazální laminy (jedna z vrstev bazální membrány) Vazba na kolagen, fibronektin, integriny Vliv na buněčnou adhezi, migraci, diferenciaci

13

14 Integriny Fce: vazba na proteiny ECM (RGD sekvence adhezních molekul) Patří do skupiny CAM (cell-adhesion molecules) společně s cadheriny a selektiny Proteiny lokalizované na membráně buněk (transmembránové receptory) Intracelulární část interaguje s cytoskeletem, extracelulární s ECM (heterofilní vazba) vazba na kolagen, fibrinogen, fibronektin, vitronektin, laminin

15 Arg (R)-Gly (G)-Asp (D)

16 Cell-matrix adhesion Fokální adheze Proteinové komplexy (více než 100 proteinů) zajišťující spojení mezi cytoskeletem buňky a proteiny ECM

17 Zpět k materiálům

18 Bulk vs surface properties

19 Bulk Material Surface Layer of Material Adsorbed layer of water, ions & proteins Cells in biological fluid

20 Katti et al. Improved Biomaterials for Tissue Engineering Applications. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2008.

21 Chemické složení povrchu Interakce buněk a materiálu závisí na fyzikálních a chemických parametrech scaffoldu Optimální buněčná adheze na mírně hydrofilní povrchy s kladným nábojem díky adsorpci adhezních molekul (vitronectin, fibronectin) ve správné konformaci dostupnost specifických AK sekvencí, které jsou přístupné integrinům na povrchu adherujících buněk Povrchy s vysokou hydrofilitou neumožňují adsorpci proteinů, popř. je vážou slabě Povrchy hydrofobní váží adhezní proteiny v rigidní, popř. v denaturované formě

22 A - Schéma adsorpce proteinů na extrémně hydrofilní povrchy (adsorpce téměř žádná nebo jen velmi slabá), nedochází k tvorbě fokálních adhezí B - podobná situace na materiálech, které se snadno deformují (dochází k vazbě proteinů, ale materiál se zhroutí po vazbě buněk) Bacakova et al, 2011

23 Chemické složení ovlivňuje energii, polaritu a smáčivost povrchu Funkční skupiny s obsahem kyslíku zvyšují energii, polaritu a smáčivost povrchu podporují buněčnou adhezi a proliferaci Smáčivost měření kontaktního úhlu s kapalinami různé polarity

24 Smáčivost povrchu Nejčastěji charakterizována měřením kontaktního úhlu Schopnost kapaliny udržovat kontakt s pevným povrchem, vyplývá z mezimolekulární interakce Stupeň smáčení je určen projevem adhezních a kohezních sil, což jsou přitažlivé a odpudivé síly mezi částicemi povrchových vrstev dvou stýkajících se látek

25 Vztah mezi úhlem smáčení θ a jednotlivými mezifázovými rozhraními je dán Youngovou rovnicí γ GS γ LS = γ LG cos θ!!!předpoklad ideálně hladkého homogenního povrchu!!!

26 Ideální smáčivost povrchu scaffoldu Testovány scaffoldy hydrofobní (θ>80 ), středně hydrofilní (θ = ) a hydrofilní (θ<35 ) měřena adheze proteinů a proliferace fibroblastů (Faucheux et al, 2004) Extrémně hydrofilní a hydrofobní materiály neumožňovaly adhezi proteinů a proliferaci fibroblastů Arima et al, 2007 vliv smáčivosti na adhezi endotelových a epitelových buněk lepší adheze se zvyšující se hydrofilicitou povrchu (ideálně θ = )

27 Modifikace povrchů Smáčivost povrchu lze modifikovat (plasma, UV záření, iontové záření) funkcionalizace povrchu vazbou biomolekul/nanočástic apod. Zmíněné modifikace mají za následek tvorbu reaktivních míst (radikály, konjugované dvojné vazby) další možnosti modifikace (vazba Gly-Ala-Leu, RGD-sekvence: Arg-Gly-Asp, BSA, PEG, nanočástice zlata) PCL vascular grafts - plasma treatment - RGD sekvence

28 Rhomboid smooth muscle cells were cultured on untreated (A) or plasma treated (B) electrospun polycaprolactone patches. There was a clear difference in cell morphology when cultured on the two different surfaces, as shown here after 3 days of culture. The nuclei were stained in blue, the a-smooth muscle actin in green, and the S100A4 in red. (Scale bars = 20 lm). The vascular implantation of untreated and plasma treated grafts showed that plasma treatment improves the cell invasion in the graft wall (A, B). The densely cellularized area (C) as well as the number of capillaries in the graft wall (D) show the significant improvement of the tissue regeneration in plasma treated grafts. De Valence et al. Plasma treatment for improving cell biocompatibility of a biodegradable polymer scaffold for vascular graft applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 85 (2013).

29 Smooth muscle regeneration and ECM production at 4 weeks after implantation. AeF, Immunofluorescence staining of cross-sections of PCL grafts, PCL-RGD grafts, and native artery with a-sma antibody; GeI, H&E staining of post-implanted grafts to demonstrate the neointima formation; JeL, Verhoeff-Van Gieson staining of the elastic fibers. Zheng W. et al. Endothelialization and patency of RGD-functionalized vascular grafts in a rabbit carotid artery model. Biomaterials 33 (2012).

30 Modifikace povrchů Katti et al. Improved Biomaterials for Tissue Engineering Applications. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2008.

31 Drsnost a morfologie povrchu Parametr R A = střední aritmetická odchylka profilu, necharakterizuje tvar!!! Obvykle měřeno metodou AFM (mikroskopie atomárních sil)

32 AFM Umožňuje 3D zobrazení povrchů (rozdíl oproti SEM 2D zobrazení) Detekce pohybu zkoumajícího hrotu nad vzorkem Zobrazení nevodivých povrchů

33 Drsnost povrchu Makrodrsnost (rozlišení okem, > 100 µm) neovlivňuje buněčnou adhezi, pouze uchycení scaffoldu Mikrodrsnost (1-100 µm) ovlivňuje adhezi (velikost buněk v suspenzi µm průměr, po adhezi spreading area stovky až tisíce µm 2 ), vliv rozporuplný v různých studiích (neúplná charakterizace)

34 Submikronová drsnost (100 nm- 1 µm) ovlivnění buněčné adheze, převládá pozitivní vliv Nanodrsnost (< 100 nm) pozitivní vliv na adhezi a proliferaci buněk díky adsorpci adhezních molekul ve správné konformaci potvrzen vliv na několika buněčných typech (MSC, kostní buňky, endotelové buňky)

35 Elektrický náboj a vodivost Lepší adheze na pozitivně nabité povrchy (adhezní molekuly jsou negativně nabité) Výjimky: -COOH (dvojí efekt, negativní náboj x hydrofilní skupina zlepšující buněčnou adhezi) Vodivost důležité např. pro kultivaci kardiomyocytů, nervových buněk Vodivé materiály podporují adhezi buněk (i bez stimulace elektrickým, elektromagnetickým polem) Použití vodivých materiálů nebo následná modifikace povrchu (Polypyrrol PPy, Polyanilin PANI)

36 Elektrický náboj a vodivost Vodivost v jednotkách až desítkách S cm -1 Syntéza chemická ( nižší vodivost) x elektrochemická ( depozice tenkého filmu s kontrolovanou tloušťkou v řádu nm a morfologií) Kompozitní materiály (PDLLA+Ppy, PET+Ppy; PANI+PCL cardiac tissue regeneration), electrospinning (blend PPy/PANI+PEO/PS, coating of fibers), hydrogely (PPy/PANI+polyakrylamid, PPy+p(HEMA)

37 composite material of polypyrrole and polycaprolactone fumarate (PCLF) for application as nerve guidance tubes in nerve regeneration Polypyrrol Biokompatibilní, chemicky stabilní Použití pro náhrady nervové tkáně (vodivost za fyziologických podmínek) Snadná syntéza při pokojové teplotě, dobrá rozpustnost Možnost přípravy různě porézních struktur Snadná modifikace inkorporace bioaktivních látek Křehkost

38 3 typy dle stupně oxidace Emeraldine nejstabilnější, největší vodivost Není biodegradabilní chronické záněty Polyanilin

39 Krystalinita Schopnost dosáhnout určitého stupně uspořádanosti a vykazovat určitou nadmolekulární strukturu Amorfní polymery: makromolekuly zaujímají zcela nahodilou pozici Semikrystalické: řetězce makromolekul jsou pravidelně uspořádány

40 Krystalinita Souvisí s pravidelností geometrické stavby polymerních řetězců statistické kopolymery amorfní Ve skutečnosti však nedochází k úplné krystalizaci existují vedle sebe oblasti krystalické i amorfní w k stupeň krystalinity, udává se v % Obecně vzniká krystalická struktura tím snadněji, čím je molekula symetričtější, řetězce hladší a pravidelnější

41 Semikrystalické polymery - houževnaté - vysoká tažnost - pevnost se zvyšuje s rostoucí krystalinitou - v organických rozpouštědlech se rozpouštějí špatně nebo vůbec (v závislosti na chemickém složení) - mléčně zakalené až bílé Polytetrafluorethylene Polyethylene terephtalate Polycaprolactone

42 - tvrdé a křehké - malá tažnost - průhledné Amorfní polymery - dobře rozpustné v organických rozpouštědlech (amorfní fáze rozpustná lépe než krystalická) Statistické kopolymery (náhodné): kopolymer polylaktidu a polykaprolaktonu (PLC)

43 Krystalinita polymerů Vliv na mechanické vlastnosti, rychlost degradace, termické vlastnosti (zpracovatelnost, sterilizace) Vlastnosti přírodních polyhydroxyalkanoatů

44 Stanovení krystalického podílu semikrystalických polymerů Měření hustoty - větší hustota krystalických polymerů než amorfních: polyamide 6 (nylon) ρ c = 1.24 g/cm 3 Kalorimetrie (DSC) ρ a = 1.08 g/cm 3 Rentgenografie (XRD) integrace peaků a halo IR, NMR

45 XRD Proložení difraktogramů polynomem tak, aby část nad polynomem (černá čárkovaná křivka pro vzorek 10% PLC a červená čárkovaná křivka pro vzorek 22% PLC) odpovídala krystalické fází či krystalickým fázím. Vzorek Global area Reduced Krystalinita, Amorfní area hm% podíl,hm% 10% PLC 722,4 9,9 1,4 98,6 22% PCL 663,9 149,8 22,6 77,4

46 Termické vlastnosti T g teplota skelného přechodu Pod ní se polymer nachází ve stavu sklovitém je tvrdý, křehký, má vysoký modul pružnosti Nad ní je ve stavu kaučukovitém (i malá napětí způsobují deformace až o několik set %) V přechodové oblasti se modul mění až o 3 řády Pod teplotou T g postačuje tepelná energie makromolekul pouze k jejich vibracím, polymer je tvrdý a křehký Při T g se uvolňuje pohyb segmentů molekul a hmota nabývá kaučukovitého charakteru

47 Tepelné chování amorfních polymerů Termomechanická křivka

48 Tepelné chování amorfních polymerů Molekuly více vzdáleny než v krystalických strukturách Sklovitý stav pod T g, segmenty se nepohybují, tepelný pohyb realizován vibrací, rotací a oscilací atomů, křehkost materiálu Viskoelastický stav mezi T g a T f, pružnost (vratná deformace materiálu) Viskozní stav nad T f o T g - významná změna fyzikálních vlastností (modul pružnosti změna až o 3 řády)

49 Tepelné chování krystalických polymerů

50 Metody termické analýzy Termogravimetrická analýza (TG) Diferenční termická analýza (DTA) Diferenční skenovací kalorimetrie (DSC)

51 Diferenční skenovací kalorimetrie udržení stejné teploty studovaného a referenčního vzorku, které jsou zahřívány současně vedle sebe Udržení nulového teplotního rozdílu se dosahuje buď dodáním energie do vzorku (pokud v něm probíhá endotermní děj) nebo do referenční látky (ve vzorku probíhá exotermní děj)

52 Diferenční skenovací kalorimetrie Příklad DSC křivky a určení charakteristických teplot Typická DSC křivka organického polymeru

53 DSC křivka semikrystalického PCL

54 DSC křivka amorfního kopolymeru PLC

55 Degradabilita V posledních letech posun od inertních materiálů k biodegradabilním Rychlost degradace závisí na mnoha faktorech: složení a morfologie scaffoldu, místo implantace, Přírodní polymery degradují převážně enzymaticky Syntetické polymery degradují převážně hydrolyticky

56 Degradabilita

57 a) Povrchová eroze b) Bulk degradation c) Bulk degradation + autokatalyzátor

58 PCL degradation mechanism

59 Degradace PCL 24 měsíců in vivo 1) Pokles molekulové hmotnosti 2) Pokles pevnosti 3) Ztráta hmoty 18 měsíců po implantaci pozorován pokles molekulové hmotnosti a fragmentace vláken bez narušení funkce graftu Valence S, Tille JC, Mugnai D, Mrowczynski W, Gurny R, Moller M, Walpoth BH. Long term performance of polycaprolactone vascular grafts in a rat abdominal aorta replacement model, Biomaterials 2012;33: Rychlost degradace závisí na průměru vláken Bolgen N, Menceloglu YZ, Acatay K, Vargel I, Piskin E. In vitro and in vivo degradation of non-woven materials made of poly(εcaprolactone) nanofibers prepared by electrospinning under different conditions, J Biomater Sci Polymer Edn 16 (2005) Sledování degradace, absorpce a exkrece PCL radioaktivně značeného Tritiem nedochází a akumulaci degradačních produktů v organismu, logaritmus molekulové hmotnosti PCL klesal s časem lineárně Hongfan S, Lin M, Cunxian S, Xiumin C, Pengyan W. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant, Biomaterials 27 (2006)

60 Degradace PCL po implantaci do cévního řečiště Pektok E, Nottelet B, Tille JC, Gurny R, Kalangos A, Moeller M, Walpoth BH. Vascular grafts in the rat systemic arterial circulation degradation and healing characteristics of small-diameter poly(e-caprolactone), Circulation 2008;118:

61 Enzymatické štěpení polyesterů

62 Enzymatické štěpení polyesterů

63 Rigidita a flexibilita Obvykle opomíjené vlastnosti Extrémně měkké materiály (gely) neumožňují tvorbu vazeb mezi buňkami a mezi buňkami a materiálem vznik dysbalance mezi těmito silami (buňky vytváří určité síly na materiál po adhezi) Pevnost, elasticita ovlivnění diferenciace kmenových buněk (měkké materiály neurony; pevnější gely svalové buňky; velmi pevné materiály osteoblasty)

64 Tahové zkoušky Mechanické vlastnosti

65 Tahové zkoušky

66 Inženýrské napětí, σ [MPa] Tahové zkoušky PCL, PLC PCL PLC Poměrná deformace, ε [%] σ max [MPa] ε max [%] PCL 3,2 23 PLC Koronární cévy 1 0, Dacron Claes et al, Kannan et al, 2005

67 Cyklické zatěžování

68 Metody sterilizace 1. Autoklávování 121 C, 23 min, 101,5kPa Sterilizace kovů, keramiky, polymerů s T m 121 C 2. Radiační sterilizace γ záření o dávce 25kGy, (8-35 kgy, akutní smrtelná dávka 0,01 kgy ), 60 Co γ záření proniká do hloubky x vznik volných radikálů (štěpení DNA, crosslink polymerních řetězců) 3. Plazmová sterilizace - Plazma ve vysokofrekvenčním elektromagnetickém poli ve vakuu působí na peroxid vodíku nebo jiné látky, převede je na reaktivní radikály, 50 C, 20 min

69 Metody sterilizace 4. Chemická sterilizace a) formaldehyd - plynná směs formaldehydu a vodní páry při C Nedostatečná likvidace choroboplodných zárodků b) ethylen oxid C, vhodné pro termolabilní předměty, karcinogenita ethylen oxidu

70 Metody sterilizace Terminální sterilizace ZP Všechny metody mohou mít vliv na vlastnosti biomateriálů!!!! Testování vlastností scaffoldů musí být vždy prováděno za stejných podmínek jako při klinickém použití Výběr vhodné sterilizační metody je klíčový Problémy: aktivní látky (růstové faktory), tepelná a chemická stabilita polymerů, reaktivita koncových skupin, změna smáčivosti povrchu, účinnost sterilizace Normy/standardy

71 Metody sterilizace Mass retention variation versus degradation period, enzymatic method, PLLA samples non irradiated and irradiated with EB, radiation doses of 50 kgy and 100 kgy Kodama Y, 2013