Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 1 z 19 Devyser AB

Transkript

1 č Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 1 z 19

2 Obsah Strana 1. Seznámení se systémem Devyser UPD Upozornění 4 3. Symboly použité na štítcích 5 4. Požadovaný materiál Obsaženo v soupravě Požadované položky, které nejsou v soupravě 6 5. Skladování a nakládání se soupravou 7 6. Požadavky na vzorek 7 7. Návod k použití Postup zpracování Devyser UPD-15 (8-A016) Příprava vzorků a amplifikace PCR Detekce Výsledky a analýza Limitace požití Reference Upozornění zákazníkům Kontaktní informace 19 Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 2 z 19

3 1. Seznámení se systémem Devyser UPD-15 Použití Pro detekci uniparentální disomie chromozomu 15 (UPD-15). Obsah soupravy Souprava Devyser UPD-15 obsahuje reagencie připravené k použití pro PCR amplifikace genetických markerů. Postup DNA extrakce Souprava Devyser UPD-15 byla validována s použitím QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, kat. č ) pro extrakci DNA z lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, kat. č ) pro extrakci DNA z biopsií choriových klků. Amplifikace Souprava Devyser UPD-15 byla validována na přístroji ABI GeneAmp System 9700 (typ 9600) s teplotní tolerancí PCR profilu ±1 C. Detekce kompatibilní s genetickými analyzátory Applied Biosystems (ABI PRISM 310, 3100, 3130, 3500, 3730), podporujícími barevnou sadu G5. Analýza dat GeneScan GeneMarker a GeneMapper. Princip metody Profil DNA vytvářený pomocí STR analýzy zahrnuje amplifikaci, detekci a analýzu STR markerů (krátkých tandemových repetic). Fluorescenčně značené primery se používají pro amplifikaci specifických STR markerů. Výsledné PCR produkty jsou separovány a analyzovány s použitím automatického genetického analyzátoru. Variabilní (polymorfní) povaha STR markerů umožňuje rozlišení mezi různými individuálními DNA profily. Polymorfismy zobrazené v každé oblasti STR markerů jsou samy o sobě velmi běžné. Typicky je každý polymorfismus přítomen u 5 20% individuí v populaci. Jedinečná kombinace různých polymorfismů u konkrétního jedince je tím, čím jej můžeme od ostatních odlišit. Jednotlivé alely STR markerů reprezentují alely zděděné od matky a od otce. Během analýzy jsou identifikované alely porovnávány s alelami nalezenými v rodičovských vzorcích. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 3 z 19

4 2. Upozornění A. B. C. D. E. F. G. H. Devyser UPD-15 byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µl. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. Předejděte mikrobiální kontaminaci při vyjímání alikvotů z reakčních zkumavek. Doporučujeme používat špičky s filtry. Nemíchejte reagencie z různých šarží ani z různých zkumavek stejné šarže. Nepoužívejte soupravu s prošlou záruční lhůtou. Nepoužívejte otevřené nebo poškozené reagenční zkumavky. Práce v laboratoři má postupovat jedním směrem. Začíná přípravou reagencií, postupující do prostoru pro extrakci DNA, do prostoru pro amplifikaci DNA a nakonec do prostoru pro detekci. Příprava reagencií a extrakce DNA provádějte v oddělených prostorách. Přístroje i spotřební materiál má být lokalizován pouze v příslušném prostoru a nesmí se přenášet mezi těmito oddělenými prostory. V příslušném prostoru používejte rukavice a při jeho opouštění je vyměňte za nové. Přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory. Nakládání s reagenciemi a vzorky, jejich použití, skladování a likvidace musí splňovat požadavky ČSN pro nakládání s biohazardním materiálem. Při práci se vzorky a reagenciemi soupravy používejte nepudrované rukavice, laboratorní plášť a ochranu očí. Po skončení práce se vzorky a reagenciemi si řádně omyjte ruce. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 4 z 19

5 3. Symboly použité na štítcích Šarže Exspirace Výrobce Počet testů In vitro diagnostický medicínský prostředek Skladujte při teplotě nižší nebo rovné Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 5 z 19

6 4. Požadovaný material 4.1 Obsaženo v soupravě Konfigurace Souprava Devyser UPD-15 obsahuje reagencie pro analýzu maximálně 25 vzorků. Doporučuje se aktivovaný reakční mix ihned po namíchání rozdělit do alikvotů. Před rozplněním do zkumavek mix řádně promíchejte (viz sekce 7.1). Rozplňte po 20 μl a uložte při teplotě nižší, než 18ºC. Vyvarujte se opakovanému rozmrazování. Složky Devyser UPD-15 test kit (8-A016) Barva víčka Barva Zkumavky Štítek Katal.č. Obsah soupravy Oranžová Čirá PCR Activator 4-A018 1x25 Tests Žlutá Hnědavá Devyser UPD-15 Mix 4-A033 1x25 Tests 4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě Příprava reagencií Extrakce DNA Amplifikace Detekce Plast pro termocykler Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry pro 10 µl*, 20 μl*, µL. Nepudrované chirurgické rukavice Reagencie a přístroje dle požadavků výrobce extrakční soupravy. Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry pro 5 μl*. Termocykler Inkubátor (suchý blok), termocykler s chlazením Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI PRISM 310, 3100, 3130, 3700). Metodika je validovaná na polymerech: POP-4, POP-6 a POP-7 Gene-Scan-500 LIZ Size Standard (ABI cat. # ). Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 6 z 19

7 4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě (pokrač.) Detekce (pokrač.) Hi-Di Formamide, čistota pro genetickou analýzu (ABI kat.č ). 1x Genetic Analyzer Buffer Pipeta nebo dispenzor a špičkami s filtry pro 1,5 μl, 15 μl.* Souprava pro barevnou kalibraci: ABI3100/3130/3500/3730: Použijte DS-33 Matrix Standard Kit (Dye Set G5) (ABI cat.# ). ABI310: DS-33 Matrix Standard Set [6FAM, VIC, NED, PET, and LIZ dyes] For The ABI PRISM 310/377 Systems (ABI cat # ) *) Pipety musí mít přesnost ± 3% nastaveného objemu. Špičky s filtry se používají jako prevence vzájemné kontaminace vzorků. 5. Skladování a nakládání se soupravou A. B. C. D. Skladujte všechny komponenty při maximální teplotě -18 o C. Reakční Master Mix může být uchováván při +2 až +8 C nejméně 7 dní a pod -18 C až do data exspirace. Vyvarujte se opakovanému rozmražování. Likvidace zbytků reagencií musí být v souladu s legislativou ČR. Nemíchejte reagencie z různých šarží. 6. Požadavky na vzorek Klinické vzorky Postup a skladování Souprava Devyser UPD-15 byla vyvinuta pro použití s lidskou genomickou DNA extrahovanou z plné krve nebo z amniotické tekutiny. Dle pokynů výrobce. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 7 z 19

8 7. Návod k použití Počty vzorků v cyklu Každá souprava Devyser UPD-15 obsahuje reagencie pro 25 reakcí, které můžeme provést najednou, nebo postupně. Doporučuje se zahrnout v každé analýze netemplátovou kontrolu a pozitivní kontrolu. Abyste předešli kontaminaci, vždy zavírejte nepoužívané zkumavky. Jakékoli zkumavky, které jste nechali otevřené, vyhoďte. 7.1 Postup zpracování Devyser UPD-15 (Katal.č. 8-A016) Reakční master mixy připravte ještě před přípravou vzorků, pokud provedete celou metodu v jediném dni. Pouze pokud extrahujete vzorky předchozí den, připravte master mixy den následující. Reakční Master Mix se připraví přidáním Devyser UPD-15 Mix k PCR Activator. Devyser UPD-15 byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µl. Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům. Ze soupravy potřebujete PCR Activator, Devyser UPD-15 Mix. Prostor pro přípravu reagencií: 1. Určete počet vzorků, který budete analyzovat a připravte si příslušný počet zkumavek. 2. Stočte krátce každou zkumavku. V tomto kroku zkumavky nevortexujte! 3. Přidejte 500 μl Devyser UPD-15 Mix k jedné zkumavce PCR Activator. POZNÁMKA!>> 4. Ručně promíchejte opakovaným pipetováním ode dna zkumavky. Zvortexujte zkumavky s reakčním Master Mixem a krátce stočte. Samotné vortexování nestačí. Reakční Master Mix je stabilní při +2-8 C nejméně 7 dní 5. Napipetujte po 20 µl Reakční Master Mixy do PCR zkumavek, příp. PCR stripu nebo destičky. 6. Uzavřete zkumavky a krátce je stočte. 7. Reakční Master Mix, připravený přidáním Devyser UPD-15 Mixu k PCR Activator, může být uchováván při +2 až +8 C nejméně 7 dní a pod -18 C až do data exspirace. Vyvarujte se opakovaného rozmražování. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 8 z 19

9 7.2. Příprava vzorků a amplifikace PCR Extrakce DNA Dle návodu výrobce. Pokud chcete použít jinou izolační soupravu pro diagnostické účely, musíte tento izolační postup nejprve validovat v kombinaci se Soupravou Devyser UPD-15. Pro doporučené podmínky PCR a nastavení analýzy je vhodné používat koncentraci DNA mezi 10 a 20 ng / PCR reakci. Přidání vzorku V prostoru odděleném od prostor pro přípravu reagencií a amplifikaci a detekci. 1. Přidejte 5 μl klinického vzorku (2-4 ng/pcr) do určené PCR zkumavky. 2. Zkumavky uzavřete a krátce stočte. Amplifikace Nejméně 30 minut před amplifikací zapněte termocykler.» Pro Eppendorf Mastercycler použijte mód CNTRL TUBE» Pro GeneAmp System 9700 nastavte ramp speed na 9600 mode.» Pro MJ Research/Bio-Rad PTC200 s 96-jamkovým alpha blokem použijte funkci Calculated vial temperature a ramping mode (rychlost vyhřívání) MAX. Amplifikační prostor: Naprogramujte termocykler pro amplifikaci dle následujícího teplotního profilu (přečtěte si manuál pro podrobné informace o programování termocykleru): 95 C 15 min 94 C 30 sec; 58 C 90 sec; 72 C 90 sec for 26 cycles 72 C 30 min 4 C FOREVER 1. Nastavte reakční objem 25 µl. 2. Spusťte amplifikaci (délka cca 2 hodiny 45 minut). 3. Po amplifikaci vyjměte zkumavky s amplifikační reakcí z termocykleru, vložte je do stojánku a stočte. Opatrně sejměte víčka, abyste zabránili kontaminaci aerosolem. Amplifikovaný materiál nepřenášejte do před amplifikačních prostor. Amplifikovaný materiál musí zůstat v amplifikačním a detekčním prostoru. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 9 z 19

10 7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR (pokrač.) Prvotní denaturace 95 C 94 C 15 min 30 sec Cyklování Finální extenze 72 C 72 C 90 sec 30 min Teplota prostředí 58 C 90 sec 26 Cykly 4 C 7.3 Detekce Příprava vzorků Řiďte se manuály pro příslušný analyzátor ABI PRISM ohledně údržby a nastavení přístroje. Než spustíte analýzu s použitím soupravy Devyser UPD-15, musí být analyzátor nakalibrován na barevnou sadu G5 s příslušným polymerem. Abychom předešli nesprávnému přiřazení velikostí alel, doporučujeme analyzovat porovnávané vzorky vždy společně na genetickém analyzátoru s použitím identických podmínek (genetický analyzátor, polymer, pufr, velikostní marker a run modul). Příprava vzorku pro ABI 310/ 3100/ 3130/ 3500/ Připravte nanášecí směs smícháním 3 µl velikostního standardu (Gene-Scan-500 LIZ) s 100 µl Hi-Di Formamidu (směs stačí pro 6 jamek/zkumavek). 2. Vortexujte 15 s. 3. Do jamek mikrotitrační destičky (nebo do jednotlivých zkukmavek v případě ABI310) napipetujte po 15 μl nanášecí směsi před vložením do analyzátoru. 4. Přidejte 1,5 µl PCR amplifikátu vzorku do příslušné jamky/zkumavky s ELFO nanášecí směsí. 5. Uzavřete destičku/zkumavky. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 10 z 19

11 7.3 Detekce (pokrač.) Příprava přístroje Připravte si pracovní protokol s využitím software analyzátoru s následujícím nastavením:» Sample ID.» Zvolte velikostní standard: GS500(-250) LIZ musí být nastaven jako velikostní standard.» Dye Set: G5.» Doporučený run Module: Viz níže pro jednotlivé polymery a přístroje. Run Modules ABI 310 Run Parameters POP-4 POP-6 POP-6 Capillary length 47 cm 47 cm 50 cm Run temperature Injection voltage Injection time Run voltage ,5 Run time 40 min 65 min 5000s ABI 3100/3130 Run Parameters POP-4 POP-6 POP-7 Capillary length 36 cm 36 cm 36 cm Run temperature Injection voltage 1,2-2,5 1,2-2,5 1,2-2,5 Injection time Run voltage Run time 2000 s 3200s 1500 s ABI 3500 Run Parameters Capillary length Run temperature Injection voltage Injection time Run voltage Run time POP-7 50 cm 60 C 1,6 kv 15 s 19,5 kv 1500 s Množství PCR produktu nasátého do kapiláry může být upraveno změnou injekčního napětí a injekční doby. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 11 z 19

12 8. Výsledky a analýza Přehled markerů Devyser UPD-15 ID Markeru Poloha 1 v mapě Pozice (s. 14) Rozsah velikosti markeru (bp) 2 Barva D15S818 15q Modrá D15S643 15q Modrá D15S822 15q Modrá D15S657 15q Modrá AMEL Xp22.2 Yp X = 104 Y = 111 (+/- 2bp) Zelená D15S817 15q Zelená D13S742 13q Zelená D18S386 18q Zelená D15S816 15q Žlutá D15S659 15q Žlutá D15S q Žlutá D15S q Žlutá 1. Dle webu UCSC 2. Dle sledovaných velikostí markerů s použitím ABI3130 a POP7 a vypočítaných velikostí markerů. Můžou se vyskytnout píky markerů s velikostí mimo dané hranice. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 12 z 19

13 8. Výsledky a analýza (pokrač.) Schematická mapa chromozomu 15 Mapě Poloha 1 Name Breakpoint 1 15q11 Breakpoint q11.2 D15S817 15p13-15p11 15q11 15q12 15q12 SNURF-SNRPN 15q13 15q12 UBE3A 2 15q12 D15S q12 D15S q14 15q q12 D15S822 15q13.3 Breakpoint 3 15q q21.1 D15S q22.2 D15S643 15q q24.1 D15S q26.2 D15S q26.2 D15S657 15q25 15q26 1. Dle webu UCSC Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 13 z 19

14 8. Výsledky a analýza (pokrač.) Teorie Nejčastější příčinou Prader-Williho syndromu (PWS) nebo Angelmanova syndromu (AS) je delece v chromozomální oblasti 15q11 15q13. Kritická oblast PWS/AS je zdůrazněna šedě na schematické mapě chromozomu 15 (str. 14). Delece v oblasti 15q11 15q13 se nejčastěji vyskytují v BP1 nebo BP2, jako nejčastější centromerické zlomy a v BP3 jako nejčastější telomerické zlomy. Tato oblast obsahuje skupinu imprintovaných genů. SNURF-SNRP je příkladem paternálně exprimovaného genu, zatímco UBE3A je příkladem maternálně exprimovaného genu. Markery D15S817, D15S1513, D15S1365 a D15S822 jsou lokalizovány v oblasti 15q11 15q13 a můžou být použity pro anlýzu delecí této oblasti. Markery D15S659, D15S643, D15S818, D15S816 a D15S657 jsou lokalizovány mimo oblast 15q11 15q13 chromozomu 15 a měly by být použity pro analýzu kompletní uniparentální disomie chromozomu 15. Provádění analýzy Vzorky maternální, paternální a probanda vždy analyzujte společně. Když provádíte manuální analýzu, měly by být píky markerů v elektroforetogramu identifikovány dle rozsahů velikosti markerů (str. 13). Pozor, rozsahy velikostí markerů se mění v závislosti na polymeru, použitém v elektroforéze. Interpretace výsledků Souprava Devyser UPD-15 může být použita k diagnostice maternální nebo paternální uniparentální disomie chromozomu 15, stejně jako delece kritické oblasti PSW/AS (15q11 15q13) na maternálně nebo paternálně derivovaném chromozomu 15. K označení výsledku jako normální jsou zapotřebí nejméně dva shodné informativní markery s bi-parentálním a bi-alelickým genotypem, přičemž ostatní markery mohou být neinformativní. K označení výsledku jako abnormální (uniparentální disomie nebo delece v oblasti 15q11-15q13), musí být ve shodě alespoň dva informativní markery, ukazující na uniparentální disomii nebo deleci kritické oblasti, přičemž ostatní markery mohou být neinformativní. V analýze jsou zahrnuty tři markery, které nejsou na chromozomu 15, čímž se určí identita jednotlivých vzorků (proband, maternální, paternální). Markery D13S742 a D18S386 mohou take posloužit jako markery kontaminace maternálními buňkami, pro analýzu prenatálních vzorků. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 14 z 19

15 8. Výsledky a analýza (pokrač.) Interpretace výsledků (pokrač.) Pokud marker vykáže neprůkazné výsledky, nebo není detekován, může to mít řadu příčin: Chromozomální mosaicismus Částečná chromozomální trizomie Stutter pík A pík (rameno píku) Překryv barevného signálu mezi kanály Elektroforetické spiky Asymetrická amplifikace Kontaminace DNA: druhý genotyp, PCR amplikony Polymorfismus v oblasti nasedání primeru DNA koncentrace je příliš vysoká, nebo příliš nízká. DNA použitá v PCR je degradovaná. Submikroskopické duplikace jednotlivých markerů. Ve výjimečných případech byla zjištěna chyba amplifikace sekvence AMEL-Y (XY1-Y) kvůli mutaci v místě nasedání primeru. U markeru D15S817 byla pozorována přítomnost tří alel kvůli komplexní duplikaci regionu, kde je přítomen marker. Pokud máme nekvalitní elektroforetogramy (výrazný přesah signálu mezi kanály nebo elektroforetické spiky), neměli bychom příslušná data interpretovat. PCR produkt můžeme opakovaně nanést do analyzátoru a analyzovat znovu. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 15 z 19

16 8. Výsledky a analýza (pokrač.) Artefakty PCR Stutter píky (obr. 8.6) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jednu nebo několik repetic menší, než aktuální STR alela. Stutter píky můžeme zahrnout do do výpočtu poměru. Typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči příslušnému STR píku. Obr Stutter pík je označen šipkou. -A píky (obr. 8.7) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jeden pár bazí kratší, než PCR produkt s plnou délkou (+A pík). A píky můžeme zahrnout do výpočku poměrů. Obr A a +A píky jsou vyznačeny šipkami. +A pík -A pík Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 16 z 19

17 8. Výsledky a analýza (pokrač.) Elektroforetické/ Detekční artefakty Během detekce může dojít k přesahu signálu mezi jednotlivými detekčními kanály. Vzniklé přesahující píky musí být z analýzy vyloučeny. Obr Pík přesahující ze zeleného do modrého kanálu je označen šipkou. Elektroforetické spiky (obr. 8.9) se mohou v průběhu detekce objevit jako ostré píky přítomné v několika barevných kanálech. Píky vzniklé z elektroforetických spiků musí být z analýzy vyloučeny. Obr Elektroforetické spiky jsou orámovány. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 17 z 19

18 9. Limitace použití A. B. C. D. Použití soupravy je omezeno pro osoby vyškolené v PCR metodách. Souprava Devyser UPD-15 byla validována s použitím systému ABI GeneAmp System 9700 s tolerancí teplotního profilu ± 1 C. Pokud chcete pro klinickou diagnostiku použít jiný termocykler, je nutná validace soupravy Devyser UPD-15 pro tento cykler. Souprava Devyser UPD-15 je validována s izolačními soupravami QIAamp DNA Blood Mini Kit pro extrakci DNA z plné lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp DNA Mini Kit pro extrakci DNA z biopsií choriových klků. Další extrakční soupravy nebyly dostatečně validovány a mohou vést k falešně negativním nebo falešně pozitivním výsledkům. Devyser UPD-15 je určen pouze pro detekci uniparentální disomie chromozomu 15 (UPD-15) přesně dle návodu k použití. Souprava nebyla validována pro detekci chromozomálních aneuploidií, mosaicismu, nebo abnormalit jiných chromozomů. Výsledek získaný pomocí UPD-15 lze použít pouze pro tkáň, nebo specifický materiál, který byl testován. Kontaminace maternálními buňkami, nebo placentární mosaicismus můžou vést k odlišnému výsledku vůči jiným technikám. 10. Reference 1. Practice Guidelines for Molecular Analysis of Prader-Willi and Angelman Syndromes. Simon C Ramsden, Jill Clayton-Smith, Rachael Birch and Karin Buiting Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 18 z 19

19 11. Upozornění zákazníkům Výsledky obdržené pomocí soupravy Devyser UPD-15 musí být interpretovány s přihlédnutím k dalším laboratorním výsledkům a klinickému obrazu pacienta. Devyser AB nezodpovídá za následná klinická rozhodnutí. Koupí tohoto produktu nezískáváte licenci k provádění PCR podléhající patentům vlastněným třetí stranou. 12. Kontaktní informace Devyser AB Instrumentvägen 19 SE Hägersten SWEDEN Phone: Homepage: Technická podpora Phone: Přehled revizí Verze Kapitola 8 (výsledky a analýza), strana 15: Následující věta byla přidána do sekce vyhodnocení výsledků: Ve vyjímeèných pøípadech byla zjištìna chyba amplifikace jedné alely markeru D15S1513 kvùli pøítomnosti SNP (rs ) v místì nasedání primeru. Jun-2012 První zveřejnění. Devyser UPD-15, Návod k použití, 7-A016-CS, verze Strana 19 z 19