FastFraX TM FMR1 Sizing kit

Transkript

1 FastFraX TM FMR1 Sizing Kit Katalogové číslo: F2-050-V Manuál Pro In vitro diagnostiku Skladování: 2-8 C pro okamžité použití -20 C pro dlouhodobé skladování Chraňte před světlem

2 1. Úvod Syndrom fragilního X (FXS) je způsoben mutacemi v genu FMR1 (fragile X mental retardation 1 gene) na chromozomu X. Mutace způsobuje expanzi CGG repetic v 5 regionu (UTR-untranslated region) genu FMR1 a spolu s jejich možnou metylací má za následek umlčení genu a zastavení produkce FMR1 proteinu. Inaktivace genu FRM1 má za následek nulovou expresi FMR1 proteinu (FMRP) [1], který se dominantně vyskytuje v neuronech, kde se podílí na stabilitě, transportu a translaci mrna. FMRP má významnou roli v synaptické plasticitě a dendritickém rozvoji [2]. Umlčení FMRP má za následek manifestaci FXS, což je jedna z nejčastějších příčin dědičné mentální poruchy [3]. Na základě závažnosti mutace rozdělujeme pacienty do následujících genotypů: normální, šedá zóna, premutace a plná mutace. Typ genotypu určuje klinickou závažnost FXS [4]. Plná mutace alel s počtem repetic větším než 200 a s methylací vede klasicky k přítomnosti FXS, takto postižení jedinci vykazují kognitivní poruchy, autismus, a poruchy chování, jako je porucha pozornosti s hyperaktivitou (ADHD). Nosiči premutovaných alel ( repetic) nemají vyvinutou FXS, ale hrozí jim jiné zdravotní problémy v dospělosti, jako je s fragilním X asociovaná primární ovariální nedostatečnost (FXPOI) u žen a tremor/ataxie (FXTAS) u obou pohlaví. Důležité je, že ženy přenašečky s premutací mají riziko přenosu plné mutace na své děti. Jedinci s normálním počtem repetic (6 až 44) mají normální hladinu FMRP a jsou klinicky nepostižení. Jedince z šedé zóny (intermediate 45 až 54 repetic) najdeme v zóně mez normálními a premutovanými jedinci a jsou svázáni s repetiční instabilitou, ačkoliv asociace s fenotypovým projevem je stále nejasná. Vzhledem k rozsahu FXS-souvisejících poruch a jejich značnému vlivu, je genetické testování důležité pro potvrzení klinické diagnózy FXS a souvisejících poruch a k identifikaci nosičů expandovaných alel, kteří plánují rodinu. Interpretace FXS alelické klasifikace Velikost CGG repetice v genu FMR1 od normální po intermediate je v obecné populaci vysoce polymorfní a to v rozmezí od přibližně 5 do 50 repetic s nejvyšším výskytem repetic Aktuální guideline American College of medical Genetics [5] definují čtyři FMR1 alelické formy: i. Normální (NL), přibližně 5-44 repetic; ii. Intermediate (IM), přibližně repetic; iii. Premutace (PM), přibližně repetic; a iv. Plná mutace (FM), vice než 200 repetic. Stávající metody FXS testování CGG repetitivní oblast v genu FMR1 se obvykle detekuje analýzou Southern blot jako velká GCbohatá repetice. Standardní PCR techniky neumožňují amplifikaci nad ~ 100 repetic, což má za následek, že velké premutace a plné mutace nejsou detekovány, protože dochází k přednostní

3 amplifikaci menších alel (repetic). Navíc, ženské vzorky homozygotní pro FMR1 musí být doanalyzovány pomocí Southern blotu, aby se vyloučila možnost nezjištěné expandované alely. Southern blot analýza, na druhé straně, je pracná, časově náročná, a vyžaduje velké množství DNA. Rozlišení Southern blot analýzy je také nízké. Tyto metody jsou proto nevhodné pro rutinní testování a / nebo screening FMR1 CGG expanse u velkého množství vzorků. FastFraX TM FMR1 Sizing Kit řeší problémy pro sizing analýzu CGG repetitivního regionu genu FMR1. CGG opakování v genu FMR1 jsou amplifikována triplet-primed PCR následovanou fragmentační analýzou na kapilární elektroforéze (CE). Metodika kitu umožňuje sizování až 200 CGG repetic a detekci alel s > 200 repetic. Souprava také dává určitou informaci o umístění AGG přerušení v CGG oblasti. Použitím kitu lze take rozlišit zygositu u žen. 2. Skladování a použití Reagencie mohou být skladovány při 2-8 C v případě, že je budete okamžitě používat a při -20 C při dlouhodobém skladovaní. Před otevřením zkumavek je krátce centrifugujte, abyste odstranili kapky z víček. Přípravu reakčních mixů je možné provádět při laboratorní teplotě. 3. Použití amplifikuje CGG repetice v 5 - netranslačním regionu FMR1 a detekuje tak expanzi CGG repetic v tomto regionu. Kit se používá pro stanovení počtu CGG repetic v množství až 200 a detekci alel s > 200 repeticemi. Test využívá k určení počtu CGG repetic přímé triplet-primed polymerázové řetězové reakce (dtp-pcr) na genomové DNA, následované fragmentační analýzou na genetickém analyzátoru Applied Biosystems. Tento test je určen pro profesionální použití v klinických laboratořích, pro pomoc při diagnóze syndromu fragilního X a jiných souvisejících stavů, jako je s fragilním X vázaná primární ovariální nedostatečnost a s fragilním X související tremor / ataxie. 4. Princip testu Konvenčně se pro detekci fragilního X a počtu repetic CGG ve FMR1 genu využívá kombinace obvyklých metod PCR a southern blot analýzy. Nicméně, tento pracovní postup je nevhodný při velkém počtu rutinních testů, protože je časově náročný, nákladný a vyžaduje častý zásah uživatele. FastFraX FMR1 kit překonává tyto nevýhody pomocí vylepšení běžných metod PCR bez nutnosti provedení Southern blottingu. V sofistikované strategii detekce kitem jsou použity inovativní PCR techniky pro zvýšení citlivosti a specifičnosti a zároveň se snižuje celkové zatížení a náklady. FastFraX FMR1 Sizing Kit poskytuje test k určení počtu CGG repetic uvnitř repetitivní oblasti CGG genu FMR1, a také k určení polohy AGG přerušení v rámci CGG repetitivní oblasti jak pro mužské tak i pro ženské vzorky. POZNÁMKA: Jako screeningový test doporučujeme použít FastFraX FMR1 Identification Kit, který poskytuje efektivnější přístup k rutinnímu testování expandovaných FMR1 alel. Jako konfirmační test lze použít Fastrax FMR1 Methylation kit, který poskytuje další informace, včetně velikosti repetice a methylačního statusu u mužských a ženských vzorků.

4 FastFraX TM Sizing kit využívá dtp-pcr a CE pro sizovaní FMR1 alel FastFraX FMR1 Sizing Kit využívá dtp-pcr, která zahrnuje kombinaci amplifikací primovaných zevnitř opakování CGG. Sady použitých primerů jsou navrženy tak, aby amplifikovaly od 3 'konce repetitivní oblasti CGG nemodifikované genomové DNA. Po amplifikaci jsou nepurifikované PCR amplikony denaturovány přídavkem Hi-Di formamidu a sizovány za použití kapilární elektroforézy společně s ROX 1000 size standardem. Amplikony jsou sizovány na libovolném Applied Biosystems genetickém analyzátoru s POP-7 polymerem. U expandovaných alel lze pozorovat elektroferogram mnoha píků, které odpovídají počtu CGG repetic přítomným ve vzorku. Vzhledem k tripletovému opakování CGG v repetitivní oblasti jsou amplifikační píky v elektroforeogramu od sebe periodicky vzdáleny 3-páry bází (obr. 1). Spočítáním píků lze určit počet CGG repetic (viz oddíl 9: Analýza dat). Ženský vzorek s plnou mutací (GM07537) 29 (9+9+9)/>200rpts Obrázek 1. Amplifikační píky získané kapilární elektroforézou pro dtp-pcr. Píky vykazují periodicitu po 3-párech bází. Elektroferogramy získané kapilární elektroforézou rovněž ukazují kontinuitu CGG repetic v regionu. Přítomnost vložené AGG sekvence v CGG repetitivním regionu vede k produkci klastrů píku oddělených mezerami bez produktu amplifikace. Kromě toho lze identifikovat ženskou zygositu z profilu píků. Použití kontrol v každém runu Doporučujeme přidání pozitivní a negativní kontroly do každého runu pro zajištění integrity reagencií a genetického analyzátoru. Negativní netemplátová kontrola obsahuje všechny reagencie vyjma genomové DNA. Jako pozitivní kontrolu doporučujeme použít ženský vzorek s plnou mutací (viz sekce 5: Materiál)

5 5. Materiál Reagencie, které jsou součástí kitu (5 zkumavek) Tabulka 1. Reagenci dodané v kitu. Katalogové číslo. Komponenta Počet zkumavek Objem F2-PRI-01 Sizing Primer Mix 1 50 µl F2-PCR-02 Sizing PCR Mix A µl FX-PCRB-02 Sizing PCR Mix B µl FX-TAQ-02 Taq Polymerase 1 50 µl FX-TAQP-01 Taq Plus 1 50 µl Počet reakcí - Množství reagencií dodaných v kitu je dostatečné pro více než 50 reakcí. - Doporučujeme připravovat master mixy pro přesný počet vzorků v runu. Doporučené pozitivní kontroly (Nejsou součástí kitu) - Ženský vzorek s plnou mutací (NA07537 z Coriell Cell Repositories) Další reagencie (Nejsou součástí kitu) - Reagencie pro izolaci genomové DNA - Nuclease-free voda Materiál pro kapilární elektroforézu (Není součástí kitu) - Genetický analyzátor Applied Biosystems s 50 cm kapilárou, POP7 polymerem pro ABI 3130xl, 3730xl nebo 3500 kalibrované na DS-30, DS-31, DS-33 nebo DS-40 dyeset. POZNÁMKA: Dyeset musí být zvolen tak, aby byl vhodný pro použitý size standard. - Pro ABI 3730xl: 96-well Plate Septa, Plate Reatiner (septa seal) a Plate Base (septa seal), Applied Biosystems # , # , # POZNÁMKA: Používejte vhodný spotřební materiál pro každý ABI genetický analyzátor dle doporučení výrobce. - Hi-Di TM Formamide: Applied Biosystems, # nebo ekvivalentní. - MapMarker 1000-ROX: Bioventures, #MM-1000-ROX. Mohou být použity i ostatní ROX nebo LIZ-značené size standardy s velikostí až do 1000 bp, pokud splňují denaturační podmínky kitu. (Nelze použít GeneScan TM 1200 LIZ ). Ostatní potřebný spotřební materiál a vybavení (není součástí kitu) - Minicentrifuga (1,5-2 ml zkumavky) - Mikrocentrifuga (0,2 ml zkumavky) - Vortex - Thermal cycler: BioRad C1000 TM Thermal Cycler s 96well modulem nebo ekvivaletní. - Pipety s přesností mezi 0,2 2 µl, 1-10 µl, 2-20 µl, µl a µl. - PCR zkumavky a víčka.

6 6. Varování a bezpečnostní opatření FastFraX TM Sizing kit je míněn jako sizovací test a nemůže být použit pro potvrzení velikosti opakování FMR1 genu nebo samostatně pro klinickou diagnózu. Osoba provádějící test musí být vyškolena v používání PCR a kapilární elektroforézy. Všechny použité a nepoužité reagencie je nutné likvidovat v souladu s místními předpisy o chemické bezpečnosti, s biologické bezpečnosti a předpisy na ochranu životního prostředí. Všechny vzorky DNA by měly být považovány za potenciálně nebezpečné. Při práci by se měly používat ochranné prostředky. Vyvarujte se rozlití a kontaktu s pokožkou. Dezinfikujte pomocí 10% bělidla nebo 70% alkoholu, pokud je třeba. Řezy a rány musí být chráněny. Ruce musí důkladně být umyty před a po použití kitu a vzorků. Nepoužívejte prošlé reagencie. Nemíchejte reagencie z různých kitů a šarží. Ujistěte se, že použité vybavení je kalibrováno a používáno v souladu s doporučením výrobce. Zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování kitu. Ujistěte se, že jsou reagencie skladovány v temnotě. Po otevření má kit trvanlivost 3 měsíce, pokud je skladován při -20 C. 7. Příprava vzorku Izolace DNA Genomová DNA izolovaná z plné krve (v EDTA) běžnými izolačními metodami je kompatibilní s kitem FastFraX TM FMR1 Sizing. Po izolaci a přečištění (pokud je nutné) změřte koncentraci genomové DNA a její čistotu (OD 260/280) a skladujte při -20 C pokud není použita ihned. 8. protokol protokol sestává z dvou klíčových kroků: I. dtp-pcr; a II. kapilární elektroforézy Následující pokyny jsou psány pro jedinou reakci; pro více reakcí se doporučuje příprava master mixu. Reakční činidla dodaná v kitu jsou dostatečná pro až 50 reakcí. Vzhledem k pravděpodobnosti kontaminace preamplifikačních reagencií PCR amplikony, se doporučuje jednosměrný workflow. Příprava master mixu (před částí I, krok 6) by měla být provedena v oblasti oddělené od post-amplifikačních prostor pro zpracování vzorků (po části I, krok 6). Vybavení použité v post-amplifikačních prostorách zpracování vzorků by se nemělo používat v preamplifikačním prostoru, aby se minimalizovala kontaminace amplikonem. Pro každý run použijte dvě kontroly: - ženský vzorek s plnou mutací jako pozitivní kontrola (viz sekce 5: Materiál) a - netemplátová negativní kontrola (NTC).

7 ČÁST I. příprava dtp-pcr 1. Nechte všechny reagencie (kromě Taq a Taq Plus) rozmrznout při laboratorní teplotě. Taq a Taq Plus uchovávejte na ledu. Lehce vortexujte (kromě Taq a Taq Plus) a centrifugujte zkumavky před otevřením. 2. Pro každý vzorek připravte dtp-pcr mix v PCR zkumavce dle složení uvedeného v tabulce 2. Test může být proveden v PCR stripech, PCR zkumavkách nebo 96-well destičce. Tabulka 2. příprava dtp-pcr. Reagencie Objem pro jednu reakci (µl)* Sizing Primer Mix 1,0 Sizing PCR Mix A 2,5 Sizing PCR Mix B 7,5 Taq Polymerase 1,0 Taq Plus 1,0 DNA templát (100 ng) Nuclease-free voda X 2,0-X Celkový objem 15,0 *POZNÁMKA: Příprava master mixu je doporučena pro analýzu více vzorků. Master mix obsahuje všechny reagencie kromě DNA templátu. 3. Ujistěte se, že jsou zkumavky pevně uzavřeny. 4. Promíchejte zkumavky. 5. Centrifugujte zkumavky nebo destičku. 6. Přeneste uzavřené zkumavky nebo zalepenou destičku do BioRad C1000 TM Thermal Cycleru nebo ekvivalentního cycleru a spusťte run dle programu uvedeného v tabulce 3. Tabulka 3. program dtp-pcr amplifikace. Teplota Čas Počet cyklů 95 C 15 min 1 99 C 45 sec 55 C 45 sec 70 C 8 min + přídavek 15 sec/cyklus* 72 C 10 min 1 11 C End 1 *POZNÁMKA: Přídavek 15 sec/cyklus znamená 8 min v první cyklu, 8 min 15 sec v druhém cyklu, 8 min 30 sec v třetím cyklu a tak dále. 40

8 7. Přeneste PCR produkty pro kapilární elektroforézu do ledničky (4 C) a chraňte je před světlem do doby než je budete analyzovat*. *POZNÁMKA: Proveďte analýzu na kapilární elektroforéze co nejdříve po PCR reakci, abyste minimalizovali degradaci PCR produktů. ČÁST II. kapilární elektroforéza (s polymerem POP-7) 1. Nechte rozmrznout Hi-Di TM Formamide a MapMarker 1000-ROX pro laboratorní teplotě. Lehce vortexujte a centrifugujte před otevřením zkumavek. 2. Připravte následující mix do jednotlivých zkumavek 96-well destičky pro kapilární elektroforézu dle složení v tabulce 4. Ujistěte se, že jsou vzorky dobře promíchány propipetováním ode dna 2-3x. Vzorky napipetujte do jamek dle pořadí uvedeného v programu genetického analyzátoru. Pokud je počet vzorků nižší než je počet kapilár, napipetujte do prázdných jamek 13,5 µl Hi-Di TM Formamidu. Tabulka 4. Mix pro Post-PCR analýzu. Reagencie Objem pro jednu reakci (µl)* PCR produkt 1,0 Hi-Di TM Formamide 9,0 MapMarker 1000-ROX** 0,5*** Celkový objem 13,5 *POZNÁMKA: Příprava master mixu je doporučena pro analýzu více vzorků. Master mix obsahuje všechny reagencie kromě PCR produktu. **POZNÁMKA: Je možné použít i jiné ROX nebo LIZ-značené size standardy o velikosti alespoň 1000 bp místo MapMarkeru 1000-ROX, ale pouze pokud fungují za stejných denaturačních podmínek. Pokud je použit LIZ-značený size standard, přístroj musí být kalibrován na DS-33 nebo DS-40 dyeset. ***POZNÁMKA: Použijte objem size standardu dle doporučení výrobce. Pro příklad, pokud je doporučený objem size standardu menší než 0,5 µl, snižte objem Hi-Di TM Formamidu tak, aby výsledný objem byl stejný (13,5 µl). 3. Uzavřete destičku septem a poklepáním odstraňte případné bubliny. Centrifugujte destičku a vložte ji do cycleru. 4. Denaturujte vzorky 5 minut při 95 C**** a poté chlaďte na 4 C dokud nejste připravení na vložení destičky do genetického analyzátoru. Doporučujeme analyzovat vzorky do 24 hodin pro optimální výsledky. ****POZNÁMKA: Při spuštění denaturačního programu u septem uzavřené 96-well destičky v termocykleru, nezavírejte vyhřívané víko termocykleru, jinak dojde k roztavení septa.

9 5. Nastavte genetický analyzátor dle doporučení výrobce. Ujistěte se, že je přístroj kalibrován pro (1) FAM; a (2) ROX nebo LIZ fluorescenční barvy, v závislosti na tom, jaký použijete size standard (tabulka 5). Tabulka 5. Dye sety Applied Biosystems použitelní pro různé size standardy. Barva size standardu Dye Set Filter Set ROX (včetně MapMarker 1000-ROX) LIZ DS-30 DS-31 DS-33 DS-40 D D G5 S 6. Použijte základní protokol Fragment Analysis POP-7 a příslušná délka kapiláry jako základní protokol, upravte injection time a voltage a run time dle doporučených parametrů pro různé přístroje v tabulce 6. Tabulka 5. Dye sety Applied Biosystems použitelní pro různé size standardy. Přístroj Délka kapiláry Injection Run Voltage, Time 3130xl 36 cm 1,2 kv, 18 sec 3730xl 50 cm 1,5 kv, 18 sec cm 1,5 kv, 18 sec 15 kv, 3000 sec 15 kv, 3000 sec 15 kv, 3000 sec a. Pro jiné přístroje, které zde nejsou uvedeny, se mohou optimální parametry kapilární elektroforézy lišit a musí být uživatelem zvalidovány. 7. Po CE mohou být data analyzována na počet CGG repetic. 9. Analýza dat Analýza dat může být provedena s použitím následujícího schématu (obrázek 2). Detailní instrukce pro každý krok analýzy je vyznačen ve schématu. Příprava dtp-pcr/ce Viz sekce 8 Generování CE profilů Viz sekce 9, část I Kontrola Size standardu Viz sekce 9, část II, krok 1a Kontrola CE profilů kontrol Viz sekce 9, část II, krok 1b/c

10 Analýza CE profilů vzorků Určení Prvního píku Viz sekce 9, část II, krok 2a Odhad rozpětí velikostí Viz sekce 9, část II, krok 2b ~ 300 bp Normální nebo intermediate bp Premutace > 450 bp Velká Premutace nebo Plná mutace Určení Posledního píku Viz tabulka 7a Viz tabulka 7b Viz tabulka 7C Určení přesného počtu repetic viz sekce 9, část II, krok 3 Muž Žena Určení zygosity Viz tabulka 8 ČÁST I.Parametry pro analýzu dat Interpretace výsledků Viz sekce 10 Obrázek 2. Data interpretační schéma pro analýzu výsledků Výsledky kapilární elektroforézy (CE) z genetických analyzátorů ABI 3130xl a 3730xl mohou být analyzovány s použitím softwaru Peak Scanner TM 2 nebo GeneMapper. Software Peak Scanner TM 2 lze zdarma stáhnout z webu Life Technologies. CE výsledky z genetického analyzátoru ABI 3500 mohou být analyzovány softwarem GeneMapper. Analýza softwarem Peak Scanner TM 2 je popsána zde. 1. Vytvořte nový projekt a přidejte vzorky (sample results files.fsa) do nového projektu použitím Add Files. 2. Pod Resources v levém panelu vytvořte New Size standard s použitím velikostí standardu MapMarker 1000-ROX:

11 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 a Barva: Red Uložte nově vytvořený Size Standard jako MM POZNÁMKA: Pokud byl použit jiný Size standard, vytvořte příslušný Size standard s příslušnými velikostmi a barvou dle doporučení výrobce. 3. Pod Resources v levém panelu vytvořte New Analysis Method s použitím defaultní metody a následujícími modifikacemi: a. Peak Detection > Minimum peak heights > Peak treshold pro Blue a Red nastavte na 10. b. Quality flags > Sizing quality > Low quality range > 0,0 to 0,05. c. Quality flags > Sizing quality > Pass range > 0,06 to 1,0. Uložte nově vytvořenou Analysis Method jako FastFraX Analysis. POZNÁMKA: Pokud byl použit LIZ značený size standard, nastavte Peak treshold pro Blue a Orange na Pro každý vzorek vyberte MapMarker 1000-ROX MM-1000 a Analysis Method FastFraX Analysis. 5. Stiskněte tlačítko Analysis. 6. Při analýze dat vzorku vypněte zelenou, žlutou a oranžovou barvu, protože signál budou přítomny pouze v modré (FAM) a červené (ROX). POZNÁMKA: Pokud byl použit LIZ značený size standard, signál bude přítomen v modré (FAM) a oranžové (LIZ). 7. Prohlédněte píky v rozmezí od bp. Rozmezí může být specifikováno v Plot Settings. ČÁST II. Pokyny pro analýzu dat 1. Kvalifikace platnost runu a. Kontrola píků ROX size standardu. MapMarker 1000-ROX produkuje charakteristické píky s konkrétní velikostí (dle obrázku 3). Nesrovnalosti v intervalu mezi píky těchto standardních velikostí budou mít vliv na analýzu. Vzorky s nestandardními píky size standardu (například, píky se nezobrazují v očekávané velikosti párů bází), musí být z další analýzy vyloučeny. b. Kontrola negativní kontroly. Ujistěte se, že není přítomen žádný signál v modré (FAM) barvě (dle obrázku 3).

12 Obrázek 3. Typický profil netemplátové negativní kontroly. c. Kontrola pozitivní kontroly (žena s plnou mutací). Ujistěte se, že pozitivní kontrola splňuje následující parametry: - shluky píků normální alely jsou dobře identifikovatelné oproti pozadí expandované alely (dle obrázku 4a a 4b); a - kontinuální profil píků plné mutace pokračuje až za 200 repetic (dle obrázku 4c), tj. pokračuje až za červený pík size standardu o velikosti 715 bp. Obrázek 4a. Typický profil NA07537.

13 Obrázek 4b. Zvětšená oblast ukazující shluky píků kratší alely (modře vyplněné) s označením prvního píku pro analýzu. První pík má velikost přibližně 140 bp a odpovídá 5 repeticím. Obrázek 4c. Zvětšená oblast kontinuálního profilu delší alely s označením posledního píku a píku odpovídajícího 200 repeticím (modře vyplněné). 2. Určení prvního a posledního píku pro analýzu a. Určení prvního píku. Píky jsou zobrazeny s periodicitou přibližně 3 bp. První vysoký pík by měl být zobrazen okolo 140 bp; tento pík odpovídá amplikonu s 5 CGG repeticemi (dle obrázku 4b). Počítáním následujících píku dojdeme k celkovému počtu CGG repetic.

14 b. Odhad rozmezí velikostí CE profilu. MapMarker 1000-ROX obsahuje píky s velikostí 300 bp a 450 bp. S použitím těchto píků lze určit, do které z níže uvedených rozmezí velikostí CE profil patři (Obrázek 5). Toto bude mít vliv na stanovení posledního píku pro analýzu ~300 bp Normální nebo intermediate alely (5 54 repetic) bp Malá premutace (55 - ~110 repetic) > 450 bp Velké premutace a plné mutace (~110 - > 200 repetic) Obrázek 5. Typické CE profily různých rozmezí délek. Rozmezí délek CE profilu se prodlužuje s množstvím repetic. Pík odpovídající 200 repeticím najdeme v blízkosti červeného píku 715 bp.

15 c. Určení posledního píku jak pro mužské, tak i pro ženské vzorky a jeho zahrnutí do analýzy. Poslední pík, který je zahrnut do analýzy, lze určit dle jeho morfologie a signálu vzhledem k sousedním píkům. Tabulka 7 uvádí pokyny pro stanovení posledního píku, který mají být zahrnut do analýzy, v závislosti na rozsahu velikostí CE profilů. Tabulka 7. Stanovení posledního píku pro analýzu pro jak mužské, tak i ženské vzorky. Do rozhodnutí o posledním píku je zahrnut pokles signálu a morfologie píku u různých typů profilů. Velikostní CE profil Zvětšení posledního píku rozmezí a) ~300bp Normální a intermediání alely Zaměřte se na pík shluku nejvíce vpravo. V rámci tohoto shluku píků, vyberte nejvyšší pík vpravo těsně předtím, než se signál výrazně snižuje. Poslední pík CE profilu a poslední pík v každém shluku jsou stanoveny podobně. Poslední pík CE profilu by měl být vyšší než falešné píky předcházející před shluky (viz sekce 11: Další informace týkající se AGG přerušení) b) bp Premutace Pro premutace s dobře definovaným rozmezím píků, vyberte nejvyšší pík vpravo těsně předtím, než se signál významně snižuje na úroveň pozadí. POZNÁMKA: Za posledním píkem by už neměly být žádné další píky. Přítomnost malých píku po poklesu signálu může indikovat přítomnost více alel ve vzorku (mozaiky). Viz sekce 12: atypické profily jako příklad takových profilů.

16 c) > 450 bp Velká premutace nebo plná mutace Pro velké premutace a plné mutace s amplifikovanými píky, které vykazují postupný pokles spíše než výrazný pokles signálu je určení posledního píku založeno na morfologii píku. Poslední pík má definovaný tvar (viz výše ve schématu). Na levé části od posledního píku (zelená oblast) jsou bílé plochy pod píkem jasně viditelné. Naproti tomu, vrcholy vpravo od posledního píku (vyplněného modře) mají bílé oblasti špatně definovatelné (oranžová plocha). Signál vpravo od posledního píku je snížen na úroveň pozadí (přibližně indikováno červeně čárkovaně). Obecně platí, že poslední pík má výšku signálu nižší než 40 RFU. Poslední pík u vzorků s profily s délkou více než ~ 650 bp může být nízký (10 RFU), ale je platný jen pokud má dobře definovaný tvar. Jako doporučení lze říci, že profily přesahující 600 bp mohou být analyzovány pomocí následujícícch parametrů: osa x: 600 bp 850 bp osa y: RFU

17 d. Určení posledního píku druhé (kratší) alely u ženských vzorků. Píky kratší alely by se měli analyzovat až po dokončení analýzy delší alely. Typicky jsou píky kratší alely u heterozygotních ženských vzorků výrazně vyšší než zbytek CE profilu. Proto, analýzou těchto vyšších píku dostaneme počet repetic kratší alely. Tabulka 8 ukazuje způsob identifikace počtu repetic kratší alely u žen v závislosti na genotypu nebo rozmezí CE profilu. Tabulka 8. Stanovení posledního píku kratší alely u žen. Výška píku a pokles signálu jsou vzaty v potaz u různých profilů. Velikostní rozmezí a) ~300bp Normální a intermediální alely CE profil Zvětšení posledního píku V případě, že má ženský vzorek CE profil podobný CE profilu normálního muže (viz výše, vlevo), jedná se o homozygotní ženu. Homozygotní žena může mít: (1) stejný počet repetic u obou alel (např. 29/29 RPT); nebo (2) rozdíl jedné repetice mezi těmito dvěma alelami (např. 29/28) RPT. Ženský vzorek s CE profilem obsahujícím shluky píků s různou výškou patří heterozygotní ženě. Ve výše uvedeném příkladu, jsou první tři shluky vyšší než je výška signálu u čtvrtého shluku. Tento vyšší signál je důsledkem příspěvku jak kratší tak i delší alely. To znamená, že poslední pík třetího shluku je posledním píkem pro kratší alelu. Za tímto píkem následuje výrazný pokles hodnot výšek a poté čtvrtý shluk. Píky čtvrtého shluku mají významně nižší signál než předchozí tři shluky a je generován pouze větší alelou. Poslední pík čtvrtého shluku je posledním píkem delší alely.

18 POZNÁMKY: - U některých normálních žen může mít poslední pík shluku viditelně, ale ne drasticky nižší signál než předcházející shluky (~ 60% v výšky signálu). Tyto ženy mohou být homozygotní. - Některé heterozygotní normální ženy mohou mít CE profily, které je složitější analyzovat, vzhledem k odlišným vzorům opakovaní u dvou alel (viz sekce 11: Další informace o AGG Přerušení a sekce 12: atypické profily). b) 140 > ~300 bp Premutace a plná mutace Ženy s premutací a plnou mutací jsou obvykle heterozygotní, s jednou expandovanou alelou a druhou typicky buď normální nebo intermediální alelou. Menší alela přispívá k shluků píky s vyššími signály, které se střídají v kontinuálním profilu delší, expandované alely. U takových uskupení, vyberte nejvyšší pík vpravo těsně předtím, než se signál významně snižuje a to je poslední pík menších alely. 3. Určení počtu CGG repetic a. Počítání píků. Jakmile je určen první a poslední pík, lze manuálně spočítat počet píků mezi nimi a tento počet odpovídá počtu CGG repetic. První pík odpovídá 5 CGG repeticím. Počet CGG repetic = Počet píků (5 x počet 18 bp mezer) Příklad, CE profil s nepřerušovaným úsekem 16 píků bez 18 bp mezer indikuje alelu s počtem repetic 20. CE profil s třemi shluky po pěti pících v každém shluku, přerušený dvěma mezerami odpovídajícími 18 bp, indikuje alelu s počtem repetic 29. Další instrukce k určení počtu repetic najdete v sekci 11: Další informace o AGG přerušeních.

19 b. Výpočet s použitím vzdálenost mezi píky (v párech bází). Vzhledem k ~ 3 bp periodicitě amplifikačních píků, lze počet CGG repetic vypočítat a aproximovat pomocí vzdálenosti (v párech bází), mezi prvním a posledním píkem. Vzorec je následující: Pík F Pík 1 Počet CGG repetic = ,95 kde Pík F je velikost posledního píku v párech bází a Pík 1 je velikost prvního píku v párech bází. 2,95 je použito místo 3,0 kvůli zkreslení elektroforetické mobility GC bohatých PCR produktů. Použití 2,95 je specifické pro přístroj, jeho konfiguraci a použitý size standard a bylo verifikováno tak, aby dalo přesnost počtu repetic (± 1 repetice) až do 200 repetic při použití následujících kombinací: Přístroj Polymer Délka kapiláry Size standard 3130xl POP-7 36 cm BioVentures MapMarker 1000-ROX 3730xl POP-7 50 cm BioVentures MapMarker 1000-ROX 3500 POP-7 50 cm BioVentures MapMarker 1000-ROX *POZNÁMKA: Pro přesnější sizování alel s více než 200 repeticemi použijte počítání píků místo výpočtu vzdálenosti mezi píky. *POZNÁMKA: Alely s posledním píkem stanoveným jako > 200 repetic a za červeným píkem 715 bp se klasifikují jako alely s >200 repeticemi. 10. Interpretace dat Počet CGG repetic pro FMR1 alely může být určen pro 5 až 200 CGG repetic. Všechny alely s více než 200 CGG repeticemi jsou klasifikovány jako > 200 repetic. U vzorků s více FMR1 alelami je možné reportovat rozsah CGG repetic u obou alel. Vzorky pacientů mohou být zařazeny do jedné ze čtyř FMR1 alelických tříd na základě velikosti CGG repetice a struktury CE profilu píků (viz tabulka 9).

20 Klasifikace alely Normální (NL) a Intermediální (IM) Počet repetic Vzorek AGG přerušení Vzorový CE profil 5-54 Muž Obvykle jsou přítomny Malé shluky píků jedna nebo dvě přerušení. Mohou však být přítomny až čtyři přerušení. Žena Obvykle jsou přítomny jedna nebo dvě přerušení. Mohou však být přítomny až čtyři přerušení. Malé shluky píků.

21 Premutace (PM) Muž Přerušení jsou nebo nejsou přítomna. Kontinuální žebřík píků, které mohou být a nemusí být separovány do shluků. Žena Přerušení jsou obvykle přítomna u kratší alely. U delší alely jsou anebo nejsou přerušení přítomna. Shluky píků s vysokým signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků. Žebřík píků může, ale nemusí být rozdělen do shluků.

22 Premutace (PM) Muž Přerušení obvykle nejsou přítomna. Kontinuální žebřík píků. Žena Přerušení jsou obvykle přítomna u krátké alely, ale ne u dlouhé alely. Shluky píků s vyšším signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků.

23 Plná mutace > 200 Muž Přerušení nejsou přítomna. Kontinuální žebřík píků pokračující až za 200 repetic (přibližně okolo 715 bp). Žena Přerušení jsou přítomna u krátké alely, ale ne u dlouhé alely. Shluky píků s vyšším signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků, který pokračuje až za 200 repetic (přibližně okolo 715 bp).

24 11. Další informace k AGG přerušením CE profily CGG repetitivní oblasti FMR1 obsahují často shluky píků, které jsou odděleny mezerami. Tyto mezery mezi shluky naznačují přítomnost AGG přerušení v rámci CGG repetic. Přítomnost AGG přerušení se vyznačuje významným poklesem signálu, za nímž následuje obnovení CGG signálu po 18 bp (nebo ekvivalentu 6 CGG píků). Vzhledem k tomu, primery amplifikují z 3 'konce repetitivní oblasti CGG, 5' 3 'repetitivní patern lze číst zprava doleva profilu. Tabulka 10 udává, jak mohou být AGG přerušení identifikována z CE profilů. Tabulka 10. Pozice AGG přerušení je indikována mezerami mezi shluky. Pozice AGG přerušení je označena +. Genotyp CE profil Zvětšení shluků Normální a intermediální muž Homozygótní normální a intermediální žena Přítomnost jednoho AGG přerušení bude mít za následek mezeru mezi shluky píků. Určení posledního píku v každém shluku s použitím tabulky 6. První pík následného shluku je ~ 18 bp (nebo 6 píků v intervalu) vzdálen od posledního píku předchozího shluku. Ve výše uvedeném příkladu běžného vzorku je počet opakování vypočtený pomocí následujícího vzorce pro každý pík shluku: Počet CGG repetic = Počet píků + 4 charakterizován jako (9 píků pro každý shluk). Po každém AGG přerušení se započítává 1 opakování. Profil výše (obsahuje 2 AGG přerušení) má tedy celkem 29 opakování. POZNÁMKA: Heterozygotní normální a intermediální ženské vzorky mohou mít CE profily, které jsou složitější analyzovat. Takové případy jsou uvedeny v sekci 12: Atypické Profily.

25 Premutace muž; premutace žena U premutací, dojde AGG přerušením ke vzniku mezery v rámci profilu píků. K určení posledního píku v každém shluku použijte tabulku 6. První pík následného shluku je ~ 18 bp (nebo 6 píků v intervalu) vzdálen od posledního píku předchozího shluku. Ve výše uvedeném příkladu vzorku premutace mužského vzorku je CGG repetitivní oblast spojitá pro 82 repetic poté vykazuje značný pokles signálu, což naznačuje přítomnost AGG přerušení. První pík následujícího shluku je určen spočítáním 6 píkového intervalu od posledního píku předchozího shluku. Počet CGG opakování je z 5 'konce (shluk s deseti repeticemi a AGG přerušení je na 5' konci repetitivní CGG oblasti). Žena; Premutace a plná mutace Zygocitu lze vyřešit pro ženy s dvěma alelami. Shluky píků (PC), které jsou promíchány s kontinuálním profilem, ukazují na přítomnost dvou alel s různými CGG repeticemi. Velikost delší alely může být určena spočítáním počtu píků mezi prvním a posledním píkem profilu. Ve výše uvedeném příkladu premutace ženy, má delší alela 122 repetic. Shluky píků jsou snadno identifikovatelné vzhledem k jejich zvýšené signálu. Mezery mezi vysokými shluky ukazují na přítomnost AGG přerušení uvnitř CGG repetitivní oblasti. K určení posledního píku v každém shluku lze použít tabulku 6. První pík následujícího shluku je určen spočítáním 6 píkového intervalu od posledního píku předchozího shluku. Ve výše uvedeném příkladu, je kratší alela charakterizována jako (2 AGG přerušení do 29 repeticích). Dohromady je počet CGG repetic v tomto vzorku 29 ( ) / 122 pro obě alely.

26 12. Atypické profily Heterozygotní normální nebo intermediální ženské vzorky mohou generovat atypické CE profily, které představují složitost a nejistotu při analýze dat. Příklady takových případů, a některé pokyny pro analýzu jsou uvedeny v tabulce 11. Tabulka 11. Příklady atypických CE profilů, které mohou způsobit komplikace při analýze dat. Problém Výrazné opakující se vzory u více alel Typický CE profil U některých heterozygotních normálních a intermediálních ženských alel, se může CE profil jevit složitější pro analýzu v důsledku odlišných opakujících se vzorů dvou alel. Jako obecné vodítko: shluky píků s vyššími signály naznačují příspěvek dvou alel. Díky analýze změny výšky signálu, a lokalizaci pozice AGG přerušení 18 bp nebo intervalu 6 píků je možné opakované vzory dvou alel rozlišit. Pro profil vzorku výše je větší alela charakterizována jako 29 repetic ( ), a kratší alela je charakterizována jako 23 repetic(13 + 9).

27 Mnohočetný CGG patern v jednom CE profilu Pro některé CE profily lze odvodit více závěrů. Například, možné vzory repetic pro ženské vzorek jsou: Možnost 1 Delší alela: 36, Kratší alela: 29,

28 Možnost 2 Delší alela: 36, Kratší alela: 29, Neidentifikovatelný počet repetic a AGG přerušení u kratší alely To znamená, že vzorek je označen jako mající větší alelu 36 repetic a menší alelu 29 repetic, s možným větším počtem opakovacích paternů. Celosvětově nejčastější jsou opakovací paterny, které obsahují shluky 9 nebo 10 CGG repetic, a proto je možnost 2 pravděpodobnějším genotypem. U většiny ženských heterozygotních vzorků lze kratší alelu identifikovat po stanovení repetic větší alely. Nicméně, u některých normálních ženských vzorků je patrné kolísání výšky signálu, což má za následek nemožnost identifikace vyšších píků kratší alely. Takové vzorky také typicky dělají potíže při identifikaci AGG přerušení. V příkladu níže je možné poslední pík delší alely (zvýrazněno) identifikovat. Nicméně, opakování vzoru u AGG přerušení, jakož i poslední pík kratší alely nelze určit.

29 Mosaicismus Počet CGG repetic u premutace může být obvykle identifikován výrazným poklesem výšky signálu po poslední pík. Nicméně mnoho vzorků s FMR1 expanzemi (premutace a plné mutace) jsou velikostní mozaiky a může obsahovat více alel různých velikostí CGG repetic. Tyto vzorky mohou mít nízké píky po počátečním poklesu signálu. Níže uvedený vzorek má alespoň dvě alely s 30 a 74 CGG repeticemi. Avšak přetrvávání nízkých píků po píku odpovídajícímu 74-RPT naznačuje, že tento vzorek může mít větší třetí alelu v nízkém množství. Tato třetí alela obsahuje alespoň 108 CGG repetic.

30 13. Parametry kitu Přesnost sizování Studie pro určení přesnosti byla provedena na 11 reprezentativních vzorcích genomové DNA z Coriell Cell Repositories, které byly předtím charakterizovány na počet repetic v genu FMR1 s použitím stávajících metod, jako je například Southern blot nebo flanking PCR. Počet repetic každého vzorku pak byl stanoven prostřednictvím spočítání píků a aproximace pomocí vzdálenost mezi píky. Výsledky studie ukázaly, že souprava má vynikající výkon a všechny získané genotypy vzorků souhlasily s referenčními genotypy, které poskytly Coriell Cell Repositories. Přesnost sizování byla hodnocena pomocí dat z Coriell referenčních vzorků s dostupnými informacemi [11]. FastFraX TM FMR1 Sizing Kit udává počet repetic s přesností: Tabulka 12. Souhrn přesnosti sizování vzorků s různými FMR1 genotypy. Přesnost sizingu nebyla hodnocena pro vzorky s plnou mutací, protože kit je určen pro detekci a ne pro sizování takových vzorků. Referenční genotyp NL a IM PN (< 110 repetic] PM ( 110 repetic) FM (> 200 repetic) Přesnost sizování 1 repetice 3 repetice 3 repetice N/A (výsledek je reportován jako > 200 repetic) Analytická sensitivita a specifita Pro analytickou citlivost, byla mez detekce ověřena pomocí řady množství DNA. Limit detekce pro plnou mutaci je 25 ng genomové DNA. Doporučené množství DNA na test je 100 ng, což umožňuje sizování obou alel u ženských vzorků. Citlivost soupravy na detekci mosaicismu byla hodnocena pomocí simulovaných mozaikových vzorků s rozdsahem mosaicismu. Pro NL / PM mozaiky, byla PM alela přesně sizována až na 5% hladině mozaicismu. U 2,5% mosaicismu, byla PM alela správně rozpoznána jako PM. Mez detekce plné mutace alely byla 10% pro NL / FM mozaiky a 20% u PM / FM mozaiky. Souprava je schopna detekovat veškeré mutace alel, velké PM u 2,5% pro NL / FM mozaiky a 5% pro PM / FM mozaiky. Pro analytickou specifičnost byl otestován "non-relevantní" DNA vzorek nesoucí CTG repetici, aby se prověřilo, zda zvýšení koncentrace nukleové kyseliny s potenciálem cross reaktivity by mohl mít vliv na kit. Výsledky ukazují, že zvyšující se množství "non-relevantní" DNA neinterferuje s amplifikací, sizováním a rozpoznáváním počtu CGG repetic v genu FMR1. Přesnost Opakovatelnost a reprodukovatelnost byly hodnoceny. Variační koeficient hlášených počtů repetic byl obecně nízký pro NL, IM a PM vzorky (CV <2%). Všechny vzorky s FM mohli být detekovány jako mající více než 200 CGG repetic.

31 Klinická výkonnost Studie vyhodnocení výkonnosti byla provedena na 198 vzorcích genomové DNA izolovaných z plné krve, které byly dříve charakterizovány na počet CGG repetic FMR1 genu prostřednictvím kombinace flanking PCR a Southern blottingu. Vzorky byly testovány pomocí soupravy FastFraX FMR1 Sizing kit na kombinaci termocykleru Biorad C1000 a ABI 3730XL DNA Analyzeru. Analýza byla provedana zaslepeně a výsledky byl porovnány s referenční metodou. Test hlásil dobrou shodu s referenčními údaji, 100% shoda, pokud jde o genotyp (Tabulka 13). Zejména, všechny vzorky s FM byly úspěšně osizovány jako nesoucí více než 200 RPT (žádné falešně negativní výsledky, 100% klinická citlivost a klinická specifičnost). Žádný PM vzorek nebyl klasifikován jako FM (žádné falešné pozitivity). Výsledné klinické výkonnostní vlastnosti kitu jsou vynikající, s citlivostí 100% a přesnosti ve zjišťování vzorků FM (Tabulka 14). Tabulka 13. Porovnání referenčního genotypu s výsledky reportovanými kitem FastFraX TM Sizing. Výsledek z referenční metody * Výsledek u kitu SZ NL IM PM FM NL IM PM FM Klíč: Pravdivě negativní Pravdivě pozitivní Falešně negativní Falešně pozitivní Tabulka 14. Souhrn klinických parametrů kitu FastFraX TM Sizing Statistika Hodnota 95% Cl Klinická specifita 100,00% 97,9% - 100,00% Klinická sensitivita 100,00% 81,47% - 100,00% Pozitivní prediktivní hodnota 100,00% 81,47% - 100,00% Negativní prediktivní hodnota 100,00% 97,97% - 100,00%

32 14. Troubleshooting A) Netemplátová kontrola Problém CE profil netemplátové kontroly obsahuje píky s periodicitou 3 bp Pravděpodobná příčina Kontaminace master mixu DNA templátem Kontaminace pipet PCR produktem Doporučení Opakujte test, dejte pozor, aby se DNA pipetovala jako poslední, aby se zabránilo kontaminaci master mixu. Dekontaminujte pipety před opakováním testu. Ujistěte se, že jsou před amplifikační a post amplifikační prostory odděleny. B) Pozitivní kontrola Problém Pravděpodobná příčina Doporučení žádné CE profily NEBO CE profil neodpovídá očekávanému profilu (viz sekce 4a, b a c) Chyba při přípravě master mixu Nedostatečná/degradovaná DNA Špatné nastavení PCR Špatné nastavení CE Opakujte test, dejte pozor, že byly přidány všechny reagencie ve správném objemu Zkontrolujte koncentraci a kvalitu DNA Pokud je třeba, použijte čerstvou DNA (novou šarži referenční DNA) a opakujte test Zkontrolujte run report z přístroje a ujistěte se, že bylo použito správné nastavení Opakujte test, ujistěte se, že je použito správné nastavení Zkontrolujte run report z přístroje a ujistěte se, že bylo použito správné nastavení Pokud bylo použito správné nastavení PCR, opakujte CE protokol na stejných PCR produktech (sladovaných při 4 C) Pokud bylo nastavení PCR i CE v pořádku, opakujte test

33 Píky size standardu jsou špatně přiřazeny Prošlé reagencie Použití nevhodného size standardu pro denaturační podmínky kitu Nesrovnalosti v MapMarker 1000-ROX size standardu Zkontrolujte exspiraci Pokud je třeba, opakujte test s novým neexspirovaným kitem Opakujte CE protokol se stejnými PCR produkty s použitím vhodného size standardu, který má stejné denaturační podmínky jako MapMarker 1000-ROX. Upravte size standard v analyzačním softwaru. - Vyberte velikosti 100, 800, 850, 900, 950 a Vymažte vybrané velikosti. - Reanalyzujte vzorky s použitím upraveného size standardu Zkontrolujte správnost přiřazení píků size standardu a upravte, pokud je to třeba Pro GeneMapper software, přepsání override sizing quality nevyřeší problém C) VZORKY Problém Pravděpodobná příčina Doporučení CE profil neodpovídá očekávanému profilu (viz sekce 9) NEBO žádné CE profily (Viz sekce 3) Nedostatečná/degradovaná DNA Zkontrolujte koncentraci a kvalitu DNA Pokud je třeba, použijte čerstvou DNA (opakujte izolaci DNA) a opakujte test POZNÁMKA: Pokud se opakují nulové / atypické výsledky získané navzdory tomu, že jste vyloučili technickou chybu, vzorky mohou mít delece v sekvenci FMR1. Tyto vzorky by měly být testovány za použití

34 Píky size standardu jsou špatně přiřazeny Použití nevhodného size standardu pro denaturační podmínky kitu Nesrovnalosti v MapMarker 1000-ROX size standardu alternativních metod, například Kitem FastFraX TM FMR1 Methylation. Opakujte CE protokol se stejnými PCR produkty s použitím vhodného size standardu, který má stejné denaturační podmínky jako MapMarker 1000-ROX. Upravte size standard v analyzačním softwaru. - Vyberte velikosti 100, 800, 850, 900, 950 a Vymažte vybrané velikosti. - Reanalyzujte vzorky s použitím upraveného size standardu Zkontrolujte správnost přiřazení píků size standardu a upravte, pokud je to třeba Pro GeneMapper software, přepsání override sizing quality nevyřeší problém

35 15. Zřeknutí se zodpovědnosti Výrobce omezuje záruku testovacího kitu, stejně jako, že testovací kit bude fungovat jako diagnostický test in vitro v rámci omezení a specifikace, jak je popsáno v manuálu k produktu, při použití přesně v souladu s pokyny v něm obsažených. Výrobce se zříká jakékoli záruky výslovně uvedené nebo předpokládané včetně takové výslovně uvedené nebo předpokládané záruky vzhledem k obchodovatelnosti, vhodnosti pro použití nebo implicitní utility pro jakýkoliv účel. Odpovědnost výrobce je omezena buď výměnu výrobku nebo vrácení kupní ceny výrobku, a v žádném případě není povinnen k reklamaci jakéhokoli druhu za částku vyšší než je kupní cena zboží, které je poškozeno. Výrobce nenese žádnou odpovědnost vůči kupujícímu nebo třetím osobám za škodu nebo ekonomickou ztrátu, způsobenou použitím výrobku jakýmkoli způsobem nebo aplikací. UPOZORNĚNÍ: Je vynaloženo veškeré úsilí dodávat objednané zásilky podle uvedeného vzoru, ale vzhledem k neustálému vývoji si společnost vyhrazuje právo na zlepšení / změny jakékoliv specifikace / komponenty bez předchozí informace / oznámení kupujícímu.

36 16. Reference

37