1. Izolaci polutantů 2. Zakoncentrování a přečištění izolované skupiny látek 3. Identifikaci jednotlivých látek 4. Stanovení identifikovaných složek

Transkript

1 Identifikace organických polutantů tenkovrstevnou chromatografií (Chromatografie) Úvod: Je mnohem snadnější zjistit kontaminaci složek ekosystému ionty a anorganickými sloučeninami, než odhalit kontaminaci analyzovaného materiálu (např. potravin) nežádoucí organickou látkou. Vyplývá to z prostého porovnání počtu toxických anorganických sloučenin, kterých jsou desítky, a počtu nežádoucích sloučenin organických, kterých jsou desítky tisíc. Ty jsou jednak přírodní povahy (alkaloidy, mykotoxiny a pod.), jednak jsou do ekosystému zaváděny lidskou činností (ropné látky; chlorované uhlovodíky včetně freonů, pesticidy, tenzidy, monomery umělých hmot, odpady průmyslových výrob včetně chemických atd.). Mnohé z nich mají karcinogenní, mutagenní či teratogenní účinky. Chemická analýza má za úkol kontaminující látky v analyzovaném materiálu odhalit, identifikovat a určit jejich množství (stanovit). U organických polutantů celý postup zahrnuje obvykle několik navazujicích kroků. 1. Izolaci polutantů 2. Zakoncentrování a přečištění izolované skupiny látek 3. Identifikaci jednotlivých látek 4. Stanovení identifikovaných složek Izolace se provádí nejčastěji extrakcí materiálu (vody, půdy, potravin atd.) do organického rozpouštědla (uhlovodíky, chlorované uhlovodíky, alkoholy, estery, aceton, acetonitril), nebo adsorpcí na pevném sorbentu (aktivní uhlí, silikagel, oxid hlinitý, silikagel s hydrofobně upraveným povrchem). Zakoncentrování se provádí oddestilováním organického rozpouštědla a většinou nastává již při samotné extrakci nebo adsorpci. Přečištění nastává současně se zakoncentrovaním a jeho účinnost závisí na volbě rozpouštědla nebo sorbentu. Další přečištění se provádí např. vymrazením, destilací, chromatografií na sloupci sorbentu atd. Těkavé látky se izolují a současně přečištují promýváním materiálu proudem plynu s následující sorpcí, nebo vymrazením těkavých polutantů (chlorované uhlovodíky, rozpouštědla, nízkomolekulární organické sloučeniny). Identifikace individuálních látek v zakoncentrovaném vzorku se provádí citlivými barevnými reakcemi (představuje většinou důkaz určité funkční skupiny - reakce zařadí látku např. mezi fenoly, sekundární aminy a pod.). Spolehlivější identifikaci dovolují metody spektrální (ultrafialová a infračervená spektrometrie, nukleární magnetická rezonance, hmotnostní spektrometrie). Úspěšné využití většiny spektrálních metod však vyžaduje dokonalé přečištění identifikované látky. Takový postup je obvyklý např. v soudní analýze, kde se po úplném (ovšem pracném) přečištění toxické látky používá k identifikaci i určení základních fyzikálních konstant, jako je teplota tání, teplota varu, index lomu atd. Velmi účinným způsobem identifikace je aplikace chromatografických metod. Výhodou chromatografie je možnost identifikovat současně větší počet látek ve směsi po izolaci a přečištění.

2 Chromatografická identifikace. Chromatografické metody dovolují dělení složité směsi látek i velmi podobné struktury. Principem dělení je různá velikost interakce látek při jejich rozdělování mezi pohyblivou (mobilní) a nepohyblivou (stacionární) fázi. Mobilní fází může být plyn - plynová chromatografie, nebo kapalina - kapalinová chromatografie. Stacionární fází je nosič (sorbent), nebo kapalná fáze na nosič nanesená a vázaná, pak mluvíme o zakotvené fázi. Při rozdělování látky mezi mobilní fázi a sorbent je řídící funkcí adsorpční izoterma - adsorpční chromatografie, při rozdělování látky mezi mobilní a zakotvenou fázi je řídící funkcí rozdělovací konstanta - rozdělovací chromatografie. Rozdělovací konstanta K je definována jako kde cz a cm jsou rovnovážné koncentrace v zakotvené a mobilní fázi. Rozdíl v hodnotách konstanty jednotlivých složek směsi je příčinou vlastního dělení. Rovnováha se opakovaně ustavuje na každém dílčím.úseku kolony, tzv. teoretickém patře. Délkový úsek kolony odpovídající jednomu teoretickému patru je u dobrých kolon menší než 1 mm, počet pater je pak vysoký a charakterizuje dělící účinnost kolony. Podle instrumentálního uspořádání dělíme chromatografické metody na kolonové a plošné. Základními částmi kolonových přístrojů je dávkovací zařízení a nástřikový prostor, kolona naplněná stacionární fází a detektor za kolonou. Identifikační konstantou dané látky v kolonových metodách je čas, který uplyne od okamžiku nástřiku vzorku do okamžiku vstupu látky do detektoru - eluční čas, nebo odpovídající objem mobilní fáze, který za tuto dobu protekl kolonou - eluční objem. Eluční objem se vyjadřuje jako relativní veličina VR kde Vi je objem mobilní fáze, který protekl, než se maximum koncentrace látky i dostalo do detektoru, a VM je tzv. mrtvý objem kolony a představuje objem mobilní fáze potřebný k vymytí látky, která není na stacionární fázi vůbec vázána (K=0). VR jako identifikační konstanta není jednoznačně spolehlivá (více látek může mít stejný VR), proto se pro identifikaci používá zjištění VR alespoň na dvou různých zakotvených fázích, nebo se spolehlivost zvyšuje použitím selektivních detektorů, případně provedením barevné reakce za kolonou. Plošná chromatografie je velmi jednoduchou a účinnou identifikační metodou, protože dovoluje separaci doplnit řadou barevných reakcí provedených přímo na nosiči. Nosičem bývá celulosa - papírová chromatografie, nebo vrstva sorbentu (Al2O3, SiO2, upravený SiO2 - tenkovrstevná chromatografie. Identifikační konstantou v plošné chromatografů je tzv. RF - hodnota (poměr vzdálenosti těžiště skvrny od startu" a vzdálenosti čela" od startu - viz obrázek.)

3 TLC chromatogram A,C,D jsou srovnávací standardy (svědci), B je rozdělená směs látek po detekci. Vedle RF hodnot se někdy k identifikaci využívá hodnot RM RM hodnoty jsou aditivní funkcí jednotlivých funkčních skupin a vazeb molekuly a využívají se k identifikaci prostřednictvím tabelovaných hodnot v případech, kdy nemáme k dispozici potřebné standardy. Tenkovrstevná chromatografie (TLC) se používá k identifikaci nepříliš těkavých organických látek obsahujících citlivě detekovatelné funkční skupiny. Typickým příkladem je identifikace fenolů, aromatických aminů, nitrolátek, polykondenzovaných aromatických uhlovodíků atd. V současné době se k TLC používají komerčně vyráběné desky. U nás jsou k dispozici desky Silufol (vrstvy silikagelu tmelené škrobovým pojidlem) a Celufol (tmelené vrstvy celulózy). Úkol: Identifikace a semikvantitativní stanovení fenolů ve vodě tenkovrstevnou chromatografií a určení RF hodnoty. Princip: Fenoly jsou slabými kyselinami, a proto jsou extrahovány z okyseleného vzorku vody do organického, s vodou nemísitelného rozpouštědla. Část extraktu je se svědky nanesena na tenkou vrstvu silikagelu a rozdělena TLC. Skvrny bezbarvých fenolů se odkryjí postřikem

4 detekčního činidla. Vhodným detekčním činidlem je roztok diazoniové soli, která s fenoly poskytuje azobarvivo: Roztok 4-nitrobenzendiazoniumchloridu se připraví diazotací 4 - nitroanilinu v prostředí kyseliny chlorovodíkové těsně před postřikem: Identifikace se provede porovnáním se svědky. Porovnáním intenzit a velikostí skvrn se obsah identifikovaných fenolů semikvantitativně zhodnotí. Přístroje, pomůcky a chemikálie: komora na vyvíjení chromatogramu laboratorní sklo dělicí nálevka deska Silufol vzorek odpadní fenolové vody standardní roztoky fenolů o známé koncentraci (10 mg/ml) chloroform p.a. (extrakční rozpouštědlo) benzen p.a. (mobilní fáze) 4-nitroanilín (0.5% v 2 M HCl) dusitan sodný (5%) octan sodný (20%) detekční fixírka nanášecí mikropipetky dělené po 5 µl neznámý vzorek chlorfenolu standardy izomerů chlorfenolů Pracovní postup: ml odpadní vody (každý student zpracovává jeden vzorek, vzorek je připraven) přesně odměříme odměrným válcem do dělicí nálevky a okyselíme přídavkem 2 ml 2 M HCI. 2. Do dělicí nálevky přidáme 5 ml chloroformu, protřepeme a necháme oddělit vrstvy. Oddělenou vrstvu chloroformu odpustíme co nejúplněji přes nálevku do odměrné baňky 10 ml. 3. Extrakci opakujeme s dalšími 5 ml chloroformu a baňku nakonec doplníme chloroformem po značku. 4. V průběhu extrakce připravíme chromatografickou vanu nalitím 20 ml benzenu a

5 necháme ji nasytit parami rozpouštědla. Potřebné rady si vyžádáme u vedoucího cvičení. 5. Z desky Silufol odstříhneme - buď je tam připraven čtverec o rozměrech cca 15cm x 15cm nebo připravíme obdélník šířky 12 cm (na šířku komory) x 15cm a měkkou tužkou vyznačíme čáru startu 2.5 cm od okraje desky a nanášecí body. Poznámka: Body nanesení musí být minimálně 2 cm od okraje desky (potlačení okrajových efektů") a minimálně 1.5 cm vzájemně od sebe. 6. Pomocí mikropipetek naneseme krátkými opakovanými doteky 5 a 10 µ1 chloroformového extraktu a po 5 µ1 roztoků svědků podle schématu na obrázku. Nanesené skvrny se snažíme udržet co nejmenší a necháme je dobře zaschnout před vložením do komory. 7. Desku vložíme do nakloněné, dobře nasycené komory. Hladina rozpouštědla nesmí ležet nad startovní čarou!! Necháme vyvinout desku, až čelo dosáhne asi 2-3 cm od horního okraje. Desku vyjmeme a tužkou rychle zaznamenáme stopu čela. 8. Připravíme roztok detekčního činidla: Do baňky fixírky odměříme válečkem 5 ml roztoku 4 - nitroanilinu a přidáme 6.5 ml roztoku dusitanu sodného. Za občasného míchání necháme proběhnout diazotaci asi 5 minut. Roztok před reakcí a při reakci musí být chladný. V případě potřeby chladíme ledem. Válečkem přidáme 15 ml 20 % roztoku octanu sodného (chladného) a promícháme. 9. Suchou desku položíme na filtrační papír a postříkáme činidlem v dobře táhnoucí digestoři. 10. Zaznamenáme středy (těžiště) barevných skvrn, změříme vzdálenosti a a b a vypočteme RF hodnoty. 11. Porovnáním RF hodnot provedeme identifikaci fenolů přítomných ve vodě a podle intenzity a velikostí skvrn odhadneme koncentraci fenolů ve vodě (mg/1). Při odhadu vezmeme v úvahu faktor prekoncentrace dosažený extrakcí. Protokol: 1. Uveďte stručně postup analýzy. 2. Zakreslete chromatogramy, uveďte nalezené experimentální hodnoty (RF), výsledek identifikace a semikvantitativního stanovení fenolů ve vodě. 3. Zapište detekční rovnici pro fenol Příprava: 1. Jaký je princip tenkovrstevné chromatografie 2. Kdy je R F = 0 a kdy 1 3. Pro jaký typ látek je TLC vhodná 4. Zapište detekční rovnici pro 3 - chlorfenol 5. Při chromatografii na tenké vrstvě urazila sloučenina A vzdálenost 7,6cm od startu a mobilní fáze vzdálenost 16,2cm. Vypočítejte hodnotu R F pro látku A. Jestliže za stejných podmínek urazí čelo rozpouštědla 14,3cm, do jaké vzdálenosti se současně dostane látka A? 6. Byla analyzována směs mastných kyselin tenkovrstevnou chromatografií s butanolem nasycených vodou jako mobilní fází. Byly změřeny hodnoty R F jednotlivých kyselin: kapronové (1,00),kaprylové (0,85), kaprinové (0,72), laurové (0,59), myristové (0,45), palmitové (0,33) a stearové (0,19). Vypočítejte hodnoty R M a vyneste závislost R M na počtu uhlíkových atomů v homologické řadě mastných kyselin.