Srovnání metod stanovení veškerých polyfenolů

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ ZAHRADNICKÁ FAKULTA V LEDNICI Srovnání metod stanovení veškerých polyfenolů Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: doc. Ing. Josef Balík, Ph.D. Vypracovala: Bc. Iva Machálková LEDNICE 2010

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením doc. Ing. Josefa Balíka, Ph.D. Uvedla jsem všechny literární prameny a publikace, ze kterých jsem čerpala. V Lednici dne Bc. Iva Machálková Bc. Iva Machálková 2

3 Poděkování Děkuji doc. Ing. Josefu Balíkovi, Ph.D. za odborné vedení, ochotu, vstřícnost, konzultace a cenné rady při vypracování této diplomové práce. Dále děkuji panu Radomilu Balounovi za vstřícnost a poskytnuté vzorky vín. Bc. Iva Machálková Bc. Iva Machálková 3

4 Obsah 1 Úvod Cíl Literární přehled Fenolické látky v potravinách Rozdělení fenolických látek Fenolické látky vína Fenolické látky piva Vlastnosti fenolických látek Metody stanovení polyfenolů Spektrofotometrické metody Chromatografické metody Materiál a metody Materiál a příprava vzorků Použité analytické metody Matematicko-statistické vyhodnocení výsledků Výsledky a diskuse Stanovení veškerých polyfenolů Srovnání metod Závěr Souhrn Resume Literatura Přílohy Bc. Iva Machálková 4

5 1 Úvod Rostliny produkují jako sekundární metabolity tisíce fenolických a polyfenolických sloučenin, které jsou nezbytné pro jejich fyziologii. Jsou zapojeny do různých biologických procesů, jako je růst rostlinného pletiva, pigmentace nebo ochrana proti škůdcům a chorobám. (Duthie et al., 2003) Fenolické složky ovoce, zeleniny a nápojů se velkou měrou podílejí na barevné kvalitě, senzorických vlastnostech a lepší údržnosti potravin. Obzvláště polyfenoly v hroznech, víně a pivu jsou hlavními nositeli barvy, svíravé chuti, hořkosti a účastní se oxidačních reakcí a interakcí s proteiny. Fenoly jsou také důležitými ukazateli druhů pylů zastoupených v medu. Hrají významnou roli v procesech hnědnutí produktů z jablek a hroznů během zpracování a skladování. (Lee, 2004) V posledních letech došlo k podstatnému rozvoji ve výzkumu účinků potravinových polyfenolů na lidské zdraví. Tyto studie posílily pozici přírodních fenolických látek jako účinných prostředků pro prevenci degenerativních onemocnění a rakoviny. Podle Scalberta et al. (2005) jsou polyfenoly nejhojněji zastoupené antioxidanty v potravinách. Jejich denní příjem může být až 1 g, což je mnohem více, než u jakéhokoliv jiného běžně přijímaného antioxidantu (například u vitaminu C je to 10 krát a u vitaminu E dokonce až 100 krát méně). (Scalbert et al., 2005). Pro stanovení veškerých polyfenolů ve všech druzích potravin neexistuje žádná univerzální a spolehlivá metoda. Bylo navrhnuto, ověřeno a publikováno několik různých postupů stanovení fenolických látek (Antolovich et al., 2000; Deshpande et al., 1986; Hagerman et al., 1997; Makkar, 1988). Tyto postupy lze rozdělit na metody stanovení veškerých polyfenolů a metody pro detekci a stanovení určité skupiny nebo jednotlivých fenolických látek. Příkladem postupů pro detekci veškerých polyfenolů jsou zkoušky Folin-Ciocalteu, Folin-Denis a metoda dle Jerumanise. Pro stanovení určitých skupin nebo druhů fenolických látek se nejčastěji využívá různých variant chromatografických metod (HPLC, GC/MS) nebo například vanilinového testu pro stanovení katechinů a proanthokyanidinů. (Shahidi a Naczk, 2004) Z pohledu potravin nelze brát výsledky metod stanovení veškerých polyfenolů jako směrodatný ukazatel nutriční a senzorické jakosti, jelikož mnoho polyfenolů přítomných v potravinách neovlivňuje barevnost, chuť nebo antioxidační kapacitu potravin (Shahidi a Naczk, 2004). Bc. Iva Machálková 5

6 2 Cíl Cílem práce bylo popsat fenolické sloučeniny vyskytující se v potravinách, především pak ve vínech a pivech a charakterizovat vlastnosti a význam těchto látek. Vybrat nejdůležitější spektrofotometrické metody používané pro stanovení veškerých polyfenolů, uvést jejich princip a aplikovat tyto metody na vybrané vzorky piv, červených a bílých vín a na základě získaných výsledků provést srovnání použitelnosti jednotlivých postupů pro detekci všech fenolických látek v různých druzích nápojů. Bc. Iva Machálková 6

7 3 Literární přehled 3.1 Fenolické látky v potravinách Většinu fenolických látek, vyskytujících se přirozeně v potravinách, lze zařadit do skupiny sekundárních metabolitů rostlin odvozených od fenylalaninu a v menší míře také od tyrosinu. (Shahidi a Naczk, 2004) Z chemického hlediska jsou tyto sloučeniny charakterizované nejméně jedním aromatickým kruhem (tzv. benzenovým jádrem), který nese jednu nebo více hydroxylových skupin (Faitová et al., 2007). Z výše uvedeného vyplývá, že přírodní fenolické sloučeniny jsou součástí především rostlinných potravin. Přítomnost polyfenolů ve tkáních zvířat není vyloučena, ale většinou je jen důsledkem požití rostlinné potravy (Shahidi a Naczk, 2004), působením mikroorganismů nebo dodáním těchto látek při výrobním procesu (viz podkapitola neflavonoidní fenolické látky). Polyfenoly jsou velice heterogenní skupinou sloučenin. V potravinách se uplatňují jako vonné nebo chuťové látky či barviva. Některé fenoly vykazují výrazné biologické účinky a řadí se proto mezi přírodní antioxidanty, přirozené toxické látky potravin nebo také obranné látky rostlin. (Velíšek, 1999a) Rozdělení fenolických látek Polyfenoly je možné na základě jejich chemické struktury rozdělit na tři základní skupiny neflavonoidní, flavonoidní a ostatní. Tyto tři množiny látek lze rozčlenit na několik dalších skupin (viz tabulka 1) podle počtu uhlíků a formy jejich vzájemných vazeb. Mimo rozdělení fenolických sloučenin podle jejich chemické struktury je lze zařadit do několika skupin dle jejich primárních vlastností. Takové skupiny jsou chuťové látky (taniny), barviva (flavonoidy, lignany, xanthony), přírodní antioxidanty (flavonoidy), vonné látky (některé benzochinony, kumariny). Bc. Iva Machálková 7

8 Tabulka 1: Rozdělení fenolických látek dle jejich chemické struktury (Harborne, 1980). Počet atomů uhlíku Základní kostra Skupina 6 C 6 jednoduché fenoly, benzochinony 7 C 6 - C 1 fenolové (benzoové) kyseliny 8 C 6 - C 2 acetofenony, fenyloctové kyseliny 9 C 6 - C 3 fenolové (skořicové) kyseliny, fenylpropeny, kumariny, chromony 10 C 6 - C 4 naftochinony 13 C 6 - C 1 - C 6 xanthony 14 C 6 - C 2 - C 6 stilbeny, antrachinony 15 C 6 - C 3 - C 6 flavonoidy, isoflavonoidy 18 (C 6 - C 3 ) 2 lignany, neolignany 30 (C 6 - C 3 - C 6 ) 2 biflavonoidy 9n (C 6 - C 3 ) n ligniny 6n (C 6 ) n katecholmelaniny 15n (C 6 - C 3 - C 6 ) n kondensované taniny, flavolany Neflavonoidní fenolické látky Do skupiny neflavonoidních fenolických látek lze zařadit takové polyfenoly, které svojí strukturou nespadají do široké skupiny flavonoidů. Nejjednodušším zástupcem neflavonoidních fenolů jsou jednoduché fenoly a benzochinony, které se v potravinách uplatňují jako vonné látky. Primárně se vyskytují jako součásti silic, a pak také jako produkty činnosti mikroorganismů nebo termických procesů při zpracování potravin (např. při uzení masa dochází ke vzniku guajakolů a syringolů). Dalším způsobem vzniku benzochinonů v potravinách je působení etanolu na lignin dřeva při zrání alkoholických nápojů v dubových sudech (Velíšek, 1999a). Potravinářsky zajímavým benzochinonem je arbutin obsažený v hruškách, jehož detekcí je možno dokázat přítomnost hruškové složky v jablečných džusech (Thavarajah a Low, 2006). Mezi neflavonoidní fenolické sloučeniny s jednoduchou strukturou lze zařadit skupinu fenolových (benzoových) kyselin, kam patří kyselina benzoová vyskytující se v mnoha druzích ovoce a zeleniny a dokonce i v některých jogurtech. Její koncentrace však nejsou nikterak velké (např. v ovoci a zelenině se pohybuje okolo 0,05%). Již přes sto let jsou známy účinky sodné soli této kyseliny, neboli benzoátu sodného, jako inhibitoru růstu plísní a díky této vlastnosti je hojně Bc. Iva Machálková 8

9 používán jako konzervant kyselých potravin jako jsou například ovocné džusy nebo vína (Krebs et al., 1983). Dalšími zástupci této skupiny, hojně se vyskytujících v rostlinách, jsou kyselina gentisová, která je přítomna ve větším množství např. v kakau, a kyselina gallová, která se jako volná objevuje jen sporadicky a je známa především jako součást hydrolyzovatelných tříslovin (gallotanninů). V ovoci se hojně nalézá dimer této kyseliny kyselina ellagová (Velíšek, 1999a), která je součástí tříslovin ellagotanninů. Gallotanniny, někdy označované jako tanniny nebo také tříslová kyselina, se používají jako čeřidla k prevenci tvoření bílkovinných zákalů např. ve víně či pivě. (Velíšek, 1999b) Potravinově a dietologicky významným zástupcem skupiny acetofenonů a fenyloctových kyselin je tyrosol, který má silné antioxidační účinky a nalézá se především v olivovém oleji (Casas et al., 2001). Do stejné skupiny je zařazena i fenyloctová kyselina, jedna z fenolických složek piva. V potravinách se vyskytuje také kyselina skořicová, a to jako součást silic některých koření a jako výchozí surovina pro tvorbu dalších důležitých fenolických látek. Od skořicové kyseliny se odvozuje hlavní kyselina zralých jahod p-kumarová a kyselina kávová, která představuje největšího zástupce skořicových kyselin v ovoci (tvoří % z obsahu všech skořicových kyselin v ovoci (Mandelová, 2006)). Methoxyderiváty těchto látek jsou kyseliny vanillová a ferulová, které jsou nejvíce zastoupeny v obilovinách, a to především ve vnějších vrstvách zrna. (Manach et al., 2004) Skupinou na pomezí neflavonoidních a flavonoidních fenolických látek jsou stilbeny, přírodní barviva s chemickou strukturou podobnou flavonoidům (Velíšek, 1999b). Jediným významnějším zástupcem v potravinách je resveratrol, významná bioaktivní látka v hroznech a vínech. Flavonoidní fenolické látky Jedná se o nejrozsáhlejší skupinu přírodních fenolů, která zahrnuje všechny fenolické látky odvozené od flavonoidů a látky s velmi podobnými vlastnostmi a strukturou. Skupina flavonoidů obsahuje více než 8000 známých sloučenin a tento počet se stále zvyšuje. Vysoká strukturální rozmanitost flavonoidů je způsobena mnoha různými hydrogenacemi, hydroxylacemi a metylacemi molekul. (Pietta et al., 2003) Chemicky lze flavonoidy popsat jako sloučeniny obsahující dva benzenové kruhy spojené tříuhlíkovým řetězcem v konstrukci C 6 C 3 C 6 (Velíšek, 1999a), s různým stupněm oxidace centrálního pyranového kruhu (Shahidi a Naczk, 2004). V rostlinách, které jsou nejvýznamnějšími zdroji těchto látek, se vyskytují převážně jako β-glykosidy (obsahují ve své molekule aglykon a cukernou sacharidovou složku). Bc. Iva Machálková 9

10 Sacharidovou složkou je nejčastěji glukosa nebo rhamosa, případně glukuronová kyselina, galaktosa nebo jiný sacharid. Volné aglykony se vyskytují pouze zřídka. (Slanina a Táborská, 2004) Jak již bylo zmíněno, skupina flavonoidů je velice široká a různorodá, proto se dělí na několik dalších podskupin. Nejdůležitější z nich uvádí tabulka 2 společně s nejčastějšími zástupci a jejich průměrným výskytem v běžně používaných potravinách. Výsledná koncentrace flavonoidů (stejně jako celková koncentrace fenolických sloučenin) v potravinách rostlinného původu je ovlivněna mnoha faktory například druhem, odrůdou, stupněm zralosti, klimatickými podmínkami i způsobem posklizňového uskladnění. (Kyle a Duthie, 2006) Flavonoidy v potravinách zastávají několik rolí. Některé skupiny jsou významnými přírodními barvivy (například anthokyany a anthokyanidiny), které mohou nabývat širokého spektra barev od modré, přes purpurovou, oranžovou až po červenou. (Schwartz et al., 2008) Jejich barva je závislá na ph prostředí (Univerzita Hamburg, 2003), teplotě, působení kyslíku a intenzitě dopadajícího světla (Schwartz et al., 2008). Jiné skupiny jsou naopak významné pro své chuťové (hořké, svíravé) nebo biologické účinky (antioxidační aktivita). Z flavonoidů uvedených v tabulce 2 se v rostlinných potravinách v největším množství vyskytují flavonoly, a to především kvercetin a kemferol. Biosyntéza těchto produktů je stimulována světlem, proto jsou největší koncentrace detekovány ve vnějších a vzdušných rostlinných pletivech (Manach et al., 2004). Zajímavou skupinou jsou i flavanony, které se ve významném množství vyskytují jen v citrusových plodech například nositelé hořké chuti naringenin v grapefruitech, hesperetin v pomerančích nebo eriodictyol v citronech. Dříve se tyto látky pro svoji vysokou antioxidační aktivitu a blahodárný vliv na lidský organismus označovaly jako skupina vitaminů P. Od tohoto značení se však upustilo, jelikož nedostatek těchto látek v organismu není doprovázen negativními reakcemi, jako je tomu u ostatních vitaminů. (Kyle a Duthie, 2006) Bc. Iva Machálková 10

11 Tabulka 2: Hlavní skupiny flavonoidů, jejich zástupci a hlavní zdroje (Duthie et al., 2003). Flavonoidy Zástupci Společný potravinový zdroj (celkový obsah skupiny; (mg.kg -1 )) Flavonoly Kvercetin Kemferol Myricetin Ovoce: jablka 34, švestky 12, brusinky 170, jahody 39, hrozny 31 Zelenina: kapusta , cibule 0,2 1096, brokolice , rajčata Nápoje:červené víno 13 mg/l, zelený čaj 39 mg/l, černý čaj 30 mg/l, hroznová šťáva 4mg/l Flavony Apigenin Luteolin Zelenina: celer 130, zelené olivy 142, sladká paprika 11 Flavan-3-oly Katechin Epigallokatechin Epigallokatechin gallát Ovoce: jablka 84, švestky 23 Nápoje: zelený a černý čaj, červené víno 110, hroznová šťáva 5 mg/l Flavanony Hesperetin Naringenin Ovoce: pomeranče 577, citrony 219 Nápoje: hroznová šťáva 2 mg/l Anthokyany Kyanidin Delfinin Ovoce: červené hrozny 92 Nápoje: červené víno 2 mg/l, hroznová šťáva 2 mg/l Isoflavony Genistein Daidzein Luštěniny: sója , cizrna Bc. Iva Machálková 11

12 Mezi flavonoidní polyfenoly jsou zařazeny také látky označované jako lignany a biflavonoidy. Za nejvýznamnější potravinový zdroj lignanů je uváděno lněné semínko obsahující poměrně vysoké koncentrace sesaminu a sesamolinu (Velíšek, 1999a). Oba zmínění zástupci vykazují silné biologické účinky (antioxidační a insekticidní). Mnohonásobně menší množství lignanů je možné nalézt i v obilninách, ovoci a v některých druzích zeleniny (Manach et al., 2004). Bioflavonoidy potravinářský význam nemají. Pouze amentoflavon a několik dalších biflavonoidů, vyskytujících se ve větším množství v listech jinanu dvojlaločného (Ginkgo biloba), se používá pro speciální účely v medicíně (Velíšek, 1999a). Ostatní fenolické látky Do této skupiny jsou zařazeny všechny zbývající polyfenolické látky nezapadající svou chemickou strukturou a vlastnostmi do předešlých dvou skupin. Z pohledu potravin jsou nejdůležitějšími zástupci kondensované tanniny (třísloviny), také nazývané proanthokyanidiny nebo flavolany. Strukturně se jedná o velmi rozmanité oligomery a polymery některých flavonoidních látek založených na flavanu. (Velíšek, 1999a) Kondensované tanniny vzniklé kondenzací dvou až deseti základních flavanových jednotek dodávají potravinám svíravou (trpkou, adstringentní), a také hořkou chuť. Svíravá chuť tanninů je výsledkem jejich interakce se slinnými proteiny, čímž sliny ztrácejí svoji lubrikační schopnost, nebo s glykoproteiny ústního epitelu. Nejedná se tedy ve skutečnosti o chuť, tak jak ji běžně chápeme, jelikož není vnímána chuťovými receptory. (Cheynier, 2006) Molekuly tvořené více jednotkami již nevykazují zmíněné chuťové vlastnosti, jsou však velice důležité pro vznik barviv červených vín, tvorbu zákalů a sedimentů vína, piva i ovocných šťáv. (Velíšek, 1999b) Potravinářský význam mají zejména proanthokyanidiny hroznů, vín, čajových listů (Velíšek, 1999b), piva, jablek a hrušek (Manach et al., 2004). Vedle kondensovaných tříslovin existují také třísloviny hydrolyzovatelné, což jsou polymery kyseliny gallové (Velíšek, 1999b) nebo ellagové Fenolické látky vína Fenolické sloučeniny, a především pak flavonoidy, jsou důležitou součástí hroznů a základem pro kvalitu vína (Cheynier, 2006). Tyto látky způsobují žlutou barvu oxidovaných bílých vín (Chaynier, 2006) a ovlivňují barvu červených vín, svíravost a hořkost a přispívají k aromatickému charakteru vín (Zoecklein a Fugelsang, 1999). Bc. Iva Machálková 12

13 Celkový obsah polyfenolů ve víně je menší než v ovoci, protože při výrobním procesu se podaří z hroznů extrahovat maximálně 60% původního obsahu polyfenolů (Zoecklein a Fugelsang, 1999). Toto množství může sice mírně vzrůst působením mikrobiální aktivity během fermentačního procesu, případně extrakcí ze sudů při zrání vína, nikdy již však nedosáhne původní hodnoty. Složení polyfenolů ve víně je závislé jak na odrůdě hroznů, tak i na podnebí, půdě, aktuálních klimatických podmínkách a použitém postupu při zpracování hroznů a výrobě samotného vína (Paixão et al., 2007). Díky široké chemické rozmanitosti fenolických látek se jejich celkové množství v moštu nebo ve víně obvykle uvádí v libovolných jednotkách (nejčastěji mg.l -1 ) fenolového standardu, kterým by bylo dosaženo stejných analytických výsledků. Nejčastěji bývají výsledky vztaženy ke standardu kyseliny gallové a označovány anglickou zkratkou GAE, neboli gallic acid equivalents (ekvivalent kyseliny gallové) (Zoecklein a Fugelsang, 1999). Hrozny a víno obsahují velké množství fenolických sloučenin ze všech tří hlavních skupin uvedených v kapitole Rozdělení fenolických sloučenin. Neflavonoidní látky se v hroznech nalézají především ve dřeni a flavonoidní ve slupce, jadércích a stopkách. Většinový podíl všech polyfenolů v hroznové šťávě tedy zaujímají neflavonoidní látky z dužniny, přičemž flavonoidní složky se do vína dostávají až následným výluhem ze slupek a jadérek (Zoecklein a Fugelsang, 1999). Z předchozího je zřejmé rozložení flavonoidních a neflavonoidních polyfenolů v červených a bílých vínech. Jak je vidět v tabulce 3 červená vína obsahují % flavonoidních sloučenin a bílá vína pouze 25 % (Zoecklein a Fugelsang, 1999), což je dáno principem výroby těchto vín. Tabulka 3: Významné skupiny fenolických sloučenin v klasických červených vínech s celkovým obsahem polyfenolů 1400 mg.l -1 (ekvivalentu kyseliny gallové) (Zoecklein a Fugelsang, 1999). Druh fenolické látky Koncentrace (mg.l -1 ) Neflavonoidní 200 Flavonoidní: Anthokyany 150 Kondensované tanniny 750 Ostatní flavonoidy 250 Flavonoly 50 Bc. Iva Machálková 13

14 Hlavními typy polyfenolů nalézajících se ve víně jsou fenolové kyseliny, skořicové kyseliny, stilbeny, flavanoly a anthokyany. Ve víně již byly dokumentovány stovky zástupců fenolových látek a nejčastěji jsou zmiňovány kyseliny gallová a ferulová, kvercetin, myricetin, katechin, epikatechin, delfinin, kyanidin a resveratrol. (Saura-Calixto a Díaz-Rubio, 2007). Reakcemi monomerních fenolických látek vznikají dimerní a větší formy, které jsou základem heterogenních struktur polymerních flavonoidů, jež tvoří hlavní skupinu v celkovém obsahu polyfenolů ve víně. Tyto látky lze nalézt během celého procesu výroby vína a patří sem především tanniny a kondensované tanniny (Zoecklein a Fugelsang, 1999), které jsou ve víně složeny především z molekul anthokyanogenů nebo katechinů (Zoecklein et al., 1990). Fenolové sloučeniny, přesněji anthokyany, flavanolové monomery i polymery, flavonoly a fenolové kyseliny hrají nezastupitelnou roli při stabilizaci barvy červených vín během zrání a následného skladování. (García-Falcón et al., 2007) Postup při výrobě vína výrazně ovlivňuje výsledné složení polyfenolů. Flavonoidy přecházejí do vína primárně z jadérek, slupky a stopek hroznů. Anthokyany a flavonoly jsou extrahovány hlavně ze slupek a katechiny a leukoanthokyany z jadérek a stopek. Prodloužením doby kontaktu hroznového moštu se zbytky hroznů, zvýšením teploty nebo lepším porušením celistvosti hroznů lze dosáhnou celkově podstatně vyššího obsahu fenolických látek ve víně. Podle Velíška (1999b) jsou pigmenty červených hroznů révy vinné (Vitis vinifera L.) hlavně 3-monoglykosidy různých aglykonů a převládajícím pigmentem je malvidin-3-β-d-glukopyranosid nazývaný dříve oenin. U mimo evropských druhů révy vinné je důležitý malvidin-3,5-β-d-diglukopyranosid, který se nazývá malvin. Tyto anthokyanové pigmenty doprovází řada dalších anthokyanů a jejich esterů s fenolovými kyselinami (bylo prokázáno 16 pigmentů) (Velíšek, 1999b). Proanthokyanidiny, neboli tanniny, se do vína dostávají mnohem rychleji ze slupek, než z jadérek hroznů. Extrakce z jadérek se zrychluje až díky působení zvýšené koncentrace etanolu produkovaného kvasinkami při fermentaci. (Cheynier, 2006) Naproti tomu anthokyany přecházejí do vína ze všech částí hroznů velice snadno a maximální koncentrace v moštu dosahují již po pár dnech. Díky následným chemickým reakcím, které způsobují jejich rozpad, koncentrace anthokyanů v moštu a následně ve víně začne klesat. (Cheynier, 2006) Fenolické látky se, podle výše uvedeného, do vína extrahují z hroznů. Tato cesta však není jediná, dalším zdrojem vinných polyfenolů je mikrobiální činnost při fermentaci, kdy dochází k přeměně benzoové, šikimové a chinonové kyseliny na katechol a protokatechovou kyselinu. Bc. Iva Machálková 14

15 Kvasinky alkoholového kvašení také přeměňují tyrosin na tyrosol, jedinou fenolovou sloučeninu produkovanou z nefenolických prekurzorů. (Zoecklein a Fugelsang, 1999) Dalším zdrojem fenolických látek ve víně mohou být dubové sudy, ve kterých víno zraje. Vína s označením Barrique pak získávají deriváty benzoové a skořicové kyseliny, které tvoří charakteristické aroma a chuť těchto vín (Matějíček et al., 2005). Tabulka 4 ukazuje zástupce fenolických sloučenin v typických stolních vínech z hroznů Vitis Vinifera L. i s uvedením primárních zdrojů těchto látek. Obsah a skladba polyfenolů ve víně, a tím i organoleptické vlastnosti, se vyvíjí i v průběhu stárnutí, kdy dochází například k oxidativnímu rozpadu proanthokyanidinů, a tím ke zmírňování svíravé chuti nebo ke změně anthokyanů na jiné pigmenty, čímž se mění purpurové zabarvení mladých červených vín na červeno hnědé zbarvení vín zralých (Cheynier, 2006). Reakce vedoucí ke změně barvy se řadí do souboru reakcí enzymového hnědnutí (Velíšek, 1999b). Dalšími reakcemi se u starých červených vín mohou postupně tvořit až hnědočervené výšemolekulární nerozpustné kondenzační produkty, které tvoří sedimenty nazývané flobafeny. Na jejich vzniku se mohou kromě flavonoidů zřejmě podílet také další složky vín (proteiny, askorbová kyselina, redukující cukry, ionty kovů aj.) (Velíšek, 1999b). Bc. Iva Machálková 15

16 Tabulka 4: Přibližné zastoupení fenolových sloučenin v typických stolních vínech v mg.l -1 (ekvivalent kyseliny gallové) (Zoecklein a Fugelsang, 1999). Skupina fenolů Zdroj * Bílá vína Červená vína Mladá Zralá Mladá Zralá Neflavonoidí, celkem Deriváty kyseliny H, D skořicové Těkavé benzenové D, M, H, P deriváty Tyrosol M Těkavé fenoly M, D, P Hydrolyzovatelné tanniny P Makromolekulární komplexy Protein-tannin H, D, P Flavonoidní, celkem Katechiny H Flavonoly H, D stopově stopově Anthokyany H Rozpustné tanniny H, D Ostatní flavonoidy H, D, P, M Fenoly celkem * H = hrozny, D = degradovatelné vysokomolekulární látky, M = kvasinky, mikroorganismy, P = prostředí, sudy V posledních letech hodně diskutovaný resveratrol jedním z nejúčinnějších antioxidantů v hroznech, a potažmo i ve víně. Často je dáván do spojitosti s tzv. francouzským nebo také středomořským paradoxem více viz kapitola Vlastnosti fenolických látek Fenolické látky piva Fenolové látky tvoří v pivu jednu z nejdůležitějších kvalitativních složek. Do piva se dostávají ze surovin, tedy z ječmene (resp. sladu), chmele a chmelových preparátů, přičemž významným způsobem ovlivňují nejen trvanlivost, ale i jeho senzorické vlastnosti (ovlivňují jak barvu, tak i chuť, vůni, pěnivost a koloidní stabilitu piva). Některé skupiny polyfenolů však v pivu působí i nežádoucně, když se podílejí na tvorbě nevratných zákalů ve vychlazeném pivu (Juchelka, 2008). V pivu bylo detekováno asi 67 různých fenolových látek, např. jednoduché fenoly, fenolové kyseliny, deriváty kyseliny hydroxyskořicové, katechiny, leucoanthokyany, anthokyany, flavonoly (rutin, kvercetin a kemferol), anthokyanogeny, flavonony, flavony, prenylované flavonoidy a Bc. Iva Machálková 16

17 fenolové glykosidy. (Shahidi a Naczk, 2004) V tabulce 5 je možno vidět základní skupiny a zástupce fenolických látek obsažených v pivě. Tabulka 5: Základní skupiny polyfenolů obsažených v pivě (Hughes a Baxter, 2001). Skupina polyfenolů Zástupce v pivě Typická koncentrace v pivě (mg.l -1 ) Neflavonoidní polyfenoly fenolické alkoholy tyrosol fenolové kyseliny ferulová kyselina Flavonoidní polyfenoly 1 23 flavan-3-oly katechin, epikatechin flavan-3,4-dioly leukokyanidin flavonoly kvercetin Ostatní polyfenoly polymerní katechin proanthokyanidiny prokyanidin B3 prodelfinidiny delfinidin B3 Hlavním donorem pivních polyfenolů je chmel. Chmelové fenolové látky se uplatňují v průběhu technologického procesu při srážení vysokomolekulárních bílkovin a v důsledku schopnosti vázat volné radikály hrají nezastupitelnou roli v procesu oxidace tuků a mastných kyselin a částečně tak zabraňují vzniku senzoricky nežádoucích produktů (Karabín et al., 2001). Zvláštní skupinou polyfenolů vyskytujících se v pivu jsou prenylované flavonoidy pocházející z chmele, který jako jeden z mála zástupců vyšších rostlin dokáže tyto látky syntetizovat. Rostlina biosyntetizuje a sekretuje prenylflavonoidy spolu s chmelovými pryskyřicemi a silicemi do lupulinových žlázek. Chmelové hlávky obsahují poměrně velké množství flavonoidů s fenylovým nebo geranylovým substituentem. Více než 80-90% z nich tvoří xanthohumol v množstvích 0,2 až 1,1 hm % v sušině chmele, který přechází do piva v izomerované formě jako isoxanthohumol. Dále je ve chmelu ve větším množství zastoupen desmethylxanthohumol a xanthohumol C. (Blovská, 2008) Dalším zdrojem fenolových látek v pivu je ječmen, respektive slad, který jako jediný z obilovin dokáže syntetizovat proanthokyanidiny (Haslam, 1998). Ječmen většinu svých polyfenolů obsahuje vně endospermu. Hlavními ječnými polyfenoly jsou leukoanthokyanidiny, katechiny Bc. Iva Machálková 17

18 (gallokatechin, epigallokatechin), deriváty různých kyselin např. hydroxyskořicové, skořicové, hydroxybenzoové, kumarinu a také chinony a ubichinony. Významnou vlastností katechinů hojně využívanou v pivovarnictví je jejich kondenzační schopnost (Juchelka, 2008). Jedná se o schopnost polyfenolů tvořit rozsáhlé komplexy s proteiny, které se projeví jako zákaly, a pokud je umožněno další narůstání těchto molekul, dojde až k jejich sedimentaci. Schéma vzniku protein-polyfenolových sedimentů je uvedeno na obrázku 1. Studie ukázaly, že proteiny vykazující silné sklony k vazbě na polyfenoly, obsahují ve své molekule prolin. Zákalová aktivita proteinů úměrně roste s množstvím obsaženého prolinu. (Siebert, 2006) Obrázek 1: Schéma interakce polyfenolů s proteiny vedoucí k zákalům a následně k sedimentaci (Siebert, 2006). Při odstraňování pivních zákalů minerálními kyselinami byla zjištěna přítomnost kyanidinových pigmentů vznikajících z anthokyanogenů (pelargonidin, kyanidin, delfinin (Čepička a Karabín, 2002)), což prokázalo účast těchto látek na tvorbě zákalů. Konverze anthokyanogenů na kyanidinové pigmenty je velmi neefektivní proces, při kterém dojde k přeměně maximálně 10 % anthokyanogenů. Na základě těchto zjištění bylo stanoveno, že pivní zákaly jsou tvořeny z % anthokyanogeny. (Hough et. al., 1999) Nekondensované a neoxidované formy tanninů a anthokyanogenů přispívají ke stabilitě pivní pěny. Pokud dojde ke vzniku výšemolekulových komplexů těchto látek, začne stabilita pivní pěny klesat. (Kunze, 2005) Vlastnosti fenolických látek Fenolické látky hrají významnou roli jak v přírodě, potravinářství, tak i v oblasti lidského zdraví. Polyfenoly vykazují široké spektrum vlastností, které závisejí na jejich chemické struktuře. Některé se projevují jako žluté, oranžové, červené a modré pigmenty, jiné naopak jako chuťové nebo vonné látky potravin. Některé volné polyfenoly jako například vanilin nebo eugenol (odpovědný za charakteristickou vůni hřebíčku), jsou velmi výraznými aromaty. Hlavními chutěmi spojovanými s polyfenoly jsou hořkost a svíravost (adstringence). Mezi hlavní vlastnosti polyfenolů je nutné zařadit také jejich antioxidační aktivitu a jejich schopnost vazby s proteiny. Poslední uvedené je Bc. Iva Machálková 18

19 v principu zodpovědné za zmíněnou svíravou chuť (interakcí s proteiny v ústech) a za vznik zákalů a sedimentů v nápojích. (Cheynier, 2005) Barevnost Jednou z nejrozšířenějších skupin barevných pigmentů ve světě rostlin jsou anthokyany, které jsou původci červeného, nachového a modrého zbarvení (Schwartz, 2008). Méně výraznou skupinou jsou flavonoly a flavany se svými žlutými odstíny (Cheynier, 2005). Ve slabě kyselém prostředí, jaké se často vyskytuje v rostlinných potravinách, se jednoduché anthokyany vyskytují v bezbarvé formě v rovnováze se žlutým chalkonovým isomerem. Změna původních anthokyanů na jiné molekuly v průběhu zpracování potravin znamená buď ztrátu, nebo stabilizaci barvy a zvýšení počtu možných odstínů. Příkladem tohoto procesu je změna barevnosti vína během jeho stárnutí, kdy dochází k přeměně původních anthokyanů na jejich různé deriváty - pyranoanthokyany jsou oranžové, zatímco deriváty s vazbou na ethyl jsou nachové. Tyto výsledné produkty jsou však mnohem odolnější proti hydratačním reakcím, než původní hroznové anthokyany, čímž přispívají k barevné stabilitě zralých vín. (Cheynier, 2005) Opakem ztráty barvy anthokyanů je změna bezbarvých fenolových látek na hnědé pigmenty během enzymového a neenzymového hnědnutí. Enzymové hnědnutí Nejvýznamnější reakcí přirozených fenolů v potravinách je oxidace. U řady potravin rostlinného původu má velký význam enzymově katalyzovaná oxidace monofenolů na o-difenoly a oxidace vzniklých o-difenolů na o-chinony. Tyto a následné reakce se řadí do souboru reakcí označovaných jako enzymatické hnědnutí. (Velíšek, 1999b) Enzymové hnědnutí je jedna z nejdůležitějších reakcí probíhajících v potravinách, které ovlivňujících barvu, a to především v ovoci, zelenině, nápojích, a také v mořských plodech. Enzymové hnědnutí je známo již více než 100 let. (Velíšek, 1999b) Reakce je dnes velice dobře prozkoumána a popsána. Vznik hnědých pigmentů, ke kterému dochází během těchto reakcí, bývá většinou nežádoucí, jelikož dochází ke zhoršení senzorických vlastností produktů (především barvy), např. hnědnutí hrušek, jablek, banánů nebo výrobků z nich. V několika případech jsou však tyto reakce žádoucí a jsou nedílnou součástí procesu výroby některých potravin, kdy dodávají charakteristický vzhled, chuť i vůni. Enzymového hnědnutí se jako potřebné části výroby potravin využívá při fermentaci Bc. Iva Machálková 19

20 čaje a kakaových bobů, dozrávání datlí nebo při výrobě černých oliv, rozinek a vín typu sherry (Velíšek, 1999b). K enzymovému hnědnutí potravin dochází při mechanickém poškození buněk, kdy se k polyfenolovému substrátu obsaženému v buňkách dostane vzdušný molekulový kyslík. Jedná se o oxidační, respektive dehydrogenační reakci polyfenolů, katalyzovanou enzymy. (Marshall et al., 2000) Nejčastějšími donory vodíku bývají při těchto reakcích látky, obsahující funkční skupinu dihydroxybenzen, běžně nazývaný jako o-difenol (nebo také katechol). Jejich enzymově katalyzované dehydrogenace bývají velmi rychlé a vznikají při nich o-chinony, typické svým hnědým zbarvením. (Ingr, 1999) Schematicky lze reakci tohoto enzymového hnědnutí vyjádřit takto: o-difenol + ½ O 2 o-chinon + H 2 O (Ingr, 1999) Enzymy z třídy oxidoreduktas katalyzujících reakce enzymového hnědnutí se nazývají polyfenoloxidasy a dělí se na dvě skupiny: katecholoxidasy, katalyzují vznik o-difenolu z jednoduchých fenolů (také nazýváno kresolasová aktivita) a následně z něj vytváří o-chinon lakkasy, které oxidují o-difenoly a p-difenoly na odpovídající chinony (Velíšek, 1999b) Enzymová aktivita je závislá na ph prostředí, teplotě, druhu, odrůdě a stáří plodu v nezralém ovoci je vyšší, proto je plod náchylnější k hnědnutí. V potravinářství se používá několik níže popsaných způsobů ošetření potravin proti enzymatickému hnědnutí: tepelné zpracování především tzv. blanšírování, neboli krátké povaření nebo spaření potraviny při teplotách od C psychroanabióza (chlazení) kryoanabióza (mražení) dehydratace (odnímání vody potravinám) ionizační záření potravina je ozářena dávkou gama záření s nízkou intenzitou (Marshall et al., 2000) ultrafialové záření tento druh ošetření nezabrání neenzymovému hnědnutí použití inhibitorů enzymatického hnědnutí jako je kyselina citronová nebo šťavelová Bc. Iva Machálková 20

21 Neenzymové hnědnutí Obdobou zmíněného enzymového hnědnutí je tzv. neenzymové hnědnutí, kdy v potravinách se zásaditým prostředím dochází k autooxidaci některých fenolových látek (především kyseliny gallové) bez přítomnosti enzymatického katalyzátoru. K těmto reakcím dochází v zásaditém až neutrálním prostředí, ve kterém jsou fenolové látky schopny samovolně oxidovat. Působením vzdušného kyslíku vznikají výšemolekulární produkty. Příkladem těchto reakcí je reakce gallové kyseliny, kde je hlavním produktem hexahydroxybifenylová kyselina, která je biochemickým prekurzorem ellagové kyseliny. Při pokračující oxidaci vznikají další acyklické sloučeniny. Velké množství produktů se tvoří také při autooxidaci skořicových kyselin. (Velíšek, 1999b) Fenoly mohou být oxidovány na příslušné o-difenoly a o-chinony také peroxidem vodíku (který např. vzniká při oxidaci askorbové kyseliny, autooxidaci o-difenolů nebo autooxidací iontů mědi v kyselém prostředí). V kyselém prostředí ovocných šťáv však peroxid vodíku přednostně oxiduje jiné látky. (Velíšek, 1999b) Souhrnně se těmto reakcím říká Maillardova reakce. Chuťové vlastnosti Nejvíce fenolových látek vykazuje hořkou a/nebo svíravou (trpkou) chuť. Podle Shahidiho a Naczka (2004) jsou některé polyfenoly zodpovědné také za kyselou chuť (nerulová kyselina), nebo za ovčí chuť ovčího tuku a zralých sýrů (alkylfenoly). Nejznámějšími hořkými látkami jsou flavonony (polyfenoly citrusů), a to především naringenin způsobující hořkou chuť grepů (Lindsay, 2008). Dalšími důležitými hořkými látkami v potravinách, především ve víně, jsou tanniny a proanthokyanidiny, které se však vyznačují také svíravou chutí, jež může částečně ovlivnit vnímání hořkosti potraviny (Macheix et al., 2000). Jak již bylo uvedeno v předcházející kapitole, svíravá chuť není chuťový smyslový vjem tak, jak je běžně chápána a souvisí spíše se schopností polyfenolů vytvářet komplexy s proteiny slin a epitelu ústní dutiny. Antioxidační aktivita Řada fenolických látek, vyskytujících se v potravinách, je řazena mezi primární antioxidanty, tedy látky, které prodlužují údržnost potravin tak, že je chrání před znehodnocením způsobeným oxidací, jejímž projevem je žluknutí přítomných tuků a dalších snadno se oxidujících složek Bc. Iva Machálková 21

22 (Velíšek, 1999a). Antioxidanty v organismu zachycují volné radikály dříve, než mohou škodit, a tím zabraňují oxidačnímu poškození buněk (Lachman et al., 2005). Mezi takové látky jsou řazeny především flavonoidy, anthokyany, fenolkarboxylové kyseliny a kumariny (Lachman et al., 2005). Fenolové sloučeniny (ArOH) mohou jako primární antioxidanty interferovat s oxidací lipidů (R-H) v kompetitivní reakce k propagační fázi autooxidační reakce tím, že reagují s radikály hydroperoxidů (ROO ) nebo alkoxylovými radikály (RO ) vzniklými oxidací lipidů a poskytují jim atom vodíku, čímž přerušují řetězovou radikálovou reakci. Jako produkty vznikají fenoxylové (aryloxylové) radikály antioxidantu ArOH + R-O-O R-O-OH + ArO nebo ArOH + R-O R-OH + ArO Tyto radikály reagují s volným hydroperoxylovým nebo alkoxylovým radikálem oxidované mastné kyseliny. (Velíšek, 1999b) Pokud je v potravině příliš vysoká koncentrace antioxidantů, může začít docházet ke vstupu fenoxylových radikálů do řetězové radikálové reakce, a tím k iniciaci štěpení dalších molekul lipidu. Dojde-li k takovéto situaci, znamená to, že se antioxidant začal chovat jako prooxidant. (Velíšek, 1999b) Přítomnost antioxidantů v lidském organismu napomáhá buňkám odolávat tzv. oxidativnímu stresu, kdy v buňce dojde k nárůstu počtu reaktivních kyslíkových radikálů označovaných anglickou zkratkou ROS (Reactive Oxygen Species). Tento nárůst může vést k poškození důležitých makromolekul (proteiny, lipidy, DNA), což vede k narušení fyziologie buňky, apoptóze nebo nekróze buněk, rozvoji nádorů a k řadě dalších onemocnění. Buhler a Miranda (2000) uvádí, že oxidativní stres může být v lidském organismu příčinou kardiovaskulárních, rakovinných a neurodegenerativních onemocnění (např. Parkinson). Také konzumace vína je spojována se zlepšením antioxidační kapacity krevní plasmy a redukcí oxidovatelných částic, přičemž červené víno vykazuje vyšší účinnost, než víno bílé. Hlavním zástupcem polyfenolických antioxidantů obsažených ve víně je resveratrol, který je schopen tvořit cheláty s mědí, která jinak stimuluje peroxidaci lipidů. S resveratrolem je také spojován tzv. Francouzský paradox (někdy uváděný i jako středomořský). Jedná se o skutečnost, že obyvatelé Francie i přes značnou konzumaci tučných jídel vykazují v průměru nižší výskyt srdečních a cévních onemocnění. (Šmidrkal et al., 2001) Tato skutečnost je připisována zvýšené konzumaci červených vín, a tedy vyššímu přísunu resveratrolu. Bc. Iva Machálková 22

23 3.2 Metody stanovení polyfenolů Tyto postupy lze rozdělit na metody stanovení veškerých polyfenolů a metody pro detekci a stanovení určité skupiny případně jednotlivých fenolických látek. Příkladem postupů pro detekci veškerých polyfenolů jsou spektrofotometrické zkoušky s činidlem Folin-Ciocalteu, Folin-Denis a test Pruskou modří. Pro stanovení určitých skupin nebo druhů fenolických látek se nejčastěji využívá různých variant chromatografických metod (HPLC, GC/MS) nebo například upraveného vanilinového testu pro stanovení katechinů a proanthokyanidinů. (Shahidi a Naczk, 2004) Dále jsou pro analýzu polyfenolů používány titrační a elektrochemické metody nebo spektrometrie nukleární magnetickou rezonancí (Shahidi a Naczk, 2004) Spektrofotometrické metody Pro stanovení fenolických látek v rostlinných materiálech, respektive v potravinách, bylo vyvinuto několik metod. Spektrofotometrickými metodami je možné určit množství veškerých polyfenolů ve vzorku, specifické fenolické látky jako je sinapin (Tzagoloff, 1963) nebo sinapinová kyselina (Naczk et al., 1992) nebo určité skupiny fenolických látek jako jsou například fenolové kyseliny (Brune et al., 1991), katechiny a proanthokyanidiny (Shahidi a Naczk, 2004). Mezi nejpoužívanější spektrofotometrické metody lze zařadit stanovení s činidly Folin-Denis nebo Folin-Ciocalteu, test Pruskou modří, upravený vanilinový test, spektrální analýza v UV (Shahidi a Naczk, 2004). Metoda Folin-Denis Metoda Folin-Denis je jedním z nejpoužívanějších postupů pro stanovení veškerých polyfenolů v rostlinných potravinách a nápojích (Shahidi a Naczk, 2004). Metoda je založena na redukční reakci fenolických sloučenin s Folin-Denisovým činidlem (fosfomolybden-fosforečná kyselina), při které vznikají v zásaditém prostředí modře zbarvené komplexy (Folin a Denis, 1912). Spektrofotometrické stanovování při 725 nm používané při rutinním stanovování velkého počtu vzorků bylo navrženo Swainem a Hillisem (1959). Metoda Folin-Ciocalteu Jedná se o metodu často používanou pro stanovování veškerých polyfenolů v potravinách (Brune et al., 1991) a s úpravou podle Singletona (Singleton et al., 1999) především pro víno. Princip je podobný Folin-Denisovu postupu, jako činidlo se však používá roztok Folin-Ciocalteau (roztok Bc. Iva Machálková 23

24 wolframových a molybdenových oxidů (Waterhouse, 2002)). Redukční reakce činidla s polyfenoly vytvářejí modře zbarvené produkty s maximální absorpcí při 765 nm (Waterhouse, 2002). Činidlo Folin-Ciocalteau je nespecifické a detekuje všechny fenolové skupiny ve zkoumaných vzorcích včetně těch, které jsou vázány na proteiny. Činidlo však také reaguje se snadno oxidovatelnými látkami jako je například kyselina askorbová, oxid siřičitý nebo aromatické aminy, což vede ke zkreslení dosažených výsledků (Shahidi a Naczk, 2004; Zoecklein et al., 1990). Při analýze sladkých vín dochází k nežádoucímu vlivu redukujících cukrů na konečné hodnoty (Zoecklein et al., 1990). Stanovení podle Jerumanise Polyfenolové látky reagují v zásaditém prostředí s citrátem železito-amonným za vzniku hnědého zabarvení, jehož absorpční maximum je při vlnové délce 600 nm (Balík, 1998). Stanovení spektrální analýzou v UV spektru Různé skupiny fenolických látek mají svá charakteristická absorpční maxima (jedno nebo i více) v ultrafialové části světelného spektra (Shahidi a Naczk, 2004). Absorpční maximum jednoduchých fenolů se pohybuje v intervalu od 220 do 280 nm (Owades et al., 1958b). Hodnoty absorpce mohou být ovlivněny ph vzorku, a také některými látkami (např. bílkovinami, nukleovými kyselinami a aminokyselinami) (Shahidi a Naczk, 2004). Tato metoda je nejvhodnější pro analýzu fenolických látek v čaji, pivě (Owades et al., 1958ab), kávě a dalších nápojích (Hoff a Singleton, 1977), a také v cereáliích a luštěninách (Sharp et al., 1977). Spektrofotometrické měření v UV a viditelném spektru se také často využívá pro stanovení určitých fenolických látek, jako jsou například flavonoidy (Mabry et al., 1970). Ke zkreslení výsledků této metody přispívá fakt, že každá fenolická látka vykazuje při 280 nm jinou hodnotu absorbance. Tento postup tedy není vhodný pro porovnávání vzorků s velmi rozdílnou skladbou polyfenolů. Jedná se o velice jednoduchou a rychlou metodu v praxi využitelnou například pro monitorování obsahu fenolických látek ve víně během procesu výroby a zrání (Waterhouse, 2002). Stanovení anthokyanogenů Anthokyanogeny (proanthokyanidiny, leukoanthokyanidiny) patří mezi kondenzované polyhydroxyflavany, které se v kyselém prostředí mění v příslušné červeně zbarvené anthokyanidiny (Balík, 1998). Bc. Iva Machálková 24

25 3.2.2 Chromatografické metody Pro analýzu fenolických látek bylo navrhnuto několik postupů založených na chromatografických metodách. Tyto techniky se využívají pro přípravu, izolaci, čištění a identifikaci polyfenolů (Shahidi a Naczk, 2004). Chromatografické metody jsou používány pro studium interakcí fenolických látek s dalšími složkami potravin (Oh et al, 1985). Kapalinová chromatografie je běžně využívaná pro oddělování tanninů nebo izolaci proanthokyanů (Shahidi a Naczk, 2004). Podle Fulcrada et al. (1999) lze s pomocí kapalinové chromatografie za použití Fraktogelu HW-50(f) rozdělit vinné polyfenoly na jednoduché skupiny fenolové kyseliny, anthokyany, flavonoly a flavanoly. Dále například Mateus et al. (2001) využil Fractogel HW-40(s) pro rozlišení pigmentů červených vín odvozených od anthokyanů. Stále širší uplatnění při separaci, identifikaci a kvantifikaci polyfenolů v potravinách nachází vysoko výkonná kapalinová chromatografie, tzv. HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Je dostupné velké množství stacionárních a mobilních fází určených pro analýzu anthokyanů, flavononů a flavonolů, flavan-3-olů, flavonů a fenolických kyselin (Senter et al., 1989). Pro detekci fenolových sloučenin v potravinách s pomocí HPLC se nejčastěji využívá měření v ultrafialovém až viditelném spektru záření (UV-Vis), fotodiodové pole (DAD) (Edenhander et al., 2001) nebo elektrochemický coulometrický detektor (EC) (Mattila et al., 2000). Pro zjišťování charakteristických struktur polyfenolů se s výhodou využívá spojení HPLC a hmotnostního spektrometru na místě detektoru tzv. HPLC-MS (Shahidi a Naczk, 2004). Bc. Iva Machálková 25

26 4 Materiál a metody 4.1 Materiál a příprava vzorků Pro porovnání metod stanovení veškerých polyfenolů byly určeny čtyři kategorie nápojů se třemi zástupci. Pro zachování opakovatelnosti metod byly vybrány vzorky běžně dostupné v maloobchodní síti. Tabulka 6 uvádí souhrn zkoumaných vzorků piv s jejich základními charakteristikami. Tabulka 6: Vybrané vzorky piv. Kategorie Vzorek Obsah alkoholu Výrobce Cena (Kč) (% obj.) Lehké světlé Měšťan 3,2 Staropramen, a.s. 6,70 Světlé výčepní Velkopopovický kozel 4,0 Pivovar Velké Popovice 9,50 Staropramen 4,0 Staropramen, a.s. 9,90 Světlý ležák Zlatý bažant 5,0 V licenci pivovar Starobrno 15,90 Regent Premium 5,0 Bohemia Regent Třeboň 11,50 Pilsner Urquell 4,4 Plzeňský Prazdroj, a.s. 20,90 Popis zkoumaných vzorků vín a jejich charakteristika: Všechny vzorky vín byly vyrobeny ve Vinařství Baloun Velké Pavlovice. Ryzlink vlašský jakost: pozdní sběr, suché; ročník: 2008 obsah alkoholu: 11,5%, zbytkový cukr: 6,2 g.l -1, kyseliny: 5,8 g.l -1 obsah: 750 ml; cena: 195,- Kč Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská (obec Mikulov viniční trať Šibeniční vrch) Bc. Iva Machálková 26

27 Veltlínské zelené jakost: pozdní sběr, suché; ročník: 2008 obsah alkoholu: 12,0%, zbytkový cukr: 6,7 g.l -1 kyseliny: 5,4 g.l -1 obsah: 750 ml; cena: 230,-Kč Vinařská oblast Morava podoblast Velkopavlovická (obec Starovičky viniční trať Nová hora) Rulandské šedé jakost: výběr z bobulí, poloslané; ročník: 2007 obsah alkoholu: 11,5% obsah: 500 ml; cena: 260,-Kč Vinařská oblast Morava podoblast Velkopavlovická (obec Velké Pavlovice viniční trať Nadzahrady) Merlot jakost: výběr z hroznů, suché; ročník: 2007 obsah alkoholu: 13,5%, zbytkový cukr: 2,8 g.l -1, kyseliny: 4,4 g.l -1 obsah: 750ml; cena: 310,-Kč Vinařská oblast Morava podoblast Velkopavlovická (obec Velké Pavlovice viniční trať Nadzahrady) Dornfelder jakost: pozdní sběr, suché; ročník: 2007 obsah alkoholu: 12,0%, zbytkový cukr: 2,3 g.l -1, kyseliny: 4,3 g.l -1 obsah: 750ml; cena: 340,-Kč Vinařská oblast Morava podoblast Velkopavlovická (obec Velké Pavlovice viniční trať Nadzahrady) Dornfelder Barrique jakost: pozdní sběr, suché; ročník: 2006 obsah alkoholu: 12,0%, zbytkový cukr: 2,6 g.l -1, kyseliny: 4,8 g.l -1 obsah: 750 ml; cena: 430,-Kč Vinařská oblast Morava podoblast Velkopavlovická (obec Velké Pavlovice viniční trať Nadzahrady) Bc. Iva Machálková 27

28 4.2 Použité analytické metody Stanovení veškerých polyfenolů podle Jerumanis Chemikálie a roztoky Karboxymetylcelulóza, 3,5 % čerstvý roztok citrátu železito-amonného, (1 : 1) roztok amoniaku, standardní roztok: 50 mg kyseliny gallové v 100 ml roztoku. Postup Pro snížení pěnivosti byly vzorky piva před použitím přefiltrovány přes filtrační papír. Vzorky vín nebyly nijak upraveny. Ze standardního roztoku kyseliny gallové bylo pipetováno do 6-ti 25 ml odměrných baněk 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 ml. Současně bylo pipetováno 10 ml čirého vzorku piva a bílého vína, 1 ml červeného vína a 0,5 ml červeného vína barrique do dalších 25 ml odměrných baněk. Do všech odměrných baněk bylo přidáno 8 ml karboxymetylcelulózy a promícháno. Dále bylo přidáno 0,5 ml roztoku citrátu železito-amonného a 1,0 ml roztoku (1 : 1) amoniaku, promícháno a doplněno po značku destilovanou vodou. Po deseti minutách bylo měřeno zabarvení pomocí VIS-spektrofotometru v 10 mm kyvetě při 600 nm proti destilované vodě. Měření každého vzorku bylo provedeno ve čtyřech opakováních. (Balík, 1998) Vyhodnocení Bylo provedeno pomocí lineární závislosti absorbance od koncentrace kyseliny gallové a objemu vzorku (vína/piva) použitého v práci. Obsah veškerých polyfenolů byl vyjádřen v mg kyseliny gallové v 1000 ml vzorku zaokrouhlených na celé číslo. (Balík, 1998) Stanovení veškerých polyfenolů s činidlem Folin-Ciocalteau Chemikálie a roztoky Standardní roztok: 50 mg kyseliny gallové v 100 ml roztoku, činidlo Folin-Ciocalteau, filtrovaný 20 % roztok Na 2 CO 3. Bc. Iva Machálková 28

29 Postup Pro snížení pěnivosti byly vzorky piva před použitím přefiltrovány přes filtrační papír. Vzorky vín nebyly nijak upraveny. Ze standardního roztoku kyseliny gallové bylo pipetováno do 50 ml odměrných baněk 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 ml roztoku. Současně bylo odpipetováno 0,5 ml od každého čirého vzorku bílého vína a piva, 0,1 ml červeného vína a 0,05 ml červeného vína barrique do 50 ml odměrný baněk. Do všech odměrných baněk bylo přidáno asi 20 ml destilované vody, 1 ml Folin-Ciocalteauova činidla a promícháno. Po třech minutách bylo přidáno 5 ml 20 % roztoku Na 2 CO 3, promícháno a doplněno destilovanou vodou po značku. Po 30 minutách byla měřena intenzita zbarvení v 10 mm kyvetě při 700 nm proti slepému pokusu (nulový obsah kyseliny gallové). Měření každého vzorku bylo provedeno ve čtyřech opakováních. (Balík, 1998) Vyhodnocení Bylo provedeno pomocí lineární závislosti absorbance od koncentrace kyseliny gallové a objemu vzorku použitého v práci. Obsah polyfenolů byl vyjádřen v mg kyseliny gallové v 1000 ml vzorku (vína/piva) zaokrouhlených na celé číslo. (Balík, 1998) Stanovení veškerých polyfenolů při 280 nm Postup Pro snížení pěnivosti byly vzorky piva před použitím přefiltrovány přes filtrační papír. Vzorky vín nebyly nijak upraveny. Ze standardního roztoku kyseliny gallové bylo pipetováno do 50 ml odměrných baněk 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ml roztoku. Současně bylo odpipetováno 5 ml od každého čirého vzorku bílého vína a 1 ml od každého čirého vzorku červeného vína a piva do 50 ml odměrný baněk. Ve všech odměrných baňkách bylo doplněno destilovanou vodou po značku. Byla měřena intenzita zbarvení v 10 mm křemenné kyvetě při 280 nm proti slepému pokusu (destilovaná voda). Měření každého vzorku bylo provedeno ve čtyřech opakováních. Vyhodnocení Bylo provedeno pomocí lineární závislosti absorbance od koncentrace kyseliny gallové a objemu vzorku použitého v práci. Obsah polyfenolů byl vyjádřen v mg kyseliny gallové v 1000 ml vzorku (vína/piva) zaokrouhlených na celé číslo. Bc. Iva Machálková 29

30 Stanovení anthokyanogenů Postup Pro snížení pěnivosti byly vzorky piva před použitím přefiltrovány přes filtrační papír. Vzorky vín nebyly nijak upraveny. Do kónické 250 ml baňky bylo odpipetováno 20 ml čirého vzorku (pivo a bílé víno), 1 g polyamidového prášku a 100 ml destilované vody. Baňka byla uzavřena a třepána 30 minut. Následně byl obsah baňky kvantitativně přefiltrován přes skleněnou fritu S3 a vrstva polyamidu na fritě byla třikrát promyta 20 ml destilované vody. Zachycený polyamid, na kterém byly adsorbované anthokyanogeny, byl kvantitativně převeden do zábrusové 150 ml varné baňky malou špachtlí a frita i špachtle byla opláchnuta 50 ml reagenční směsi. Varná baňka byla připevněna na zpětný chladič a zahřívána 20 minut ve vroucí vodní lázni. Poté byla baňka ochlazena na laboratorní teplotu a intenzita červenofialového zabarvení měřena při 550 nm proti slepému pokusu. Slepý vzorek byl připraven obdobným způsobem, avšak místo vzorku bylo pipetováno 10 ml destilované vody. Měření každého vzorku bylo provedeno ve čtyřech opakováních. (Balík, 1998) Vyhodnocení Ke stanovené hodnotě absorbance byla v tabulce přílohy č. 1 vyhledána koncentrace anthokyanogenů v 1000 ml vzorku (vína/piva). (Balík, 1998) 4.3 Matematicko-statistické vyhodnocení výsledků Střed souboru výsledků Pro výpočet střední hodnoty souboru výsledků je zvolen aritmetický průměr (výpočet viz rovnice 1, kde n je počet hodnot, i pořadové číslo hodnoty a x je naměřená hodnota). Před výpočtem aritmetického průměru jsou vypuštěny příliš odlehlé hodnoty způsobené hrubými chybami. Tyto hodnoty se vypočtou Q-testem tak, že se výsledky nejprve seřadí od nejnižší do nejvyšší hodnoty do řady: x 1, x 2, x 3,, x n-1, x n. Pak se vypočte hodnota Q podle rovnice 2. Jestliže tato hodnota překročí hodnotu q n (z tabulky přílohy č. 2) na hladině významnosti α = 0,10, výsledek se vypustí. Takto se postupuje z obou stran souboru tak dlouho, až hodnota Q < q n. Teprve z tohoto korigovaného souboru se počítá aritmetický průměr. (Davídek, 1977) Bc. Iva Machálková 30

31 Rovnice 1: Aritmetický průměr. Rovnice 2: Hodnota Q pro Q-test. Pro charakteristiku rozptýlení výsledků kolem střední hodnoty je použit výběrový rozptyl s 2 vypočtený podle rovnice 3. Rovnice 3: Výběrový rozptyl. Mírou reprodukovatelnosti analýzy je hodnota směrodatné odchylky, kterou při malém počtu výsledků (n < 7) vypočteme podle vztahu s = R. k n, kde R = x n x 1 a hodnoty k n jsou uvedeny v příloze č. 2 (hladina významnosti α = 0,05). Čím je menší směrodatná odchylka, tím je přesnější výsledek. Měřítkem přesnosti aritmetického průměru je směrodatná odchylka průměru (Davídek, 1977): Rovnice 4: Směrodatná odchylka průměru. Určení intervalu spolehlivosti L se provede s pomocí rovnice 5, kde u n jsou hodnoty tabelární uvedené v příloze č. 3. Použijí se hodnoty pro hladinu významnosti α = 0,05. Rovnice 5: Interval spolehlivosti. Významnost rozdílů mezi metodami a skupinami vzorků byla použita analýza rozptylu (variance), neboli jednofaktorová ANOVA (z anglického ANalysis Of VAriance). Data byla zpracována statistickým softwarem Statistica 8 a výsledky byly zobrazeny pomocí svorkových grafů prezentujících průměrné hodnoty a intervaly spolehlivosti na hladině významnosti α = 0,05. Základem této analýzy je získání rozptylu mezi skupinami (metody měření) S A viz rovnice 9, kde k je počet metod a n počet měření, a rozptylu uvnitř skupin S e viz rovnice 10, kde k je počet metod a n je počet měření v rámci metody. Porovnáním těchto rozptylů byla získána hodnotu testované statistiky F podle rovnice 11. Pokud překročí hodnota F hodnotu tabelovanou pro hladinu významnosti α = 0,01, pak mezi jednotlivými metodami existují statisticky podstatné rozdíly. Bc. Iva Machálková 31

32 Rovnice 6: Rozptyl mezi skupinami. Rovnice 7: Rozptyl uvnitř skupin. Rovnice 8: Testovaná statistika F. Pro stanovení, zda mezi jednotlivými metodami existuje lineární závislost, byl použit korelační koeficient (viz rovnice 12). Překročí-li vypočtená hodnota korelačního koeficientu hodnotu tabelovanou (tabulka v příloze č. 3) na hladině významnosti α = 0,01, považuje se závislost za statisticky významnou (Davídek, 1977). Rovnice 9: Výpočet korelačního koeficientu. Pro hodnocení korelačního koeficientu byla použita hladina pravděpodobnosti P = 99%. Případná závislost mezi metodami se vyjádřila tzv. rovnicí regresní přímky (viz rovnice 10). Posunutí regresní přímky a bylo vypočteno podle rovnice 11 a směrnice b podle rovnice 12. Rovnice 10: Rovnice regresní přímky. Rovnice 11: Výpočet posunutí regresní přímky. Rovnice 12: Výpočet směrnice regresní přímky. Bc. Iva Machálková 32

33 5 Výsledky a diskuse 5.1 Stanovení veškerých polyfenolů Při analýzách byl jako standard použit roztok kyseliny gallové, proto jsou všechny naměřené hodnoty uváděny v mezinárodně uznávaném zápisu mg.l -1 (GAE), neboli mg.l -1 ekvivalentu kyseliny gallové. Podle Jerumanis Vzorky použité pro stanovení veškerých polyfenolů metodou podle Jerumanis byly analyzovány v následujících koncentracích: piva a bílá vína 10 ml, červená vína 1 ml a Dornfelder Barrique 0,5 ml vzorku do 25 ml odměrné baňky. Provedeným Q-testem bylo dokázáno, že všechna měření provedená metodou podle Jerumanise, nejsou zatížena hrubými chybami při měření (hodnoty vypočteného Q jsou menší, než tabulkami předepsaná hodnota pro čtyři provedená měření 0,76). Koeficient determinace R 2 kalibrační křivky se při jednotlivých měřeních pohyboval v intervalu od 0,9963 do 0,9994. Podle předpokladu vykazovaly nejvyšší průměrný obsah veškerých polyfenolů vzorky červeného vína Merlot 676 ± 18 mg.l -1 (GAE), Dornfelder 623 ± 3 mg.l -1 (GAE) a Dornfelder Barrique dokonce 1790 ± 28 mg.l -1 (GAE). Výsledky vzorků bílého vína se pohybovaly v rozmezí hodnot ± 3mg.l -1 (GAE). Nejnižší koncentraci polyfenolů 17 ± 0,5 mg.l -1 (GAE) vykázal jediný zástupce lehkých piv Měšťan. Měření také prokázalo vyšší obsah veškerých fenolických látek v pivech vyšší stupňovitosti, než v pivech méně stupňových. Tento rozdíl se však pohybuje pouze v řádech jednotek mg. Naměřené hodnoty metodou podle Jerumanis ukázaly následující průměrné obsahy veškerých polyfenolů bílá vína 70 ± 3 mg.l -1 (GAE), červená vína 1030 ± 26 mg.l -1 (GAE) a piva 41 ± 3 mg.l -1 (GAE). Přehledné zobrazení dosažených průměrných výsledků u všech zkoumaných vzorků metodou podle Jerumanis je uvedeno v grafu v příloze č. 7. Všechny naměřené a vypočtené hodnoty jsou uvedeny v přílohách č. 4 až č. 6, kde je možné nalézt hodnoty směrodatných odchylek s, směrodatných odchylek průměru s x a intervaly spolehlivosti pro jednotlivé zkoumané vzorky. Bc. Iva Machálková 33

34 S činidlem Folin-Ciocalteau Pro stanovení veškerých polyfenolů spektrofotometrickou metodou s použitím Folin-Ciocalteau byly použity vzorky s následujícími koncentracemi: piva a bílá vína 0,5 ml, červená vína 0,1 ml a Dornfelder Barrique pouze 0,05 ml vzorku do 50 ml odměrné baňky. Podle Q-testu provedeného na výsledcích měření metodou s činidlem Folin-Ciocalteau, nebyla žádná z analýz ovlivněna hrubou chybou měření. Všechna získaná data je tedy možné použít pro další analýzy. Koeficient determinace R 2 kalibrační křivky se při jednotlivých měřeních pohyboval v intervalu od 0,9986 do 0,9998. Metodou s Folin-Ciocalteau činidlem byly nejvyšší koncentrace veškerých polyfenolů opět zjištěny v červených vínech, a především ve vzorku Dornfelder Barrique 3166 ± 348 mg.l -1 (GAE). Světlá piva výčepní vykazovala nižší hodnoty celkových fenolických látek oproti ležákům. Výjimkou však bylo pivo Pilsner Urqell, jehož hodnota dosáhla pouhých 380 ± 28 mg.l -1 (GAE). Množství polyfenolů v bílých vínech bylo průměrně stanoveno na 360 ± 39 mg.l -1 (GAE). Hodnoty koncentrací veškerých fenolických látek stanovovaných metodou s Folin-Ciocalteau činidlem uváděných v literatuře se značně liší. Gorinstein et al. (2000) určil u bílých vín 436 ± 16, u červených vín 831 ± 36 a u piva 345 ± 12 mg.l -1 (GAE). Pazourek et al. (2005) však u červených vín stanovil hodnoty v rozsahu od 1687 až do 4102 mg.l -1 (GAE) (tento rozsah je dán množstvím zkoumaných odrůd a typů vín zahrnující i vína Barrique). Vzorky piv ve studii Shahidi a Naczk (2004) vykázaly průměrný obsah polyfenolů mg.l -1 (GAE). Přehledné zobrazení dosažených průměrných výsledků u všech zkoumaných vzorků spektrofotometrickou metodou s použitím činidla Folin-Ciocalteau je uvedeno v grafu v příloze č 11. Všechny naměřené a vypočtené hodnoty jsou uvedeny v přílohách č. 8 až č. 10, kde je možné nalézt hodnoty směrodatných odchylek s, směrodatných odchylek průměru s x a intervaly spolehlivosti pro jednotlivé zkoumané vzorky. Stanovení veškerých polyfenolů při 280 nm Stanovení veškerých polyfenolů při vlnové délce 280 nm byly použity vzorky s následujícími koncentracemi: bílá vína 5 ml, piva 1 ml, červená vína 5 ml a Dornfelder Barrique 0,5 ml vzorku do 50 ml odměrné baňky. Bc. Iva Machálková 34

35 Provedením Q-testu na výsledcích měření nebyly zjištěny žádné hrubé chyby, proto byla pro další analýzu použita všechna získaná data. Koeficient determinace R 2 kalibrační křivky se při jednotlivých měřeních pohyboval v intervalu od 0,9962 do 0,9981. Metodou stanovení veškerých polyfenolů při 280 nm bylo dosaženo překvapivě nízkých koncentrací fenolických látek v červených a bílých vínech (od 219 do 247 mg.l -1 (GAE)). Výjimkou byl pouze vzorek červeného vína Dornfelder Barrique, který tyto hodnoty překračoval téměř 8 krát. Výsledky získané u vzorků zkoumaných piv vykazovaly průměrně nižší zastoupení fenolických látek u lehkých a výčepních piv. Macheix et al. (2000) uvádí tuto metodu jako jednoduchou a rychlou, avšak zatíženou nepřesnostmi způsobenými detekcí nefenolických sloučenin a rozdílnou detekovatelností jednoduchých fenolů. Přehledné zobrazení dosažených průměrných výsledků u všech zkoumaných vzorků metodou stanovení při vlnové délce 280 nm je uvedeno v grafu v příloze 15. Všechny naměřené a vypočtené hodnoty jsou uvedeny v přílohách č. 12 až č. 14, kde je možné nalézt hodnoty směrodatných odchylek s, směrodatných odchylek průměru s x a intervaly spolehlivosti pro jednotlivé zkoumané vzorky. Stanovení anthokyanogenů Množství anthokyanogenů bylo stanovováno pouze ve vzorcích bílých vín a piv. Podle provedeného Q-testu nejsou zjištěné hodnoty zatíženy hrubými chybami (při míře pravděpodobnosti P = 90%). Nejnižší obsah anthokyanogenů vykazovala světlá výčepní piva, a to přibližně 30 mg.l -1. Bílá vína společně s 12 pivem Regent Premium dosáhla nejvyšších hodnot pohybujících se na úrovni 70 mg.l -1. Zajímavá hodnota byla zjištěna u světlého ležáku Pilsner Urqell, který podle měření obsahoval téměř poloviční množství anthokyanogenů oproti ostatním ležákům a řadí se tak spíše na úroveň výčepních piv. Detailní zobrazení dosažených průměrných hodnot anthokyanogenů u všech zkoumaných vzorků je uvedeno v grafu v příloze č. 18. Všechny naměřené a vypočtené hodnoty jsou uvedeny v přílohách č. 16 až č. 17, kde je možné nalézt hodnoty směrodatných odchylek s, směrodatných odchylek průměru s x a intervaly spolehlivosti pro jednotlivé zkoumané vzorky. Bc. Iva Machálková 35

36 5.2 Srovnání metod Použité metody byly na základě získaných dat porovnány s pomocí analýzy rozptylu a korelačních koeficientů, díky kterým bylo možné potvrdit nebo zamítnout statisticky průkazné vztahy mezi jednotlivými metodami stanovení u rozdílných vzorků. Nejvyšší míru opakovatelnosti bylo možné pozorovat při zkoumání vzorků piv, kdy se odchylky hodnot od průměru jednotlivých metod pohybovaly na hranici 5%. Opakem byly vzorky bílých vín s poměrně vysokou proměnlivostí těchto odchylek, které se pohybovaly od 2 do 10 %. Analýza rozptylů mezi metodami byla provedena pro výsledky získané při měření bílých vín a piv, jelikož červená vína nebyla měřena metodou stanovení anthokyanogenů. Získaná hodnota testovaného rozdílu rozptylů F (viz tabulka 7) přesáhla tabelovanou hodnotu pro hladinu významnosti α = 0,01 a spočtená hladina významnosti p je nižší, než hodnota α. Mezi jednotlivými metodami tedy existuje statisticky významný rozdíl. Tabulka 7: Výsledky analýzy rozptylu (ANOVA) mezi všemi metodami pro výsledky bílých vín a piv. Rozptyly Stupně volnosti F Hladina významnosti Mezi skupinami S A ,8443 0,0037 Uvnitř skupin S e Celkové 4165 Pro zjištění, mezi kterými metodami existuje významný rozdíl, a pro grafické znázornění výsledků měření, byly zvoleny tzv. svorkové grafy znázorňující průměrnou hodnotu společně s intervalem spolehlivosti. Pro snazší porovnání dosažených hodnot byly vytvořeny dvě skupiny vzájemné porovnání vzorků v rámci metody a porovnání metod v rámci skupin vzorků (bílé, červené víno a pivo). Tyto grafy jsou uvedeny v přílohách č. 19 až č. 25. Z grafu v příloze č. 19 je zřejmý statisticky významný rozdíl mezi hodnotami polyfenolů určených metodou podle Jerumanis v červených vínech oproti výsledkům bílých vín a piv. Skupiny vzorků bílých vín a piv nevykazují vzájemně statisticky významný rozdíl. Toto rozložení je patrné i u metody stanovení veškerých fenolických látek činidlem Folin- Ciocalteau (viz graf v příloze č. 20). Naopak v grafu v příloze č. 21 je vidět významný rozdíl mezi hodnotami naměřenými pro bílá vína a hodnotami červených vín a piv metodou stanovení při 280 nm. Tento rozdíl mohl být způsoben náchylností metody stanovení polyfenolů při 280 nm ke Bc. Iva Machálková 36

37 zkreslení výsledků na základě obsahu dalších látek absorbujících UV záření (bílkoviny, aminokyseliny), kterou zmiňuje Shahidy a Naczk (2004). Hodnoty anthokyanogenů, podle grafu v příloze č. 22, vykazují významný rozdíl mezi vzorky bílých vín a piv, což ukazuje na rozdílné množství anthokyanogenů v zástupcích jednotlivých skupin, přesněji vyšší množství v bílých vínech, než v pivech. Skupiny vzorků, u kterých byly stanovovány hodnoty anthokyanogenů (bílá vína a piva), neprokázaly existenci statisticky významného rozdílu mezi metodami Jerumanis a stanovení anthokyanogenů. Metoda Folin-Ciocalteau v porovnání se všemi ostatními metodami dosáhla rozdílu, který je možno označit za významný u všech zkoumaných skupin vzorků. Při porovnání stanovení veškerých polyfenolů při 280 nm s ostatními metodami se pro jednotlivé skupiny vzorků projevila vysoká variabilita výsledků, což znamená, že u piv bylo takto dosaženo nejvyšších, u bílých vín druhých nejvyšších a u červených vín nejnižších hodnot ze všech použitých metod. Výsledné koncentrace veškerých polyfenolů získané postupem Folin-Ciocalteau dosahují nejvyšších hodnot ze všech použitých metod, což může být způsobeno vysokou citlivostí na interferující látky, tedy že se do výsledků promítají i látky nefenolických struktur. Stejná vlastnost se projevila i u metody stanovení při 280 nm, která obdobně jako Folin-Ciocalteau vykazovala u bílých vín a piv vysoké koncentrace veškerých polyfenolů. Pro jednotlivé vzorky byly z naměřených údajů vypočteny korelační koeficienty pro všechny přístupné kombinace použitých metod, tedy pro každý vzorek bylo získáno šest hodnot. Pro rozhodování o přijatelnosti vztahu mezi metodami byla stanovena hladina významnosti α na hodnotu 0,01. Pro tuto hladinu je určena tabelární kritická hodnota korelačního koeficientu na 0,9900 (viz příloha č. 2.). U vzorků bílých vín nebyla prokázána závislost u žádné z přípustných kombinací metod. Určitou závislost, i když statisticky neprůkaznou na stanovené hladině významnosti, prokázaly metody stanovení veškerých polyfenolů při 280 nm a stanovení anthokyanogenů, kdy průměrná hodnota korelačních koeficientů dosáhla hodnoty nad 0,900. U ostatních kombinací metod u bílých vín tato hodnota nepřekročila hranici 0,600. Bc. Iva Machálková 37

38 Kombinace metod stanovení veškerých polyfenolů v červených vínech stejně jako u bílých vín neprokázaly žádnou významnou závislost. Průměrné hodnoty korelačních koeficientů se dokonce pohybovaly v intervalu blízkém nule. Korelační koeficient pro vzorky piva jako jediný přesáhl kritickou hodnotu stanovenou v tabulkách. Jako statisticky průkaznou je možné označit závislost mezi metodou stanovení veškerých polyfenolů činidlem Folin-Ciocalteau a stanovení anthokyanogenů u vzorku světlého výčepního piva Staropramen (hodnota korelačního koeficientu r xy = 0,9986). Takto vysokého koeficientu však pro tuto kombinaci metod bylo dosaženo pouze u jednoho vzorku ze šesti zkoumaných piv, což nasvědčuje spíše náhodnému vzniku takovéto závislosti. Stabilní výsledky byly vypočteny pro kombinaci stanovení veškerých polyfenolů při 280 nm a stanovení anthokyanogenů, kdy korelační koeficienty všech vzorků piv (s výjimkou Pilsner Urqell) přesahují hodnotu 0,9500, která je kritická pro hladinu významnosti α = 0,05. Pro všechny skupiny vzorků (bílá, červená vína a piva) byla provedena vzájemná korelační analýza všech metod (s výjimkou stanovení anthokyanogenů) bez rozlišení zkoumaných vzorků. Výsledná korelační matice udávající korelační koeficienty pro jednotlivé kombinace metod je uvedena v tabulce 8 (významné koeficienty jsou vyznačeny tučně). Tabulka 8: Korelační matice metod stanovení polyfenolů pro vzorky bílých, červených vín a piv. Jerumanis Folin-Ciocalteau Folin-Ciocalteau 0, nm 0,6578 0,5261 Korelační koeficient kombinace metod Jerumanis a Folin-Ciocalteau ukazuje, na hladině významnosti α = 0,01, na závislost těchto metod, které se dají popsat rovnicemi regresních přímek v následujícím tvaru nebo opačně při korelačním koeficientu r xy = 0,9655. Pro výpočet korelační matice kombinací všech metod byly brány v úvahu pouze vzorky bílých vín a piv, jelikož v červených vínech nebyly stanovovány anthokyanogeny. Při použití stanovené hladiny významnosti α = 0,01 prokázaly určitou vzájemnou závislost pouze metody stanovení veškerých polyfenolů podle Jerumanise a stanovení anthokyanogenů viz tabulka 9 (významné koeficienty jsou vyznačeny tučně), což již částečně naznačila analýza rozptylu, díky které nebyl mezi těmito metodami prokázán statisticky významný rozdíl. Bc. Iva Machálková 38

39 Tabulka 9: Korelační matice metod stanovení polyfenolů pro vzorky bílých vín a piv. Jerumanis Folin-Ciocalteau 280 nm Folin-Ciocalteau -0,31 1, nm -0,73 0,66 Anthokyanogeny 0,93-0,10-0,59 Závislost metody Jerumanis (y) na Anthokyanogenech (x) je vyjádřena rovnicí regresní přímky a opačná závislost rovnicí. Podle Nitao et al. (2001) však tyto metody nelze zaměnit, jelikož metoda pro stanovení anthokyanogenů na rozdíl od metody Jerumanise a Folin-Ciocalteau detekuje pouze určitou skupinu látek (anthokyanogeny). Z výsledků metod stanovení veškerých polyfenolů tedy není možno stanovit poměr obsažených anthokyanogenů. Bc. Iva Machálková 39

40 6 Závěr Obsah veškerých polyfenolů a anthokyanogenů byl zjišťován ve vzorcích bílých, červených vín a piv spektrofotometrickými metodami stanovení podle Jerumanis, Folin-Ciocalteau, při 280 nm a stanovení anthokyanogenů s použitím butanol-hcl činidla. Jako standard byla použita kyselina gallová a výsledky uváděny v mg.l -1 ekvivalentu kyseliny gallové (GAE). Použitím metody stanovení veškerých fenolických látek při 280 nm byly zjištěny průměrné koncentrace polyfenolů ve vzorcích bílých vín 231 ± 6 mg.l -1, červených vín 788 ± 29 mg.l -1 a piva 742 ± 48 mg.l -1. Tato metoda vyniká svojí jednoduchostí a rychlostí. V literatuře nejlépe popsanou a v analytické praxi nejvíce používanou metodou pro stanovení veškerých polyfenolů je postup s použitím Folin-Ciocalteau činidla. Výsledky dosažené tímto měřením odpovídají hodnotám uveřejněným v několika odborných pracích. Pro bílá vína byla zjištěna průměrná koncentrace veškerých polyfenolů 360 ± 39 mg.l -1, u červených vín 2373 ± 160 mg.l -1 a u piv 482 ± 22 mg.l -1. Metodou podle Jerumanis, která je postupem podobná Folin-Ciocalteau, byly naměřeny následující průměrné hodnoty koncentrací veškerých polyfenolů bílá vína 70 ± 3 mg.l -1, červená vína 1030 ± 26 mg.l -1 a piva 41 ± 2 mg.l -1. Anthokyanogeny byly stanovovány ve vzorcích bílých vín a piva. Jedná se o poměrně časově náročnou metodu, jejíž přesnost záleží na dodržení teploty a délky reakčního působení činidla. U zkoumaných skupin vzorků byly průměrné koncentrace anthokyanogenů stanoveny na 72 ± 5 mg.l -1 u bílých vín a 56 ± 3 mg.l -1 u piv. Provedením analýzy rozptylu bylo zjištěno několik následujících faktů. Hodnoty červených vín získaných stanovením Folin-Ciocalteau se významně odlišují od výsledků ostatních metod. U bílých vín jsou významně rozdílné výsledky Folin-Ciocalteau a stanovení při 280 nm. Stejných závěrů bylo dosaženo i vzorků piv. Uvedené rozdíly mezi metodami mohly být způsobeny rozdílnou citlivostí metod na interferující látky, které jsou v jednotlivých skupinách nápojů přítomny. Výsledků bez vyšší hladiny rozdílnosti bylo u bílých vín a piv dosaženo při použití postupu Jerumanis a stanovení anthokyanogenů. Korelační analýzou metod byla na hladině významnosti α = 0,01, při vypuštění stanovení anthokyanogenů (které nebyly určovány pro červená vína), zjištěna určitá závislost mezi metodou Jerumanis a Folin-Ciocalteau. Při zahrnutí stanovení anthokyanogenů a vypuštění vzorků červených Bc. Iva Machálková 40

41 vín byla na stejné hladině významnosti zjištěna závislost mezi metodou Jerumanis a stanovení Anthokyanogenů. Bc. Iva Machálková 41

42 7 Souhrn Práce byla zpracována v letech na Ústavu posklizňové technologie zahradnických produktů na Zahradnické fakultě v Lednici Mendelovy univerzity v Brně. Cílem práce bylo popsat fenolické látky vyskytující se v potravinách, především pak ve víně a pivě, a charakterizovat jejich vlastnosti. Dále pak vybrat nejpoužívanější spektrofotometrické metody pro stanovení veškerých polyfenolů a na základě výsledků provedených měření provést srovnání použitých metod z pohledu jejich vzájemné zaměnitelnosti. V práci bylo uvedeno standardní rozdělení fenolických látek nalézajících se v potravinách společně se stručným přehledem jejich vlastností, s důrazem na polyfenoly nalézající se ve víně a pivě. V praktické části práce byly srovnávány výsledky stanovení veškerých polyfenolů dle Jerumanise, za použítí činidla Folin-Ciocalteau, měřením absorbance při 280 nm a metodu stanovení anthokyanogenů. Resume The thesis was disposed in years at The Department of Post-Harvest Technology of Horticultural Products, Faculty of Horticulture, Mendel University in Brno. The purpose of this work was to describe phenolic compounds which occur in foodstuffs, mainly in wine and beer and to define their characteristics. Also to choose the most widely used spectrophotometric assays for determination of all polyfenols and on the basis of results from performed measurement to compare used methods from the view of their reciprocal compatibility. In this work was also indicated default fission of phenolic compounds, that can be found in foodstuffs, together with short review of their characteristics, emphasis was placed on polyfenols in wine and beer. For practical part of this work were compared the results of determination of all polyfenols according to Jerumanis, using surfactant Folin-Ciocalteau, determination of absorbance at 280nm and method of determination leucoanthocyanidins. Bc. Iva Machálková 42

43 Literatura Antolovich, M., Prenzler, P., Robards, K.: Sample preparation in the determination of phenolic compounds in fruits. Analyst., 125, 2000, Balík, J.: Vinařství návody do laboratorních cvičení. Skriptum MZLU. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 1998, ISBN: Blovská, S.: Stanovení fenolových látek a jejich antioxidační aktivity v pivech a výchozích pivovarských surovinách. Brno, Diplomová práce na Agronomické fakultě Mandelovy univerzity. Vedoucí diplomové práce Pavel Stratil. Brune, M., Hallberg, L., Skanberg, A. B.: Determination of iron-binding phenolic groups in foods. Journal of Food Science, 56, 1991, Buhler, D. R., Miranda, C.: Antioxidant activities of flavonoids. (on-line) Oregon State University: Department of Environmental and Molecular Toxicology. Poslední revize únor 2000 (cit ) Dostupné z URL < Casas, E. M., Albadalejo, M. F., Planells, M. I. C.: Tyrosol bioavailibility in humans after ingestion of virgin olive oil. Clinical Chemistry, 47, 2001, Čepička, J., Karabín, M.: Polyfenolové látky piva Přirozené antioxidanty. Chemické listy, 96, 2002, Davídek, J.: Laboratorní příručka analýzy potravin. Praha: SNTL Nakladatelství technické literatury, Deshpande, S. S., Cheryan, M., Salunkhe, D. K.: Tannin analysis of food products. CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 24, 1986, Duthie, G. G., Gardner, P. T., Kyle, J. A. M.: Plant polyphenols: are they the new magic bullet? Nutrition Society, 62, 2003, Edenharder, R., Keller, G., Platt, K. L.: Isolation and characterization of structurally novel antimutagenic flavonoids from spinach (Spinacia oleracea). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2001, Faitová, K., Prugar, J., Lachman, J.: Polyfenolové látky v českých vínech. Výživa a potraviny, 1, 2007, 2 3. Folin, O., Denis, W.: On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagens. The Journal of Biological Chemistry, 12, 1912, Bc. Iva Machálková 43

44 Fulcrand, H., Remy, S., Souquet, J.-M-.: Study of wine tannin ologomers by on-line liquid chromatogramy electrospray ionization mass spectrophotometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 1999, García-Falcón, M. S., Pérez-Lamela, C., Martínez-Carballo, E.: Determination of phenolic compounds in wines: Influence of bottle storage of young red wines on thein evolution. Food Chemistry, 105, 2007, Gorinstein, S., Caspi, A., Zemser, M.: Comparative content of some phenolics in beer, red and white wine. Nutrition Research, 20, 2000, Hagerman, A. E., Zhao, Y., Johnson, S.: Methods for determination of condensed and hydrolyzable tannins. In Antinutrients and Phztochemicals in Food. Shahidi, F., ACS Symposium Series 662, American Chemical Society, Washington, D. C., 1997, Harborne, J.B.: Encyclopedia of Plant Physiology, Secondary Plant Products, Berlin: Springer- Verlag, Haslam, E.: Practical Polyphenolics. Cambridge: Cambridge University Press, 1998, ISBN: Hoff, J. F., Singleton, K. I.: A method for determination of tannin in foods by means od immobilized enzymes. Journal of Food Science, 42, 1977, Hough, J. S., Briggs, D. E., Stevens, R.: Malting and Brewing Science: Volume 2 Hopped Worth and Beer. New York: Aspen Publisher, 2 vydání, 1999, ISBN: Hughes, P. S., Baxter, E. D.: Beer: Quality, Safety and Nutritional aspects. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2001, ISBN: Cheynier, V.: Flavonoids in Wine. In Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications. Boca Raton: CRC Press, Kapitola 5, , ISBN: Cheynier, V.: Polyphenols in food are more complex then often thought. American Journal of Clinical Nutrition, 81, 2005, Juchelka, V.: Stanovení polyfenolických látek v pivu v pivovaru Janáček. Brno, Diplomová práce na Agronomické fakultě Mendelovy univerzity. Vedoucí diplomové práce Tomáš Gregor. Karabín, M., Čepička, J., Skoblík, R.: Stanovení antioxidační kapacity vybraných polyfenolů. Souhrny referátů XXII. symposia o nových směrech výroby a hodnocení potravin, května 2001, s Bc. Iva Machálková 44

45 Krebs, H. A., Wiggins, D., Stubbs, M.: Studies on the mechanism of the antifungal action of benzoate. Biochemical Journal, 214, 1983, Kunze, W.: Beer Foam. [on-line] Australian CraftBrewers, 2005, [cit ], Dostupné z URL: < Kyle, J. A. M., Duthie, G. G.: Flavonoids in Food. In Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications. Boca Raton: CRC Press, Kapitola 4, , ISBN: Ingr, I.: Základy konzervace potravin. Skriptum MZLU. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 1999, ISBN: Lachman, J., Hamoun, K., Orsák, M.: Červeně a modře zbarvené brambory významný zdroj antioxidantů v lidské výživě. Chemické listy, 99, 2005, Lee, H. S., Phenolic Compounds in Foods. In Handbook of Food Analysis. 2. vydání, New York: Marcel Dekker, Inc Kapitola 19, , ISBN: Lindsay, R. C.: Flavors. In Fennema s Food Chemistry. 4. vyd. Boca Raton: CRC Press, Kapitola 10, ISBN: Mabry, T. J., Markham, K. R., Thomas, M. B.: The Systematic Identification of Flavonoids. New York: Springer-Verlag Macheix, J. J., Fleuriet, A., Billot, J.: Fruit phenolics. Boca Raton: CRC Press, 2000, ISBN: Makkar, H. P. S., Dawra, R. K., Singh, B.: Determination of both tannin and protein in tanninprotein complex. J. Agric. Food Chem., 36, 1988, Manach, C., Scalbert, A., Morand, Ch., Rémésy, Ch., Jiménez, L.: Polyphenols: food source and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition, 79, 2004, Mandelová, L.: Antimutagenní aktivita obsahových látek v zelenině a ovoci. Brno, Disertační práce na Lékařské fakultě Masarykovy univerzity. Školitel disertační práce Jiří Totušek. Marshall, M.R., Jeongmok, K., Cheng-I, W.: Enzymatic browning in fruits, vegetables and seafoods. [on-line] Auburn: Nutrition and Food Science Department, 2000, [cit ] Dokument dostupné z URL < Mateus, N., Silva, A. M. S., Vercauteren, J.: Occurrence of anthocyanin-derived pigments in red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2001, Matějíček, D., Mikeš, O., Klejdus, B.: Changes in contents of phenolic compounds during maturing of barrique red wines. Food Chemistry, 90, 2005, Bc. Iva Machálková 45

46 Mattila, P., Astola, J., Kumpulainen, J.: Determination of flavonoids in plant material by HPLC with diode-array and electro-array detections. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 2000, Naczk, M., Wanasundara, P. K. J. P. D., Shahidi, F.: A facile spectrophotometric quantification method of sinapic acid in hexane-extracted and methanol-ammonia-water treated mustard and rapeseed meals. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 1992, Nitao, J. K., Birr, B. A., Nair, M. G.: Rapid Quantification of Proanthocyanidins (Condensed Tannins) with a Continuous Flow Analyzer. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2001, Oh, H. I., Hoff, J. E., Haff, L. A.: Immobilized condensed tannins and their interaction with proteins. Journal of Food Science, 50, 1985, Owades, J. L., Rubin, G., Brenner, M. W.: Determination of tannins in beer and brewing materials by ultraviolet spectroscopy. Proc. Am. Soc. Brew. Chem., 6, 1958a. Owades, J. L., Rubin, G., Brenner, M. W.: Food tannins measurement, determination of food tannins by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 6, 1958b, Paixão, N., Perestrelo, R., Marques, J. C.: Relationship between antioxidant capacity and total phenolic content of red, rosé and white wine. Food Chemistry, 105, 2007, Pietta, P., Gardana, C., Pietta, A.: Flavonoids in Herbs. In Flavonoids in health and disease.2. vyd. New York: Marcel Dekker, Inc., Kapitola 2, 43 70, ISBN: Pazourek, J., Gajdošová, D., Spanilá, M.: Analysis of polyphenols in wine: Correlation between total polyphenolic content and antioxidant potential from photometric measurements. Prediction of cultivars and vintage from capillary zone electrophoresis fingerprints using artificial neural network. Journal of Chromatography A, 1081, 2005, Saura-Calixto, F., Díaz-Rubio, M. E.: Polyphenols associated with dietary fibre in wine. A wine Polyphenols gap? Food Research International, 40, 2007, Scalbert, A., Johnson, I. T., Saltmarsh, M.: Polyphenols: antioxidants and beyond. Am. J. Clin. Nutr., 81, 2005, Senter, S. D., Robertson, J. A., Meredith, F. I.: Phenoloc compounds of the mesocarp of cresthaven peaches during storage and ripening. Journal of Food Science, 54, 1989, Shahidi, F.,Naczk, M.: Phenolics in food and nutraceuticals. Boca Raton: CRC Press, 2004, ISBN Bc. Iva Machálková 46

47 Sharp, R. N., Sharp, C. Q., Kattan, A. A.: Tannin kontent of sorghum grain by UV spectrophotometry. Cereal Chem., 55, 1977, Schwartz, S. J., vonelbe, J. H., Giusti, M. M.: Colorants. In Fennema s Food Chemistry. 4. vyd. Boca Raton: CRC Přes, Kapitola 10, ISBN: Siebert, K. J.: Haze formation in beverages. LWT, 39, 2006, Singleton, V. L., Orthofer, R., Lamuela-Raventos, R. M.: Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteau reagent. Methods Enzymol., 299, 1999, Slanina, J., Táborská, E.: Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenolů u člověka, Chemické listy, 98, 2004, Šmidrkal, J., Filip, V., Melzoch, K., Hanzlíková, I.: Resveratrol, Chemické listy, 95, 2001, Swain, T., Hillis, W. E.: Phenolic constituents of Prunus domestica. I. Quantitative analysis of phenolic constituents. Journal of the Science of Food and Agriculture, 46, 1959, Thavarajah, P., Low, N. H.: Adulteration of apple with pear juice: emphasis on major carbohydrates, proline and arbutin. J. Agric. Food Chem., 54, 2006, Tzagoloff, A.: Metabolism of sinapine in mustard plants. I. Degradation of sinapine into sinapic acid and choline. Plant Physiology, 38, 1963, University of Hamburg Department of Biology in the MIN-Faculty: The Secondary Metabolism of Plants - Phenolic Compounds. [on-line] Poslední revize [cit ] Dostupné z URL < Velíšek, J.: Chemie potravin 2. Tábor: OSSIS, 1999a, ISBN: Velíšek, J.: Chemie potravin 3. Tábor: OSSIS, 1999b, ISBN: Waterhous, A. L.: Determination of Total Phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. [on-line] University of California. Poslední revize 2002 [cit ] Dostupné z URL < Zoecklein, B. W., Fugelsang, K. C.: Wine analysis and production. New York: Aspen Publisher, 1999, ISBN: Zoecklein, B. W., Fugelsang, K. C., Gump, B. H.: Production Wine Analysis. New York: Van Nostrad Reinhold, 1990, ISBN: Bc. Iva Machálková 47

48 8 Přílohy Příloha č. 1:Závislost absorbance od koncentrace anthokyanogenů (Balík, 1998). Bc. Iva Machálková 48

49 Pokračování přílohy č. 1: Závislost absorbance od koncentrace anthokyanogenů (Balík, 1998). Bc. Iva Machálková 49