pro ZDRL Týden 27: ICQ

Transkript

1 Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 27: Odběr, transport a zpracování různých typů vzorků k mikrobiologickému mu vyšet etření Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz ICQ

2 Co nás n s dnes čeká Povídání o diagnostice vzorků z určit ité lokalizace společné zákonitosti a zásadyz Povídání o odběru a transportu vzorků z.jednotlivých lokalizací Povídání o diagnostice vzorků z jednotlivých lokalizací

3 Odečítání í bakteriologie Foto: archiv MÚ

4

5 Proces mikrobiologického vyšet etřování na všem v zález leží!!! PACIENT/LÉKAŘ LABORATOŘ Indikace vyšetření zda, jaké Vlastní provedení odběru Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález) Transport materiálu Zaslání výsledku Rozhodnutí, jak zpracovat Vlastní zpracování materiálu

6 1A Indikace ZDA provést Lékař, ke kterému přišel pacient k vyšetření, by se měl zeptat sám sebe: Co udělám jinak v.závislosti na výsledku vyšetření? Pokud zjistí, že ať vyjde vyšetření jakkoli, bude jeho další postup ve vztahu k pacientovi stejný, je vyšetření pravděpodobně zbytečné Toto ale neplatí u epidemiologických indikací (třeba začátek epidemie chřipky) a také u profylaktických indikací (jako je screening mikrobiálního osídlení pacientů v.těžkém stavu)

7 1A Indikace CO provést Rozhodnutím, že e lékal kař chce provést vyšet etření, to zdaleka nekončí.. Musí se ještě rozmyslet, jaké vyšet etření se rozhodne provést. Musí znát spektrum patogenů a možnosti jejich vyšet etření Součást stí je také rozhodnutí o tom, jak technicky se odběr r provede, do jaké nádobky či odběrov rové soupravy a podobně

8 Tři i typy patogenů (1) Patogen typu Streptococcus pyogenes. Nemusí se vědět, v že e se myslí zrovna na tohoto patogena, ale musí se přesnp esně vědět, kde je jeho předpoklp edpokládaná lokalizace. Patogen typu Mycobacterium tuberculosis. Musí se vědět, v kde patogena hledat, a zárovez roveň i to, že e se hledá právě tato skupina patogenů. Patogen typu Toxoplasma gondii.. Nemusí se vědět, kde se patogen v těle t nachází,, ale musí se vědět, v že e se hledá právě on.

9 Tři i typy patogenů (2) Patogen typu Streptococcus pyogenes. Týká se kultivovatelných bakterií a kvasinek Patogen typu Mycobacterium tuberculosis. Stále je to přímý p průkaz, ale speciáln lní postupy, při p i běžb ěžné kultivaci se nezachytí. Mykobakteria, gonokoky, legionely, plísn sně, paraziti apod. Patogen typu Toxoplasma gondii. Nepřímý průkaz, event. přímý p průkaz virového antigenu. Spirochety, viry, chlamydie, mykoplasmata aj.

10 Foto: O. Z.

11 2 Vlastní odběr r vzorku 3 Transport vzorku do laboratoře Tyto fáze f nelze oddělit odběr r je nutno činit již se zřetelem z na transport materiálu do laboratoře Jednotlivé typy vzorků budou probrány dáled Nelze zapomenout na správn vné vyplnění průvodky

12 Průvodka Správn vně vyplněná průvodka je základ z dobré diagnostiky je vodítkem, jaké vyšet etření se mám provést a jak Laborant není pasivním m prvkem,, který trpně opíš íše e to, co je na průvodce napíš íše. Naopak dobrý laborant si umí všimnout chybně vyplněné průvodky, volat na oddělen lení a požadovat doplnění

13 Průvodka 1 Správn vně vyplněná průvodka je velice důled ležitá! Osobní údaje: podstatné kvůli pojišťovn ovně,, ale i kvůli identifikaci, komu poslat výsledek apod. Přesný popis materiálu a požadovan adovaného vyšet etření nepsat pouze výtěr, když není jasné,, odkud ani stěr r z rányr ny nestačí (jaká rána, kde lokalizována) Katetrizovaná moč moč z permanentního katetru uvést, zda je požadov adováno např.. anaerobní vyšet etření nepožadovat vyšet etření,, které nelze provést nebo nemá smysl (např.. serologické vyšet etření TBC)

14 Průvodka 2 co uvést skutečnou diagnózu zu,, je-li více, v napsat tu, která souvisí s vyšet etřením, popř.. všechny v /např.. (1) diabetes mellitus, (2) poševn evní výtok/ akutní / chronický stav / kontrola po léčběl uvést stávaj vající nebo uvažovanou antibiotickou terapii,, případnp padně i alergii na antibiotika

15 Průvodka 3 co ještě uvést cestovatelská anamnéza návrat z tropů pracovní anamnéza práce v zemědělstv lství aj. u serologických vyšet etření datum prvních příznaků,, první / druhý vzorek u gynekologických materiálů fázi menstruačního cyklu (a při p i menses raději neodebírat) v případp padě mimořádných vzorků se dohodnout, telefonicky

16 4 Rozhodnutí,, jak zpracovat Je dáno standardními operačními postupy (SOP). Pro každý typ vzorku je dáno v SOP, jak má být vzorek zpracován a jaké metody na něj mají být aplikovány Ne vždy je ovšem vše dáno SOP. Zvláště ve vzácných a mimořádných případech je na rozhodnutí zkušeného laboranta či VŠ mikrobiologa, jak vzorek zpracovat V důležitých případech není naprosto chybou zatelefonovat do laboratoře a domluvit se.

17 5 Vlastní zpracování (1) Vlastní zpracování zpravidla zajišťuj ují laboranti, dříve se SŠS vzděláním, nyní s VOŠ nebo Bc. stupněm vysoké školy Postupuje se vždy přísně asepticky, aby se omezilo riziko laboratorní kontaminace. Práce v biohazard boxu je zároveň i dobrou prevencí profesionálních nákaz Foto: archiv MÚ

18 5 Vlastní zpracování (2) Zpracování bakteriologických kultivačních vzorků obvykle zahrnuje následujn sledující před vlastním m zpracováním m se některn které vzorky homogenizují,, centrifugují či i jinak upravují u některých n typů vzorků rychlé postupy mikroskopie, popř.. přímý p průkaz antigenu téměř vždy je základem z kultivace na několika n pevných půdáchp (KA + Endo + popř.. další ší) někdy téžt pomnožen ení v tekuté půdě (v případp padě výtěrů ze spojivky POUZE tento bod) Zpracování jiných vzorků (serologie, PCR, mykologie, parazitologie) je speciáln lní a je dána d typem vyšet etření a povahou vzorku

19 Laboratoř klinické bakteriologie Laborant 2 dělá opáčka ka : : u pozitivních vzorků připravuje testy citlivosti a testy bližší šího určen ení mikroba Mikrobiolog (VŠ) odečítá laboratoř prohlíží výsledky kultivací Laborant 1 zapisuje výsledky Foto: archiv MÚ

20 6 Zaslání výsledku Výsledek je zaslán n poté,, co je dokončen diagnostický proces.. Někdy N je poslán předběžný výsledek ( mezivýsledek( mezivýsledek ) ) po ukončen ení aerobní kultivace s tím, t že e to, co trvá delší dobu (kultivace kvasinek, anaerobů apod.) bude případnp padně zasláno dodatečně Výsledek už v sobě zahrnuje kus interpretace: mikrobiolog se vyjadřuje k evidentním kontaminacím, m, náhodným n nálezn lezům, běžb ěžné flóře, komentuje nález n v poznámce

21 Zaslání výsledku organizace zorganizovat tak, aby nedocházelo ke zbytečným prodlevám dnes zpravidla možnost využít zasílání vzorků elektronicky (v rámci r zdravotnického zařízen zení i mezi zařízen zeními navzájem) lékař dohodne s mikrobiologem (nebo napíš íše na průvodku), zda mám být zaslán n aža konečný ný výsledek nebo i mezivýsledek dohodnout, kam mám být výsledek poslán,, je-li při i odběru známo, že e bude pacient přelop eloženen

22 7 Interpretace Definitivní interpretace nálezu n v rukou lékal kaře. Pouze on, nikoli mikrobiolog, totiž drží v.rukou vedle mikrobiologického nálezu n také biochemický, rentgenový, ultrazvukový, a především m zná pacienta vypáčil z něj n anamnézu, vyšet etřil jej, popřípad padě (u obvodních lékařů) ) jej zná dlouhodobě. Samozřejm ejmě, konzultace klinika a mikrobiologa je u závaz važných případp padů velice vhodná.. Na druhou stranu nelze konzultovat každý nález. n

23 Interpretace příklady Laboratoř odfiltruje evidentní kontaminace. To, že výsledek není označen jako kontaminace, ovšem ještě neznamená, že e o ni nemůž ůže e jít. j Poznámka ke kvantitě ( ojediněle, masivně )) je užitečná,, ale nesmí se ale přecenitp U vzorků z dutin normáln lně osídlených běžb ěžnou flórou je nezbytné chápat ekosystém m mikrobů jako celek, nemoc je často porušen ením m rovnováhy mezi mikroby a léčba l antibiotiky nemusí být nutná Interpretace serologických vyšet etření samotná přítomnost protilátek tek není zpravidla významná důležitější je titr a jeho změny v čase u moderních reakcí (ELISA) poměr r IgM IgG; na indexu pozitivity zase tolik nezále leží

24 Pozitivní výsledek ale co znamená? Nalezený mikrob můžm ůže e být skutečný patogen součást st běžb ěžné flóry trvalé či i přechodnp echodné náhodný nález n (např.. z potravy u výtěrů z krku) kontaminace Lékaři i jsou rádi, r když má jejich laboratoř hodně pozitivních výsledků. Mohou to ale být náhodnn hodné kontaminace, kolonizace apod. Lepší je laboratoř,, která nevydává za nález patogena to, co patogenem s největší pravděpodobnost podobností není Léčit neexistující infekci je chyba

25 Průběž ěžná spolupráce mezi klinickým pracovištěm m a laboratoří Nejde jen o domluvu o konkrétn tních vzorcích! ch! Spolupráce můžm ůže e mít m t nejrůzn znější formy od občasných konzultací až po součinnost při p výzkumné práci je oboustranně užitečná klinikovi pomáhá při i rozhodování mikrobiologovi zase dávád konkrétn tnější představu o pacientech,, jejichž vzorky mu procházej zejí rukama.

26

27 Typy vzorků v klinické mikrobiologii Tekuté a kusové vzorky představují odebrané tkáně,, tělnt lní tekutiny, tekutiny, kterými bylo vyplachováno, umělé materiály vyňat até z těla t a podobně Stěry a výtěry jsou odběry vatovým tamponem na špejli či i drátku Ostatní vzorky: otisky, urikulty, sklíčka ka apod. Každý typ vzorku vyžaduje jiný přístup, p jiné zpracování,, jiné hodnocení výsledku.

28 Jak různr zné typy vzorků ovlivňuj ují vyšet etření Vzorky typu výtěr r ze spojivkového vaku. U zdravého člověka mikroby nejsou, i malá množstv ství mohou být významná.. Není vhodné nebo možné přímo očkovat o na pevné půdy, proto se nejprve pomnoží v půdách p tekutých Vzorky typu rána. r Opět t u zdravého člověka mikroby nejsou, i malá množstv ství mohou být významná, zároveň je však v třeba t rychle zachytit případnp padná velká množstv ství.. Očkuje O se zárovez roveň na tekuté i pevné půdy, často různorodr znorodé pevné půdy. Vzorky typu výtěr r z krku. U zdravého člověka obsahují běžnou flóru. Pomnožen ení v tekuté půdě nemá smysl, dávád se na různr zné pevné půdy.

29 Foto: archiv MÚ Výtěry a stěry Dnes již prakticky neexistuje kultivační indikace suchého ho tamponu bez transportního média. m Tento tampon je indikován n praktický výhradně pro vyšet etření metodou PCR a některn které průkazy antigenů Používaj vají se tedy transportní média.. Na bakteriologii je to zpravidla médium m Amiesovo (na obrázku) Speciáln lní média vyžaduj adují houby (Fungiquick), houby + trichomonády z genitáli lií (C. A. T.), viry, chlamydie Potřebuji ebuji-li se dostat za roh,, použiji tampon na drátu a nikoli na špejli.

30 Některé odběrov rové soupravy zleva: CAT FungiQuick souprava na chlamydie suchý tampon s.drátem Foto: archiv MÚ

31 Odběrov rové soupravy ještě jednou Foto O. Z.

32 Přehled výtěrovek Suchý tampon na špejli: průkaz antigenu a DNA Tampon v Amiesu na špejli: univerzáln lní pro bakteriologickou kultivaci (vč.. anaerobů, kapavky, kampylobakt.) Fungiquick houby Suchý tampon na drátku: totéž,, potřebuji ebuji-li se dostat na jinak nedostupné místo Tampon v Amiesu na drátku: totéž,, potřebuji ebuji-li se dostat na jinak nedostupné místo C. A. T. houby a trichomonády (stěry z pohlaví) Soupravy s médiem na viry, popř. chlamydie

33 Odběrov rové nádobky Odběrov rové nádobky se používaj vají na kusové a tekuté vzorky.. Na rozměrech rech fakticky přílip liš nezále leží,, stejně tak barva uzávěru nemá samozřejm ejmě reálný dopad. Má však někdy n význam organizační záleží na dohodě v rámci r konkrétn tní laboratoře U anaerobní kultivace je lépe l zaslat přímo p stříka kačku ku s.jehlou zabodnutou do sterilní gumové zátky Vzorky se snažíme vždy v dopravit do laboratoře e co nejdříve ve,, zásadnz sadní je to však v u moče do dvou hodin

34 Příklady nádobek Vlevo klasická zkumavka, např.. na sérum, vpravo kontejnerek na střevn evní parazity Foto: archiv MÚ

35 Co se například posílá,, a jak rychle se to musí dopravit Moč do dvou hodin, pokud nelze, nutno dát d t do ledničky (výjimka!!!) Sérum (srážliv livá krev) na čase tolik nezále leží,, ani na teplotě (ale lépe l nechat v ledničce) Punktáty, ty, exsudáty, různr zné podobné tekuté materiály co nejrychleji, ale není dán n přímo p časový limit. Nelze-li li zpracovat hned, je lépe l nechat při p i pokojové teplotě,, ne do ledničky! Odstřižen ené katétry try vhodné zalít t bujonem či fyziologickým roztokem, aby nevyschly. I zde je vhodné rychlé zaslání event. pokojová teplota.

36 Jiné typy odběrů než výtěrovky a odběrov rové nádobky nátěr r na podložní sklíčko: ko: kapavka, aktinomykóza, přímo zaslaná tlustá a tenká kapka apod. v kožním m lékal kařství otisky přímo na kultivační půdu, která je pro tento účel nalita aža po okraj Petriho misky urikult zvláš áštní způsob zasílání moče e na půdu; p z.různých zných důvodd vodů se přílip liš neujalo. rychlé diagnostické soupravy,, většinou v založen ené na přímém m průkazu antigenu; jednoduchá manipulace, dostupná i pro nemikrobiologický personál. Při P pochybách o výsledku použít t klasické zaslání do laboratoře.

37

38

39 Výtěr z krku hauser/labs/microbiology/st rep_detection/throat_swab _P jpg

40 Odběr r vzorků na vyšet etření z dýchacích cest Na bakteriologii se posílaj lají výtěry (z krku, tonzil, nosu apod.), vždy v na tamponu v.transportní půdě (např.. Amiesově) sputum, tracheáln lní aspirát či i bronchoalveolárn rní laváž u bronchitid a pneumonií hemokultury u pneumonií Viroví původci se většinou v nevyšet etřují.. Je-li výjimečně potřeba je vyšet etřit, volíme např.. výplachy z nosohltanu a bronchoalveolárn rní laváže e speciáln lním m médiem, m či krev na serologii respiračních virů Na mykologické vyšet etření volíme výtěr r na tamponu v soupravě FungiQuick

41 Vyšet etřen ení sputa /mech/cases/case9/sputum1.jpg

42 Co se se vzorky děje d v laboratoři Většina výtěrů se kultivuje na krevním m agaru. Na ten se umisťuj ují disky, jejichž cílem je odclonit běžb ěžnou flóru a umožnit záchyt z patogenů.. Kvůli hemofilovi, který na KA roste jen v přítomnosti p např.. zlatého stafylokoka, se na agar očkuje o stafylokoková čára U sput apod. se také provádí mikroskopie Kromě KA se užívaju vají další půdy,, např.. Endova Virologické vzorky se izolují na vajíčkách či tkáňových kulturách, nebo se hledá antigen V serologických vzorcích ch se hledají protilátky tky

43 Vyšet etření sputa Diagnostické schéma (1) Den 0: mikroskopie (Gramovo barvení) Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA, EA a NaCl. Je-li přítomna p jen běžb ěžná flóra, EA se vyhodí a KA a NaCl se prodlužuje uje do další šího dne. Případný P patogen se určuje uje a testuje se jeho citlivost; je-li ho málo m dělád se jeho izolace (kolonie se opatrně nabere kličkou kou a naočkuje se na celou misku křížovým k roztěrem rem tak, aby se určit itě získal čistý kmen

44 Vyšet etření sputa Diagnostické schéma (2) Den 2: expedice negativních výsledků (prohlížen ení prodlužek,, jak říkáme u nás, n či dohřívek,, jak říkají v nemocnici na Homolce). Expedice většiny v pozitivních výsledků,, je-li bližší určen ení hotovo a test citlivosti uspokojivý. Není-li, nebo je-li hotova teprve izolace, jede se dál. d Den 3: expedice většiny v zbylých pozitivních výsledků (rezistentní, špatně určiteln itelné,, z izolací) Den 4: výjimečně expedice posledních výsledků

45 Výtěr r z krku Diagnostické schéma Den 0: pouze nasazení kultivací Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA a EA. NaCl se zde nepoužívá.. I v tomto případp padě se KA s běžb ěžnou flórou prodlužuj ují Den 2: expedice všech v negativních a většiny v pozitivních výsledků Den 3: expedice téměřt všech zbylých pozitivních výsledků

46 Záchyt patogena v krku či i sputu

47 Kultivační výsledek výtěru z krku s běžb ěžnou flórou V těchto místech pátráme po hemofilech Foto: archiv MÚ

48 Co je potřeba vědětv Na průvodku je nutno uvést, o jaký vzorek jde, jaké vyšet etření je požadov adováno, a případnp padně další podstatné údaje Laboratoř má právo odmítnout špatně odebraný vzorek sputa (nehnisavý, neobsahuje leukocyty, jen epitelie jsou to sliny!!!) Kultivace tuberkulózy musí být požadov adována zvláš ášť,, i když se posílá stejný vzorek sputa U virologie a průkaz kazů různých antigenů se případně posílaj lají suché tampony, výplachy z.nosohltanu (izolace viru) a podobně

49

50 Odběr r a transport stolice na jednotlivá vyšet etření Bakterie v Amiesově transportní půdě Kvasinky v půděp FungiQuick Viry vzorek velikosti lískovl skového oříšo íšku; má-li m být provedena izolace viru, je nutno chladit Paraziti opět t velikosti lískovl skového oříšo íšku, nemusí být sterilní.. Označit cestovatelskou anamnézu! Zpravidla tři t i vzorky. Roupi Grahamova metoda perianáln lní otisk na speciáln lní lepicí pásku, mikroskopuje se Otravy zvratky, zbytky jídelj

51 Diagnostika bakteriáln lních původcp vodců Přímý průkaz toxinu A (Clostridium difficile) jako antigenu. Průkaz toxinu je důled ležitější než samotný nález n klostridia to mohou mít m t i zdraví! Kultivace na různých r půdách p (výběr r závisz visí na stáří pacienta a diagnóze) U U cestovatelů přidáváme i méněm obvyklé půdy Průkaz toxinu A u C. difficile. Foto archiv MÚ

52 Kultivace stolice Den 0. (přijat ijatá stolice) selenit XLD endo MCs KA 24hod 48hod MAL endo 28 C CIN 42 C CCDA Nacl Negativní výsledek je za 48h Pozitivní za 72h a déled + 72hod identifikace Schéma: Lenka Černohorská *Není-li uvedeno jinak kultivace probíhá při 37 C

53 Identifikace bakterie Bakterie kultivujeme na různých r půdáchp ch, na kterých mají charakteristický vzhled Bakterie dále d identifikujeme biochemickými testy V některých n případech p padech (salmonely, escherichie) je žádoucí antigenní analýza vypěstovan stovaného kmene

54 Plazivý mikrob Proteus mirabilis er-garten/pics/pat05.jpg

55 Průkaz enterotoxikóz Nestačí kultivační průkaz mikroba Vždy nutný průkaz toxinu (pokud není dostupný v nejbližší mikrobiologické laboratoři, lze požádat o spolupráci např. referenční laboratoři Pokud možno vyšet etřit i vzorek jídlaj

56

57 Odběr r a transport moče Nejspolehlivější je moč získaná suprapubickou punkcí.. V praxi se ovšem používá málokdy Poměrn rně dobrá je také katetrizovaná moč (katetrizace provedená kvůli odběru) Běžně odebraná moč nemusí být špatným vzorkem, je-li správn vně odebrána a zaslána Moč z permanentního katetru je k ničemu, s.výjimkou případu, p padu, kdy chceme zjistit osídlen dlení katetru

58 Permanentní katetr (lepší obrázek jsem na internetu nenašel) el)

59 Odběr r moče e spontánn nně vymočen ené ze středn edního proudu moči i spontánn nně vymočen ené (rutinní typ s rizikem sekundárn rní kontaminace během b odběru) postup: nádoba pro odběr r moči i musí být sterilní,, se širokým hrdlem (např. kádinka) dinka)*, poučený pacient si před p odběrem důkladnd kladně omyje zevní genitálie vodou a mýdlem a otře si zevní ústí močov ové trubice tamponem smočeným v dezinfekčním m roztoku (u dětíd se použit ití dezinfekčního roztoku nedoporučuje). uje). *pokud ale pacient močí přímo ve sprše, můžm ůže e močit přímo p do zkumavky, a poté se omyje pacient i zkumavka zvenku, a odpadá další manipulace

60 Odběr r moče e u muže e a ženy Muži jedním m krouživým tahem Ženy zaujmou široký postoj nad klozetovou mísou, jednou rukou oddálí labia a druhou rukou tamponem otřou ou genitálie předozadnp edozadním pohybem. Poté pacient odmočí první porci moče e a do sterilní nádoby bez přerup erušení močen ení zachytí středn ední proud.. Odebraná moč se přelije p do sterilní nádobky určen ené k transportu. (Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně, DOPORUČEN ENÉ POSTUPY PRO PRAKTICKÉ LÉKAŘE, Projekt MZ ČR R zpracovaný ČLS JEP za podpory grantu IGA MZ ČR R )

61 Odběr r moče e u ženy Důležité je prsty odtáhnout malé stydké pysky od proudu moče tak, aby moč nebyla kontaminována mikroflórou vulvy Foto: archiv O. Z.

62 Výjimky z pravidel o odběru moče U podezřen ení na záněty z močov ové trubice se bere první porce moče (spláchnou se mikroby ze stěny trubice). U zánětůz prostaty se naopak hodí poslední porce moče Poslední porce moče se zasílá také v případp padě podezřen ení na parazitárn rní infekci (např. schistosomózu)

63 Transport moče Pro hodnocení močov ové infekce je důled ležitá kvantita viz dále. d Tu však v lze hodnotit pouze v případp padě, že e se mikroby v moči během transportu nepomnoží pokud se pomnoží,, kvantitativní poměry se změní Proto je moč bezpodmíne nečně nutno dopravit do laboratoře do dvou hodin po odběru (raději ještě rychleji) Pokud zcela výjimečně toto nelze dodržet, je potřeba moč dát do ledničky (u jiných vzorků se to naopak nedoporučuje) uje)

64 Soupravy typu URIKULT Smyslem těchto t souprav je odstranit čas mezi odběrem moče e a začátkem kultivace. Moč se odebere a ihned se do nín zanoří speciáln lní destička s kultivačními půdami. p Poté se moč vylije a půdy p se začínaj nají kultivovat (třeba přímo na oddělen lení) Na těchto t destičkách se však v mikroby obtížně diagnostikují.. Tato metoda se proto neujala tak, jak se od nín původně očekávalo Pokud užu se používaj vají,, je nutno bezpodmíne nečně dodržet správný postup

65 Kvantitativní a semikvantitativní vyšet etření moče Při kvantitativním vyšetření se moč ředí a očkuje se na několik kultivačních půd Při semikvantitativním vyšetření se moč neředí, avšak používá se kalibrovaná klička na jedno použití. Vyšetření je méně pracné, ale také méně přesné Samozřejmě se hodnotí nejen kvantita, ale zároveň se normálním způsobem diagnostikuje, o kterého mikroba jde

66 Semikvantitativní vyšet etření I Použije se kalibrovaná klička ka o objemu 1µl1 To znamená, že e při p i ponořen ení do vody či tekutiny s podobným povrchovým napětím m ulpí v očku o kličky ky právě jeden mikrolitr Celý objem se rozočkuje na půl p l nebo celou misku s agarovou půdoup Poté se normáln lně inkubuje (24 h, 37 C) Druhý den se spočítaj tají kolonie.. Podle počtu kolonií se interpretuje výsledek Používá se zpravidla krevní agar + jedna další půda. V naší laboratoři i se v poslední době používá chromogenní půda URICHROM.

67 Foto O. Z. Bakterie na půděp urichrom

68 Semikvantitativní vyšet etření II Počet kolonií po inkubaci odpovídá počtu CFU v 1 µl l původnp vodní moče CFU = colony forming unit, jednotka tvořící kolonii. Jednotlivý mikrob, dvojice, krátký řetízek, malý shluk. V praxi zanedbáváme rozdíl l mezi mikrobem a CFU, říkáme tedy, že e počítáme mikroby, i když ve skutečnosti počítáme CFU Pokud tedy počet kolonií zhruba odpovídá počtu mikrobů v 1 µl l původnp vodní moče, pak počet kolonií 1000 odpovídá počtu mikrobů v 1 ml původnp vodní moče. 10 kolonií 10 4 mikrobů v mililitru, 100 kolonií 10 5 mik/ml

69 Automatické kultivační systémy Některé firmy dnes nabízej zejí automatické kultivační systémy my,, které detekují pozitivitu již po čtyřech hodinách a hlásí i antibiotickou citlivost (italský systém UroQuick). NěkterN které,, zejména soukromé laboratoře takové systémy vítajv tají. Tento přístup p je však v velice rizikový,, protože antibiotická citlivost bez určen ení druhu bakterie je velice zrádn dná.. Pokud je takový systém m doplněn n možnost ností klasické diagnostiky, nemusí být nutně na škodu. Je však nepřípustn pustné používat takový systém m bez toho, aby jeho výsledky interpretoval mikrobiolog (např.. umíst stění přístroje do biochemické laboratoře)

70 ms/l173/mbahmu/urine.gif

71 Interpretace vyšet etření moče e I Při i nálezu n jednoho druhu mikroba platí: Kvantita nad 10 5 mikrobů v 1 ml se považuje za pravděpodobnou podobnou močovou ovou infekci. U starých lidí to ovšem můžm ůže e být kolonizace Kvantita je hraniční.. Jsou-li pochybnosti o kvalitě odběru (např.. u kojenců), považuje se spíš íše e za kontaminaci. Významná je spíš íše e u mužů a u dětí. d Kvantita pod 10 4 se považuje za kontaminaci Neplatí u punktované a katetrizované moči.

72 Interpretace vyšet etření moče e II Při i nálezu n dvou mikrobů platí Kvantita do 10 5 je zřejmz ejmě kontaminace Kvantita nad 10 5 je sporná (hraniční) Při i nálezu n třít mikrobů platí V podstatě vždy se považuje za kontaminaci Výjimka: jeden mikrob v kvantitě nad 10 5, ostatní dva naopak pod 10 4 první mikrob se považuje za pravděpodobn podobného původcep V praxi se zohledňuje také o jaké mikroby jde apod. (stafylokoky se berou méně vážně )

73 Diagnostika infekcí pohlavních, kožních, očnícho

74 Odběry z genitáli lií Ke kultivaci se používá transportně kultivační souprava C. A. T. (kvasinky a trichomonády) a Amies (bakterie včetnv etně gardnerel, mykolplasmat a anaerobů). Z CATu se provádí mikroskopie ve formě nativního preparátu Doporučuje uje se také poslat sklíčko ko nebo dvě sklíčka ka (podle situace) na barvení.. Klasické zaslání dvou sklíček je MOP mikrobní obraz poševn evní V případp padě průkazu kapavky, syfilis, chlamydií, papilomavirů se užívaju vají zvláš áštní postupy

75 Odečítání kultivací z pohlavních Den 0 odběr a zasl orgánů r a zaslání vzorku, případnp padná mikroskopie zaslaného sklíčka ka Den 1 odečet et KA, EA, popř. ČA A + GC (kapavka) Den 1 2 odečet et C. A. T. (trichomonády) Den 2 odečet et NaCl, gardnerel, anaerobní kultivace, popř. ČA A + GC (definitivně) Den 1, 2, 3, 4 odečet et kultivace kvasinek Den 6 odečet et kultivace mykoplasmat

76 MOP mikrobní obraz poševn evní Posílaj lají se dvě sklíčka ka.. Jedno se obarví dle Grama, druhé dle Giemsy (hlavně kvůli trichomonádám) m) Hodnotí se jednak kvantita jednotlivých útvarů,, jednak celkový vzhled preparátu. Dosud se používá dělení na šest typů,, ale postupně se přehodnocujep MOP I tzv. normáln lní obraz zdravé ženy MOP II bakteriáln lní nehnisavý (i fyziologický) MOP III bakteriáln lní hnisavý MOP IV kapavka MOP V trichomonóza MOP VI kvasinková infekce

77 MOP I (Giemsa)

78 MOP II MOP II bakteriáln lní vaginóza za

79 MOP III (bakteriáln lní hnisavý)

80 MOP IV (kapavka)

81 MOP V (trichomonóza)

82 MOP VI (Giemsa)

83 MOP VI (Gram) pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-3.htm.

84 Diagnostika nemocí s kožními projevy U řady běžb ěžných dětských d nemocí není laboratorní diagnostika nutná,, nemoci jsou poznatelné klinicky Pokud by se měly m diagnostikovat,, dělád se to zpravidla serologicky U spály je podstatné vyšet etření výtěru z.krku, z které odhalí streptokoka U skutečných kožních infekcí se provádějí stěry, otisky apod.; na mykologii se posílaj lají šupiny aj. Kultivuje se běžb ěžným způsobem

85 Diagnostika očních o infekcí V případp padě povrchových infekcí se posílaj lají výtěry ze spojivkového vaku. V laboratoři i se primokultivují pouze v bujónu Při podezřen ení na akantaméby je k vyšet etření je nutno poslat celé kontaktní čočky v jejich tekutině,, popř.. provést seškrab rohovky V případp padě hlubší ších infekcí se materiál l na přímý průkaz odebírá jen tehdy, je-li to možné bez toho, abychom pacienta vyšet etřením poškodili. V některých n případech p padech (toxoplasmosa) lze hledat protilátky. tky.

86

87 Hemokultury odběr r krve Jedná se o nesrážlivou krev,, principiáln lně zcela odlišné vyšet etření než vyšet etření serologická Dnes zpravidla odběr r do speciáln lních lahviček pro automatickou kultivaci Nutno odebrat dvě,, ale ještě lépe tři t hemokultury při i vzestupu teploty Ideáln lně pokaždé z nového vpichu,, nebo aspoň jedna venepunkce + centráln lní žíla + periferní žíla (odlišen ení bakteriémie od kolonizace vstupu)

88 Zásady odběru krve Odebírat asepticky!!! Nejen kvůli pacientovi, ale i kvůli vzorku. Nestačí očistit kůžk ůži benzinem, nutná desinfekce Desinfekci nechat působit p dostatečně dlouho,, u alkoholových prostředk edků do zaschnutí (nechat skutečně zaschnout) Nejlépe použít t tři t i stejné hemokultivační nádobky.. PřípadnP padně doplnit např.. jednou anaerobní Hemokultury popsat,, nezapomenout na čas odběru

89 Pseudobakteriémie příčiny Nevhodně provedený odběr,, nedostatek asepse při p i odběru krve Odběr r pouze ze zavedených vstupů (zachytí se bakterie kolonizující vstup, která však nemusí být původcem p skutečné bakteriémie, natož sepse)

90 Jak zamezit pseudobakteriémii I Odebírat hemokultury cíleně,, když je přítomnost p bakterií v krvi pravděpodobn podobná,, naopak neodebírat z.rozpaků když je indikováno no jiné vyšet etření Odebírat hemokultury v dostatečné kvantitě: jedna je k ničemu, i dvě jsou málo, m tři t i je optimum Odebírat hemokultury z vhodných míst: m nejméně jednu z nové venepunkce, ideáln lně tři i venepunkce plus odběr r z žilního katetru Odebírat hemokultury ve vhodnou chvíli li,, u septických stavů typicky při p i vzestupu teploty

91 Jak zamezit pseudobakteriémii II Odebírat hemokultury správn vně,, velmi důled ležité a často opomíjen jené je dodržen ení aseptického odběru (desinfekci nechat doopravdy zaschnout) Odebírat hemokultury do správn vné soupravy: zpravidla není důvod posílat aerobní a anaerobní, není-li skutečné podezřen ení na anaeroby. Odběr r do lahviček s aktivním m uhlím m je nutný přinejmenp inejmenším m tam, kde je pacient již zaléčen antibiotikem Doprovodit hemokultury dobře e vyplněnou nou průvodkou: nutné je nejen datum, ale i čas odběru pro interpretaci nálezun

92 Jak zamezit pseudobakteriémii III U podezřen ení na kontaminovaný cévnc vní katetr se katetr mění. m. Starý katetr nevyhazujeme, nýbrž pošleme na bakteriologii. Dnes již existují metody schopné odhadnout, zda jde o skutečné osídlen dlení katetru či i náhodný n nálezn Totéž samozřejm ejmě platí pro jakékoli koli implantáty, ty, které se vyjímaj mají z tělat jejich mikrobiologické vyšet etření může e přinp inést podstatnou informaci pro další léčbu

93 Druhy kultivačních nádobekn Existují různé typy podle toho, které mikroby mají být předevp edevším m zachyceny (aerobní,, anaerobní,, kvasinky) Některé nádobky obsahují aktivní uhlí. Jsou určeny ke kultivaci krve pacientů, kteří už berou antibiotika (klasická lahvička by mohla dát d t falešně negativní výsledek antibiotikum by potlačilo růst) r Nejběž ěžnější jsou aerobní standardní, aerobní s uhlím m a anaerobní s uhlím.

94 Příklady nádobek n na hemokultivaci

95 Fungování kultivátor torů Kultivátor, tor, napojený na počíta tač, automatický udržuje uje optimáln lní podmínky kultivace, a zárovez roveň vyhodnocuje stav nádobky a indikuje případný p padný růst r (např. změna tenze CO 2 ) Růst je zvukově a opticky signalizován. Pokud ani po týdnu nic neroste, signalizuje to přístroj p také (je třeba t expedovat negativní výsledek)

96 Foto: O. Z. Automat na hemokultury

97 Hemokultivační automat otevřený ený Foto: O. Z.

98 Když je hemokultura pozitivní Lahvička je vyjmuta z přístrojep Je nutno zaevidovat čas, resp. dobu od příjmu do pozitivity. Čím m delší je tato doba, tím t m je pravděpodobn podobnější, že e jde o kontaminaci Provádí se vyočkov kování na pevné půdy, nátěr r na sklo barvený Gramem a podle jeho výsledku zpravidla napřímo orientační diskový test citlivosti; místo standardní suspenze se použije přímo p tekutina z lahvičky není spolehlivé

99 Další postup Je třeba t počítat s tím, t že testy napřímo jsou jen orientační,, užu pro nestandardní obsah baktéri rií v jednotlivých krvích. Zpravidla se proto v další ším m kroku provádí řádné vyšet etření citlivosti Výjimkou jsou případy, pady, kdy jde asi o kontaminaci (pozitivní jen jedna hemokultura ze tří, t, nebo pozitivní všechny, ale evidentně různé kmeny, pozitivita aža za delší dobu, koaguláza negativní stafylokoky)

100 E. coli v hemokultuře, e, fázový kontrast

101 Cévní katetry V případp padě pacientů se zavedenými katetry je vždy podezřen ení na katetrový původ p sepse V takovém m případp padě je nutno odebírat hemokultury jak z katetru, tak i ze zvláš áštních odpichů Posílaj lají se také odstřižen ené části katetrů,, a je velmi důled ležité,, jak budou vyšet etřeny. eny.

102 Klasické zpracování cévních katetrů Klasická kultivace v bujonu: katetr se vloží do tekuté půdy a kultivuje 24 h. Je-li po této t to době bujon zakalený, je vyočkov kován n na pevnou půdu a případnp padné bakterie identifikovány. ny. Co se stane: Uvolní se bakterie v.planktonickv planktonické formě.. Bakterie ve formě biofilmu se uvolní málo nebo vůbec. v Vzhledem k použit ití bujónu jako pomnožovac ovací půdy nevíme nic o kvantitě (kontaminace infekce).

103 Nové možnosti zpracování katetrů Semikvantitativní metoda: Bujon se oválí po povrchu pevné půdy. Co se stane: zmapujeme povrch katétru tru a semikvantitativně posoudit nález, n nevypovídá však o bakteriích uvnitř a bakterie se nemusí uvolnit z biofilmu. Sonifikace: biofilm rozbijeme ultrazvukem. Co se stane: rozruší šíme biofilm na povrchu i uvnitř katétru. tru. Vyočkov kování určit itého objemu vzorku je kvantitativní metoda, takže e dávád možnost posoudit množstv ství mikrobů.

104 (hepatitid, infekce HIV apod.)

105 Systémov mové virózy Základem je průkaz protilátek tek,, případnp padně také průkaz antigenu a průkaz DNA Vyšet etřuje se zpravidla sérum,, a to nejen na průkaz protilátek, tek, ale i virových antigenů Na průvodku je vždy v nutno přesnp esně uvést, jaká vyšet etření mají být provedena (nejen který virus, ale i jakými postupy už kvůli proplácen cení pojišťovnou) ovnou)

106

107 Bakteriologická diagnostika purulentních meningitid Vzorek: Mozkomíš íšní mok (Při i odběru měřm ěřit tlak likvoru a prohlédnout jeho vzhled Po přijetp ijetí do laboratoře: mikroskopie (hledají se leukocyty a bakterie) přímý průkaz antigenu ve vzorku likvoru kultivace: obohacené půdy (čokol( okoládový agar) Identifikace kmenů,, u meningokoků až na úroveň séroskupiny kvůli očkovo kování Interpretace: pozor na kožní kontaminaci (koagulasa negativní stafylokoky)

108 Diagnostika ostatních neuroinfekcí Ostatní bakteriáln lní infekce U abscesů je nutno získat z vzorek z příslup slušného abscesu, protilátky tky nemusí být vytvořeny U borreliózy a neurolues je diagnostika serologická Virové neuroinfekce Přímý průkaz: Kultivace virů na tkáňových kulturách a na sajících ch myšatech; PCR. Nepřímý průkaz: Dva vzorky krve na serologii respiračních virů - provede se vyšet etření protilátek tek proti nejběž ěžnějším m virovým, ale případnp padně i bakteriáln lním m agens.

109 Diagnostika ranných, pojivových, hnisavých infekcí

110 Odběry u hnisavých infekcí a infekcí ran V diagnostice hnisavých infekcí má vždy větší význam tekutý materiál (hnis) než pouhý výtěr r z hnisavého ho ložiska U podezřen ení na anaerobních infekci je nutno zajistit přežitp ití anaerobů (viz dále) d Je nezbytné pečliv livě vyplnit průvodku vodku, nestačí stěr r z rányr ny,, ale specifikovat původ p rány i její lokalizaci na tělet Také důležité anamnestické údaje (návrat ze zahraničí,, práce v zemědělstv lství) ) je užitečné na průvodku uvést

111 Výtěr r z rányr

112 Diagnostika hnisavých infekcí V laboratoři i je provedena mikroskopie vzorku,, dále d jeho kultivace, bližší určen ení odhalených patogenů a vyšet etření jejich citlivosti na antibiotika U mikroskopie se hodnotí nejen mikroby, ale i množstv ství leukocytů apod. Při i kultivaci je užiteu itečné využívat vat pomnožovac ovací tekuté půdy (kdyby bylo mikrobů málo) a také selektivní půdy (s.nacl na stafylokoky, s amikacinem na streptokoky), zejména u dekubitů apod.

113 Výtěr r z rány: r ZákladnZ kladní diagnostické schéma (bez anaerobů,, kvasinek aj.) (Liší se dle lokalizace rány r a další ších okolností) Den 0: pouze nasazení kultivací Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA, EA, NaCl a KA+AMI. V případp padě negativity všech v pevných půd p d se prohlíží B, je-li zakalený, vyočkov kovává se (tzv. subkultivace) Den 2: expedice všech v negativních a mnohých pozitivních výsledků pro komplikace, rezistence apod. ovšem zdaleka ne všechv Den 3: expedice další ších pozitivních výsledků

114 Výtěr r z rány r interpretace Běžná flóra: žádná není,, vše, v co se najde, se považuje za patogena (pro jistotu i to, o čem máme me pochybnosti, není-li to kontaminace) Patogeny: všechno možné,, od stafylokoků přes streptokoky a pseudomonády dy aža po anaeroby u břišních ran a pasterurelly u ran po pokousání psem. Proto se doporučuje uje s atb léčbou l vyčkat až po alespoň předběžném m výsledku kultivace

115 Závěr Jak je vidět, u různých r typů infekcí se posílaj lají různé vzorky, a jsou tu různr zné požadavky na průvodky Nemůž ůžeme chtít t po klinických lékal kařích ani po zdravotnických sestrách, aby se ve všem v neomylně vyznali. Mikrobiologové i laboranti v mikrobiologických laboratořích jsou povinni být nápomocni, n posloužit spíš íše e dobrou radou než nadáváním zase jste to odebrali blbě.

116 Nashledanou příšp íště!