UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE VÝVOJ A VALIDACE HPLC METODY PRO STANOVENÍ NEČISTOTY 2-ETHYLPYRIDINU V GELU OBSAHUJÍCÍM DIMETINDEN-MALEINÁT DIPLOMOVÁ PRÁCE Vedoucí práce: Ing. Renata Hájková Hradec Králové 2008 Petra Hudcová

2 Ráda bych na tomto místě poděkovala především Mgr. Lucii Havlíkové, Ph.D. za odborné vedení, trpělivost a cenné rady při vypracování této diplomové práce, a vedoucí mé diplomové práce Ing. Renatě Hájkové. Dále děkuji PharmDr. Ludmile Matysové, Ph.D. a všem pracovníkům katedry analytické chemie za ochotu pomoci i mimo rámec své vlastní práce. Také bych chtěla poděkovat mé rodině a všem blízkým, kteří mne podporovali po dobu celého studia. 2

3 1 OBSAH 3

4 1 OBSAH ÚVOD Úvod a cíl práce TEORETICKÁ ČÁST Gel s obsahem dimetinden-maleinátu (Fenistil gel) Přípravek Fenistil gel - charakteristika Účinná látka dimetinden-maleinát Chemická a fyzikálně-chemická charakteristika [6] Farmakologická charakteristika dimetinden-maleinátu Nečistoty Kontrola nečistot v látkách pro farmaceutické použití dle ČL Nečistoty v nové léčivé látce Nečistoty v léčivých přípravcích Chromatografie Obecné principy chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Princip metody Kapalinový chromatograf Chromatografické kolony a jejich náplně Detektory v HPLC Validace analytických metod Provedení validace Druhy validací Testování vhodnosti chromatografického systému Dělící účinnost systému Faktor asymetrie chromatografického píku Rozlišení chromatografických píků Opakovatelnost analýzy Validace analytické metody Přesnost (precision) Správnost (accuracy) Linearita (linearity) Robustnost (robustness) Selektivita (selectivity) Detekční limit (limit of detection, LOD) Kvantitativní limit (limit of quantication, LOQ) Rešerše HPLC metoda stanovení 2-ethylpyridinu Analytické metody hodnocení dimetinden-maleinátu HPLC metoda stanovení kyseliny maleinové EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiál a pomůcky

5 4.1.1 Chemikálie, standardy, vzorky Sestava pro HPLC Přístrojové vybavení Pomůcky Příprava pracovních a zásobních roztoků Příprava vzorku Hledání vhodné chromatografické metody VÝSLEDKY A DISKUSE Vývoj metody - optimalizace chromatografických podmínek Vlnová délka detektoru Hledání vhodné analytické kolony Optimalizace složení mobilní fáze Hledání vhodného vnitřního standardu Rychlost průtoku mobilní fáze Souhrn nalezených optimálních chromatografických podmínek Validace metody Test vhodnosti chromatografického systému Účinnost chromatografické kolony (počet pater) N Asymetrie chromatografických píků Rozlišení chromatografických píků R Opakovatelnost analýzy Validace analytické metody Přesnost Linearita Správnost Selektivita Robustnost Limit detekce a kvantifikace ZÁVĚR POUŢITÁ LITERATURA SEZNAM ZKRATEK

6 2 ÚVOD 6

7 2.1 ÚVOD A CÍL PRÁCE Jedním ze základních cílů farmacie je zajistit pacientovi kvalitní, bezpečný a účinný lék v požadovaném množství a v požadované kvalitě. Hodnocení kvality, bezpečnosti a účinnosti léku, resp. léčivého přípravku, se ve většině případů opírá o různé analytické metody. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), je v současné době jedna z nejprogresivnějších analytických metodik, která nachází stále větší uplatnění ve všech oblastech analýzy léčiv. Umožňuje analyzovat od anorganických iontů až po polymerní sloučeniny včetně termolabilních a netěkavých sloučenin (výhoda oproti GC plynové chromatografii). Všechny moderní lékopisy využívají HPLC pro kontrolu čistoty a pro stanovení obsahu. [1,2] Gel, jehož hlavní účinnou látkou je dimetinden-maleinát (Fenistil gel, výrobce firma Novartis), je volně prodejný přípravek, který se používá ke zmírnění svědění u dermatitid, kopřivky, štípnutí hmyzem, při spálení od sluníčka, povrchových popáleninách i při alergii na kovy. Přípravek podobné indikace ve stejné lékové formě u nás není k dispozici. [3] 2 ethylpyridin je sloučenina, která se v gelu může vyskytnout jako nečistota, t.j. jako rozkladný produkt hlavní účinné látky dimetinden-maleinátu. Dimetinden-maleinát, účinná látka přípravku, je v ČL 2005 stanovován nevodnou titrací. Ke stanovení nečistoty 2 ethylpyridinu v ČL 2005 je použita plynová chromatografie. Pro stanovení hlavní účinné látky a nečistoty zároveň byla použita jako vhodná metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie, která je oblíbenou analytickou metodou pro analýzu chemických sloučenin i léčivých přípravků proto, že je vysoce selektivní a citlivá. 7

8 Cílem této práce bylo vyvinout a validovat HPLC metodu pro stanovení nečistoty 2 ethylpyridinu současně s účinnou látkou dimetinden-maleinátem v přípravku Fenistil gel. Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. V Kolíně dne podpis: 8

9 3 TEORETICKÁ ČÁST 9

10 3.1 GEL S OBSAHEM DIMETINDEN-MALEINÁTU (FENISTIL GEL) Přípravek Fenistil gel - charakteristika Fenistil gel má antihistaminický a antipruriginózní účinek a používá se jako dermatologikum. Je to protisvědivý a protialergický přípravek. Nejčastěji se používá při svědivých onemocněních kůže, kopřivce, po pokousání a poštípání hmyzem, při poškození kůže slunečním zářením a u mírných povrchových popálenin. [3] Fenistil gel rychle prostupuje do kůže a po několika minutách začínají antihistaminové účinky, maxima dosahuje během jedné až čtyř hodin po aplikaci. [4] Přípravek je balen po 30 g gelu v aluminiové tubě s uzávěrem, která je uložena v papírové skládačce. Přípravek mohou používat dospělí a děti od 6 měsíců věku i bez doporučení lékaře. Je volně prodejný. [3] Nežádoucí účinky přípravku jsou vzácné, nejčastěji lokální podráždění nebo kontaktní senzibilizace, při ošetření rozsáhlých ploch intoxikace. [5] Přípravek je homogenní, bezbarvý, čirý až slabě opalescentní gel. Účinnou látkou je dimetinden-maleinát (dimetindeni maleas) v koncentraci 1 mg (0,1 %) v 1 g gelu. Gelotvornou látkou je sodná sůl karbomeru 974 P. [4] Kompletní složení přípravku Fenistil gel: [4] Dimetindeni maleas 0,1 g/100 g Benzalkonii chloridum Dinatrii edetas dihydricus Carbomerum 974 P Natrii hydroxidi solutio 300 g/l Propylenglycolum Aqua purificata 10

11 3.1.2 Účinná látka dimetinden-maleinát Chemická a fyzikálně-chemická charakteristika [6] Dimetindeni maleas (Dimetinden-maleinát) je chemicky N,N-dimethyl-2-{3- [(RS)-1-(pyridin-2-yl)ethyl]-1H-inden-2-yl}ethanamin-(Z)-butendioát. Je to bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je těžce rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v methanolu. Jeho chemická struktura je uvedena na Obr. 1. Obr.1 : Chemická struktura dimetinden-maleinátu Sumární vzorec - C 24 H 28 N 2 O 4 M r - 408,50 Synonymum - Dimetindeniummaleinat Farmakologická charakteristika dimetinden-maleinátu Dimetinden-maleinát je silný H 1 -receptorový antagonista histaminu. [4] Je to H 1 -antihistaminikum 1. generace se sedativním účinkem. Tato H 1 -antihistaminika 1. generace reagují také s jinými typy receptorů, např. s cholinergními muskarinovými receptory, tudíž mají nežádoucí účinky podobné atropinu. Dále působí i centrálně tlumivě. Mechanismus účinku spočívá v inhibici účinků histaminu vyvolávané aktivací H 1 -receptorů: blokují zvýšení tonu hladkého svalstva bronchů a trávicího ústrojí, zabraňují vazodilataci, snížení krevního tlaku i zvýšení cévní permeability. Mezi jejich nežádoucí účinky patří výrazná sedace a dále reakce vyvolané inhibicí aktivity jiných receptorů, především cholinergních muskarinových. Při lokálním podání se kromě antihistaminového účinku využije i lokálně anestetický efekt látky, takže použití dimetindenu příznivě ovlivní alergicky podmíněné svědění. Dimetinden se vyrábí v lékových formách: gel, tablety, kapky. [7] 11

12 3.2 NEČISTOTY Kontrola nečistot v látkách pro farmaceutické pouţití dle ČL 2005 Úkolem lékopisu při ochraně zdraví veřejnosti je, aby byla v článcích zajištěna dostatečná kontrola nečistot. Požadavky týkající se nečistot se uvádějí v konkrétních článcích a v obecném článku Corpora ad usum pharmaceuticum (Látky pro farmaceutické použití). Konkrétní články a obecný článek se navzájem doplňují: konkrétní články předepisují přijatá kritéria pro nečistoty, zatímco obecný článek rozebírá potřebu kvalifikace, identifikace a uvádění organických nečistot, které se vyskytují v léčivých přípravcích. Mezní hodnoty pro uvádění, identifikaci a kvalifikaci uvedené v obecném článku Látky pro farmaceutické použití jsou platné pro všechny příbuzné látky. Organické nečistoty přítomné v léčivých látkách se musí uvádět, kdekoliv je to možné, identifikovat a kvalifikovat, jak je uvedeno v Tab. 1. Použití Maximální denní dávka Mezní hodnota pro uvádění pro humánní nebo pro humánní a veterinární použití 2 g/den > 0,05 % Mezní hodnota pro identifikaci > 0,10 % nebo denní příjem >1,0 mg (podle toho, který je nižší) Mezní hodnota pro kvalifikaci > 0,15 % nebo denní příjem >1,0 mg (podle toho, který je nižší) pro humánní nebo pro humánní a veterinární použití > 2 g/den > 0,03 % > 0,05 % > 0,05 % pouze pro veterinární použití neuvedeno > 0,1 % > 0,2 % > 0,5 % Tab. 1: Uvádění, identifikace a kvalifikace organických nečistot v léčivých látkách Specifické mezní hodnoty se mohou použít pro nečistoty, u nichž je známo, že jsou neobyčejně účinné nebo vykazují toxické či neočekávané farmakologické efekty. 12

13 Jestliže jednotlivý článek neumožňuje vhodnou kontrolu nové nečistoty, musí se vyvinout nová zkouška, která se zahrne do specifikace látky. Jakost se s ohledem na nečistoty kontroluje souborem zkoušek uvedeným v článku. Tyto zkoušky jsou určené ke stanovení organických a anorganických nečistot, které jsou závažné z pohledu původu léčivých látek v registrovaných léčivých přípravcích. Články organických látek obvykle obsahují zkoušku nazvanou Příbuzné látky, která se týká příslušných organických nečistot. Odstavec Nečistoty v článku obsahuje nečistoty (chemickou strukturu a název, pokud je to možné), které jsou obvykle organické a o kterých je známo, že se dají detekovat zkouškami předepsanými v článku. Tento odstavec obsahuje specifikované nečistoty a tam, kde je to uvedeno, i jiné detekovatelné nečistoty. Specifikované nečistoty mají kritérium přijatelnosti, které nepřesahuje kritérium schválené oprávněnou autoritou. Jiné detekovatelné nečistoty jsou potenciální nečistoty s definovanou strukturou, o kterých není známo, že by byly normálně přítomné nad mezní hodnotou pro identifikaci v látkách použitých v léčivých přípravcích, které povolily oprávněné autority členských států Úmluvy o vypracování Evropského lékopisu. Uvádějí se v odstavci Nečistoty pro informaci. [6] Nečistoty v nové léčivé látce ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use), která se sešla v roce 1995 v Japonsku, zavedla směrnice (guidelines), které se zabývají hodnocením nečistot v léčivých přípravcích a léčivých látkách. První směrnice týkající se nečistot ve farmaceutické analýze - Q3A Impurities in New Drug Substances [8] - definuje nečistoty v nové léčivé látce a diskutuje jejich přítomnost z chemického hlediska a z hlediska bezpečnosti. Zahrnuje rozdělení nečistot a jejich charakterizaci, vytváření reportu o přítomnosti nečistot, pravidla uvádění nečistot ve specifikacích a také podmínky pro použité analytické metodiky. Nečistoty podle chemického hlediska mohou být organické, anorganické a zbytková rozpouštědla. 13

14 a) Organické nečistoty mohou vznikat během výrobního procesu nebo během uchovávání léčivé látky. Mohou být definované nebo nedefinované, zahrnují výchozí substance, meziprodukty reakce, rozkladné produkty, katalyzátory a další reagencia. b) Anorganické nečistoty pocházejí z výrobního procesu. Bývají převážně známé a patří mezi ně reagencia, ligandy, katalyzátory, těžké kovy, anorganické soli. Anorganické nečistoty jsou obvykle detekovány nebo kvantifikovány s využitím lékopisných nebo jiných vhodných metod. c) Zbytková rozpouštědla ve farmaceutické substanci jsou definována jako těkavé organické látky, které se používají nebo vznikají při výrobě léčivé látky, pomocných látek nebo léčivého přípravku. Směrnice Q3C Impurities: Guideline for Residual Solvents [9] se zabývá tématikou zbytkových rozpouštědel. Kromě limitů pro obsah účinné látky jsou stanoveny také limity pro jednotlivé nečistoty a pro celkovou sumu nečistot účinné látky. Sem patří vedlejší produkty syntetické reakce, nečistoty přítomné ve výchozích surovinách, nečistoty vzniklé izomerizací, přítomné enantiomery, rozkladné produkty, zbytková rozpouštědla a anorganické nečistoty. Specifikace látky stanovuje soubor kritérií, která musí daná látka splňovat, aby mohla být považována za přijatelnou pro zamýšlené použití. Jde v podstatě o seznam zkoušek s odkazy na analytické metody a také s uvedenými kritérii přijatelnosti pro jednotlivé zkoušky. Specifikace je kritický standard kvality, který je navrhován a posuzován výrobcem a poté schválen příslušnými autoritami (Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria For New Drug substances And New Drug Products: Chemical Substances Q6A) [10]. Specifikace nové účinné látky by měla zahrnovat: organické nečistoty každou definovanou známou nečistotu každou definovanou neznámou nečistotu jakoukoliv nedefinovanou nečistotu a kritérium její tolerance celkovou sumu nečistot anorganické nečistoty zbytková rozpouštědla 14

15 3.2.3 Nečistoty v léčivých přípravcích Problematikou nečistot v léčivých přípravcích se zabývá směrnice ICH Impurities in new drug products Q3B [11], která poskytuje směrnici pro registrační žádosti na obsah a identifikaci nečistot v nových léčivých přípravcích vyrobených z nových dosud neregistrovaných léčivých látek. Směrnice se zabývá pouze nečistotami v nové léčivé substanci, které jsou klasifikovány jako rozkladné produkty účinné látky nebo reakční produkty účinné látky s pomocnými látkami nebo s obalovým materiálem. U léčivého přípravku je vždy potřeba vyjmenovat degradační produkty pozorované během výroby nebo během stabilitních studií léčivého přípravku. Degradační produkty pozorované během stabilitních studiích prováděných za doporučených skladovacích podmínek by měly být identifikovány, pokud jsou přítomny na hladině vyšší než je identifikační prahová hodnota (směrnice Q3B). Analytické postupy by měly být vyvinuty pro ty degradační produkty, u kterých je očekáván toxický nebo farmakologický účinek i na hladinách nižších než je prahová hodnota. V registrační žádosti by mělo být zdokumentováno, že analytická metoda byla validována a je vhodná pro detekci a kvantifikaci degradačních produktů (viz směrnice Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures: Text and Metodology) [12]. Specifikace nového léčivého přípravku by měla zahrnovat seznam rozkladných produktů, u kterých se očekává, že se objeví během výrobního procesu a za doporučených skladovacích podmínek. Specifikace výběru rozkladných produktů by měla být založena na degradačních produktech nalezených v šarži vyrobené k předpokládanému komerčnímu použití. Specifikace nového přípravku by měla zahrnovat: každý definovaný známý rozkladný produkt každý definovaný neznámý rozkladný produkt jakýkoliv nedefinovaný degradační produkt s akceptačním kritériem celkovou sumu přítomných rozkladných produktů [13] 15

16 3.3 CHROMATOGRAFIE Obecné principy chromatografie Chromatografické metody jsou vysoce účinné separační metody, sloužící k oddělení analyzovaných složek ze směsi a zároveň k jejich kvalitativní a kvantitativní analýze. Při všech chromatografických metodách se mnohonásobně ustavuje rovnováha součástí analyzované směsi mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi. Nepohyblivá, stacionární fáze, má schopnost různou měrou zadržovat jednotlivé součásti směsi, zatímco pohyblivá mobilní fáze vymývá jednotlivé součásti směsi z nepohyblivé fáze a odnáší je ve směru toku různou rychlostí. Tím dojde k jejich oddělení. Hybnou silou v chromatografickém systému je tok mobilní fáze, která unáší ionty nebo molekuly. Vlastní dělení látek závisí na brzdící síle (retenci), která působí selektivně. Chromatografické metody lze rozdělit podle různých hledisek: 1. Podle skupenství mobilní a stacionární fáze: a) chromatografie kapalina tuhá látka b) chromatografie kapalina kapalina c) chromatografie plyn kapalina d) chromatografie plyn tuhá látka [2] 2. Podle podstaty separačního procesu: a) Adsorpční chromatografie: Podstatou je rozdílná adsorbovatelnost dělených látek na aktivní povrch adsorbentu. Jako sorbenty se nejčastěji používají silikagel a oxid hlinitý. V kapalinové chromatografii se jedná o separaci pevná fáze kapalina (LSC), v plynové chromatografii pevná fáze - plyn (GSC). b) Rozdělovací chromatografie V kapalinové rozdělovací chromatografii je podstatou separace rozdílná rozpustnost dělených látek ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách (LLC), přičemž kapalina použitá jako stacionární fáze je zakotvena na vhodném nosiči. V plynové rozdělovací chromatografii se jedná o separaci v systému kapalina 16

17 (zakotvená fáze) plyn (GLC) a podstatou separačního procesu je rozdílná rozpustnost dělených látek unášených nosným plynem v kapalné stacionární fázi. c) Iontově výměnná chromatografie (IEC) Lze ji realizovat jen jako kapalinovou chromatografii; stacionární fází jsou iontoměniče (katexy nebo anexy). Podstatou separace je rozdílná afinita dělených látek, které jsou zpravidla v iontové formě, k iontovýměnným skupinám iontoměniče. Rozdílnost afinity separovaných látek je dána rozdílnými hodnotami disociačních konstant iontogenních skupin, různou velikostí iontů a různým mocenstvím iontů. d) Gelová chromatografie(na molekulových sítech) Jedná se o kapalinovou chromatografii, přičemž jsou analyzované látky separovány na základě velikosti molekul. Molekuly látky jsou neseny protékající mobilní fází kolonou naplněnou porézním materiálem (gelem), přičemž pronikají (permeací) do rozpouštědlem naplněných pórů gelu. Malé molekuly pronikají do pórů všech velikostí, větší molekuly jen do větších pórů a velké molekuly, které přesahují průměr pórů, vycházejí z kolony bez jakéhokoliv zadržení. Separace molekul je tedy závislá na rozmezí velikosti pórů zvoleného gelu. [1] 3. Podle použité techniky: a) chromatografie sloupcová b) chromatografie papírová c) chromatografie na tenké vrstvě 4. Podle způsobu vyvíjení: a) chromatografie eluční b) chromatografie vytěsňovací c) frontální analýza [2] Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Princip metody Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je v současné době jedna z nejprogresivnějších analytických metodik. 17

18 Hlavní přednosti HPLC: - jedná se o separační metodu, která umožňuje kvalitativní i kvantitativní hodnocení separovaných složek směsi - rychlost a citlivost stanovení (v závislosti na použitém detektoru) - pro analýzu postačuje minimální množství vzorku - možnost automatizace - její univerzálnost (je srovnatelná s plynovou chromatografií, avšak vzhledem k tomu, že většina léčiv je netěkavá, je HPLC mnohem použitelnější metodou než GC). [1] Při této metodě nastává dělení látek mezi stacionární fázi naplněnou v koloně a mobilní fází procházející kolonou za vysokého tlaku. K dělení lze využít všech vratných dvoufázových separačních mechanismů, t.j. adsorpce, rozdělování, iontová výměna, sítový efekt gelu. Díky tomu je možné nalézt selektivní a účinný chromatografický systém k dělení směsi prakticky všech organických látek rozpustných ve vodě, zředěných kyselinách nebo organických rozpouštědlech. Při dělení směsi látek, jejichž eluční parametry se příliš neliší, se používá isokratická eluce jedinou mobilní fází s konstantním složením. Jestliže se jednotlivé složky směsi liší svými elučními parametry, využívá se gradientové eluce, při které se k jedné mobilní fázi plynule přimíchává rostoucí množství druhé mobilní fáze s větším elučním účinkem. Vytváří se tak plynulý gradient mobilní fáze; obdobným způsobem lze pro eluci využít i gradient ph. [2] Základní kvalitativní charakteristikou v HPLC je retenční (eluční) čas t R, což je čas od nástřiku vzorku na kolonu k maximu chromatografického píku. Nejčastějším důkazem totožnosti je shoda retenčních časů chromatografického píku látky v analyzovaném vzorku s retenčním časem píku standardu. Kvantitativní charakteristikou látek v HPLC je plocha (eventuelně výška) chromatografického píku. [1] Kapalinový chromatograf Při chromatografii je mobilní fáze čerpána vysokotlakým čerpadlem, které musí umožňovat konstantní bezpulzní tok mobilní fáze o malé rychlosti (0,1 10 ml/min) za vysokého tlaku až 40 MPa. Dávkování roztoku vzorku se provádí buď speciální injekční mikrostříkačkou nebo dávkovacím kohoutem. Jehlou stříkačky se 18

19 probodne septum ze speciální pryže a lze dávkovat různé objemy; kohoutem lze dávkovat pevně daný objem roztoku avšak mnohem přesněji. [1] Základní části kapalinového chromatografu jsou uvedeny na Obr. 2. Obr. 2 : Schéma kapalinového chromatografu Zásobníky mobilní fáze (1, 2), vysokotlaké čerpadlo (3), směšovač (4), manometr (5), dávkovací zařízení (6), předkolona (7), analytická kolona (8), detektor (9), sběrač frakcí (10), počítač se speciálním softwarem (11). Přítomen může být ještě odplyňovač (degasser). [2] Chromatografické kolony a jejich náplně Kolony pro HPLC jsou ocelové nebo skleněné trubice 5 30 cm dlouhé o vnitřním průměru 2 8 mm naplněné stacionární fází. Náplň kolony musí být naprosto homogenní a rovnoměrná, proto se nejčastěji používají kolony plněné a testované přímo výrobcem. Spoje mezi kolonou, dávkovacím zařízením a detektorem jsou kapilární (vnitřní průměr 0,5 mm), nejčastěji z nerezové oceli. [2] Kolony musí odolávat relativně vysokým tlakům, chemickému působení mobilních fází a separovaných látek, na něž nesmí působit katalyticky. S rostoucí délkou kolony se úměrně zvyšuje účinnost separace (počet pater kolony), ale také doba analýzy. V moderní vysokoúčinné kapalinové chromatografii převažují aplikace v systémech s obrácenými fázemi, převážně na oktadecylsilikagelu a oktylsilikagelu. Používají se i nepolární chemicky vázané fáze s alkyly o délkách C2 - C40 a 19

20 s chemicky vázanými aryly či alkylaryly na silikagelové matrici, jejich nevýhodou je použití při omezeném rozsahu ph. Pro práci při ph vyšším než 8,5 byly navrženy náplně na bázi organických gelů (polystyren divinylbenzoové kopolymery, polymerní fluorovodíky) a skelný uhlík. V systémech s normálními fázemi je nejčastějším používaným polárním adsorbentem silikagel, uplatňuje se také oxid hlinitý a hydroxylapatit. V systémech s normálními i obrácenými fázemi lze použít náplně se středně polárními stacionárními fázemi (silikagel s navázanými aminovými, nitrilovými, diolovými a nitro skupinami). Chemicky vázané nebo polymerní sorbenty s cyklodextrinovými stacionárními fázemi jsou využívány pro separaci geometrických i optických izomerů. Pokrokem v analýze léčiv bylo zavedení monolitických a zirkoniových kolon do praxe. Monolitické kolony nejsou tvořeny částicemi silikagelu, ale jeho monolitem, jehož povrch může být různě modifikován. Výhodou je jejich využití při analýze za použití vyšších tlaků a dokonce i při gradientu tlaků. Zirkoniové kolony jsou tvořeny částicemi oxidu zirkoničitého, jejichž povrch může být také modifikován. Jejich předností je překonání omezení ph hodnot pro silikagel. [14] Někdy se používá tzv. předkolonka (krátká kolona, často plněná stejným sorbentem jako hlavní kolona). Zapojuje se do systému před hlavní kolonu a slouží k zachycení větší části nečistot při analýze vzorků, kde je veliké riziko zanesení kolony nečistotami (např. z neúplně přečištěného biologického materiálu), a prodlužuje tak životnost kolony. [15] Detektory v HPLC Na detektory pro HPLC jsou kladeny mimořádné požadavky: - vysoká citlivost (detekce látek v roztoku v koncentracích ng až μg/ml) - reprodukovatelnost a linearita odezvy - nezávislost odezvy na změně složení mobilní fáze při gradientové eluci - univerzálnost (detekce všech oddělených složek vzorku) [2] Na použitém detektoru závisí citlivost a selektivita chromatografické analýzy. 20

21 Spektrometrické detektory Proměřují absorbanci elektromagnetického záření určité vlnové délky složkami eluátu protékajícího celou detektoru. K detekci léčiv se využívá především UV oblast spektra, méně oblast viditelná a minimálně infračervená oblast. UV-VIS spektrometrický detektor je nejpoužívanějším detektorem v kapalinové chromatografii, vyznačuje se značnou citlivostí (10-9 až g/ml) a lze jej používat při gradientové eluci Fluorimetrické detektory Používají se v případech, kdy analyzovaná látka vykazuje fluorescenci. Látky, které nefluoreskují, lze vhodnou derivatizací převést na fluoreskující deriváty. Tyto detektory jsou méně univerzální než UV detektory, ale jsou citlivější (10-9 až g/ml), selektivnější a jsou také použitelné při gradientové eluci Elektrochemické detektory Bývají uplatňovány při hodnocení látek, u nichž lze využít dějů, souvisejících s elektrochemickou reakcí probíhající na rozhraní elektroda eluent. Proměřují elektrochemické veličiny, jejichž hodnota je závislá na koncentraci analyzovaného léčiva. Schopnost elektrochemické redukovatelnosti a oxidovatelnosti látek využívá voltametrický, amperometrický a polarografický detektor. Elektrochemické detektory jsou značně citlivé (10-9 až g/ml), ale většinu z nich nelze použít při gradientové eluci Refraktometrické detektory Měří rozdílný index lomu mezi čistou mobilní fází a eluátem vytékajícím z kolony, obsahujícím analyzovanou látku. Jsou univerzální, ale při analytickém hodnocení látek se používají ojediněle, protože mají poměrně velké nevýhody výrazně menší citlivost (10-6 g/ml), nutnost termostatování (odezva detektoru je závislá na teplotě) a nelze je použít při gradientové eluci Spojení HPLC s hmotnostní spektrometrií (MS) Po výstupu z kolony je nutno z eluentu odstranit mobilní fázi a molekuly léčiva v plynném stavu jsou v hmotnostním spektrometru ionizovány nárazy elektronů, termoionizací či elektroionizací. Nabité částice jsou v magnetickém nebo 21

22 vysokofrekvenčním poli separovány podle hmotnosti a náboje a zaznamenáno je hmotnostní spektrum (tj. četnost iontů ve vztahu k poměru hmotnost/počet nábojů). Spojení HPLC-MS je vysoce selektivní a vysoce citlivé, ovšem hmotnostní detektory jsou finančně velmi náročné. [1] 3.4 VALIDACE ANALYTICKÝCH METOD Provedení validace Validaci můžeme definovat jako proceduru, jejímž cílem je demonstrovat a dokumentovat kvalitu analytické metody ustanovením definovaných kriterií a měřením hodnot těchto kriterií. Validace je zjednodušeně řečeno ověření platnosti zvoleného analytického postupu (metody). Vlastnost, která je předmětem validace se nazývá validovaná vlastnost a může jí být např. koncentrace hlavní látky, koncentrace nečistoty nebo fyzikálně-chemický parametr. Validace se používá vždy při validaci nové metody, při převodu validované metody (např. z vývojové do přijímací laboratoře, publikované validované metody), při kontrole způsobilosti systému a při revalidaci metody, kdy podmínky revalidace jsou striktně stanoveny. [16] Každý test by měl být v protokolu ukončen definovaným požadavkem na jeho úspěšnost a zhodnocením, zda byl požadavek splněn nebo ne. Nesplnění požadavku neznamená automaticky zamítnutí metody, ale třeba jen, že stanovení jisté vedlejší látky je méně přesné než jiné; u testu linearity se uvádí více požadavků a některé mohou být splněny a jiné ne. [17] Vlastní validace sestává z těchto testů: přesnost správnost linearita robustnost selektivita detekční a kvantitativní limit [17] 22

23 Test vhodnosti (způsobilosti) analytického systému: Test způsobilosti systému představuje nedílnou součást metody a slouží k zajištění přiměřené účinnosti chromatografického systému. [6] Pro hodnocení účinnosti kolony se používají parametry: dělící účinnost systému (počet teoretických pater) asymetrie píku rozlišení píků opakovatelnost analýzy [17] Druhy validací Interní (vnitřní) validace jsou validace metody v rámci jedné laboratoře. Podle účelu se dále rozlišují: Průzkumová validace - jejímž cílem je na omezeném počtu vzorků stanovit, zda zvolená analytická metoda je vhodnou metodou pro plnou validaci. Zaměřuje se na vyhodnocení delikátních validačních parametrů jako je selektivita a robustnost, a na stanovení opakovatelnosti na omezeném počtu vzorků. Plná validace následuje po prokázání vhodnosti průzkumové validace. Jejím cílem je demonstrovat vhodnost metody k zamýšlenému použití vyhodnocením všech požadovaných validačních parametrů. Validace při převodu metody používá se při zavedení publikované validované analytické metody (resp. validované metody v jiné laboratoři). Obvykle zahrnuje stanovení správnosti laboratoře a opakovatelnosti. K ověření platnosti dříve plně zvalidované metody se používá kontrola způsobilosti metody a zahrnuje pouze kontrolu kalibrační přímky (linearita a citlivost) Retrospektivní validace může se použít tehdy, existují-li již dříve naměřená data, která byla naměřena za stejných podmínek. Umožní vyhodnotit jeden z nejdůležitějších validačních parametrů - opakovatelnost. Externí (vnější) validace zahrnuje interní validaci společně s validací metody srovnáním výsledků metody z více laboratoří (mezilaboratorní porovnávací zkoušky) a zahrnuje výpočet reprodukovatelnosti metody. [16] 23

24 3.4.3 Testování vhodnosti chromatografického systému (System suitability test, SST) Dělící účinnost systému Účinnost kolony může být vypočítána jako zdánlivý počet teoretických pater (N). Použije se následující vzorec, v němž hodnoty t R a w h musí být vyjádřeny ve stejných jednotkách (času, objemu nebo vzdálenosti): N t R 5,54 wh 2 t R retenční čas (nebo objem) nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce w h šířka píku v polovině jeho výšky [6] Faktor asymetrie chromatografického píku Ve vzdálenosti 5 % výšky píku se vede rovnoběžka se základní linií. Úsečka w 0,05, která vznikne protnutím ramen píku je rozdělena kolmicí spuštěnou z vrcholu na dvě části: menší část se označí f a asymetrie T se vypočítá podle vzorce: T = w 0,05 / 2f w 0,05 šířka píku v 5 % jeho výšky (min) f menší část úsečky, která vznikla protnutím úsečky kolmicí spuštěnou z vrcholu píku Pro symetrický pík je T = 1 a tato hodnota se zvětšuje s rostoucí asymetrií. [17] Rozlišení chromatografických píků Rozlišení (R S ) mezi píky dvou složek může být vypočteno ze vzorce: 1,18. t R2 t RS w w h1 h2 R1 24

25 kde t R2 > t R1, v němž značí: t R1 a t R2 retenční časy w h1 a w h2 šířky píků v poloviční výšce Rozlišení větší než 1,5 odpovídá rozdělení píků na základní linii. [6] Opakovatelnost analýzy Opakovatelnost odezvy se vyjadřuje jako odhad relativní směrodatné odchylky (RSD % ) v procentech pro řadu následných měření porovnávacího roztoku a vypočítá se podle vzorce: RSD % = 100 * y y y n 1 2 y - průměr jednotlivých hodnot y jednotlivé hodnoty vyjádřené jako plochy píků n počet jednotlivých hodnot [6] Validace analytické metody Přesnost (precision) V literatuře někdy označovaná jako shodnost metody. Přesnost metody je definována jako údaj o míře shody mezi vzájemně nezávislými výsledky zkoušek za předem specifikovaných podmínek. Nezávislé výsledky jsou výsledky získané takovým způsobem, že nejsou ovlivněny žádným předchozím výsledkem na tomtéž nebo podobném zkoušeném vzorku. Míra shodnosti se vyjadřuje (počítá) jako směrodatná odchylka výsledků zkoušek. Směrodatná odchylka (s): není-li směrodatná odchylka závislá na obsahu, uvádí se její absolutní hodnota v těch jednotkách jako samotný výsledek, je-li směrodatná odchylka závislá na obsahu, uvádí se relativní hodnota v procentech nebo jako desetinný zlomek. Je-li směrodatná odchylka konstantní v celém oboru měřených hodnot, pak se také počítá relativní směrodatná odchylka (s R ). [16] 25

26 Podle podmínek opakování metody se rozlišuje opakovatelnost a reprodukovatelnost. Opakovatelnost (repeatability) metoda se provádí jedním analytikem na tomtéž přístroji, se stejnými činidly, na jednom zhomogenizovaném vzorku (přesnost uvnitř laboratoře). Reprodukovatelnost (reproducibility) provádí se na jednom zhomogenizovaném vzorku v různých laboratořích, různými analytiky, s různými činidly i přístroji (přesnost při přenosu metody z jedné laboratoře do druhé). SÚKL požaduje jen doložení opakovatelnosti metody. [18] Předepsaným postupem se připraví šest roztoků analyzované látky a nastříkne se do chromatografu. Změří se odpovídající plochy píků (A i ) pro hlavní látku i pro přítomné vedlejší látky (nečistoty nebo degradační produkty) a získané hodnoty se použijí pro výpočet průměrné hodnoty (A p ), směrodatné odchylky (s) a relativní směrodatné odchylky (s R ) podle vzorce: A p A n i 2 Ai A p s n 1 s R 100 s A p Požadavek je s R < 1 % pro hlavní látku a s R < 5 % pro vedlejší látky, které se za normálních okolností vyskytují ve vzorku v 0,1 1,0 procentním množství. [17] Správnost (accuracy) Správnost analytické metody je odchylka výsledku metody od správné hodnoty. Problémem je zjištění správné hodnoty. Používají se tři možnosti. Správná hodnota se zjistí buď jinou, nezávislou metodou, jejíž správnost je ověřena, nebo analýzou modelového vzorku, tj. placeba s přidaným standardem nebo, není-li k dispozici placebo, analýzou vzorku s přídavkem standardní látky. [18] Statisticky se správnost testuje pomocí výtěžnosti R (recovery), která se vypočítá podle vzorce: R i 100 ci % c O 26

27 c i - nalezená hodnota c 0 - skutečná (referenční) hodnota [17] Pokud se analyzuje modelový vzorek, přidává se standardní látka v množství menším i větším než je deklarovaný obsah. Některé postupy uvádějí 10 %, jiné 50 %. SÚKL požaduje jen jednu hladinu, tedy stanovení minimálně 6 různých modelových vzorků s přibližně 100 %-ním obsahem stanovované látky. Při přidání standardní látky ke vzorku se přidává méně než 100 %, aby se výsledek nedostal mimo kalibrační křivku. [18] Linearita (linearity) Linearita je schopnost metody dávat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované látky ve vzorku. Linearita analytické metody se doloží buď graficky jako závislost výsledků na koncentraci stanovované látky, nebo matematicky pomocí výsledků lineární regresní analýzy. Uvádí se korelační faktor, směrnice, y-úsek a chyby stanovení všech těchto hodnot. Korelační faktor je mírou linearity, směrnice citlivosti a y-úsek mírou vedlejších vlivů. SÚKL požaduje potvrzení linearity v rozmezí % deklarovaného obsahu a stanovení minimálně 5 různých koncentrací standardní látky. [18] Robustnost (robustness) Je to míra schopnosti metody dávat správné a přesné výsledky i při menších změnách pracovních podmínek. Znamená míru vlivu proměnných podmínek při provedení metody na její výsledky. [18] V tomto experimentu se mění 5 pracovních podmínek (proměnných) na dvou úrovních spodní a horní. Proměnné si zvolí analytik tak, aby zahrnovaly ty faktory, které podle jeho přesvědčení mohou ovlivnit průběh analýzy. Proměnnými mohou být například: průtoková rychlost MF (ml/min), voda ve vzorku, objem nástřiku, voda v mobilní fázi, ph mobilní fáze, složení MF, teplota na koloně, vlnová délka detekce. [17] 27

28 Stabilita standardů a vzorků - Do parametru robustnost je možné zahrnout i stabilitu roztoku standardních látek v roztoku. Připravené roztoky standardu rozdělené na dvě části se po 4 dny uchovávají při teplotě 2 8 ºC v temnu (lednice) a při teplotě místnosti za přístupu světla. Každý den se takto skladované roztoky analyzují (v čase přípravy, po 24 hodinách, po 48 hod. a po 72 hod.) a plochy píků se srovnávají s plochami píků získaných z čerstvě připravených roztoků. Stabilita S T (%) se vypočte: S T % 100 A A A T A T - průměr tří měření ploch píků u roztoku skladovaného A - průměr tří měření ploch píků u roztoku čerstvě připraveného Požadavek je, aby hodnota S T byla < 1 %. [17] Selektivita (selectivity) Je schopnost analytické metody kvantitativně stanovit analyt v přítomnosti možných vedlejších látek. Přesnost stanovení analyzované látky nesmí být ovlivněna přítomností látek vedlejších (nečistot, rozkladných produktů nebo v případě léčiv látek pomocných). [17] V HPLC se zjišťuje porovnáváním chromatogramů roztoků standardů a placeba. Zjišťuje se, zda se na záznamu placeba nevyskytují interferující píky v retenčních časech stanovovaných látek. [19] Detekční limit (limit of detection, LOD) Detekční limit je pro limitní testy, tj. testy zjišťující jen je-li látka nad nebo pod určitou hranicí. [18] Je definován jako nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být detekováno, nikoliv však nezbytně stanoveno jako exaktní hodnota. [20] 28

29 Kvantitativní limit (limit of quantication, LOQ) Limit kvantifikace je pro kvantitativní stanovení obsahu nečistot. [18] Je to nejnižší koncentrace analytu, která může být stanovena s přijatelnou přesností (opakovatelností) a správností za uvedených podmínek. [20] Tyto dva limity je nutné doložit u metod pro stanovení nečistot. U instrumentálních metod se zjišťují na základě šumu. Obvykle se stanoví směrodatná odchylka odezvy slepého vzorku, její trojnásobek odpovídá detekčnímu limitu a desetinásobek kvantitativnímu limitu. Získaná hodnota se pak ověří analýzou příslušné koncentrace vzorku. [18] 3.5 REŠERŠE Byla vypracována literární rešerše na téma HPLC stanovení dimetindenmaleinátu a 2-ethylpyridinu z dostupných databází (Science Direct, Web of Science). Hesla zadávaná do vyhledávačů byla: dimetindene, dimethindene, dimetindene maleate, 2-ethylpyridine a maleic acid. Výsledky uvedené v Tab. 5 byly využity při optimalizaci chromatografických podmínek HPLC metoda stanovení 2-ethylpyridinu Citace [21] Kolona Mobilní fáze Průtok Detekce Tab. 2: HPLC analýza 2-ethylpyridinu CAPCELL PAK C 18 MG (150 x 4,6 mm) H 2 O/CH 3 OH = 50/50 (v/v) 1 ml/min UV 254 nm Analytické metody hodnocení dimetinden-maleinátu Citace [6] Úprava vzorku 0,150 g se rozpustí v 80 ml bezvodé kyseliny octové Titruje se kyselinou chloristou 0,1 ml/l za potenciometrické Vlastní indikace bodu ekvivalence (1 ml kyseliny chloristé 0,1 stanovení mol/l odpovídá 20,43 mg C 24 H 28 N 2 O 4 ) Tab. 3: Stanovení dimetinden-maleinátu 29

30 Citace [22] Kolona Mobilní fáze Průtok ZIC - HILIC kolona (150 x 2,1 mm, 5 μm) ACN/25 mm CH 3 COOH, 2,5 mm CH 3 COONH 4, 80/20 (v/v) 0,1 ml/min Detekce UV 254 nm Tab. 4: Stanovení dusíkatých bazí (adenin, cytosin, guanin, thymin, uracil) metodou HILIC Citace [23] Kolona CN kolona Nucleosil CC-5-CN (125 x 4,0 mm, 5 μm) Mobilní fáze ACN/0,05 M (NH 4 ) 3 PO 4 ph 5,5 = 40/60 (v/v) Průtok 1,2 ml/min Detekce UV 258 nm Tab. 5: HPLC analýza dimetinden-maleinátu Citace [19] Kolona Mobilní fáze Průtok SeQuant ZIC TM kolona (50 x 2,1 mm, 5 μm) ACN/25 mm CH 3 COOH, 2,5 mm CH 3 COONH 4, 87,5/12,5 (v/v) 0,5 ml/min Detekce UV 258 nm Tab. 6: HPLC analýza dimetinden-maleinátu HPLC metoda stanovení kyseliny maleinové Citace [24] Kolona Apollo TM C18 (150 x 4,6 mm, 5 μm) Mobilní fáze CH 3 CN/50 mm KH 2 PO 4 = 60/40 Průtok 1 ml/min Detekce UV 254 nm Tab. 7: HPLC analýza kyseliny maleinové 30

31 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 31

32 4.1 MATERIÁL A POMŮCKY Chemikálie, standardy, vzorky - Acetonitril CHROMASOLV for HPLC, Sigma Aldrich, Praha, ČR - Diltiazem-hydrochlorid (š. č. DIL/M-086/2000), Herbacos-Bofarma, Pardubice, ČR - Dimetinden-maleinát (VV 085/06, š. č. DMM/070502), Herbacos-Bofarma, Pardubice, ČR - 2-ethylpyridin 97 % (GC), (š. č ), Sigma Aldrich, Praha, ČR - Fenistil gel (š. č. F00395A), Novartis s.r.o., Praha, ČR - Hydrogenfosforečnan amonný, Lachema, Neratovice, ČR - Hydroxid amonný, Sigma Aldrich, Praha, ČR k úpravě ph MF - Kyselina fosforečná 85 % p. a., Merck, Germany k úpravě ph MF - Kyselina maleinová (š. č /143601), Sigma Aldrich, Praha, ČR - Kyselina octová 99,0 %, Sigma Aldrich, Praha, ČR - Octan amonný, Lachema, Brno, ČR - Triethylamin, Sigma Aldrich, Praha, ČR - Ultračistá voda, čištěná systémem Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) Sestava pro HPLC Kapalinový chromatograf SHIMADZU LC-2010 (Shimadzu Corporation, Japan) Kolona SUPELCO Discovery Cyano 5 µm, 100 x 4 mm, Sigma Aldrich Vyhodnocení (PC Program) Shimadzu CLASS-VP, verze Přístrojové vybavení Analytické váhy Sartorius 2004 MP, Germany Centrifuga EBA 21, Hettich Zentrifugen, Germany Laboratorní ph metr Microprocessor ph Meter, ph 112, HANNA Instruments, Germany Magnetická míchačka Chladicí box Ultrazvuková lázeň Bandelin SONOREX RK52, Berlín, Germany 32

33 UV spektrofotometr Hewlett Packard 8453, USA Pomůcky kádinky, Erlenmayerovy baňky, odměrné baňky, odměrné válce, mikropipeta, dělené pipety, nedělené pipety, balónek k pipetě, střička, laboratorní lžička, alobal, zátky se zábrusem, svorky, držáky, tyčinky 4.2 PŘÍPRAVA PRACOVNÍCH A ZÁSOBNÍCH ROZTOKŮ Jako rozpouštědlo pro přípravu zásobních a pracovních roztoků hlavní účinné látky, dimetinden-maleinátu, byl použit acetonitril a to podle použité mobilní fáze a analytické kolony pro danou analýzu. Látka je v acetonitrilu dobře rozpustná. Pro zásobní roztok byla zvolena koncentrace 25 mg/100 ml. Pracovní roztoky byly připraveny ze zásobních roztoků tak, aby jejich koncentrace odpovídaly koncentraci roztoku získaného extrakcí 0,5 g přípravku Fenistil gel do 20,00 ml rozpouštědla při 100 % výtěžnosti, tedy o koncentraci 2,5 mg/100 ml desetinásobným zředěním zásobních roztoků. Rozpouštědlem pro přípravu zásobních a pracovních roztoků nečistoty 2- ethylpyridinu byl acetonitril. Pro zásobní roztok byla zvolena koncentrace 50 mg/100 ml. Pracovní roztoky byly připraveny ze zásobních roztoků stonásobným zředěním zásobních roztoků. Výsledná koncentrace pracovních roztoků byla 0,5 mg/100 ml. Jako rozpouštědlo pro přípravu zásobních a pracovních roztoků diltiazemhydrochloridu (IS), byl použit také acetonitril. Pro zásobní roztok IS byla zvolena koncentrace 50 mg/100 ml. Pracovní roztoky byly připravované o koncentraci 1 mg/100 ml ze zásobních roztoků jejich padesátinásobným zředěním. 4.3 PŘÍPRAVA VZORKU Postup při přípravě vzorku pro analýzu vychází ze zkušeností akreditované laboratoře Katedry analytické chemie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové s hodnocením podobných léčivých přípravků. 33

34 Do centrifugační zkumavky o objemu 50 ml bylo odváženo 0,5 g gelu přesně, přidáno 20,00 ml roztoku vnitřního standardu diltiazem-hydrochloridu v acetonitrilu (IS) a směs byla umístěna na 15 minut do ultrazvukové lázně. Po uplynutí této doby byla směs centrifugována 15 minut při rychlosti 3000 otáček/min. Supernatant byl dávkován autosamplerem přímo na kolonu. 4.4 HLEDÁNÍ VHODNÉ CHROMATOGRAFICKÉ METODY Nejdříve bylo nutné najít vhodné chromatografické podmínky jako je vlnová délka detekce, složení mobilní fáze a analytická kolona s vyhovujícím sorbentem a vhodný vnitřní standard. Při hledání vlnové délky detektoru bylo proměřeno UV spektrum stanovované látky (2-ethylpyridin). Po nalezení vhodné vlnové délky byly zkoušeny různé analytické kolony a různé mobilní fáze. Zkoušené kolony: hydrofilní analytická kolona SeQuant ZIC TM (50 x 2,1 mm; 5 μm) a Supelco-Discovery C18 (125 x 4,6 mm; 5 μm). U každé kolony bylo testováno několik mobilních fází. Výsledky nebyly uspokojivé, proto byla vyzkoušena kolona Supelco-Discovery Cyano (100 x 4 mm, 5 μm) a ta se ukázala jako vyhovující. Neméně důležitým krokem optimalizace chromatografických podmínek bylo nalezení vnitřního standardu. Bylo testováno asi 30 látek než se našla ta nejvhodnější. 34

35 5 VÝSLEDKY A DISKUSE 35

36 Absorbance (AU) 5.1 VÝVOJ METODY - OPTIMALIZACE CHROMATOGRAFICKÝCH PODMÍNEK Vlnová délka detektoru Při hledání vlnové délky pro detekci 2-ethylpyridinu posloužilo UV spektrum naměřené v roztoku standardu 2-ethylpyridinu v acetonitrilu (Obr. 3). Koncentrace roztoku není známá, protože šlo především o zjištění absorpčních maxim a minim. Jako kontrolní roztok byl použit acetonitril Vlnová délka (nm) Obr. 3: UV spektrum nečistoty 2-ethylpyridinu Na základě polohy maxima a minima výše uvedeného spektra byla jako optimální vlnová délka zvolena hodnota λ = 258 nm Hledání vhodné analytické kolony Při hledání vhodné analytické kolony se nejdříve vycházelo z diplomové práce vypracované na Katedře analytické chemie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. [19] Hydrofilní analytická kolona SeQuant ZIC TM (50 x 2,1 mm; 5 μm) se ukázala jako nevhodná pro stanovení 2-ethylpyridinu. Dimetinden-maleinát se eluoval jako dvě látky kyselina maleinová a dimetinden. 2-ethylpyridin měl stejný retenční čas jako kyselina maleinová a na chromatogramu se tyto dvě látky vyskytly jako jeden 36

37 pík. Ani vyzkoušení různých mobilních fází (organická složka mobilní fáze acetonitril, nebo směs acetonitrilu a tetrahydrofuranu), různých ph octanového pufru (ph 3,8; 4,8; 5,8; 6,8; 7,8) a různých poměrů organické a vodné složky (88:12, 95:5) a změn rychlosti průtoku nevedlo k dokonalému separačnímu procesu. K dalšímu hledání bylo využito poznatků literární rešerše. Druhou zkoušenou kolonou byla analytická kolona Supelco-Discovery C18 (125 x 4,6 mm; 5 μm). Mobilní fází byla směs acetonitrilu s 50 mm pufrem (dihydrogenfosforečnan draselný) o ph 3,0 v poměru ACN:pufr 60:40 a 50:50. Docházelo k nežádoucím jevům - k rozmývání píků a k výskytu negativních píků. Pro další měření byla vyzkoušena kolona Supelco-Discovery Cyano (100 x 4 mm, 5 μm) a výsledky se ukázaly jako uspokojivé. Došlo k oddělení 2- ethylpyridinu od kyseliny maleinové, ovšem její retenční čas byl tentokrát shodný s tzv. mrtvým objemem kolony (změřeným pomocí roztoku jodidu draselného). Proto musely být zkoušeny různé mobilní fáze a měněna průtoková rychlost Optimalizace sloţení mobilní fáze Zkoušela se řada mobilních fází (různé složení, různé ph) tak, aby byla vytipována mobilní fáze, která by vyhovovala stanovení dimetinden-maleinátu i 2- ethylpyridinu na koloně Supelco-Discovery Cyano (100 x 4 mm, 5 μm). Na základě rešerše bylo jako výchozí složení mobilní fáze vybrána směs acetonitrilu a pufru (hydrogenfosforečnan amonný 50 mm) o ph 5,5 v poměru ACN:pufr 60:40 (v/v). Retenční čas kyseliny maleinové se shodoval s mrtvým objemem kolony. Byly vyzkoušeny různé poměry MF (ACN:pufr 30:70, 35:65, 45:55, 50:50 (v/v)). Proto, že se v chromatogramu vyskytl blíže neidentifikovaný pík, tak se k MF postupně přidával různý poměr tetrahydrofuranu (ACN:pufr:tetrahydrofuran 35:60:5, 37:57:6, 30:60:10, 20:70:10 (v/v)), ovšem bez uspokojivých výsledků. Dále byl testován hydrogenfosforečnanový pufr o různé hodnotě ph (ph 3,5; 4,5; 6; 6,5) a zároveň měněn poměr mobilní fáze ACN:pufr (40:60, 50:50, 60:40, 70:30 (v/v)) i průtok MF. ph vodné složky mobilní fáze bylo upraveno kyselinou fosforečnou nebo hydroxidem amonným. Jako nejlepší volba se ukázalo rozhodnutí vyzkoušet přídavek triethylaminu (TEA). Opět byly vyzkoušeny různé poměry mobilní fáze, rychlosti 37

38 , mau ky. maleinová 2,03 4,17 2-ethylpyridin diltiazem hydrochlorid (IS) mau ,37 dimethinden průtoku i hodnoty ph mobilní fáze, ovšem jako nejideálnější ze všech možností byla mobilní fáze v poměru ACN:pufr o ph 5,5 40:60 s přídavkem 0,5 ml triethylaminu ve 100 ml hydrogenfosforečnanového pufru (Obr. 4). Optimální rychlost průtoku byla rychlost 0,7 ml/min ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 Minutes Obr. 4: Chromatogram standardů: kolona Supelco-Discovery Cyano (100 x 4 mm, 5 μm), mobilní fáze ACN:pufr o ph 5,5 (hydrogenfosforečnan amonný 50 mm ) v poměru 40:60 (v/v) s přídavkem 0,5 ml triethylaminu ve 100 ml pufru, průtok 0,7 ml/min a UV detekce při 258 nm Hledání vhodného vnitřního standardu Vnitřní standard je sloučenina, která se přidává ke směsi stanovovaných látek ve známém množství a její pík musí být separován od píků všech ostatních složek. Byla zkoušena řada látek jako potencionální vnitřní standardy, například: methylparaben, propylparaben, methylester kyseliny p-hydroxybenzoové, ibuprofen, ketoprofen, klotrimazol, estradiol, hydrokortison, kyselina citronová, pantotenan vápenatý a mnohé další. 38

39 Jako nejvhodnější vnitřní standard se ukázal diltiazem-hydrochlorid, jehož pík vykazoval retenční čas 4,17 min, byl dobře separován od píků ostatních látek, eluoval se před dimetindenem a zbytečně se tak neprodlužoval čas analýzy (Obr. 4) Rychlost průtoku mobilní fáze Jako optimální se ukázala rychlost průtoku 0,7 ml/min. Vyšší rychlost průtoku mobilní fáze měla pozitivní vliv na dobu trvání analýzy, zároveň však bylo negativně ovlivněno rozlišení chromatografických píků Souhrn nalezených optimálních chromatografických podmínek Mobilní fáze: acetonitril:vodný roztok hydrogenfosforečnanu amonného (50 mm) o ph 5,5 s 0,5 ml triethylaminu ve 100 ml pufru, 40:60 (v/v) Analytická kolona: Supelco Discovery Cyano (100 x 4 mm; 5 µm) Průtok F m (ml/min): 0, 7 Vlnová délka detekce λ (nm): 258 Vnitřní standard: diltiazem-hydrochlorid Dávkovaný objem: 10µl Reţim: izokratický Teplota: laboratorní 39