Úvod do MIKROBIOLOGIE. Filip Růžička Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Transkript

1 Úvod do MIKROBIOLOGIE Filip Růžička Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně Přednáška pro II. r. ZL 2012

2 Lékařská mikrobiologie soubor věd o mikroorganismech čili mikrobech, které mají význam v medicíně humánní, případně i veterinární patogenní mikroby, které vyvolávají onemocnění lidí nebo zvířat mikroby, které se u nich nalézají jen jako tzv. normální mikroflóra vzájemné vztahy mezi mikroby a jejich hostitelem vztahy mezi mikroby a prostředím Klinická mikrobiologie část lékařské mikrobiologie, zabývající se etiologií, patogenezí a diagnostikou onemocnění vyvolaných mikroby

3 Orální mikrobiologie úzce změřená část lékařské mikrobiologie na mikroorganizmy dutiny ústní Další mikrobiologie sanitární prostředí (půdní, vody apod.) rostlinolékařská potravinářská průmyslové mikrobiologie

4 bakterie mikromycety (plísně a kvasinky) (řasy) parazité viry prvoci helminti členovci bakteriologie mykologie (algologie) parazitologie protozoologie helmintologie entomologie virologie mikrobiologie obecná mikrobiologie speciální

5 Co nutno znát o agens Představení mikroba: jak vypadá, co způsobuje a proč, jak se infekce diagnostikuje, jak se léčí 1. Klasifikace a charakteristika Zařazení + typ buňky (eukaryotická/prokaryotická), příp. nebuněčný organizmus či protein) Je to bakterie, kvasinka, plíseň, či prvok? Morfologie + barvení Je bakterie kok, tyčinka, vlákno, spirála? G+, G-, nebo se barví jinak? Jak jsou buňky navzájem uspořádány? Tvoří spory, pouzdra, granula? Je virus obalený? Jakou má kapsidu? Aj. 2. Fyziologie, biochemie, genetika, odolnost Typ metabolismu Je to aerob/anaerob aj.? Odolnost Je odolný, či choulostivý? Růstová náročnost jak se kultivuje - je-li specifická, významná (např. T.pallidum/ nekultivovatelná, H. influenzae růstové faktory atd.), viry jen na živých buňkách, S. aureus 10% NaCl ) Biochemie je-li specifická, významná pro diagnostiku (př. Enterobacteriaceae) Antigeny Je jediný antigenní typ, či je typů několik? Je to významné pro diagnostiku (př. Enterobacteriaceae, streptokoky atd.) Genetika je-li významná pro rezistenci na ATB, faktory patogenity a virulence apod.

6 4. Patogenita Které choroby či syndromy vyvolává? česká a latinská (!) jména chorob, nejvýznamnější příznaky(př. varicella-zoster virus plané neštovice vyrážka/puchýřky, reaktivace jako herpes zoster u oslabených...) 5. Patogeneze Brána vstupu, šíření tělem, vylučování? Jak vznikají příznaky? Které jsou faktory patogenity? 6. Imunita Vzniká vůbec? Krátkodobá, nebo doživotní, humorální, či celulární? 7. Epidemiologie Zdroj infekce: člověk, zvíře, nebo prostředí? Jak se přenáší? 9. Prevence, případně profylaxe Očkuje se, nebo se imunizuje pasivně? O jaký typ očkovací látky jde? 10. Terapie Co je lékem volby? (klíčové příklady S.pyogenes - PNC apod.) Pokud antibiotikum, tak které?

7 8. Laboratorní diagnostika Průkaz přímý - průkaz příslušného agens (mikroskopie, kultivace, antigeny, NK) viz praktika nepřímý - průkaz protilátek viz praktika Co se nemocnému odebírá? Jak se to vyšetřuje? Když kultivací, nechce to zvláštní půdu? Jak se izolát blíže určí? Interpretace (Co se považuje za pozitivní nález, význam)

8 Jak tedy na zkoušku Trojotázky příklad: Biofilm a jeho medicínský význam Streptococcus pyogenes Rod Hepatovirus Obecná mikrobiologie Etiologické otázky strukturovat odpověď, vybrat vhodné příklady Orální otázky viz letní semestr, etiologie parodontitid, zubního kazu atd., správné názvy mikrobů Speciální mikrobiologie viz výše

9 Doporučená literatura

10

11 Biofilm a jeho význam Filip Růžička Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně Přednáška pro II. r. ZL 2012

12

13 HISTORIE 1676 Antony van Leeuwehoek sledoval bakterie v zubním povlaku Od dob Pasteura a Kocha 100 let nikoho nenapadlo, že mikrobi v přírodě rostou jinak, než jako volně se vznášející plankton v tekutinách nebo jako kolonie na pevných půdách 1935 C. E. Zobel první popis biofilmu u mořských bakterií první zprávy o problémech s biofilmem 1978 J. W. Costerton upozornění na všudypřítomnost biofilmu a jeho možná účast na perzistentních infekcích

14 Biofilm adheze, kooperace, gradient Planktonická forma Šíření mikroorganizmů Způsob života mimo rozhraní fází Biofilm Mechanická ochrana Vliv na účinek ATB Ochrana před chem. látkami Výměna genetické informace Homeostáza - mikroprostředí Kooperace a specializace buněk Ochrana před imunitním systémem

15 BIOFILM Mikrobiální biofilm je společenství mikroorganizmů, které se tvoří na rozhraní fází. Pevně lne k inertním i živým povrchům. Vedle mikrobiálních buněk bývá důležitou stavební složkou biofilmu i mezibuněčná hmota. V biofilmu probíhá komunikace a kooperace mezi jednotlivými buňkami i celými populacemi

16 ČASNÁ FÁZE - atraktace a adheze buněk k povrchu STŘEDNÍ FÁZE - tvorba mikrokoloní (akumulace buněk), příp. tvorba pseudo/hyf, produkce extracellulární matrix MATURACE - vytvoření silné vrstvy biofilmu s etracellulární matrix DISPERSE - odlučování buněk TVORBA BIOFILMU

17 Regulace tvorby biofilmu hustota populace, složení společenstva, koncentraci živin aj. Systém quorum-sensing malé extracelulární signální molekuly akumulace transkripce cílových genů. Jeden druh může mít více QS systémů a více signálních molekul Kandidy - FARNESOL vliv na expresi min. 274 genů inhibice biofilmu X tvorba klíčků, časná fáze tvorby biofimu - TYROSOL G- bakterie - N-acyl-L-homoserin laktony G+ bakterie - signální peptidy (s cyklickou thionolaktonovou strukturou)

18 Biofilm významný faktor virulence mechanická ochrana buněk (adheze k povrchům a matrix) Vrstva biofilmu tvoří vhodné mikroprostředí v okolí mikrobů Kooperace a specializace buněk, přenos genů Ochrana před účinky imunitního systému Vliv na účinek antimikrobiálních látek Snížená difúze do biofilmové vrstvy, vazba na struktury biofilmu, Zvýšená degradace ATB účinkem enzymů Změny vlastností mikroba, exprese odlišných genů (multidrug efflux pumps CDR, MDR) Heterogenita populace (genetická variabilita), perzistoři Změny mikroprostředí Změny rychlosti růstu

19 BIOFILMOVÁ ONEMOCNĚNÍ pomalý, chronický průběh často bez výraznějších příznaků občas akutně exacerbují antibiotická terapie mívá omezený efekt po vysazení antibiotik infekce rekurují izolovaná agens se mohou jevit dle MIC jako citlivá

20 Biofilmové infekce spojené s přítomností implantátů biofilmové infekce krevního řečiště (katétrové sepse, infekce chlopenních náhrad, aj..), endotracheální kanyly, chirurgické stehy, infekce močových katetrů, inf. kloubních náhrad, kontaktní čočky aj aj... kolpitidy, zubní kaz, rány otitis, osteomyelitidy, pneumonie u cystické fibrózy subakutní endokarditidy, cholecystitidy Biofimové infekce nativních povrchů

21 BIOFILM V MAKROORGANISMU HRAJE I PROSPĚŠNOU ROLI normální mikroflóra tvoří vrstvu biofilmu na sliznicích

22 Problémy s biofilmem jsou i mimo medicínu Znečištění povrchů Zvýšení turbulence protékající tekutiny Zúžení průsvitu až ucpání potrubí Koroze ropovodů, nádrží paliva v letadlech Černání tekutin redukovanými kovy Tvorba izolační vrstvy v tepelných výměnících Zvýšení odporu lodního trupu při plavbě aj.

23 Jak diagnostikovat infekce s přítomností biofilmu? Jak interpretovat schopnost agens tvořit biofilm? Jak léčit infekce spojené s přítomností biofilmu?

24 Laboratorní diagnostika biofilmových infekcí Pevné přilnutí k povrchu - záchytu mikroba. Je přítomen biofilm? Jakou hraje roli v patogenezi? Jak ovlivní biofilm terapii? Průkaz infekce implantátu A) Nevyžadující vyjmutí implantátu B) Průkaz kolonizace implantátu po jeho vyjmutí Průkaz schopnosti tvořit biofilm Účinnost antimikrobiální terapie na biofilm

25 Fenotypové metody průkazu tvorby biofilmu Vizualizace Adheze Biofilmová vrstva Kultivační průkaz Průkaz klíčových složek biofilmu Povrchové vlastnosti mikroba

26 Kultivační průkaz tvorby biofilmu Modifikace Christensenovy metody (Christensen et al., 1982,1985) 1) Kultivace mikroba v přítomnosti vhodného kutivačního povrchu Zkumavková metoda Disková metoda Mikrodestičková metoda 2 ) Promytí - odstranění planktonických buněk 3) Průkaz vytvořené biofilmové vrstvy Zjištění počtu CFU Barvení + spektrofotometrické měření Sušina Kolorimetrická média (redukce tetrazoliových solí, resazurin aj.) a další

27 Průkaz stavebních složek biofilmu (extracelulární matrix) Charakteristický růst na agaru s Kongo červení (Freeman 1985) Povrchové vlastnosti zodpovědné za adhezi Hydrofobita Adheze buněk na rozhraní uhlovodík/voda (Rosenberg et al., 1980) Suspenze testovaného + Uhlovodík (xylen, oktan aj.) Vortexování OD vodní fáze Hydrofobicita redukci OD původní susp. Měření kontaktního úhlu Povrchový náboj a izoelektrický bod (pi) kapilární izoelektrická fokusace (Růžička et al., 2009; 2010)

28 Genotypové metody průkazu schopnosti tvořit biofilm detekce genů kódujících tvorbu biofilmu Průkaz ica operonu u stafylokoků pomocí PCR Primer-F Primer-R ica R ica A ica D ica B ica C 546 bp - ica operon 124 bp S. epidermidis

29 Klinický význam průkazu tvorby biofilmu Marker klinické významnosti kmene Je kmen izolovaný z hemokultur klinicky relevantní? Nejde o kontaminaci? Průkaz tvorby biofilmu může přinést cenné klinické informace Prognóza. Jak postupovat v další léčbě? Citlivost biofilmu k antimikrobiálním látkám Jaké antimikrobiální látky použít na katétrovou infekci?

30 MIKROBY V BIOFILMU JSOU VŽDY ODOLNĚJŠÍ NEŽ FORMY PLANKTONICKÉ MIC neodpovídá koncentracím antimikrobiálních látek schopných zasáhnout biofilm (MBIC a MBEC) Zvýšená odolnost se týká dezinfekčních látek i antibiotik/antimykotik Rozdíly v citlivost činí až několik řádů Předpokládá se více mechanizmů, které se na rezistenci BF podílí MIC nemá přímý vztah k MBIC a MBEC MBIC - minimální biofilm inhibující koncentrace MBEC - minimální biofilm eradikující koncentrace

31 ZHORŠENÝ PRŮNIK EXTRACELULÁRNÍ MATRIX - PENETRAČNÍ BARIÉRA SNÍŽENÍ DIFÚZE ANTIMIKROBIÁLNÍ LÁTKY nelze však vždy prokázat VLIV POVRCHOVÉHO NÁBOJE zdá se důležitější např. aminoglykosidy (+) se vážou na alginát (-) P. aeruginosa SNÍŽENÁ DIFÚZE ENZYMŮ jako jsou ß-laktamázy Snazší degradace antibiotik

32 ZMĚNA PROSTŘEDÍ vyčerpání O 2 v určitých oblastech zvýšení osmotického tlaku nahromadění kyselých zplodin metabolismu přímý účinek - potlačení účinku antibiotika chinolony, aminoglykosidy nepřímý účinek - snížení růstové rychlosti beta-laktamy, glykopeptidy

33 ZMĚNA MIKROBIÁLNÍ POPULACE toxická látka zabije většinu mikrobů v biofilmu zůstane subpopulace buněk k dané látce vysoce rezistentních Biofilmový fenotyp - exprese genů zodpovědných za rezistenci tato subpopulace odpovídá za zvýšenou rezistenci biofilmu

34 PREVENCE BIOFILMOVÝCH INFEKCÍ JE VÝHODNĚJŠÍ NEŽ LÉČBA Společný zájem pacienta, lékaře i ekonomů

35 Agens a jeho faktory virulence (adheze aj.) Stav pacienta (imunosuprese, věk, další onemocnění) Typ implantátu (mechanické, konstrukční a fyzikálně-chem. vlastnosti, zvl. charakter povrchu aj.) Způsob zavedení a péče o implantát

36 Prevence biofilmových infekcí Vhodná volba implantátu a způsob zavedení (asepticky!) Zkušený personál + kvalitní následná péče Preventivní/preemptivní podání ATB u rizikových pacientů??? Vhodný materiál (charakter povrchu: druh materiálu, povrchová energie, povrchový náboj, hrubost aj.) Impregnace implantátů - antimikrobiální látky a antiseptika (chlorhexidin, Ag)

37 Terapie infekcí spojených s tvorbou biofilmu

38 Terapie infekcí spojených s tvorbou biofilmu Likvidace ložiska odstranění implantátu + následná ATM terapie Ponechání infikovaného implantátu Méně závažné infekce patogenními mikroby (např. CoNS), riziko disseminace Stabilizovaný pacient, benigní průběh, bez komplikací Reaguje na ATB terapii Pokus o likvidaci ložiska biofilmu (Vysoká pravděpodobnost selhání) (Doporučení IDSA - Mermel et al, 2009)

39 Budoucnost Prevence katétrových infekcí Interference se signály typu quorum sensing (furanony, RNAIII-IP, AIP) Ovlivnění povrchových vlastností katétru Inhibice vzniku vysoce odolných perzistorů Vakcinace? Terapie katétrových infekcí Rozvolnění mezibuněčné hmoty enzymaticky (lyasy polysacharidů) fyzikálně (ultrazvukem, elektromagnetickým polem) Molekuly vyvolávajících autodestrukci biofilmu? regulátory tvorby biofilmu (quorum sensing - furanony, RNAIII-IP, AIP)

40

41 Úvod do orální mikrobiologie Filip Růžička Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně Přednáška pro II. r. ZL 2012

42 Mikroflóra dutiny ústní

43 Vše začalo Leeuwenhoekem (a) Původní kresba A.L., (b) Campylobacter rectus, (c) Selenomonas sputigena, (d) ústní koky (e) Treponema denticola, (f) Leptotrichia buccalis

44 Mikroflóra dutiny ústní Jedno z nejrozsáhlejších mikrobiálních společenství, přes 700 rodů, některé dosud nepopsané Stálá komenzálové, nebo přechodná Ekologický systém Tvorba biofilmu Významný vliv na zdraví lokálně i celkově Vztah k etiologii zubního kazu a parodontitidy

45 Prostředí dutiny ústní Vícevrstevný dlaždicový epitel Rty Bukální sliznice Sliznice patra Hřbet jazyka Dásňové sulky Dále Povrch zubů Protetické náhrady a ortodontické aparáty

46 Rty Mikroflóra přechodem mezi mikroflórou kůže a ústní sliznice. Na retní sliznici převážně streptokoky, např. Str. vestibularis. Bukální sliznice Sliznice dutiny ústní je osídlena relativně řídce na jednu epitelii připadá jen 5 25 bakterií. Na bukální sliznici nalézáme hlavně Str. sanguinis a Str. mitis, H. parainfluenzae a částečně i ústní neisserie.

47 Sliznice patra Hlavními zástupci streptokoky a aktinomycety, méně hemofily a gramnegativní anaeroby. Kandidy - snímací totální a parciální náhrady. Hřbet jazyka V prostorách mezi papilami mohou zůstávat odloupané epitelie; mikrobů proto daleko více. Nízký redox potenciál - růst anaerobů. Kromě Str. sanguinis nalézáme na jazyku i Str. salivarius, Stomatococcus mucilaginosus, neisserie (zejména u malých dětí) a hemofily, ale i veillonely, aktinomycety a prevotely.

48 Sulci gingivales Hlavně anaeroby a fakultativně anaerobní bakterie ANAEROBY fakultativní AEROBY Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans Actinomyces A. gerencseriae, A. georgiae Fusobacterium F. nucleatum, F. alocis, F. sulci Prevotella nigrescens Porphyromonas gingivalis, P. endodontalis Treponema denticola, T. vincentii, pectinovarum, socranskii Tannerella forsythia Wolinella succinogenes Selenomonas sputigena Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus subsp. constellatus, Streptococcus constellatus subsp. pharyngis, Streptococcus intermedius Z prvoků se v sulci gingivales vyskytují Entamoeba gingivalis a Trichomonas tenax.

49 Subgingivální plak převládají anaeroby, např. Peptococcus anaerobius, Peptococcus magnus a Peptococcus micros, různé druhy eubakterií, Propionibacterium propionicum, Bifidobacterium dentium, veillonely, Porphyromonas gingivalis a Porphyromonas endodontalis, Prevotella nigrescens a Leptotrichia buccalis.

50 Povrch zubů Zubní plak - liší se dle lokalizace. Hladké supragingivální povrchy jsou osídleny menším počtem mikrobů, a to vesměs aerobních, než rozmanité štěrbiny a mezizubní prostory, Subgingivální plak poskytuje výhodnější podmínky mikrobům anaerobním.

51 Supragingivální plak - na povrchu zubů zejména Streptococcus mutans a Streptococcus sobrinus. Ve vyvinutém plaku pak též Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis a Streptococcus peroris, většinou ale ne S. salivarius. Dále mohou být různé druhy laktobacilů a hemofilů, Rothia dentocariosa, Eikenella corrodens, Capnocytophaga haemolytica a Capnocytophaga granulosa.

52 Protetické náhrady a ortodontické aparáty Na dentálních pomůckách velmi snadno vzniká biofilm plak, na jehož vzniku se kromě vyjmenovaných spíše aerobních mikrobů podílejí ještě stafylokoky, a to i Staphylococcus aureus, a především kvasinky, zvláště Candida albicans. V případě špatně udržovaných protetických náhrad mohou tyto kvasinky vyvolat stomatitidu.

53 Mikroflóra dutiny ústní má významnou úlohu při vzniku a vývoji onemocnění dásní a parodontu i při patogenezi celkových onemocnění

54 Rod Streptococcus α-hemolytické druhy streptokoků, rozděleny na skupiny Skupina S. mutans: Nejčastěji se izoluje S. mutans, méně často S. sobrinus, vzácně S. cricetus a S. rattus. Ze sacharózy tvoří lepkavé glukany a fruktany, rychle tvoří kyseliny ze sacharidů Skupina S. salivarius: S. salivarius, S. vestibularis - ve slinách a na povrchu jazyka. Sacharózu metabolizuje na fruktan levan, na půdách s tímto cukrem roste v mukózních koloniích, může vyvolat endokarditidu.

55 Skupina S. mitis: S. mitis, S. oralis a S. peroris - na sliznici i v zubním plaku a s výjimkou S. mitis vyvolávají loudavou sepsi + S. sanguinis a S. gordonii - na jazyku, na bukální sliznici a v zubním plaku. S. sanguinis dovede štěpit sekreční IgA. Oba druhy jsou významnými původci subakutní bakteriální endokarditidy (sepsis lenta)!! Skupina S. anginosus rostoucí v drobných koloniích - S. anginosus (v brit. literatuře S. milleri), S. constellatus se dvěma poddruhy, constellatus a pharyngis, a S. intermedius. Kromě nosohltanu se nalézají zejména v gingiválních sulcích. Působí dentoalveolární a endodontické infekce.