Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie Charles University in Prague Faculty of Science Department of Genetics and Microbiology Doktorský studijní program: Mikrobiologie Ph.D. study program: Microbiology Autoreferát dizertační práce Summary of the Ph.D. Thesis Divergentní mikrobiální konsorcia respirující organohalidy v sedimentech kontaminovaných PCB Divergent organohalide-respiring consortia in PCB-contaminated sediments Mgr. Martina Pravečková Školitel / Supervisor: RNDr. Maria Brennerová, CSc. Prague, 2016

2 Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Program: Mikrobiologie Předseda oborové rady: doc. RNDr. Ivo Konopásek, CSc. Školící pracoviště: Laboratoř molekulární genetiky bakterií Mikrobiologický ústav Akademie věd České republiky, v. v. i. Autor: Mgr. Martina Pravečková Školitel: RNDr. Maria Brennerová, CSc. Konzultant: Pierre Rossi, Ph.D. Konzultant: Prof.RNDr.Tomáš Cajthaml, Ph.D. S touto dizertační prací je možno se seznámit v příslušných knihovnách Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze.

3 Obsah/ Content Abstrakt (CZ)... 4 Abstract (ENG)... 6 Úvod... 8 Cíle práce a hypotézy... 9 Materiály a metody Výsledky a diskuze Shrnutí Introduction Aims and hypothesis Materials and Methods Results and Discussion Conclusions Použitá literatura / References Životopis/ Curriculum Vitae Seznam publikací / List of publications... 31

4 Abstrakt Tato práce je zaměřena skupinu halogenovaných sloučenin označovaných jako polychlorované bifenyly (PCB) syntetické organické látky, u nichž jsou vodíkové atomy na bifenylovém skeletu nahrazeny v různé míře atomy chloru. Počet atomů chloru v molekule PCB může být v rozmezí 1-10 a dle poloh umístění těchto atomů může být vytvořeno až 209 různých kongenerů, z nichž některé jsou toxické. Přestože byla produkce PCB směsí zastavena již před více než třiceti lety, odolnost těchto látek k degradaci je učinila jedním z hlavních polutantů životního prostředí v globálním měřítku. Velké množství PCB bylo produkováno několika zeměmi a bývalé Československo patřilo k deseti největším světovým producentům. Přestože jsou PCB kongenery velice chemicky stabilní, bylo zjištěno, že proces bakteriální reduktivní dechlorinace, nazvaný též jako respirace organohalidů (OHR) je velmi účinným způsobem dechlorinace vysoce chlorovaných molekul PCB. Tento proces je také nutným krokem ke kompletní mineralizaci aerobními bakteriemi. V rámci této studie byla reduktivní dechlorinace PCB studována pomocí dlouhodobě kultivovaných anaerobních mikrokosmů. Mikrokosmy byly inokulovány sedimentem s vysokou kontaminací PCB. Vzorky byly odebrány z vypouštěcího kanálu bývalého výrobce PCB Chemko Strážske. Po 10 měsících kultivace byla provedena chemická analýza, která prokázala dechlorinaci vysoce chlorovaných PCB až o 36 % ve prospěch středně a méně chlorovaných sloučenin. T-RFLP analýza bakteriálních komunit prokázala, že došlo k vývoji odlišných mikrobiálních společenstev v různých vzorcích, přestože na počátku byly profily podobné. Analýza genu rrna naznačila přítomnost početné skupiny zástupců kmene Chloroflexi, zahrnujícího také rod Dehalococcoides a skupinu bakterií blízce příbuzných Dehalococcoides, které jsou známými OHR bakteriemi a také skupinu sekundárních fermentujících bakterií. Druhá studie v rámci této práce cílila na odhalení degradačního potenciálu dalšími taxony bakterií s použitím mikrokosmů bez přítomnosti sedimentu, tzv. sediment-free kultur (SFM) doplněných o komerční směs PCB (Delor 103). Naše výsledky prokázaly vysokou míru dehalogenace kongenerů (až o 95.5 %) v dlouhodobě kultivovaných mikrokosmech (692 dní). Bakteriální komunity byly reprezentovány především dvanácti kmeny, mezi nimiž dominovaly především bakterie taxonů Chloroflexi, Proteobacteria a Firmicutes. V prvním souboru kultur bez sedimentu byly detekovány kmeny Dehalococcoides mccartyi CG4 a CBDB1 jako bakterie dechlorinující hlavní kongenery. V druhém souboru mikrokosmů byl

5 přidán 2-bromoethansulfonát (BES), který růst Dehalococcoides sp. nepřímo inhiboval. Ze všech detekovaných částečných sekvencí genu rrna v BESem ošetřených mikrokosmech byly získány pouze dvě sekvence vykazující příbuznost s rodem Dehalococcoides, tvořící 0.02 % a 0.04 % celkové komunity (jedna sekvence z celkových 5983 byla získána ze SFM11 a jedna z celkových 2494 sekvencí pocházela ze SFM13). BESem ošetřené kultury ukázaly odlišnou strukturu komunit, především s ohledem na organismy zapojené v syntrofních procesech. Nepřímé důkazy poskytnuté na základě statistických a fylogenetických analýz prokázaly významný vliv nového taxonomického shluku (patřícího do čeledi Geobacteraceae) na dechlorinaci PCB. Členové této čeledi jsou známí také svou kapacitou degradovat chlorovaná rozpouštědla. Tato studie tedy poskytuje první důkazy o možném zapojení taxonu Geobacteraceae do dechlorinace PCB kongenerů..

6 Abstract This study is focused on one particular group of halogenated compounds known as polychlorinated biphenyls (PCBs) synthetic organic substances, where the hydrogen atoms of the biphenyl core are replaced by chlorine atoms. Number of chlorine atoms in the PCB molecule may vary from 1 to 10. Depending on the position and number of chlorines, there are theoretically 209 individual PCB congeners, some of which are toxic. Although PCBs production was brought to a halt thirty years ago, recalcitrance to degradation makes them a major environmental pollutant at a global scale. Large amounts of PCBs were produced in several countries, and former Czechoslovakia belonged to the ten major world producers. Despite the high chemical stability of PCB congeners, bacterial process of reductive dechlorination, named organohalide respiration (OHR), was shown to be efficient in the dechlorination of extensively chlorinated PCB congeners as a prerequisite step towards their subsequent complete mineralization by aerobic bacteria. In our study, reductive dechlorination of PCBs was assessed using long term anaerobic microcosms. The microcosms were inoculated with highly contaminated sediments with weathered Delor located in the efflux channel of the former PCB manufacturer Chemko Strazske. After 10 months of cultivation the chemical analysis showed a dechlorination of up to 36.% of the highly chlorinated congeners in favor of medium and low chlorinated ones. T-RFLP analysis of the bacterial communities demonstrated that the diverse microbial consortia evolved from the original sediment samples after inoculation. Analysis of the rrna gene pools indicated the presence of numerous members of the phylum Chloroflexi, including Dehalococcoides sp. and Dehalococcoides -like group (DLG), as well as already known secondary fermenters. Second study aimed at exploring degradation contributions by other taxa using sediment-free microcosms (SFMs) supplemented with the commercial PCB mixture Delor 103. Our results showed high rates of congener dehalogenation (up to 95.5 %) in the long term (692 days). The bacterial communities were represented by twelve major phyla dominated by Chloroflexi, Proteobacteria, and Firmicutes. In the first batch of SFMs, Dehalococcoides mccartyi strains CG4 and CBDB1 were considered as the main congener degraders. However, addition of 2- bromoethanesulfonate (BES) in a second batch of SFMs inhibited population of Dehalococcoides sp. From all retrieved partial 16S rrna gene sequences from BES-treated microcosms only two sequences affiliated to genus Dehalococcoides were detected contributing to a mere 0.02 % and 0.04 % of the community (one sequence out of 5983 sequences from SFM 11 and one out of 2494 sequences from SFM13). The BES-treated SFMs showed different community structures, especially with contributions of organisms

7 involved in syntrophic activities. Indirect evidence provided by both statistical and phylogenetic analyses validated the significant implication of a new cluster of actors, affiliated with family Geobacteraceae (phylum δ-proteobacteria) in the dechlorination of PCBs. Members of this family are known already for the degradation capacity of chlorinated solvents. This study provides first evidence about the possible implication of the Geobacteraceae members in the PCB congener degradation.

8 Úvod Polychlorované bifenyly (PCB) byly masivně používány pro různé průmyslové využití díky unikátním vlastnostem, jako např. extrémní odolnost vůči teplotám a vysoká chemická stabilita. Tyto směsi byly prodávány pod různými obchodními názvy specifickými pro konkrétní zemi původu (např. Aroclor, Kaneclor, Fenclor atd. Od roku 1954 až do 1984 byly také vyráběny v dřívějším Československu (dnes východní Slovensko) závodem Chemko Strážske (Kočan, 2001). Směsi PCB se zde vyráběly pod označením Delor, Hydelor a Delotherm (Dercová et al., 2008). V lokálním měřítku došlo k rozšíření kontaminace z této chemické továrny především ve vypouštěcím vodním kanálu, který vede do řeky Laborec a následně do vodní nádrže Zemplínská Šírava, která je oblíbenou prázdninovou lokalitou (Dercová et al., 2008). Velmi vysoká koncentrace kongenerů PCB je zde stále přítomna a to i po 25 letech od ukončení produkce (Kočan, 2001), což činí tuto oblast jednou z lokalit nejvíce kontaminovaných PCB na celém světě. Přestože jsou kongenery PCB odolné vůči chemickým modifikacím, bylo zjištěno, že je možné tyto kongenery odstranit za pomoci anaerobních bakterií. První pozorování tohoto procesu učinil a popsal v roce 1987 tým doktora Browna v sedimentech řeky Hudson (Brown et al., 1987, 1988). Tato pozorování vedla k rozsáhlým laboratorním studiím, potvrzujícím potenciál anaerobní respirace organohalidů (OHR) v sedimentech (Abramowicz, 1995; Pagano et al., 1995; Quensen et al., 1990; Rysavy et al., 2005; Yan et al., 2006a; Yang et al., 2008). Anaerobní reduktivní dechlorinace vysoce chlorovaných kongenerů PCB byla shledána jako nutný předpoklad pro následnou mineralizaci aerobními bakteriemi (Field and Sierra-Alvarez, 2008). Laboratorní studie prokázaly efektivitu degradace PCB kongenerů mikrobiálními komunitami s použitím kultur bez sedimentu. Přestože však již byla provedena řada studií degradačních procesů, je stále dostupné pouze omezené množství informací o příslušnosti hlavních bakteriálních skupin podílejících se na OHR procesu (Bedard, 2008; Bedard et al., 2006; Fagervold et al., 2007; Hiraishi, 2008; Kjellerup et al., 2008; Yan et al., 2006). Zástupci čtyř hlavních kmenů (včetně Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes a Chloroflexi) se pravděpodobně účastní OHR procesu (Cutter et al., 2001; Kjellerup et al., 2008; Wu et al., 2002; Zanaroli et al., 2010). Dehalococcoides sp. a bakterie fylogeneticky vzdálených kmenů o-17, DF-1 a m-1 (náležící ke kmenu Chloroflexi) byly definovány jako klíčoví členové OHR procesu díky jejich obligatorně dehalorespirujícímu metabolismu (Bedard, 2008). Fakultativní OHR izoláty náležící k rodu Anaeromyxobacter, Desulfitobacterium, Sulfurospirillum,

9 Desulfomonile, Desulfuromonas, Desulfovibrio a Geobacter jsou metabolicky univerzální s ohledem na spektrum donorů a akceptorů elektronů. Tyto rody jsou také schopny dehalogenovat široké spektrum halogenovaných sloučenin, ale jejich účast v degradaci kongenerů PCB nebyla zatím přímo prokázána. Cíle práce a hypotézy Mnoho studií bylo již provedeno na znečištěné lokalitě Strážske s účelem monitorování PCB kontaminace nebo posouzení vlivu znečištění na lidské zdraví (Dudková et al., 2012 Koc an et al., 1994 Wimmerová et al., 2015). Málo je však známo o OHR bakteriích účastnících se dechlorinace PCB v sedimentech Strážskeho kanálu. Jelikož jsou mikrobiální komunity fundamentální složkou vodního ekosystému a hrají důležitou roli v detoxikaci PCB, pochopení jejich funkce je prioritou, která následně umožní odstranit PCB znečištění z přírody. V této studii jsme se proto zabývali identifikací taxonomických struktur aktivních mikrobiálních společenství během anaerobní dechlorinace PCB v sedimentech z lokality Strážske. Hlavní cíle této práce byly proto definovány jako i) charakterizace struktur mikrobiálních komunit přítomných v sedimentech vypouštěcího kanálu Strážske, ii) vývoj stabilních kultur bez sedimentu za účelem studia mikrobiálních komunit, iii) identifikace nových bakteriálních taxonů se schopností respirace organohalidů.

10 Materiály a metody Pro účely studie byly provedeny tři experimenty založené na anaerobních mikrokosmech. Jako první byly odebrány vzorky z vypouštěcího kanálu chemičky Chemko Strážske. Celkové množství osmi vzorků sedimentů (vzorky M1 až M6, S2 a S3) bylo odebráno ze spodní vrstvy sedimentu s použitím sterilní vzorkovnice. Obsah vzorkovnice byl umístěn uchováván v anaerobním plastovém kontejneru při 4 C. Následně byly v anaerobním rukávovém boxu zkonstruovány anaerobní sedimentové mikrokosmy založené na odebraných vzorcích z kanálu chemičky Chemko Strážske. Anaerobní mikrokosmy byly zhotoveny s použitím skleněných lahví naplněných tekutým kultivačním médiem pro rod Dehalobacter (Holliger et al., 1998). Ke kulturám byl v pravidelných časových intervalech přidáván roztok s donory elektronů (etanol:propionát:butyrát:acetát). Plynná fáze byla vyměněna směsí CO 2 /N 2 a v láhvích byl udržován přetlak po celou dobu kultivace, která probíhala ve tmě při 30 C (bez míchání). Během kultivace bylo provedeno několik odběrů a ze vzorků byly izolovány DNA a RNA, které byly použity pro vyhodnocení přítomnosti známých bakterií a genů účastnících se OHR procesu pomocí PCR metody. Mikrobiální komunity byly testovány s použitím metody T- RFLP a následné statistické analýzy (Rossi et al., 2009). Hloubková fylogenetická analýza vybraných mikrokosmů byla provedena s použitím klonování, sekvenování a následnou konstrukcí fylogenetických stromů. Po 13 měsících kontinuální kultivace byl obsah PCB hodnocen na základě dat z GC-MS metody. Druhý experiment byl založen na kultivaci 14 kultur bez sedimentu. Anaerobní mikrokosmy byly zkonstruovány dle techniky vyvinuté Bedard a kol. (Bedard et al., 2006). Směs kongenerů Delor 103 byla přidána jako koncentrovaný roztok acetonu k silica částicím ve skleněných kultivačních lahvích. Lahve byly poté naplněny kultivačním médiem pro rod Dehalobacter (Holliger et al., 1998). 2,6-dibromobifenyl byl přidán pro prvotní nastartování redukce PCB kongenerů (Bedard et al., 2007). K polovině mikrokosmů byl přidán 2- bromoethanesulfonát (BES), selektivní inhibitor methanogeneze. Jako jediný zdroj elektronů byla přidána směs etanol:propionát:butyrát:acetát. Plynná fáze byla vyměněna za CO 2 /N 2 s nastavením mírného přetlaku. Mikrokosmy byly inokulovány suspenzí ze sedimentového mikrokosmu M1 a byly kontinuálně kultivovány po dobu 98 až 692 dnů. Za účelem detekce známých OHR bakterií a genů pomocí PCR byly z kultur izolovány DNA a RNA. Diverzita mikrobiálních komunit byla zjišťována za pomoci sekvenování nové generace (NGS) ze

11 vzorků cdna s použitím primerů cílících na V3 hypervariabilní oblast 16S rdna. Množství PCB kongenerů bylo analyzováno po skončení kultivace každého mikrokosmu s použitím GC-ECD. V posledním experimentu byla testována druhá generace 4 kultur bez sedimentu, která byla sestavena a kultivována za stejných podmínek jako generace první. Jediný rozdíl činilo inokulum, kterým byl v případě druhé generace mikrokosmů supernatant ze 4 vybraných mikrokosmů první generace. DNA a RNA byly izolovány z mikrokosmů po 504 dnech kontinuální kultivace a stejně tak byla provedena NGS analýza, aby bylo možné identifikovat složení mikrobiálních komunit. Metoda GC-ECD byla použita pro finální zhodnocení PCB dechlorinace. Metody statistické analýzy byly použity pro interpretaci datových setů z NGS v kombinaci se získanými dechlorinačními patterny PCB získanými pomocí GC-ECD. Byly použity následující metody: Konstrukce, kultivace a udržování anaerobních kultur Analytické metody GC-MS a GC-ECD Klonování a Sangerovo sekvenování PCR Sekvenování nové generace Statistická analýza a příprava fylogenetických stromů Materiál a metody jsou detailně popsány v příslušných publikacích autora a v této disertační práci.

12 Výsledky a diskuze Tato studie poskytuje první náhled do mikrobiální komplexity konsorcií se schopností transformace PCB pomocí respirace organohalidů specifických pro oblast východní Evropy vysoce kontaminované částečně rozštěpeným Delorem. Strategie tohoto výzkumu se zaměřila na tři po sobě jdoucí kultivace v mikrokosmech. Všechny mikrokosmové experimenty byly provedeny s použitím komplexního kultivačního média dle Holliger et al. (1998), které je vhodné pro anaerobní kultivaci OHR bakterií z různých fylogenetických skupin. Kultivační médium mimo jiné také umožnilo standardizovat prostředí konsorcií v mikrokosmech, které byly na počátku inokulovány osmi odlišnými vzorky sedimentů. Donory elektronů byly pravidelně přidávány, aby umožnily správný rozvoj bakteriálních komunit díky aktivnímu mezidruhovému přenosu H 2 (Achtnich et al., 1995; Heimann et al., 2006). Vitamín B12, který byl složkou kultivačního média, pomohl navíc zkonstruovat korinoidový kofaktor, který je esenciální částí Fe-S aktivního místa reduktivních dehalogenáz účastnících se OHR (Rupakula et al., 2015). Design sedimentových mikrokosmů se lišil od konvenčních anaerobních kultivačních technik běžně používaných při studiu dechlorinace PCB a dioxinů (Bedard et al., 2007a D Angelo and Nunez, 2010; Watts et al., 2005; Zanaroli et al., 2010). Vyšší objem umožnil opakované vzorkování celkové DNA a RNA a pomohl vyvážit možný vliv eliminace chloridových iontů během OHR procesu, jelikož bylo prokázáno, že ph je důležitým faktorem ovlivňujícím průběh OHR (Lacroix et al., 2014). Pro analýzy dechlorinačních patternů a diverzity přítomných OHR bakteriálních skupin byly použity mikrokosmy bez sedimentu (Bedard et al., 2007a Dudková et al., 2012 Fagervold et al., 2007a; Yan et al., 2006a). Prvotní chemická analýza sedimentů na lokalitě Strážské potvrdila stále vysoké koncentrace PCB ve výpustním kanálu. Koncentrace se pohybovaly mezi 6.8 až 136 mg/kg. Tyto hodnoty byly porovnatelné s těmi, které byly nalezeny v sedimentech v roce 1997/1998 skupinou Kočan a kol. (Kočan, 2001) V následné studii byl zjišťován degradační potenciál a složení mikrobiálních komunit pomocí sedimentových mikrokosmů. Výsledky dechlorinace naštěpených PCB kongenerů po 10 měsících kontinuální kultivace ukázaly velké rozdíly mezi mikrokosmy ve smyslu celkového množství kongenerů. Pouze tři mikrokosmy (M1, S2 a S3) ukázaly vysokou dehalogenační kapacitu vysoce chlorovaných PCB kongenerů. Kompletní odstranění PCB však vyžaduje

13 kooperaci různých bakterií a ty mají rozdílné požadavky na prostředí, v němž žijí (Borja et al., 2005). Anaerobní sedimenty kontaminované PCB obvykle hostí několik různých fylotypů jako např. β-, δ- a γ-proteobacteria, Clostridiales, Bacteroidetes, grampozitivní bakterie s nízkým obsahem G+C a Chloroflexi (Bedard et al., 2006, 2007a; Yan et al., 2006a). V této studii byla studována struktura celé bakteriální komunity přítomné v sedimentovém mikrokosmu pomocí metody T-RFLP. Po šesti měsících kontinuální kultivace byl detekován posun ve struktuře komunity, přestože kultivační podmínky byly jednotné a struktury mikrobiálních komunit na počátku byly velice podobné. Tato situace byla již popsána u triplikátů sedimentových mikrokosmů, které vykazovaly různé úrovně dehalogenačních kapacit (Bedard et al., 2005). Bakteriální kmeny s kapacitou redukce chlorovaných sloučenin byly detekovány ve vzorcích RNA (resp. cdna) extrahovaných ze všech mikrokosmů. Výsledky potvrdily přítomnost kmenů Dehalococcoides sp. a Dehalobacter sp., které jsou známé jako obligátní OHR bakterie. V mikrokosmech byly identifikovány také známé neobligátní OHR bakterie, jako např. kmeny Desulfitobacterium sp., Desulfuromonas sp., Geobacter lovleyi a Sulfurospirillum multivorans. Dva vzorky byly proto vybrány (konkrétně M4 a S3) pro fylogenetickou analýzu. Cílem tohoto testu byly dvě skupiny bakterií (třída Chloroflexi a rod Dehalococcoides) zahrnující bakteriální kmeny účastnící se PCB dehalogenace. V mikrokosmu S3 byly detekovány pouze tradiční obligátní OHR bakterie blízce příbuzné bakteriím Dehalococcoides sp. z podskupiny Pinellas. Tato zjištění korespondovala s dehalogenačním patternem, kdy bylo prokázáno, že bakteriální konsorcia v mikrokosmu S3 dehalogenují vysoce chlorované kongenery, zatímco komunity z mikrokosmu M4 středně chlorované PCB. Jeden shluk skládající se z pěti sekvencí byl izolován z obou mikrokosmů. Klony náležící do skupiny Chloroflexi a dále do podkmenu I z rodů Levilinea, Bellilinea, Leptolinea, Longilinea a Anaerolinea (Yamada and Sekiguchi, 2009) byly nalezeny ve významném počtu tvořícím až 61 % (v S3) a až 34 % (v M4) celkového množství detekovaných sekvencí. Pomalu rostoucí vláknité bakterie náležící do skupiny Chloroflexipodkmene I jsou známé tím, že se účastní produkce H 2 jako koncového produktu fermentace sacharidů a peptidů (Yamada and Sekiguchi, 2009). Vysoká převaha klonů tohoto podkmenu tedy naznačuje, že tyto bakterie mohou hrát roli v degradaci PCB tím, že poskytují molekuly H 2 OHR bakteriím (Watts et al., 2005). Hlavními enzymy účastnícími se OHR procesu v bakteriích rodu Dehalococcoides jsou tzv. reduktivní dehalogenázy. Funkční diverzita genů rodiny reduktivních dehalogenáz zatím

14 nebyla dostatečně popsána (Maphosa et al., 2012). Reduktivní dehalogenázy, které se přímo účastní PCB dechlorinace byly popsány poprvé až v roce Wang a kol. charakterizovali tři nové Dehalococcoides kmeny CG1, CG4 a CG5, u nichž bylo nalezeno 35, 15 a 26 rdha genů. Ukázalo se však, že dechlorinace PCB byla prováděna běžnými reduktivními dehalogenázami vykazujícími specificitu také k tetrachloroetylenu (Wang et al., 2014). Testování vzorků sedimentových mikrokosmů cílilo na prokázání přítomnosti/absence genů bvca a vcra pro vinyl chlorid reduktázy s použitím PCR (Behrens et al. 2008). Překvapivě nebyly v této studii u vzorků S3 a M4 prokázány žádné bvca geny, které jsou specifické pro D.mccartyi kmen BAV1. Na druhé straně byly detekovány v mikrokosmech M2, M3, M6, S2 a S3 geny typu vcra popsané pro D.mccartyi kmen VS. Sekvenační analýza prokázala blízkou podobnost nalezených sekvencí s genem vcra přítomným v D.mccartyi kmene BTF08 (Pöritz et al., 2013). Za účelem provedení detailní studie mikrobiálních komunit a identifikace bakteriálních druhů účastnících se dehalogenace kongenerů PCB byly konstruovány kultury bez sedimentu provedením jednoho kultivačního transferu. Suspenze pocházející z mikrokosmu M1 byla použita jako inokulum pro 14 kultur bez sedimentu první generace. Část mikrokosmů byla ošetřena 2-bromoethansulfonátem (BES), který je strukturním analogem a kompetitivním inhibitorem koenzymu M (CoM) u methanogenních bakterií. Bylo prokázáno, že BES je proto účinným inhibitorem methanogeneze (Zhou et al., 2011). Bylo zjištěno, že tyto bakterie se přímo nebo nepřímo účastní procesu respirace organohalidů (Löffler et al., 1999). Různé patterny dechlorinace byly v různém rozsahu pozorovány ve všech mikrokosmech bez ohledu na přítomnost BES. Tento fakt proto naznačil, že při dechlorinaci PCB mohou být aktivní i další bakterie, které jsou méně závislé na mezidruhovém přenosu H 2. Všechny mikrokosmy také dechlorinovaly nejvíce 5- a 6-chlorobifenylové kongenery. Výsledkem dlouhodobě kultivovaných mikrokosmů byla vysoká míra totální dechlorinace PCB až o 95 % v mikrokosmech SFM7 a SFM13. V rámci experimentu byl také proveden jeden kultivační transfer kultur bez sedimentu, kdy byl supernatant první generace těchto kultur použit jako inokulum pro generaci druhou, která vykazovala ještě lepší výsledky. Bylo zjištěno, že došlo k 99 % snížení koncentrace PCB po 503 dnech kultivace ve všech sledovaných mikrokosmech druhé generace. Fylogenetická data, získaná pomocí bioinformatických nástrojů z primárních NGS dat získaných z cdna a DNA z mikrokosmů první i druhé generace prokázala přítomnost

15 několika tříd bakterií reprezentujících všechny součásti mikrobiální sítě vyžadované pro OHR. Určité třídy byly v kulturách bez sedimentu nalezeny ve velkém počtu - konkrétně Anaerolineae, Clostridia, Dehalococcoidia, Synergistia, Actinobacteria, δ-proteobacteria, Bacteriodia, Cloacamonae a Thermotogae. NGS analýza v tomto projektu prokázala významný efekt BES sloučeniny na přítomnost třídy Dehalococcoidia. V mikrokosmech kultivovaných bez BES byly bakterie rodu Dehalococcoides nalezeny a vykazovaly 99 % podobnost s kmenem D.mccartyi CG5 z podskupiny Pinellas, která je blízce příbuzná kmenům CBDB1, GT a BAV1 (Wang et al., 2014). BES neměl žádný vliv na početnost bakterií třídy Anaerolineae náležící do kmene Chloroflexi. V rámci třídy Anaerolineae byla zjištěna převaha 16S rrna sekvencí příbuzných rodu T78 s potenciálem degradovat sacharidy (Sekiguchi et al., 2001). Role těchto bakterií v mikrokosmech může být důležitá v oblasti primární fermentace. Velmi početnou skupinou byly také bakterie třídy Clostridia. Velká převaha bakterií z rodu Syntrophomonas byla detekována v pozdních mikrokosmech obou generací kultur. Role těchto bakterií je spojena se syntrofickou oxidací mastných kyselin (McInerney et al., 1981). Heterogenní a početná skupina bakterií přítomných v mikrokosmech byla příbuzná s bakteriemi třídy δ-proteobacteria. Tyto bakterie jsou známé svou metabolickou univerzálností nalezneme zde sulfát-redukující bakterie i bakterie respirující organohalidy. Bylo prokázáno, že se několik rodů účastní degradace fenolu a benzoátů pokud spolupracují s methanogenním partnerem (Qiu et al., 2008). Rod Geobacter byl popsán jako rod s velkým rozsahem použití akceptorů elektronů včetně tetrachloroethenu, trichloroethenu, nitrátu, fumarátu, Fe(III), malátu, Mn(IV), U(VI) a elementární síry (Sung et al., 2006). Geobacter thiogenes kmen K a Geobacter lovleyi kmen SZ jsou unikátními bakteriemi čeledi Geobacteraceae u nichž byla prokázána redukce organohalidů jako funkce uchování energie a růstu. V rámci prováděných experimentů bylo identifikováno významné množství sekvencí asociovaných s čeledí Geobacteraceae, které formovaly neznámý shluk pojmenovaný jako Strazske cluster. Bakterie tohoto Strazske clusteru sdílí pouze cca. 94 % podobnost s G.lovleyi kmene SZ. Při zohlednění vysoké metabolické plasticity čeledi Geobacteraceae můžeme očekávat rychlejší funkční genovou adaptabilitu v porovnání s mírou divergence 16S rrna genu. Detailní analýza genomu Geobacter lovleyi navíc prokázala schopnost laterálního přenosu genů jako zdroje schopností využívat chlorované sloučeniny jako

16 akceptory elektronů (Wagner et al., 2012). Z dat získaných z multifaktoriální analýzy (MFA) a z výpočtu statistických korelačních Pearsonových koeficientů byla zjištěna vysoce významná korelace nově definovaného Strazske clusteru se snižováním koncentrace PCB. NGS data získaná z druhé generace mikrokosmů navíc potvrdila perzistenci tohoto taxonu podobnému Geobacteraceae. Tato hypotéza byla navíc posílena zjištěním absence dalších fakultativních OHR bakterií (např. Desulfitobacterium, Sulfurospirillum, Desulfuromonas a dalších) v mikrokosmech ošetřených BES. Horizontální přenos genů a získání funkčních genů pro reduktivní dehalogenázy může sloužit jako mechanismus adaptace bakterií rodu Geobacter v PCB kontaminovaném prostředí a vytvořit tak nový Strazske cluster náležící do čeledi Geobacteraceae. V rámci experimentu byla také taxonomicky analyzována komunita domény Archaea, kdy bylo zjištěno, že BES zcela neinhiboval methanogenní Archaea. Sekvence produkované pomocí NGS prokázaly přítomnost acetiklastických methanogenů rodu Methanosaeta. Při společné kultivaci bakterií rodu Geobacter a Methanosaeta bylo zjištěno, že tyto Archaea podporují růst rodu Geobacter díky procesu známému jako přímý mezidruhový přenos elektronů (DIET) (Rotaru et al., 2015). K podobnému jevu tedy mohlo dojít i v případě kultur bez sedimentu, které byly odvozeny ze sedimentů z lokality Strážske. Shrnutí Tato studie upozornila na organohalidy respirující komunity v PCB kontaminované oblasti lokalizované ve východní Evropě. Kultury se sedimentem i bez něho prokázaly vývoj životaschopných a stabilních mikrobiálních komunit s funkcí respirace organohalidů a následnou dehalogenací PCB. Multivariační analýza ukázala jak časovou tak i prostorovou heterogenitu v rozložení mikrobiálních populací. Anaerobní kultivace umožnila detekci PCB dehalorespirující aktivity v sedimentech z lokality Strážské. Přímé a nepřímé důkazy z této studie naznačují, že kromě známých organohalidy respirujících bakterií může být na této lokalitě aktivní nový shluk Geobacteraceae, pojmenovaný jako Strazske cluster. Výsledky publikované v této práci podpoří další výzkum pro objevování plného potenciálu původních PCB dechlorinujících populací na lokalitě Strážske a pro rozvoj účinných bioremediačních přístupů, které umožní provádět kompletní mineralizaci PCB ve znečištěném prostředí.

17 Introduction Polychlorinated biphenyls (PCBs) have been massively used in diverse industrial applications due to their extreme resistance to temperature and high chemical stability. These mixtures were sold under specific trade names, which were specific to their country of the origin (e.g. Aroclor, Kaneclor, Fenclor etc.). From 1954 to 1984 belonged former Czechoslovakia to the eighth largest world commercial manufacturers of PCB mixtures with the brand names Delor, Hydelor and Delotherm (Dercová et al., 2008 Kočan, 2001). At a local scale, the contamination issued from the chemical plant occurred primarily in an effluent industrial water channel leading to the Laborec River (today Eastern Slovakia) and subsequently to the Zemplinska Sirava water reservoir, a local recreational area (Dercová et al., 2008). Very high concentrations of PCB congeners were still found in the sediment of the river 25 years after the ban of production (Kočan, 2001), making this zone one of the most heavily PCBscontaminated areas worldwide. Despite the PCB congener resistance to chemical modification, a first occurrence of in situ anaerobic degradation mediated by bacterial activities was reported in 1987 by Brown et al. in the Hudson River sediments (Brown et al., 1987, 1988). These findings led to subsequent extensive laboratory studies, confirming the potential of anaerobic organohalide respiration (OHR) in sediments (Abramowicz, 1995; Pagano et al., 1995; Quensen et al., 1990; Rysavy et al., 2005; Yan et al., 2006; Yang et al., 2008). The anaerobic reductive dechlorination of extensively chlorinated PCB congeners was found to be a prerequisite step towards their subsequent mineralization by aerobic bacteria (Field and Sierra-Alvarez, 2008). Laboratory studies demonstrated the effectiveness of microbial communities present in sediment-free microcosms in the degradation of PCB congeners. However, and despite numerous studies carried out on the degradation processes, limited information is available nowadays about the main bacterial guild members participating to the OHR process (Bedard, 2008; Bedard et al., 2006; Fagervold et al., 2007a; Hiraishi, 2008; Kjellerup et al., 2008; Yan et al., 2006). Representatives of four major phyla, including Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes and Chloroflexi, were apparently involved in the OHR process (Cutter et al., 2001; Kjellerup et al., 2008; Wu et al., 2002; Zanaroli et al., 2010). Dehalococcoides sp. and members of phylogenetically distant strains o-17, DF-1 and m-1 (affiliated to the Chloroflexi phylum), were defined as the key members of the OHR process due to their obligatory dehalorespiring metabolism (Bedard, 2008). Facultative OHR isolates belonging to the genera Anaeromyxobacter, Desulfitobacterium, Sulfurospirillum, Desulfomonile, Desulfuromonas, Desulfovibrio and Geobacter are metabolically versatile with respect to their spectrum of

18 electron donors and acceptors and are able to dehalogenate a wide range of halogenated compounds but their implication in the degradation of PCB congeners has not been demonstrated yet. Aims and hypothesis Several studies were conducted on the polluted Strazske locality with purpose to monitor the PCB contamination or to assess the pollution impact on human health (Dudková et al., 2012 Koc an et al., 1994 Wimmerová et al., 2015). However, little is known about the OHR bacteria involved in the dechlorination of the PCBs in Strazske channel sediment. Since microbial communities are a fundamental part of the water ecosystem and play a significant role in the PCB detoxification, understanding of their functions is a priority task, supporting the remediation of PCBs in the nature. In our study we aimed toward collecting missing information regarding the identification of the taxonomic structure of the active microbial guilds during anaerobic dechlorination of PCBs in sediments from the Strazske locality. The main goals of the presented thesis were defined as i) characterization of the microbial communities structure present in the sediments at the Strazske efflux channel, ii) development of stable sediment-free cultures so as to study microbial communities without impact of the sediment, iii) identification of new putative organohalide-respiring bacteria.

19 Materials and Methods For the purpose of the study, three anaerobic microcosms experiment were set up. Initially, sediment samples were collected from the efflux channel issued from the former Chemko Strazske factory. A total of eight sediment samples (M1 to M6, S2 and S3) were taken from the bottom sediment layer using a sterile auger. The content of the auger was deposited and stored in anaerobic chambers (Anaerobox, Difco, USA) at 4 C. Anaerobic microcosms were started using the above mentioned PCB-contaminated sediment samples. All subsequent operations were carried out in an anaerobic glove box. Anaerobic microcosms were initiated using glass bottles filled with Dehalobacter sp. liquid growth medium (Holliger et al., 1998). An electron donor solution (ethanol:propionate:butyrate:acetate) was added at a regular basis. The gaseous phase was replaced by a mixture of CO 2 /N 2, keeping overpressure and microcosms were incubated in the dark at 30 C (no shaking). Several samplings were done and DNA and RNA were extracted and used for PCR evaluation of the presence of known bacteria and genes linked with OHR process. Microbial communities were examined using T-RFLP analysis (Rossi et al., 2009). And a deep phylogenetic analysis of the selected microcosms was done using cloningsequencing strategy followed by construction of phylogenetic trees. After 13 months of continuous cultivation, content of PCBs was assessed by GC-MS technique. The second experiment was based on the construction of 14 sediment-free microcosms. Anaerobic sediment-free microcosms were set up according to the technique developed by Bedard et al. (Bedard et al., 2006). Delor 103 congener mixture was added as a concentrated acetone solution to silica particles and bottle was filled with Dehalobacter sp. liquid growth medium (Holliger et al., 1998). 2,6-dibromo-biphenyl was added to prime the reduction of PCB congeners (Bedard et al., 2006). Half of the microcosms received 2- Bromoethanesulfonate (BES), a selective inhibitor of methanogenesis. Mixture of ethanol:propionate:butyrate:acetate was added as electron source. The gaseous phase was exchanged by CO 2 /N 2 keeping overpressure. Microcosms were inoculated by the suspension of the sediment microcosm M1. Microcosms were continuously cultivated from 98 to 692 days. DNA and RNA were extracted and used for the PCR targeting the known OHR members as well as the known genes. Diversity of the microbial communities was examined using next-generation sequencing (NGS) of cdna using 16S primers targeting V3

20 hypervariable region. PCBs were analyzed after termination of each microcosm using GC- ECD technique. The last set of microcosms was the second-generation of sediment-free cultures, which were started under the same conditions as the first generation. The only difference was the inoculum. In this case, supernatant from selected first generation SFMs was used. Subsequently, DNA and RNA were extracted from the microcosms after 504 days of continuous cultivation and the NGS technique was performed so as to identify the microbial composition. GC-ECD method was used for the final evaluation of the PCB dechlorination. Statistical analyses were used for the interpretation of the NGS data sets from SFMs in correlation with the PCB dechlorination patterns obtained for the GC-ECD. In particular, the following methods were used: Cultivation and maintenance of anaerobic cultures Analytical methods GC-MS and GC-ECD Cloning-sequencing method PCR Next-generation sequencing Statistical analysis and preparation of the phylogenetic trees The materials and methods have been described in detail in the author s publication set attached to this thesis.

21 Results and Discussion This study provides the first insight into the microbial complexity of the PCB-transforming organohalide-respiring consortia specific for the region of Eastern Europe highly contaminated with weathered Delor. The strategy of our research was based on examining of three sequential microcosm cultivations. All microcosms experiments were run using a complex cultivation medium. Since the organohalide respiration is thought to be a complex biological process and bacterial species involved in this process originate presumably from a very diverse phylogenetic horizon, the need of growth requirements could be very different. So as to satisfy the best possible support of the majority of bacterial spectra, the complex growing media developed by Holliger et al. (1998) proved to be effective for many organohalide respiring bacteria was used (Holliger et al., 1998). Furthermore, this medium provided also a way to standardize the habitat of the consortia in the micrococosms which were initially inoculated using eight different river sediment samples. Electron donors (ethanol, propionate, butyrate and acetate) were injected on a regular basis so as to sustain correct development of bacterial communities due to the active interspecies H 2 transfer (Achtnich et al., 1995; Heimann et al., 2006). Additionally, vitamin B12 helped to build-up a corrinoid co-factor, an essential part of the Fe-S active site of the reductive dehalogenase enzymes (Rupakula et al., 2015). The design of the sediment microcosms differed from the conventional anaerobic culturing techniques classically applied to the dechlorination of PCBs and dioxins (Bedard et al., 2007a; D Angelo and Nunez, 2010; Watts et al., 2005; Zanaroli et al., 2010). Higher volume allowed for multiple samplings of total DNA and RNA and could equilibrate the possible impact of the elimination of chloride ions during the OHR process, as ph has been shown to be of critical importance (Lacroix et al., 2014). Sediment-free microcosms were used for the analyses of the dechlorination patterns and diversity of developed OHR bacterial guild members (Bedard et al., 2007; Dudkova et al., 2012; Fagervold et al., 2007b; Yan et al., 2006). The first chemical analyses of the sediments sampled in Strazske locality confirmed that high levels of PCBs were still present in the efflux channel. The concentration values ranged from 6.8 to 136 mg/kg. Thus, the PCB concentration was comparable with those found in the sediments in 1997/1998 by the Kocan et al. (Kočan, 2001). In the present study, the degradation potential and the composition of the microbial communities were initially examined using sediment microcosms. The results of

22 dechlorination of the weathered PCB congeners after 10 months of continuous cultivation showed large discrepancies among all microcosms in terms of total amounts of congener removal. Only three microcosms (M1, S2 and S3) showed a high dehalogenation capacity of the highly chlorinated PCB congeners. Complete removal of PCBs often requires cooperation of various bacteria and all of them may have different preferences on their living environment (Borja et al., 2005). Anaerobic PCB-contaminated sediments were shown to host bacteria affiliated to several phylotypes, such as β-, δ-, and γ-proteobacteria, as well as members of the Clostridiales, Bacteroidetes, low G+C Gram positive bacteria and Chloroflexi (Bedard et al., 2006, 2007; Yan et al., 2006). In this study, the structures of the whole bacterial communities present in the slurry microcosms were studied in time by T-RFLP analysis. After six months of continuous cultivation, a shift in the bacterial community structures was detected, even though the cultivation conditions were unified. Similar situation was already described by Bedard et al. showing that even triplicate slurry microcosms could evolve differently and could develop different PCB dehalogenating capacities (Bedard et al., 2005). Bacterial strains known already for their capacity to reduce chlorinated compounds were detected in RNA (resp.cdna) samples extracted from all microcosms. The results confirmed the presence of Dehalococcoides sp. and Dehalobacter sp., which are both known as obligate OHR bacteria. Known non-obligate OHR were detected equally, such as Desulfitobacterium sp., Desulfuromonas sp., Geobacter lovleyi and Sulfurospirillum multivorans. Thus, two samples (namely M4 and S3) were selected for phylogenetic analysis. Specifically, two groups of bacteria (class Chloroflexi and Dehalococcoides sp. genus) containing bacterial strains supposedly involved in PCB dehalogenation were targeted. In our study, the both M4 and S3 bacterial communities displayed completely different bacterial structures. Traditional obligate OHR bacteria closely related to Dehalococcoides sp. subgroup Pinellas were detected in microcosm S3 only. These findings corresponded to the dehalogenation pattern where S3 microcosm handled highly-chlorinated congeners and M4 middle-chlorinated ones. A single cluster composed of five sequences was isolated from both microcosms. Interestingly, clones belonging to Chloroflexi - Subphylum I from the genera Levilinea, Bellilinea, Leptolinea, Longilinea and Anaerolinea (Yamada and Sekiguchi, 2009) were found in significant number making up to 61 % and 34 % of all clones in S3 and M4, respectively. Slowly growing filamentous bacteria belonging to the Chloroflexi - Subphylum I are known already to participate in the production of H 2 as the end product of the fermentation of saccharides and peptides (Yamada and Sekiguchi, 2009). The high prevalence

23 of clones belonging to this subphylum strongly suggested the role played by these members in the PCB degradation process, possibly fuelling the OHR bacteria with hydrogen molecules (Watts et al., 2005). Main enzymes driving OHR processes in Dehalococcoides bacteria are the so-called reductive dehalogenases. The functional diversity of the reductive dehalogenase gene family has still not been explored sufficiently (Maphosa et al., 2012). Reductive dehalogenase genes directly involved in the PCB dechlorination have been reported for first time in Wang et al. characterized three new Dehalococcoides strains CG1, CG4 and CG5 revealing 35, 15 and 26 rdha genes. They showed that the PCB dechlorination was driven by common reductive dehalogenases showing specificity also for PCE (Wang et al., 2014). The examination of the sediment microcosms was targeting the presence/absence of bvca and vcra genes for vinyl chloride reductases by using PCR (Behrens et al., 2008). Notably, no bvca, which is specific for D. mccartyi strain BAV1, was found in this study in both S3 and M4 microcosms. On the other hand, vcra-type genes reported for D. mccartyi strain VS were detected in microcosms M2, M3, M6, S2 and S3. Sequence analysis revealed the closest similarity with the vcra gene present in D. mccartyi strain BTF08 (Pöritz et al., 2013). For the purpose of a detail study of the microbial communities structure and identification of bacterial species involved in the dehalogenation of the PCB congeners, sediment-free cultures with one sequential transfer were set up. Suspension originating from sediment microcosm M1 was used as an inoculum for fourteen first generation sediment-free cultures. Part of the microcosms was treated by 2-Bromoethanesulfonate (BES), a structural analog and competitive inhibitor of coenzyme M (CoM) of the methanogens. BES was proved as an efficient inhibitor of methanogenesis (Zhou et al., 2011). Methanogens were described to be directly or indirectly involved in the organohalide respiration processes (Löffler et al., 1999). Interestingly, dechlorination rates and patterns were observed in all microcosms without any influence of BES suggesting the role of other microbial members, which are not strongly dependent on the interspecies H 2 transfer. All microcosms depleted mostly 5-CB and 6-CB congeners. And, as a result, the long-term maintained SFMs showed high rates of congener removal in total up to 95 % in SFM7 and SFM13. In addition, the second generation sediment-free microcosms issued from the first SFMs revealed more than 99 % of the total PCB removal after 503 days of cultivation in all monitored microcosms. The phylogenetic data, obtained by using bioinformatic tools from NGS of cdna and DNA, proved the presence of several bacterial classes representing all parts of the microbial net

24 required for OHR. Certain bacterial classes were found to be abundant in our sediment-free microcosms Anaerolineae, Clostridia, Dehalococcoidia, Synergistia, Actinobacteria, δ- Proteobacteria, Bacteroidia, Cloacamonae and Thermotogae. In this project, NGS analysis showed that there was a significant effect on the Dehalococcoidia group in microcosms with and without BES addition. In the microcosms cultivated without BES, Dehalococcoides sequences were found. They were affiliated at 99 % of similarity to D. mccartyi CG5 from Pinellas subgroup, which is closely related to strains CBDB1, GT and BAV1 (Wang et al., 2014). BES had no impact on the abundance of class Anaerolineae belonging to phylum Chloroflexi. Inside Anaerolineae prevalence of 16S rrna gene sequences related to T78, a candidate genus with potential to degrade carbohydrates was detected (Sekiguchi et al., 2001). The role of these bacteria in the microcosms can be explained as primary fermenters. A very abundant group was class Clostridia. Clear prevalence of bacteria from genus Syntrophomonas was detected in the late microcosms both first and second generation. The role of these bacteria is connected with syntrophic fatty-acidoxidation (McInerney et al., 1981). Heterogeneous and abundant group of bacteria present in the microcosms was affiliated to the class δ-proteobacteria. These bacteria are known to be metabolically versatile - from sulfatereducers to organohalide respirers. Several genera are involved in the phenol or benzoates degradation in association with H 2 -scavenging methanogenic partner (Qiu et al., 2008). Genus Geobacter was showed to use a broad range of electron acceptors including tetrachloroethene, trichloroethene, nitrate, fumarate, Fe(III), malate, Mn(IV), U(VI) and elemental sulphur (Sung et al., 2006). Geobacter thiogenes strain K and Geobacter lovleyi strain SZ are unique representatives of family Geobacteraceae capable of coupling the reduction of organohalides to energy conservation and growth. In our research, significant numbers of sequences were associated with family Geobacteraceae and formed an unknown cluster - the Strazske Cluster. The members of Strazske cluster share only ca. 94.% similarity with G.lovleyi strain SZ. Taking in account the high metabolic plasticity of Geobacteraceae, we can expect faster functional gene adaptability compared to the divergency of the 16S rrna gene. Recently, a detailed analysis of the genome of G. lovleyi revealed that lateral gene acquisition was the source of the capability to use chlorinated compounds as electron acceptors (Wagner et al., 2012). The obtained data from multifactorial analysis (MFA) and statistically significant computations using pairwise Pearson correlation coefficients provides evidence about the highly significant correlation of the new Strazske cluster with the PCB removal. The NGS data indicated the persistent presence of this Geobacteraceae-like taxon in most of

25 the sediment-free microcosms of second generation. This hypothesis is reinforced further by the absence of any other facultative OHRB in the BES-treated SFMs, such as Genera Desulfitobacterium (Firmicutes) and Sulfurospirillum (ε-proteobacteria) etc. Horizontal gene transfer and acquisition of the functional reductive dehalogenase genes could serve as mechanism of adaptation of Geobacter in the PCB contaminated environment and evolving of the new Strazske cluster belonging to Geobacteraceae. Additionally, archaeal community was taxonomically analysed. The complete BES-inhibition of the methanogenic Archaea was not achieved and sequences produced by NGS targeting archaeal community showed presence of the aceticlastic methanogens Methanosaeta. In coculture with Geobacter, Methanosaeta was proved to support the growth of Geobacter via direct interspecies electron transfer process (Rotaru et al., 2015). It was concluded that a similar relationship could occur in the sediment-free cultures from Strazske sediment. Conclusions This study provided the first insight into the organohalide-respiring community at the highly PCB contaminated region located in the Eastern Europe. Sediment and sediment-free cultures demonstrated evolution of viable and stable microbial communities with PCB organohaliderespiring function. Multivariate analysis showed both temporal and spatial heterogeneity in the distribution of the microbial populations. Anaerobic cultivation allowed the detection of widespread PCB-dehalorespiring activity in Strazske channel sediments. Direct and indirect evidence obtained from this study strongly suggested that besides the known organohaliderespiring bacteria a new Geobacteraceae cluster, named Strazske may be involved in the PCBs dechlorination at the locality. The results in the presented thesis should encourage further research for exploring the full potential of the indigenous PCB dechlorinating populations in Strazske and for developing effective bioremediation approaches that can perform the complete mineralization of PCBs in polluted environments.