CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB

Transkript

1 CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB Vyučující: Zuzana Trojanová ( ) Michaela Sedlářová ( ) Barbora Mieslerová ( ) + Anna Zedková (laborantka) Podmínky k udělení zápočtu: Protokoly Zápočtový test termíny dle domluvy s vyučujícími

2 Mikrobiologické předměty a vybavení mikrobiologické laboratoře Katedry botaniky PřF UP v Olomouci jsou inovovány v rámci projektu OPVK Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/

3 Pátek Očkování biotrofních mikroorganismů Anaerobní kultivace Mikrobiologický rozbor pitné vody Mikroorganismy ve vzduchu Průkaz MO v ústní dutině a na povrchu kůže člověka Příprava izolátů plísní Hodnocení - Neděle Přeočkování sobota, neděle Hodnocení neděle Neděle Sobota Neděle

4 Biotrofní mikromycety a houbám podobné organismy

5 BIOTROFNÍ PARAZITÉ parazit a hostitel žijí pohromadě po delší dobu parazit závisí na živém pletivu většina biotrofních hub jsou obligátní parazité neprodukují velké množství extracelulárních enzymů narušujících buněčné stěny rostlin nebo toxinů - po penetraci nenásleduje rychlé odumření napadené buňky mají omezený hostitelský okruh (hostitelská a orgánová specificita) přežívají pouze omezeně v saprofytické fázi; speciálně vývoj rozmnožovacích struktur závisí na přítomnosti hostitele kultivace vegetativního stadia těchto hub na umělých médiích je velmi málo časté

6 Extracelulární biotrofové Peronosporální houby (Peronosporales) Padlí (Erysiphales) Rzi (Uredinales) a Sněti (Ustilaginales) Taphrinales Intracelulární biotrofové Plasmodiophora brassicae, Spongospora subterranea (Plasmodiophoromycota) Olpidium sp. (Chytridiomycota)

7 PERONOSPORÁLNÍ HOUBY OOMYCOTA biotrofní parazité s vysokou hostitelskou specificitou většinou mají intercelulární mycelia a haustoria v napadených buňkách na povrchu hostitelských pletiv produkují sporangiofory nesoucí sporangia (často obsahují zoospory) mnoho parazitických oomycet napadá suchozemské rostliny a vykazují adaptace na tento způsob života - sporangia jsou odlamována a jsou přenášena celá, chovají se jako konidie, celá klíčí klíčním vláknem. PERONOSPORALES Plasmopara viticola Plasmopara halstedii Bremia lactucae Pseudoperonospora cubensis Peronospora destructor Albugo candida Vřetenatka révová Plíseň slunečnicová Plíseň salátová Plíseň okurková Plíseň cibulová Plíseň bělostná

8 Plasmopara viticola vřetenatka révová Bremia lactucae plíseň salátová Pseudoperonospora cubensis plíseň okurková Peronospora destructor plíseň cibulová Plasmopara halstedii plíseň slunečnicová

9 PADLÍ ŘÁD ERYSIPHALES, ASCOMYCOTINA jedná se o biotrofní parazity většinou s bílým povrchovým myceliem, které penetruje hostitelské buňky pomocí haustorií na listovém povrchu tvoří konidiofory s konidiemi a za specifických podmínek vytváří teleomorfní stádium - kleistothecia

10 PADLÍ Klíčící konidie Konidiofory a povrchové mycelium Apendixy u kleistotecií Kleistotecium s jedním vřeckem Microsphaera Uncinula

11 Padlí angreštové Sphaerotheca mors-uvae Blumeria graminis Padlí travní Sphaerotheca fusca (Podosphaera xantii) Padlí tykvovitých

12 UREDINALES (RZI) BASIDIOMYCOTINA řád Uredinales zahrnuje okolo druhů ve 100 rodech jsou charakterizovány rezavě hnědavým zbarvením spor rzi napadají krytosemenné i nahosemenné rostliny a dokonce kapraďorosty Puccinia graminis je klasickým příkladem rzi, které střídají hostitele. Haploidní (monokaryotické) mycelium roste na dřišťálu (Berberis) a dikaryotické mycelium na různých travách (Poaceae) P. graminis je charakterizována komplexním životním cyklem, kde postupně dochází k produkci až 5 typů spor.

13 Puccinia graminis rez travní Cronartium ribicola rez vejmutovková

14 1. ÚKOL (var. A): Očkování biotrofních mikroorganismů Cíl úkolu: Seznámit studenty s postupem inokulace a kultivace Plasmopara halstedii, původce plísňovitosti slunečnice Pomůcky: Pinzeta, destilovaná voda, semenáčky slunečnice (Helianthus annuus), zamražené kultury plísně slunečnicové (Plasmopara halstedii), třepačka, plastové zkumavky, rozprašovač, květináče s perlitem, vzrostlé inokulované semenáčky slunečnic, mikrotenové sáčky, špejle Provedení: Spory ze zamraženého inokula převedeme na třepačce do destilované vody a do vzniklé suspenze ponoříme cca 3 denní semenáčky slunečnice. Kultivujeme 3 hodiny zakryté tmavou fólií ve fytotronu při C (12/12 den/noc), poté vyjmeme z inokula a přesadíme do perlitu. Kultivujeme dalších 6 8 dní při C. Vzrostlé semenáčky navlhčíme pomocí rozprašovače destilovanou vodou a uzavřeme do mikrotenového sáčku tak, aby se stěny nedotýkaly rostlin (tím zajistíme vhodné podmínky pro sporulaci vysoká vzdušná vlhkost). Kultivujeme 2 3 dny při C nebo do té doby, než začne P. halstedii sporulovat.

15 POSTUP PŘI PŘEOČKOVÁNÍ IZOLÁTU PLÍSNĚ SLUNEČNICOVÉ: 1. dezinfekce osiva 2. naklíčení 3. příprava inokula 4. inokulace 5. výsev 6. kultivace 7. vytvoření podmínek pro sporulaci 8. sporulace 9. opětovné přeočkování/zamražení

16 1. ÚKOL (var. B): Očkování biotrofních mikroorganismů Cíl úkolu: Seznámit studenty s postupem inokulace a kultivace Oidium neolycopersici, původce padlí rajčat Pomůcky: Pinzeta, kahan, odmaštěná podložní skla, semenáčky rajčete (Lycopersicon esculentum), kultury padlí (Oidium neolycopersici) Provedení: Cca 7-9 týdenní semenáčky rajčete (Lycopersicon esculentum) inokulujeme konidiemi padlí suchou cestou, tj. otiskem (nebo poprášením). Rostliny označíme a kultivujeme pod plastovou klíckou ve fytotronu 20/18 C, 12/12h den/noc. Zaznamenáme nárůst konidioforů Oidium neolycopersici.

17 ZUZI, napiš postup přeočkování padlí kultivace padlí pod plastovými klíckami ve fytotronu Narůstání Oidium neolycopersici na listu Lycopersicon esculentum

18 Anaerobní kultivace

19 Rozdělení bakterií podle vztahu ke kyslíku Obligátně (přísně) anaerobní nemohou se množit v přítomnosti kyslíku Clostridium Fakultativně anaerobní mohou se množit i za nepřítomnosti kyslíku rostou obvykle rychleji za přítomnosti kyslíku Saccharomyces, Escherichia coli Mikroaerofilní vyžadují malé množství kyslíku (2 10%) Helicobacter pylori Aerotolerantní mikroorganismy indiferentní ke kyslíku Streptococcus pyogenes, Lactococcus Obligátně (přísně) aerobní k množení potřebují kyslík Pseudomonas, Bacillus fakultativně anaerobní mikroaerofilní obligátně anaerobní obligátně aerobní aerotolerantní kyslík - kyslík +

20 Kultivace anaerobů = zabezpečení optimálních podmínek pro růst použití anaerobní nádoby (anaerostat) obsahuje chemikálie produkující vodík a katalyzátor, na kterém vodík reaguje s volným kyslíkem na vodu s některými přísně anaerobními mikroorganismy je veškerá manipulace nutná za anaerobních podmínek - anaerobní komory i krátkodobý kontakt s kyslíkem vede ke smrti obligátně anaerobního mikroorganismu

21 2. ÚKOL - Anaerobní kultivace mikroorganismů Cíl: seznámit studenty se způsobem získávání čistých kultur mikroorganismů a s metodou anaerobní kultivace bakterií Pomůcky: bakteriologická klička, Petriho misky s živnou půdou (TSA), lihový kahan, kultura E. coli, anaerostat s příslušenstvím Postup: Naočkujeme E. coli na TSA medium metodou křížového roztěru: z kolonie vyrostlé na agaru odebereme bakteriologickou kličkou část populace a rozetřeme do několika /3-4/ vodorovných čar po povrchu agarové plotny. Kličku vyžíháme a po vychladnutí přiložíme na konec rozetřených čar a znovu rozetřeme do několika čar. Tento postup opakujeme několikrát a zakončíme vlnitou čarou. Misky narovnáme do anaerostatu, podle návodu navlhčíme pohlcovač O 2 a kultivujeme v inkubátoru při příslušné teplotě (37 C).

22

23 Mikroorganismy ve vodě

24 BAKTERIE VE VODĚ Voda v přírodě obsahuje určité množství mikroorganismů Jejich kvalitativní i druhové zastoupení kolísá Sterilní voda v přírodě není! Sladká voda je jedním z přirozených stanovišť bakterií Bakterie přítomné ve vodě můžeme rozdělit do tří základních skupin: DRUHY BAKTERIÍ VE VODĚ: 1. Autochtonní bakterie 2. Bakterie z půdy 3. Bakterie ze střevního traktu lidí a zvířat AUTOCHTONNÍ BAKTERIE BAKTERIE Z PŮDY BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT

25 AUTOCHTONNÍ BAKTERIE G - Chromobacterium violaceum nefermentující tyčky saprofytické bakterie běžně v půdě, vodě nejčastěji v tropických a subtropických oblastech velmi zřídka může způsobovat humánní choroby (často fatální).

26 AUTOCHTONNÍ BAKTERIE G - Flavobacterium nepohyblivé, nefermentující, tyčinkovité bakterie velmi běžný rod - v půdě, na rostlinných, živočišných a potravinových zbytcích a téměř ve všech vodních systémech. Flavobacterium psychrophilum některé druhy mohou způsobovat choroby sladkovodních ryb (Flavobacterium psychrophilum) Flavobacterium meningosepticum, bývá izolován při dětských meningitidách

27 AUTOCHTONNÍ BAKTERIE G - Pseudomonas pohyblivé, nefermentujcí, nesporulující tyčinky jeden z nejpočetnějších rodů, které známe saprofytické, fytopatogenní, nebo i druhy patogenní pro člověka důležitý podíl na rozkladu různých skupin látek Spirilly zakřivené tyčinky s jedním nebo dvěma závity Spirillum nacházíme v mnoha místech se stojatou vodou

28 Pochvaté bakterie schopné tvořit dlouhá, mnohobuněčná vlákna uzavřené do těsně přiléhající pochvy : AUTOCHTONNÍ BAKTERIE G - Sphaerotilus v tekoucích vodách a odpadních vodách (s vysokým obsahem dusíku) roste dobře v nízkých koncentracích kyslíku není známo, že by byla patogenní Leptothrix ve vodních prostředích s dostatečným množstvím organické hmoty pochva impregnována hydroxidem železitým (oranžové útvary)

29 Bakterie čeledi Vibrionaceae AUTOCHTONNÍ BAKTERIE pohyblivé, mírně zakřivené tyčinky, chemoorganotrofní, anaerobní G - častý výskyt ve vodním prostředí značná část má pro svou patogenitu epidemiologický význam rody vyskytující se ve sladké vodě Vibrio, Aeromonas V. cholerae původce cholery další druhy jsou saprofytické Aeromonas v silně znečištěných vodách Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila původce onemocnění žab, hadů, ryb

30 Fototrofní bakterie AUTOCHTONNÍ BAKTERIE uskutečňují fotosyntézu za anaerobních podmínek bez produkce molekulárního kyslíku, barviva jsou bakteriochlorofyly a karotenoidy G - V současné době 3 čeledi fototrofních bakterií: 1. Chromatiaceae, tj. purpurové sirné b. r. Chromatium, Chromosystis 2. Chlorobiaceae, tj. zelené sirné b. r. Chlorobium, Prosthecochloris 2. Rhodospirillaceae, tj. nesirné purpurové b. r. Rhodopseudomonas, Rhodomicrobium, Rhodospirillum Často v anaerobních vodních prostředích stoky, hluboká jezera, znečištěné řeky, sirné prameny Chromatium

31 Klouzavé bakterie Cytophaga Beggiatoa AUTOCHTONNÍ BAKTERIE G - charakteristický způsobem pohybu - buňky nemají bičíky, pohybují se na pevném podkladě vylučováním slizu ve vodě jsou možnosti volného pohybu omezené,na pevném podkladu se pohybují velmi čile Řád Cytophagales zástupci často ve vodním prostředí Cytophaga, Sporocytophaga rozklad celulózy, Beggiatoa, Leucothrix sulfurikační bakterie oxidace sulfidů

32 AUTOCHTONNÍ BAKTERIE G + Micrococcus luteus okrouhlá, saprofytická bakterie obligátní aerob, nachází se v půdě, prachu, vodě a vzduchu a je součástí normální mikrobiální flóry na kůži savců může kolonizovat lidská ústa, oropharynx (ústní část hltanu) a horní cesty dýchací

33 Clostridia Clostridium, Desulfotomaculum G + AUTOCHTONNÍ BAKTERIE sporulující, anaerobní tyčky produkují řadu toxinů, některé z nich jsou smrtelné často - v půdě, odpadních vodách, mořských usazeninách a vnitřních orgánech lidí i zvířat nebezpečné - Clostridium tetani, Clostridium botulinum Clostridium botulinum

34 G + AUTOCHTONNÍ BAKTERIE Desulfotomaculum acetoxidans Desulfotomaculum anaerobní bakterie, která redukuje sulfáty, sulfity a jiné sloučeniny síry (desulfurikační) okolo 20 druhů bylo objeveno v různých prostředích v půdě, ve vodě v geotermálních oblastech a ve vnitřních orgánech hmyzu a žaludku teplokrevných živočichů

35 Mykobakterie Mycobacterium rod s cca 100 druhy nepohyblivé a nesporulují, samostatná čeleď Mycobacteriaceae, řazeny k aktinomycetám komplexní buněčná stěna, předpona myko odkazuje na fakt, že jejich buněčná stěna obsahuje vosky rostou obecně poměrně pomalu, jsou acidorezistentní ( acid fast ), tzn. zbarvení vyvolané činidly se nedá vymýt kyselinami široce rozšířené organismy, typicky žijící ve vodě (i chlorované) a zdrojích potravy zástupci způsobují těžká onemocnění obligátní patogeny tuberkulóza Mycobacterium tuberculosis tuberkulóza skotu M. bovis lepra Mycobacterium leprae Mykobakterie nepatogenní : Mycobacterium smegmatis, M. phlei, M. butyricum G +/rezistentní AUTOCHTONNÍ BAKTERIE

36 Bakterie z půdy se do vody se dostávají splavováním osídlují pobřežní úseky vodní plochy, se vzrůstající vzdáleností od břehu jejich počet klesá aerobní bakterie tj. výskyt ve vrchních vrstvách vody Nejčastější rody: Bacillus, Corynebacterium, Clostridium, Micrococcus, Streptomyces G + G + BAKTERIE Z PŮDY Bacillus rozsáhlý rod sporulujících bakterií široce rozšířen v půdě a prachu (obvykle spory) často na mrtvém organickém materiálu zodpovědný za kažení potravin. Corynebacterium malé, obvykle nepohyblivé, nesporulující mnoho druhů izolováno z různých stanovišť: půda, voda, krev a lidská kůže patogenní kmeny mohou infikovat rostliny, živočichy včetně člověka

37 G + BAKTERIE Z PŮDY G + Micrococcus luteus nacházen na různých stanovištích: lidská kůže, voda, prach a půda Micrococcus není obecně považován za nebezpečnou bakterii Streptomyces zástupce skupiny Actinomycetes obvykle osidluje půdu a je důležitý rozkladač producenti antibiotik (Streptomyces griseus)

38 Bakterie ze střevního traktu především zástupci: čeledi Enterobacteriaceae BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT rodů Streptococcus, Clostridium za určitých podmínek můžeme izolovat i patogenní bakterie (Salmonella typhi, Schigella dysenteriae), jejich výskyt je však krátkodobý, protože voda pro ně není vhodným stanovištěm indikují fekální znečištění bakterie v pitné vodě pocházející ze střevního traktu lidí a zvířat neindikují fekální znečištění enterokoky (fekální streptokoky) čel. Enterococcaceae enterobakterie čel. Enterobacteriaceae anaerobní nesporulující b. Streptococcus fecalis Salmonella Shigella Yersinia koliformní b. E. coli Enterobacter Klebsiella Citrobacter Clostridium perfringens

39 ENTEROKOKY (FEKÁLNÍ STREPTOKOKY) G + streptokoky nesporulující, fakultativně anaerobní, někdy jako diplokoky, někdy mohou být pohyblivé ve vodách se množí vzácně; původní prostředí zažívací trakt člověka a teplokrevných živočichů mohou se stát původci některých nepříjemných onemocnění jiných tělesných systémů (močových cest, žlučníku, podíl na meningitidách) mnoho enterokoků je rezistentních vůči antibiotikům značná odolnost vůči některým toxickým látkám; oproti koliformním bakteriím snášejí vyšší koncentrace chlóru a indikují přiváděné fekální znečištění i v případech, kdy doznívají účinky stříbra (Sagen), který zatím spolehlivě potlačuje koliformní bakterie teplotní nároky v širokém rozmezí (10-45 C, krátkodobě i 60 C) BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT snášejí vysoké koncentrace solí (obsah žluči) a vysoké hodnoty ph (kolem 9) využívá se při kultivaci, kdy se selektivní podmínky pro jejich růst zajišťují přídavkem azidu sodného za fekální streptokoky jsou počítány pouze kmeny hydrolyzující aeskulin s negativním testem na přítomnost katalázy

40 G + BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT Streptococcus (dříve Enterococcus např. S. faecalis) běžní komensálové trávicího traktu živočichů (lidí). S. faecalis (90%), S. faecidum (5-10%) některé druhy mohou být patogenní močové cesty, osrdečník, meningitida

41 ENTEROBACTERIACEAE BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT G - běžně zvané enterobakterie rodově i druhově početná čeleď, zahrnuje fakultativně anaerobní tyčinky, z nichž většina žije ve trávicím traktu obratlovců jako přirozená součást mikroflóry střeva většina zástupců je nepatogenní, některé jsou podmíněně patogenní a některé druhy jsou nebezpečnými původci vážných i smrtelných nemocí (např. Salmonella, Shigella, Yersinia pestis, některé kmeny E. coli) nevadí jim vysoká koncentrace žlučových solí, toho se využívá při přípravě výběrově diagnostických půd. většina saprofyti a mutualisté trávícího ústrojí, tvoří součást obligátní mikroflóry střeva vyskytují se také ve vodě, v půdě a na rostlinách rody: Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter tzv. koliformní bakterie, tedy Escherichia coli a další druhy štěpící laktózu, jsou indikátorem fekálního znečištění pitné vody

42 Koliformní bakterie BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT G - nesporulující aerobní až fakultativně anaerobní tyčinky zkvašují laktózu na plyny, kyseliny a aldehydy patří do čeledi Enterobacteriaceae jsou indikátorem fekálního znečištění pitné vody r. Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter r. Escherichia chemoorganotrofní, fakultativně anaerobní, metabolismus aerobně respirační a fermentativní tvar tyčinek, petrichální bičíky/nepohyblivé, opouzdřené (kapsula, může se rozpadat) teplota C, opt. 37 C zkvašuje sacharidy (včetně laktózy) produkce plynu; produkce indolu její přítomnost v čerstvé vodě indikuje fekální znečištění a vede k vyloučení vody pro použití jakožto pitné vody některé vzácnější kmeny E. coli jsou nebo za určitých okolností mohou být patogenní - různé zánětlivé stavy (zánět močového měchýře)

43 ANAEROBNÍ SPORULUJÍCÍ BAKTERIE hlavně rod Clostridium BAKTERIE ZE STŘEVNÍHO TRAKTU LIDÍ A ZVÍŘAT anaerobní sporulující tyčinky, nepohyblivé, excentrické spory v místě tvorby buňku mírně rozšiřují, některé druhy klostridií tvoří pouzdro spory vydrží ve vodě dlouhou dobu dobře se kultivují, rychle rostou a tvoří plyny mnoho druhů je známých produkcí toxinů (C. botulinum ( z potravin), C. tetani ( z půdy) při stanovení hodnocení fekálního znečištění je někdy používána kultivace spor Clostridium perfringens - běžně přítomný ve stolici ale ve značném množství se vyskytuje i v půdě z uvedených důvodů jeho nálezy ve vodě nelze považovat za jednoznačnou indikaci fekálního znečištění spory jsou velmi rezistentní k poměrně vysokým dávkám chloru, je možno stanovení využít ke kontrole účinnosti provedené desinfekce

44 Mikrobiologický rozbor pitné vody I.

45 Hlavní původci onemocnění z pitné vody Vibrio cholerae je bakterie způsobující choleru, životu nebezpečné onemocnění, které se projevuje těžkými vodnatými až krvavými průjmy. Ročně se ve světě vyskytne okolo jedné miliardy případů cholery a více než tři miliony úmrtí, především v Asii, Africe a Jižní Americe. I v ČR se dodnes každoročně vyskytne několik ojedinělých případů importovaných z exotických zemí.

46 Salmonella enterica typhi je bakterie způsobující břišní tyfus nemoc, která ještě před sto lety byla nejčastější příčinou vodních epidemií v průmyslově rozvinutých zemích. Charakteristickým obrazem nemoci je náhlý atak horečky, bolest břicha a hlavy, celková schvácenost, nevolnost a průjmy vedoucí k vážné a život ohrožující dehydrataci nebo perforaci střeva.

47 Salmonella typhimurium a další druhy vyvolávají salmonelózy akutní průjmovitá onemocnění s krátkou inkubační dobou (8 10 hodin). Typické jsou explozivní epidemie, při nichž v rozmezí několika hodin onemocní většina osob exponovaných nákaze. Salmonelóza je nemoc, která je vevropě na vzestupu, i když pitná voda není hlavní cestou přenosu.

48 Shigella dysenteriae, S. flexneri a S. sonnei jsou bakterie způsobující bacilární úplavici, vážné a vysoce nakažlivé průjmové horečnaté onemocnění charakterizované až krvavými průjmy, k jehož vzniku stačí velmi nízká infekční dávka. I když hlavní cesta přenosu je osobní kontakt ( nemoc špinavých rukou ), přenos pitnou vodou je také možný a dobře známý.

49 Escherichia coli je bakterie, která žije ve velkých počtech ve střevech lidí a zvířat a je ve většině případů zcela neškodná. Existují však i patogenní kmeny (např. Escherichia coli O157:H7), které byly příčinou řady epidemií z pitné vody (viz příklady z Walkertonu nebo Caboolu) s velmi vážnými následky. U lidí se kromě krvavých průjmů může vyvinout (ve 2 7 % případů) i hemolyticko-uremický syndrom, který bývá často smrtelný. Postiženým (často malým dětem) při něm selhává činnost ledvin.

50 Legionella je bakterie způsobující nemoc legionelózu, která může mít dvě klinické formy: tzv. legionářskou nemoc, která se projevuje těžkým zápalem plic, nebo tzv. pontiackou horečku, což je mírnější horečnaté onemocnění. Byla objevena až v roce 1976 díky záhadné epidemii v USA, která postihla účastníky sjezdu legionářů (odtud název) a která měla původ v hotelové klimatizaci masivně kontaminované legionelou. Legionela se vyskytuje běžně ve vodách, ale v teplé vodě nebo klimatizačních jednotkách se může pomnožit do velmi vysokých počtů. Cesta přenosu infekce je především inhalační a spočívá ve vdechnutí infikovaného aerosolu (kapének) například při sprchování, ve vířivých koupelích nebo v klimatizovaných prostorách. Popsána je ale i cesta aspirační, která spočívá ve vdechnutí kapky vody při pití kontaminované vody.

51 Viry hepatitidy A, E a F jsou skupiny virů způsobující zánětlivé onemocnění jater a přenášené fekálně-orální cestou. Vyskytují se po celém světě a i v ČR byly v posledním desetiletí příčinou několika epidemií z pitné vody. Rotaviry jsou hlavní virovou příčinou těžkých horečnatých průjmů u kojenců a malých dětí v rozvinutých i rozvojových zemích. Byly objeveny teprve na počátku 70. let dvacátého století. Vzhledem k obtížné diagnostice se rotavirové infekce dostávají do statistik nejčastěji jako akutní infekční záněty trávicího traktu bez zjistitelného původce. Přenos pitnou vodou je možný, ale nevíme, jak je častý; rozhodujícím způsobem přenosu je však osobní kontakt (fekálně-orální cesta).

52 Všeobecné zásady při odběru vzorků vody 1. Volba správného místa odběru tak aby vzorek pro sledovaný zdroj vody byl reprezentativní, tj. aby správně vystihoval podmínky existující ve vodě 2. Odebíráme vodu do sterilních odběrových setů autoklávované. 3. Respektovat, že při odběru vzorku pro komplexní analýzu se vzorek určený pro mikrobiologický rozbor odebírá jako první. Do sterilních lahví se zabroušenou zátkou nebo plastů bez toxických látek. 4. Pro většinu účelů stačí 300 ml. Vzorky mají zůstat neprodyšně uzavřené do otevření v laboratoři. Pokud se provádí i chemická analýza odebírá se 1 l. 5. Odběr cm pod vodní hladinou u tekoucích vod, ale nesmí se odebírat ode dna. 6. Ideální je zpracovat vzorky do 2 až 6 h po odběru. Nejpozději je možno vzorky zpracovat do 24 h po odběru, za předpokladu, že během přepravy do laboratoře budou uchovávány při teplotě 4-6 C. 7. Přesné protokoly místo, datum, hodina odběru, zdroj vody, jméno osoby, která vzorek odebírala, datum analýzy, použitá metoda, způsob manipulace se vzorkem, a výsledek analýzy.

53 Limity mikrobiologického rozboru pitné vody podle vyhlášky 252/2004Sb. Test Limit Poznámka Clostridium perfringens Negativní / 100 ml Stanovení se provádí u pitných vod vyrobených z vod povrchových nebo z vod jimi ovlivněných Enterokoky Escherichia coli Koliformní bakterie Psychrofilní bakterie (22 C) Mezofilní bakterie (36 C) Negativní / 100 ml Negativní / 250 ml Negativní / 100 ml Negativní / 250 ml Negativní / 100 ml 200 CFU / ml Platí pouze pro balenou pitnou vodu Platí pouze pro balenou pitnou vodu 500 CFU / ml Platí pro balenou pitnou vodu 500 CFU / ml Platí pro vodu náhradního zásobování a vodu z malých zdrojů *** 100 CFU / ml 20 CFU / ml Platí pro balenou pitnou vodu 100 CFU / ml Platí pro vodu náhradního zásobování a vodu z malých zdrojů *** Pseudomonas aeruginosa Negativní / 250 ml Platí pouze pro balenou pitnou vodu negativní = 0 CFU/ml CFU = KTJ

54 MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODY filtrace 100 ml vody přes membránový filtr přenos 1 ml vody na agarovou plotnu ENTEROKOKY KOLIFORMNÍ B. a E. COLI Slanetz-Bartley agar 37 C (44-48 hod) TTC agar s tergitolem C (24-48 hod) PSYCHROFILNÍ B. MasoPeptonový Agar 22 C (do 72 h) MEZOFILNÍ B. MasoPeptonový Agar C (24-48 h) přeočkování červenohnědých kolonií žluč-aeskulin-azidový agar (BEA), 44 C 48 h přeočkování žlutých kolonií Tryptofan- Sojový Agar 36 C, až 24 h oxidázový test průkaz E. coli indol

55 Další testy mikrobiologického rozboru pitné vody podle vyhlášky 252/2004Sb. Clostridium perfringens, C. pasteurianum - pokud je povrchová voda upravená na pitnou Pseudomonas aeruginosa Mikroskopické hodnocení - počet všech a počet živých mikroorganismů v 1 ml

56 ENTEROKOKY (FEKÁLNÍ STREPTOKOKY) G+ (strepto)koky, žijící převážně v trávicím traktu živočichů redukují 2,3,5 trifenyltetrazoliumchlorid na formazan a hydrolyzují aeskulin stanovení (intestinálních) enterokoků doplňuje průkaz koliformních bakterií, neboť enterokoky jsou odolnější vůči nepříznivým účinkům prostředí (včetně chlorování a jiných dezinfekčních zásahů) než koliformní bakterie přítomnost enterokoků v pitných vodách nepřímo indikuje i možnou přítomnost patogenních virů, které jsou k chloraci rovněž odolnější než koliformní bakterie pro kultivaci enterokoků jsou používána živná média s obsahem azidu sodného, který potlačuje růst G- bakterií. Nejpoužívanější půdou je Slanetz-Bartleyův agar, na němž rostou enterokoky v podobě červených nebo růžových koloniích s červeným středem. Inkubace se provádí při 37 C 2 dny.

57 ENTEROKOKY (FEKÁLNÍ STREPTOKOKY) Slanetz-Bartleyův agar jemně růžový obsahuje azid sodný diagnostická a selektivní půda pro střevní (fekální) enterokoky kultivace při 37 C (24-48 h) Azid sodný nejpoužívanější selektivní agens, většina médií jej obsahuje %. inhibuje enzymatické systémy elektronového transportu, např. katalázy nebo cytochromoxidázy c hodnotíme počet (KTJ/ml) červenohnědých kolonií

58 KOLIFORMNÍ BAKTERIE A ESCHERICHIA COLI za koliformní bakterie označujeme několik druhů gramnegativních bakterií z bohaté čeledi Enterobacteriaceae, které při kultivaci na selektivně-diagnostických půdách rozkládají laktózu během hodin nejtypičtějším a nejrozšířenějším zástupcem koliformních bakterií je druh Escherichia coli, který žije převážně v trávicím traktu teplokrevných živočichů včetně člověka - ve vodě je indikátorem fekálního znečištění a je schopna růstu i při teplotách C kromě Escherichia coli patří ke koliformním bakteriím i druhy rodů Enterobacter, Citrobacter a Klebsiella, které se však kromě trávicího traktu někdy vyskytují i jiných prostředích. pro kultivaci koliformních bakterií se používá řada živných médií, většinou s obsahem laktózy (Endova půda, půda s Tergitolem 7). Druhy rozkládající laktózu na půdě s Tergitolem 7 vyrůstají ve žlutých koloniích, Escherichia coli na Endově agaru je červená s kovově zlatým leskem, zatímco bakterie nevyužívající laktózu vytváří kolonie růžové nebo bezbarvé

59 KOLIFORMNÍ BAKTERIE A ESCHERICHIA COLI TTC půda s tergitolem 7 zelená obsahuje heptadecylsulfát sodný diagnostická půda pro koliformní bakterie a E. coli kultivace při teplotě 36+2 C (24 hod) po kultivaci membránového filtru se jako laktóza pozitivní bakterie počítají všechny charakteristické kolonie (bez ohledu na velikost), které vykazují tvorbu žlutého zbarvení média po membránovým filtrem. hodnotíme počet žlutých (okrových) kolonií (KTJ/ml) a jejich tvar

60 PSYCHROFILNÍ A MEZOFILNÍ BAKTERIE pod těmito pojmy se rozumí všechny bakterie schopné růstu na organických látkách, a to při teplotě 22 C (psychrofilní) a 36 C (mezofilní) kultivace se provádí 2-3 dny na univerzálních živných půdách s bohatým obsahem organických živin, jako jsou kasein-sojový agar nebo masopeptonový agar MPA 1 kultivace při teplotě 36 C až 48 hodin stanovení MEZOFILNÍCH BAKTERIÍ MPA 2 kultivace při teplotě 26 C 48 až 72 hodin stanovení PSYCHROFILNÍCH BAKTERIÍ potvrzuje se přítomnost saprofytických bakterií Hodnotíme počet kolonií (KTJ/ml) a jejich tvar

61 PSEUDOMONAS AERUGINOSA G- aerobní tyčky, na vhodných diagnostických agarech produkuje modrozelené nebo žlutozelené exobarvivo schopnost růstu při teplotách 42 C vyšetření přítomnosti této bakterie se provádí jen u balených pitných vod Pseudomonas aeruginosa je nejzávažnějším patogenním druhem rodu Pseudomonas a může se vyskytovat v některých typech přírodních vod jako potenciální patogen vyvolává řadu onemocnění: zánět močových cest, středního ucha či hnisání popálenin většina kmenů vylučuje prudce toxický toxin A rezistence k antibiotikům

62 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS G+ anaerobní sporulující bakterie, původce akutních střevních onemocnění s náhlým vznikem břišních kolik, nauzeou a průjmem výskyt v půdách a ve střevním traktu některých živočichů clostridiální typ spor, velmi odolné (více než enterokoky) a ve vodách může přežívat dlouhou dobu přítomnost v pitné vodě může indikovat přítomnost dalších patogenních mikroorganismů (např. kryptosporidií) kultivace C. perfringens se provádí anaerobně na m-cp agaru při 44 C po dobu 21 hodin, s následným potvrzením kolonií pomocí par amoniaku (žluté kolonie C. perfringens se zbarví do růžova až červena).

63 MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR VODY RYCHLOTESTY rychlotesty firmy Merck (Readycult Coliforms 100, Readycult Enterococci 100) založeny na změně barvy substrátu po působení specifických enzymů méně náročné na prostor a na vybavení laboratoře 100 ml vzorku + granule kultivace 18 až 24 hodin při C

64 Readycult Enterococci 100 enterokoky (fekální streptokoky) POZITIVNÍ REAKCE enterokoky přítomny NEGATIVNÍ REAKCE enterokoky nepřítomny

65 Readycult Coliforms 100 koliformní bakterie a E. coli POZITIVNÍ REAKCE koliformní b. přítomny NEGATIVNÍ REAKCE koliformní b. nepřítomny POZITIVNÍ REAKCE E. coli přítomna

66 3. ÚKOL - MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODY Cíl úkolu: Prokázat přítomnost bakterií obecného a fekálního znečištění pitné vody Pomůcky: Různé vzorky pitných vod /podzemní studniční voda/, pipety na 1 ml, odměrný válec, filtrační zařízení, membránové filtry /0,45 μm/, MPA, SB agar, laktózový TTC agar /tergitol 7/ Provedení: Ze vzorků pitných vod odebraných do sterilních lahví provedeme kultivační vyšetření 1. Zfiltrujeme 100 ml vody přes membránový filtr a filtr přeneseme do středu SB agaru, kultivace 37 C (44-48 hod) 2. Zfiltrujeme 100 ml vody přes membránový filtr a filtr přeneseme do středu agaru s tergitolem 7, kultivace C (24-48 hod) 3. Na každou misku s MPA napipetujeme 1 ml vody a rozlijeme po celém povrchu agaru kultivace při 22 C (do 72 h) a C (24-48 h)

67 Pracovní postup I. filtrace vzorku vody 1. Sterilace předcházející zpracování každého vzorku 2. Umístění membránového filtru na filtrační stojan 3. Umístění nálevky na stojan, její stlačení a pevné zasazení na místo

68 Pracovní postup II. filtrace vzorku vody 4. Nalití vzorku do nálevky s filtrem 5. Odstranění nálevky, zmáčknutí páčky, které umožní snadné odebrání membrány ze stojanu 6. Umístění filtru do Petriho misky s živnou půdou

69

70

71 Provedení (pokračování): Kultivujeme v bioinkubátoru: MEZOFILNÍ BAKTERIE (MPA 1) - při teplotě 36 C až 48 h PSYCHROFILNÍ BAKTERIE (MPA 2) - při teplotě 26 C až 72 h ENTEROKOKY (Slanetz-Bartleyův agar)-při teplotě 37 C 44+4 h narostlé kolonie na membránovém filtru přeočkujeme na žluč-aeskulinazidový agar /inkubujeme při teplotě 44 C a hodnotíme po 48 h/ KOLIFORMNÍ BAKTERIE a E. COLI (půda s tergitolem 7) -při teplotě 36+2 C 24 h narostlé kolonie na membránovém filtru přeočkujeme na neselektivní agar /inkubujeme při 36 C až 24 h/ a po této době provedeme konfirmační testy - oxidázový test, a test na produkci indolu

72 Mikrobiologický rozbor vzduchu

73 MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR VZDUCHU vzduch není vlastním prostředím pro mikroorganismy, ale je jen jejich dočasným přechovávačem a přenášečem mikroorganismy se dostávají do vzduchu rozvířeným prachem z půdy, drobnými kapkami vody z vodní hladiny, kapkami slin ze sliznic počet mikroorganismů v ovzduší se liší podle místa nejvíce je jich v průmyslových aglomeracích a nejméně nad mořem, nad chudými půdami, nad zalesněnými plochami prachové částice nosiče mikroorganismů jsou roznášeny až do výšky 10 km, běžné druhy se vyskytují do výšky 3000 m prachové částečky mohou sedimentovat, nebo drobné částečky zůstávají v ovzduší aerosol mikrobiologické vyšetření vzduchu se provádí nejčastěji v uzavřených prostorách, přičemž se stanovuje celková koncentrace směsné populace bakterií a celková koncentrace směsné populace plísní v ovzduší v současné době 3 druhy metod, kterými lze mikroorganismy v ovzduší sledovat

74 1. Aktivní nasávání vzduchu 1.A Impakční metody využívají pro průchod vzduchu sací hlavu s otvory, mikroorganismy jsou zachycovány na agarová média v Petriho miskách nejčastěji krevní agary (pro humánní patogeny) a SA (pro vláknité houby) a tomto principu fungují tzv. aeroskopy Jsou používány pro měření možného mikrobiálního rizika kontaminace z ventilačních a klimatizačních systémů. Nasávají úzkou štěrbinou vzduch a vrhají ho směrem k povrchu pomalu rotující Petriho misky se sterilním živným médiem, která se za 60 s otočí 360. Velikost štěrbiny je měnitelná

75 Aeroskop

76 1.B Filtrační metody zachycují mikroorganismy pomocí čerpadla nebo vývěvy na filtry, které jsou vkládány na Petriho misky a agary 2. Sedimentační metoda ve vyšetřovaném prostoru (místnosti, laboratoři..) se určitou dobu nechají otevřené Petriho misky se živným médiem do takto otevřených Petriho misek se nechají sedimentovat mikroorganismy, ulpívající na prachových částečkách vzduchu, expozice může trvat 10 min až 1 hodinu. stanovuje se celková koncentrace směsné populace bakterií a celková koncentrace směsné populace plísní v ovzduší neměla by být používaná pro hodnocení prostor zdravotnických zařízení, které využívají oběhový vzduch

77 SA Sabouraudův agar selektivní půda pro houby obsahuje pepton, agar a cukry (glukozu nebo maltozu) ph 5,0 kultivace při 26 C 72 h MPA Masopeptonový agar obsahuje pouze výtažek z masa, pepton, sole a 2% agarovou řasu základ pro další půdy neselektivní kultivace při C h

78 4. ÚKOL - Průkaz mikroorganismů v ovzduší Cíl úkolu Zjistit, zda v ovzduší laboratoře a jiných míst pracoviště /fytotrony, sterilní boxy, skleník / se vyskytují mikroorganismy Pomůcky: Petriho misky s masopeptonovým agarem /MPA/ a Sabouraudovým glukózovým agarem /SA/ Provedení SEDIMENTAČNÍ METODA Petriho misky odkryjeme na dobu 10 min v předem určeném prostoru. Pak misky uzavřeme víčkem, popíšeme /datum, lokalita, jméno/ a vložíme dnem vzhůru do bioinkubátoru. Mikroorganismy kultivujeme při teplotě 26 C /SA/, a 37 C /MPA/

79 Výsledek: zapisujeme v neděli vytvořit seznam míst, kde se nechávaly otevřené Petriho misky počítáme veškeré vyrostlé kolonie na každé agarové misce zvlášť a popisujeme morfologické vlastnosti jednotlivých kolonií hodnoty v KTJ kolonie tvořící jednotky - vztáhnout buď k času přepočet na 1 hodinu makroskopicky rozlišíme kolonie vláknitých hub /jsou chmýřité, vláknité/ od kolonií ostatních mikroorganismů /bakterií a kvasinek/ seřadíme odběrná místa podle intenzity kontaminace Petriho misek

80 Kontaminace povrchů Envirocheck Contact TVC

81 5. ÚKOL - Průkaz bakterií v ústní dutině a na povrchu kůže člověka A. Kultivační průkaz bakterií v ústní dutině člověka Cíl úkolu: Průkaz bakterií v ústní dutině Pomůcky: Sterilní vatový tampón na špejli, sterilní fyziologický roztok, Petriho miska s MPA Provedení: Zvlhčeným tamponem setřeme sliznici ústní dutiny kolem zubů dolní čelisti. Tampon rozetřeme na agarovou plotnu z inokula do několika rovnoběžných čar. Inkubujeme při teplotě 37 C 24 hod. Výsledek: Na agarové plotně spočítáme počet vyrostlých kolonií a popíšeme jejich morfologické vlastnosti. Z vybraných kolonií si připravíme nativní preparát, který prohlédneme velkým zvětšením mikroskopu a popíšeme.

82 B. Kultivační průkaz bakterií na kůži Cíl úkolu: Průkaz bakterií ulpívajících na rukou Pomůcky: Petriho miska s MPA Provedení: Provedeme otisk několika prstů na agarovou plotnu. Po té si umyjeme ruce, použijeme desinfekci, a znovu provedeme otisk prstů na agarovou plotnu. Inkubujeme 24 hod při teplotě 37 C. Výsledek: Na agarové plotně spočítáme počet vyrostlých kolonií a popíšeme jejich morfologické vlastnosti. Z vybraných kolonií si připravíme nativní preparát, který prohlédneme velkým zvětšením mikroskopu a popíšeme.

83 Očkování mikroorganismů

84 OČKOVÁNÍ BAKTERIÍ Kolonie je populace buněk, která vzniká z jedné buňky. Mnohé druhy bakterií rostou jako stejně vyhlížející kolonie. Různě vypadající kolonie jsou obvykle jiné druhy. Kolonie umožňují zhodnocení čistoty kultury, výskyt více než jednoho typu kolonie svědčí o kontaminaci kultury. Mikrobiální růst se v tekutých médiích projeví zakalením. Prvním krokem kultivace mikroorganismů je jejich přenesení z odebraného vzorku nebo dříve vytvořené kultury do čerstvého živného prostředí. Tomuto přenosu říkáme očkování (inokulace). Očkování musí být provedeno tak, aby během přenosu nedošlo k zavedení nechtěných mikroorganismů neboli kontaminaci ze vzduchu, rukou, dýchacích cest nebo pracovní plochy. Při očkování se užívá tzv. aseptická technika, což je sled kroků používaných k zabránění kontaminace sterilních předmětů nebo mikrobiálních kultur během manipulace.

85 A. Odběr kultury z tekutého média bakteriologickou kličkou a. Očkovací kličku držte v jedné ruce a zkumavku s bakteriální kulturou v druhé ruce. Sterilizujte kličku důkladným vyžíháním v nesvítivé časti plamene (klička se rozžhaví do ruda). Kličku nechejte vychladnout (asi 30 s). b. Malíkem ruky, která drží kličku, sejměte ze zkumavky víčko. (V případě použití zkumavek se šroubovacím víčkem je vhodné víčko předem mírně povolit). Vičko nepokládejte na podložku, ale stále ho držte. c. Zkumavku držte mírně nakloněnou a ožehněte její hrdlo v plameni. Ponořte sterilní kličku do bakteriální kultury a do očka naberte bakteriální suspensi. d. Kličku vytáhněte ven, ožehněte hrdlo zkumavky a vraťte na ni víčko. Zkumavku umístěte do stojánku. Kličku stále držíte v ruce.

86 B. Očkování do tekutého média Vezměte do ruky zkumavku se sterilním masopeptonovým bujónem, odstraňte víčko a ožehněte hrdlo zkumavky. Ponořte kličku s odebranou kulturou do bujónu a potom ji ze zkumavky vytáhněte. Ožehněte hrdlo zkumavky a vraťte víčko zpět. Zkumavku vraťte do stojánku. Vyžíhejte kličku.

87 C. Očkování na šikmý agar Postupujte obdobně jako u očkováni do bujónu, na šikmý agar očkujte jemným pohybem plochou očka kličky po povrchu agaru směrem ode dna nahoru, tak aby nedošlo k narušení agaru. Po naočkování zkumavku ožehněte, uzavřete víčkem a postavte do stojánku. Vyžíhejte kličku.

88 CHARAKTER RŮSTU NA ŠIKMÉM AGARU Hodnotíme: rychlost růstu, tvar nátěru, průřez nátěru, povrch nátěru, konzistenci, barvu

89 D. Očkování na agar v Petriho misce Mírně odklopte víčko, vsuňte dovnitř kličku s odebranou kulturou a lehkým pohybem kreslete po povrchu agaru (čáry nebo vlnovku) plochou očka kličky. Vytáhněte kličku, zavřete víčko a kličku vyžíhejte.

90 Křížový roztěr ředění vzorku mikroorganismů, cílem je získat jednotlivé KTJ

91 E. Očkování do hlubokého agaru očkovací jehlou Kulturu odeberte očkovací jehlou stejně jako v bodě 1. Vezměte do ruky zkumavku se sterilním masopeptonovým hlubokým agarem, odstraňte víčko a ožehněte hrdlo zkumavky. Očkujte hluboký agar zapíchnutím jehly do středu agaru. Jehlu opatrně vytáhněte, tak že ji pohybujete ve stejné draze jako při vpichu. Ožehněte hrdlo zkumavky a vraťte víčko zpět. Zkumavku vraťte do stojánku. Vyžíhejte jehlu.

92 Charakter růstu podél vpichu do agarové půdy (pouze u bakterií) Vpichem se očkuje z 24 h staré kultury narostlé v bujónu, kultivace při C a) aerobní (v horní části vpichu), b) mikroaerofilní c) fakultativně anaerobní (rostou po celé délce vpichu), d) anaerobní mikroorganismy (rostou na spodní části vpichu)

93 F. očkování teplého agaru zřeďování Ředění sterilními pipetami, kultivace podpovrchová

94 6. ÚKOL Příprava izolátů plísní Cíl úkolu: Získat základní dovednosti při přípravě monokultur houbových mikroorganismů Pomůcky: Petriho misky se Sabouraudovým glukózovým agarem, korkovrt, pinzeta, směsné kultury plísní, kahan, podložní skla, krycí skla, vlhká komůrka, bakteriologická klička, šikmý agar Provedení: Korkovrtem vysekneme z čisté misky s SA 1-3 disky. Získané čisté disky s SA položíme na podložní sklo a bakteriologickou kličkou přeneseme na jejich povrch kulturu spor plísní. Přikryjeme krycím sklem, vložíme do vlhké komůrky a kultivujeme při C 2-3 dny, pak uschováme v ledničce. Pozorujeme pod mikroskopem. Na šikmý agar naočkujeme bakteriologickou kličkou stejnou kulturu spor plísní, kultivujeme při C 2-3 dny Výsledek: Pozorujeme růst kultur mikroorganismů, mikroskopujeme

95 Podložní sklo s agarovým diskem Petriho miska s vyseknutými agarovým disky Agarový disk s kulturou plísně