UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd DIPLOMOVÁ PRÁCE MDOC a jeho vliv na iniciaci aterogenního procesu u experimentálních modelů aterosklerózy. MDOC and its effects on the initiation of atherogenic process in experimental models of atherosclerosis. Hradec Králové, 2007 Lukáš Pachman 1

2 Poděkování Dovoluji si poděkovat PharmDr. Petru Nachtigalovi, Ph.D. za odborné vedení diplomové práce a poskytnuté rady. Dále bych chtěl poděkovat Mgr. Nadě Pospíšilové za veškeré konzultace při práci v laboratoři. 2

3 OBSAH 1. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST ATEROSKLERÓZA Historie a současný pohled na vznik choroby Patogeneze aterosklerózy Rizikové faktory aterosklerózy Neovlivnitelné faktory Ovlivnitelné faktory Endoteliální dysfunkce Buněčné adhezivní molekuly Imunoglobuliny VLÁKNINA Klasifikace vlákniny Rozpustná vláknina Význam vlákniny MDOC oxidovaná celulóza MYŠÍ MODELY CÍL PRÁCE EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ZVÍŘATA A PŘEDEPSANÁ DIETA BIOCHEMICKÁ ANALÝZA IMUNOHISTOCHEMIE Kvantitativní analýza imunohistochemie a velikost lézí STATISTICKÁ ANALÝZA VÝSLEDKY BIOCHEMICKÁ ANALÝZA IMUNOHISTOCHEMIE Imunohistochemické barvení VCAM-1 v oblasti aortálního sinu Stereologická analýza exprese VCAM-1 u ApoE deficientních myší DISKUZE ZÁVĚR ABSTRAKT LITERATURA

4 1. Úvod 4

5 Ateroskleróza patří mezi kardiovaskulární onemocnění, které tvoří v posledních letech nejčastější příčinu morbidity a mortality ve všech ekonomicky vyspělých zemích Evropy a USA. Více než 50% všech úmrtí jsou dány aterosklerotickými komplikacemi, jakými jsou různé ischemické kardiomyopatie a mozkové cévní příhody. Stav vysoké úmrtnosti na kardiovaskulární choroby u nás není dán nedostatečnými znalostmi o ateroskleróze, nýbrž je spíše zaviněn nedůkladnou zdravotní výchovou obyvatelstva, nesprávným životním stylem, především dietetickými návyky a nedostatečnou pohybovou aktivitou. Nejméně nákladným bojem s touto nemocí by byla primární prevence, která by dbala na zdravý životní styl každého jedince. Bohužel v této uspěchané době, kdy se zvyšuje náročnost životního stylu v moderní společnosti, je primární prevence nedostačující. Je to dáno také tím, že ateroskleróza se vyvíjí dlouho nepozorovaně bez varovných příznaků, proto chybí i základní motivační činitel, který by působil na obyvatelstvo, aby o své zdraví více dbalo. Cílem této diplomové práce bylo zjistit potencionální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC. Jako model byly použity apoe deficientní myši, kterým byla podávána aterogenní dieta. Byly sledovány hladiny lipidů a sérové koncentrace zánětlivých markerů v krvi. Pro zobrazení exprese VCAM-1 byly využity imunohistochemické metody a ke kvantifikaci jeho exprese stereologické metody a endoteliální exprese VCAM-1. 5

6 2. Teoretická část 6

7 2.1. Ateroskleróza Ateroskleróza je pomalu postupující zánětlivé onemocnění tepen. Je charakterizována podle WHO jako variabilní kombinace změn intimy artérií spojená s ukládáním lipidů (cholesterolu), polysacharidů a krevních elementů. V dalším vývoji tvorbou fibrózní tkáně provázenou ukládáním vápenatých sloučenin se změnami v medii artérií. (1) Nejčastějšími lokalizacemi aterosklerotických lézí jsou arteria carotis communis dextra et sinistra, oblast arcus aortae (především oblasti hlavních odstupů), arteriae coronarie, aorta thoracica, aorta abdominalis (oblast odstupů viscerálních větví), arteriae renales, arteriae iliacae a arteriae femorales. (2) Místa výskytu aterosklerózy nejsou náhodná. Lokalizace vzniku aterosklerotického plátu je silně determinována především různými vlastnostmi v jednotlivých místech cévního řečiště. (3) Obrázek 1. Predispoziční místa výskytu aterosklerotických lézí podle De Bakey et al. (4) 7

8 Historie a současný pohled na vznik choroby V 19. století patolog Wirchow dal vzniknout infiltrační teorii aterosklerózy, která předpokládala lipidovou infiltraci skrz endotel jako iniciační faktor vzniku aterosklerotického plátu. Ve druhé polovině 20. století byla vyslovena teorie mechanického poškození endotelu, podle které léze endotelových buněk s následným odkrytím subendotelového vaziva způsobí aktivaci krevních destiček a jejich nasednutí na poškozenou část cévní stěny. Aktivované destičky produkují řadu působků, z nichž především plateled derived growth factor (PDGF) byl pokládán za spouštěcí faktor. Tato teorie byla nakonec vyvrácena, protože nikdy nebyl prokázán defekt integrity endotelu na počátku vývoje léze. Destičky hrají roli spíše při komplikacích již vytvořené aterosklerózy a ne v jejích počátečních stádiích. (5) Díky intenzivním výzkumům v posledních letech se jednotlivé pohledy jednomyslně sjednotili v teorii zánětlivé choroby. Prvním nejrozšířenějším signálem vedoucím ke vzniku endoteliální dysfunkce jsou lipoproteiny, které z různých důvodů, nejčastěji kvůli zvýšení jejich koncentrací v krvi, vstupují ve zvýšené míře do subendotelu. Zde mají tendenci vázat se na složky extracelulární matrix a vlivem prodloužené doby jejich výskytu v tomto místě se oxidují. (6) Oxidované či jinak změněné lipoproteiny, především pak LDL, jsou velmi silným podnětem pro aktivaci endotelových buněk. Tyto oxidované LDL se váží na scavenger receptory na endotelové buňce a vedou k její aktivaci přes signalizační molekuly a cesty, které nejsou ještě přesně známy. Aktivace se projevuje zvýšenou expresí adhezivních molekul na povrchu endotelu, produkcí cytokinů a chemokinů stav usnadňující vychytání cirkulujících krevních buněk, především monocytů a lymfocytů. Endotel na počátku vývoje aterosklerózy se tedy nachází ve stavu zánětlivé aktivace, který podporuje vychytávání cirkulujících monocytů a lymfocytů. Ateroskleróza je tudíž chronické zánětlivé onemocnění velkých artérií s intimální lokalizací. (7) Patogeneze aterosklerózy Ateroskleróza, jak již bylo několikrát řečeno, je systémové onemocnění postihující cévy tepenného řečiště (velké a střední); z klinického hlediska mají největší význam léze srdečních věnčitých tepen, extrakraniálních tepen zásobujících mozek, eventuálně dalších 8

9 orgánů (ledviny). Na patogenezi aterosklerózy se podílí komplex po sobě jdoucích událostí, zahrnujících rozvoj chronického zánětlivého procesu stěny artérií jako odpověď na hemodynamické poškozování cévní stěny v nejvíce namáhaných místech, jejíž příčina nebyla odstraněna a proces nebyl neutralizován. To způsobuje nejprve dysfunkci cévního endotelu s tvorbou cytokinů, adhezivních molekul a růstových faktorů. Aktivované endotelové buňky přitahují do místa léze monocyty/makrofágy a T- lymfocyty z krevní cirkulace, buňky hladké svaloviny z medie, subendotelový prostor se postupně zvětšuje a současné zvýšení permeability endotelové výstelky umožňuje pronikání lipoproteinových částic do tohoto prostoru. Dochází v nich k lipoperoxidaci působením reaktivních forem kyslíku a dusíku, které nebyly zneškodněny antioxidačním mechanismem. Uvolněný cholesterol je pohlcován makrofágy za vzniku pěnových buněk; stěna cévy se v místě poškození ztlušťuje (migrací a proliferací buněk hladké svaloviny, tvorbou extracelulární matrix, nekrotickými depozity z rozpadlých pěnových buněk), a dostává prokoagulační vlastnosti. Celý proces vyúsťuje do tvorby aterómu (aterómového plátu). Klinické příznaky se projeví, až když se pokročilé léze cévní stěny komplikují rupturou obalu ateromového plátu, krvácením do plátu, vznikem trombózy nebo embolu. (2) Obrázek 2. Schéma ztlušťování artérie v průběhu aterogeneze (převzato z internetových stránek: 9

10 Příčiny endotelové dysfunkce vedoucí k ateroskleróze zahrnují hemodynamickou zátěž, zvýšení a modifikaci LDL-částic, tvorbu reaktivních forem kyslíku a dusíku, zvýšený arteriální tlak, diabetes mellitus, genové alterace kódující progresi zánětlivé a reparační odpovědi, zvýšenou hladinu homocysteinu a také přítomnost infekčních agens jako jsou herpetické viry, cytomegalovirus, virus Epsteina a Barrové, Hemophilus influezae, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae nebo Helicobacter pylori. Dysfunkce endotelu, způsobená těmito vlivy, vede ke kompenzační odpovědi, která mění normální homeostatické vlastnosti cévního endotelu. Zvyšuje se adhezivita endotelových buněk vzhledem k leukocytům nebo krevním destičkám, roste permeabilita cévní stěny, endotelie získávají prokoagulační vlastnosti namísto antikoagulačních a zvyšuje se produkce vazoaktivních molekul, cytokinů, chemokinů i růstových faktorů. (8) Obrázek 3. Schéma počáteční fáze dysfunkce endotelu (převzato z internetových stránek: Když tato zánětlivá odpověď nedokáže vyvolávající příčiny odstranit a není-li účinně neutralizována nebo potlačena obrannými mechanismy, postupuje ve svých účincích dále. Migrace a proliferace buněk hladké svaloviny pokračuje; myocyty pronikají do oblastí zánětu, dochází k jejich aktivaci, tvorbě extracelulární matrix. Dochází k nakupení makrofágů a T- lymfocytů v subendotelovém prostoru ve stěně cévy, která se takto ztlušťuje. Toto ztluštění je nejprve kompenzováno dilatací a lumen cévy zůstává zpočátku nezměněno (fenomén 10

11 remodelace). (9) Pokračující zánět zvyšuje počet makrofágů a lymfocytů, které se sem dostávají z krevního oběhu nebo vznikají na místě léze proliferací. Makrofágy fagocytují oxidovavané LDL-částice, které pronikly do intimy a vznikají z nich pěnové buňky. Aktivace makrofágů a T-lymfocytů vede k dalšímu uvolňování cytokinů, chemokinů (monocytový chemoatraktant-protein 1 = MCP-1), hydrolytických enzymů a růstových faktorů, které navozují další poškození, eventuálně způsobují ložiskovou nekrózu. A tak postupující akumulace monocytů/makrofágů, migrace a proliferace buněk hladké svaloviny a tvorba fibrózní tkáně vede k dalšímu rozšiřování a restrukturalizaci léze, která se pokrývá vazivovou čepičkou, zakrývající lipidové jádro s nekrotickými hmotami (aterómový plát). To je stádium pokročilé komplikující léze arteriální stěny. (10) Od určité doby arterie nemůže kompenzovat lézi pronikající do lumen cévy dilatací, které se zmenšuje, což vede ke snížení průtoku cirkulující krve. Na zhrubnělém povrchu léze (ateromového plátu) adherují trombocyty. Jejich aktivací se uvolňují granula obsahující cytokiny a růstové faktory, které spolu s trombinem přispívají k další migraci a proliferaci buněk hladké svaloviny a monocytů. Aktivací destiček také vzniká arachidonová kyselina, která se přeměňuje (působením cyklooxygenázy 1) na prostaglandiny jako je tromboxan A 2, který je velice potentním vazokonstriktorem a látkou agregující trombocyty; z arachidonové kyseliny také vznikají (působením lipooxygenázy) leukotrieny, amplifikující zánětlivou reakci. (11) Pokud fibrózní čepička pokrývající aterómový plát zůstává dostatečně tlustá, nehrozí takové nebezpečí z obturace lumen artérie. Jakmile však dojde k jejímu ztenčování působením metaloproteináz (kolagenáz, elastáz, stromelyzínu) uvolňovaných z makrofágů po aktivaci T- lymfocyty, vzniká tak stádium nestabilního plátu, kdy hrozí ruptura plátu, průnik krve do jeho nitra a vznik obturujícího trombu. Uzávěr lumen cévy vede k akutní hypoxii, se všemi jejími důsledky pro zásobenou tkáň. (12) 11

12 Obrázek 4. Schéma aterómového plátu (převzato z internetových stránek: Obrázek 5. Schéma mechanismu rozvoje aterogeneze (převzato z internetových stránek: 12

13 Rizikové faktory aterosklerózy Neovlivnitelné faktory Věk Člověk je tak mladý jako jeho cévy. Profesor Gotthard Schettler ( 1996), Univerzita Heidelberg, SRN Každý člověk stárne, někdo rychleji, někdo pomaleji, ale s ním rovněž stárnou i jeho cévy. Projevuje se zde nejen fyziologické opotřebení, ale i snížená funkce reparativních procesů. Tím, že se lidská populace dnes dožívá poměrně vysokého věku, tím se také setkáváme jako zdravotníci se staršími cévami. Snižují se endoteliální funkce a objevuje se ateroskleróza, což se pak projevuje zvýšeným výskytem ischemickým chorob hlavně u lidí mezi 65. a 85. rokem. Riziko mozkového apoplexu je u 85letého člověka 1000krát vyšší než u 45letého. (13) Pohlaví Riziko aterosklerózy se prudce zvyšuje o mužů nad 45 let a u žen nad 55 let. Přitom do 60. roku věku jsou muži postiženi častěji než ženy. Po 60. roku se riziko u obou pohlaví vyrovnává a ženy začnou muže rychle dohánět, až je dokonce předeženou, takže po 75. roce je incidence koronární aterosklerózy vyšší než u stejně starých mužů! Důvodem pro tyto rozdíly specifické pro pohlaví je ženský pohlavní hormon, který ženám poskytuje přirozenou ochranu, tzn., že snižuje hladinu LDL a zvyšuje hladinu HDL. Ta je po přechodu stále nižší s poklesem produkce estrogenu stoupá onemocnění žen dvakrát až třikrát. U žen kuřaček nastává pokles estrogenu přibližně o dva roky dříve a současně se v důsledku rizikového faktoru kouření zvyšuje riziko vzniku aterosklerózy. (2) Dědičnost Lidé, jejichž rodiče trpěli aterosklerózou, hypertenzí, rodinnou hypercholesterolemií nebo jinými kardiovaskulárními chorobami, mají výrazně vyšší riziko výskytu některé z těchto chorob. Potomek je pro nemoc predisponován - může ji, ale nemusí dostat. Jedna americká studie prokázala, že riziko mozkové mrtvice u mužů, jejichž matka zemřela na mozkovou mrtvici, se trojnásobně zvýšilo. (14) 13

14 Ovlivnitelné faktory Výživové faktory Cholesterol v krvi Určitá hladina cholesterolu je pro tělo zcela nezbytná, protože cholesterol je důležitou součástí membrán, je základní substancí pro hormony nadledvin, pohlavní hormony a je základní substancí pro žlučové kyseliny. Koncentruje se v nadledvinách, v mozku, v kožním tuku a ve slezině, vaječnících, v krevním séru a červených krvinkách. Ovšem toto potřebné množství si je schopné tělo syntetizovat samo. Člověk přijímá cholesterol také exogenně s potravou (v ČR průměrně 460mg!!!). Tím klesá produkce endogenně syntetizovaného cholesterolu. Tento regulační mechanismus, udržující stabilní hladinu cholesterolu, je vázán jednou podmínkou: vlastní produkce cholesterolu a exogenní přísun musí být v určité rovnováze. Jestliže přísun z venku příliš stoupne (nad 300mg/den), je možné část cholesterolu ještě odbourat v játrech, ale později dojde k poškození jaterních receptorů. Dojde ke zvyšování cholesterolu v krvi a k poruše cholesterolové výměny a nakonec k hypercholesterolémii. Cholesterol je tedy škodlivý, pouze když je ho mnoho. Celkový cholesterol má hraniční hodnoty koncentrace v krvi mg/dl, přičemž hodnota 200 mg/dl je hraniční mezi normálním a zvýšeným cholesterolem. Tato hodnota udává informace o celkovém cholesterolu a triacylglycerolech. Pokud ovšem udáváme hladinu v jiných jednotkách a to v mmol/l, musíme rozlišovat mezi údaji o cholesterolu a triacylglycerolech. Přepočet je 200mg/dL=5,2 mmol/l u cholesterolu a pro triacylglyceroly je to 200mg/dL=2,28mmol/l. Hladina LDL by se měla u dospělého člověka pohybovat v rozmezí mg/dl. Závisí také na tom, jestli pacient vykazuje ještě některé další rizikové faktory. Velmi důležité je znát kromě hodnoty celkového cholesterolu také poměr mezi množstvím LDL a HDL. Hodnota HDL by měla být vyšší než 35 mg/dl. Hodnoty HDL se snižují také při kouření cigaret, nadváze, poruchách štítné žlázy a při zvýšených hodnotách triacylglycerolů. (15) Triacylglyceroly v krvi Triacylglyceroly (Tg) slouží buňkám těla jako zásobník energie, ochrana orgánů a tepelná izolace. Nadbytek Tg se ukládá do tukové tkáně jako deponovaný tuk. Stejně jako cholesterol si může tělo Tg vyrábět samo (v tukové tkáni nebo v játrech, také syntézou 14

15 ze sacharidů). Mnoho Tg ale přichází společně s potravou. V krvi jsou Tg vázány hlavně na VLDL a vzniká tak jejich transportní forma. Krevní hladina Tg je optimální kolem 200 mg/dl. Hlavními rizikovými faktory pro příliš vysokou hladinu Tg jsou cukry a alkohol. Dodávají do těla příliš mnoho kalorií (1 gram alkoholu dodá 7,2 kcal). Alkohol je také velmi rychle přeměňován na tuk a zpomaluje odbourávání tuku a cholesterolu v játrech. (15) Cukry a diabetes mellitus Trvale vysoké hodnoty krevního cukru (nalačno nad 120mg/dL a po jídle nad 200mg/dL) poškozují v krátké době cévní stěny, usnadňují pronikání cholesterolu do buněk a příznivě ovlivňují proces aterosklerózy s těžkými následky. U diabetiků je také jiné složení lipoproteinů než u zdravých lidí. Vyskytují se u nich ve zvýšené míře malé aterosklerózu podporující částečky, takže zvýšení hodnot cholesterolu je u nich ještě větším rizikovým faktorem než u lidí netrpících cukrovkou. Diabetici umírají na infarkt třikrát častěji než nediabetici. Pokud není při cukrovce dobře vyregulován krevní cukr, stoupají hodnoty krevních tuků, cholesterolu a triacylglycerolů. Proto je diabetes značným rizikem aterosklerózy. Vysoké hodnoty krevního cukru podporují usazovaní cholesterolu ve velkých tepnách, které zásobují kyslíkem mozek a srdce. Ještě jednoznačnější je souvislost s onemocněním malých srdečních a mozkových artérií. Zde dochází k houstnutí spojovací tkáně, které nakonec končí uzavřením cévy. (16) Mezi osobami dlouhodobě nemocnými cukrovkou se také často vyskytuje hypertenze. U diabetiků typu 1 koreluje výskyt hypertenze s délkou onemocnění, u diabetiků typu 2 nikoliv. Redukce hmotnosti často vede nejen k úpravě diabetu, ale i hypertenze. Glukóza a produkty neenzymové glykace jsou výkonnými lapači radikálu NO. Glukóza tak může způsobit endoteliální dysfunkci a může se podílet na jejím dalším zhoršování. Faktory mimo výživu Nedostatek pohybové aktivity nadváha a obezita Lidé, kteří jsou pravidelně fyzicky aktivní, mají jen poloviční riziko výskytu cévních onemocnění. Vytrvalostní fyzická aktivita nejen snižuje hladinu LDL, triacylglyceroly a krevní tlak, ale i zvyšuje HDL. Výsledkem je zřetelné snížení rizika aterosklerózy. 15

16 Nadváha vzniká, jakmile člověk přijímá více energie, než spotřebuje. Potřeba výživných látek závisí na fyzické aktivitě, věku a pohlaví. Ženy obecně potřebují o něco menší příjem než muži a starší lidé podstatně méně než mladí. Obezita je spojena s řadou metabolických poruch, jako jsou dyslipidémie, inzulinorezistence, endoteliální dysfunkce a další. Metabolické abnormality, které provázejí obezitu, jsou známými rizikovými faktory závažných organických (aterosklerotických) změn. (13) Hypertenze Tak zvaná primární neboli esenciální hypertenze (hypertenze z neznámých příčin) tvoří asi 95% všech případů. Trpí jí zhruba každý pátý dospělý občan. Vyšší hodnota krevního tlaku než je 140/90 mmhg výrazně zatěžuje srdce a poškozuje endotel cévy. Hodnota nad 160/95 mmhg je již hodnocena jako vysoký krevní tlak. Kouření Asi čtvrtina všech onemocnění cév je způsobena kouřením. Při kouření cigaret se uvolňují volné radikály, které napadají částečky LDL, vzniká tak oxidační stres, který urychluje rozvoj aterosklerózy. Kouření také podporuje proces stárnutí, což platí hlavně u žen, ty také přicházejí o dva roky dříve do přechodu. Kouření zužuje malé arterie v mozku, takže tlumí jeho zásobení krví. Kombinace kouření a vysokého krevního tlaku vede v souladu s tím ke značnému zvýšení rizika mozkové mrtvice. Je také prokázáno, že kouření zesiluje sklon krevních destiček ke shlukování a nepříznivě ovlivňuje složení krevních tuků, navíc podporuje vývoj aterosklerotických usazenin na velkých arteriích, které zásobují mozek. Následkem kouření je také vzestup krevního cholesterolu. Poměr mezi HDL a LDL cholesterolem je nižší než u nekuřáků. (17) 16

17 Endoteliální dysfunkce Endotel je jednovrstevný plošný epitel, který vystýlá lumen cév a odděluje tak krevní elementy od extravaskulární tkáně. Endotel se významě podílí na regulaci cévní permeability, regulaci cévního tonu, uplatňuje se v hemostáze a fibrinolýze, ovlivňuje strukturu cévní stěny a podílí se na interakci s buňkami krve. (18) Endoteliální dysfunkcí rozumíme lokalizované či generalizované postižení endotelu charakterizované zvýšením propustnosti cévní stěny a vznikem nerovnováhy mezi faktory vazorelaxačními a vazokonstrikčními, prokoagulačními a antikoagulačními, růst stimulujícími a růst inhibujícími. Výsledkem je proaterogenní účinek s převahou vazokonstrikčních, protrombotických a proliferačních pochodů se zvýšenou expresí zánětlivých markerů a adhezivních molekul. Rizikové faktory kardiovaskulárních onemocnění uvedené výše, vedou ke vzniku endoteliální dysfunkce. (19) Buněčné adhezivní molekuly Adhezivní molekuly jsou látky proteinového charakteru, které jsou exprimované na povrchu všech tkání organismu. Nepůsobí pouze jako pasivní lepidlo, ale účastní se také přenosu signálu mezi buňkami a podílí se tak na interakci buněk s okolním prostředím. Adhezivní molekuly se účastní řady fyziologických dějů, jako jsou buněčný růst a diferenciace, embryogeneze, hojení ran a obnova tkání. Uplatňují se také při patologických procesech, kde se podílejí na interakcích mezi složkami imunitního systému. (20) Dělí se do čtyř základních skupin. A to na selektiny, integriny, imunoglobuliny a kadheriny Imunoglobuliny Tato skupina tvoří rozsáhlou rodinu povrchových buněčných molekul, která představuje 50% všech povrchových molekul leukocytů. Jde o látky glykoproteinového charakteru tvořené opakujícími se Ig doménami z beta řetězců. Zprostředkovávají jak homofilní (vazba adhezivní molekuly jedné buňky na stejnou molekulu druhé buňky), tak heterofilní interakce (vazba adhezivní molekuly jedné buňky na neidentickou molekulu druhé buňky). (21) 17

18 Patří sem celá řada adhezivních molekul. Antigenně specifické receptory T a B lymfocytů TCR, BCR, koreceptory T - lymfocytů CD4 a CD8. Z hlediska aterosklerózy jsou nejvýznamnějšími zástupci VCAM-1 (vascular cell adhesion molekule-1), ICAM-1 (intercellular cell adhesion molekule-1), PECAM-1 (platelet cell adhesion molekule-1). VCAM 1 Struktura: Transmembránový glykoprotein obsahující N-konec, sérii Ig domén, transmembránovou oblast a cytoplazmatický konec. VCAM-1 má 7 extracelulárních domén, přičemž domény 1 a 4 jsou speifická vazebná místa místá pro vazbu α4β1-integrinu (VLA-4). Tento integrin exprimuje většina lekocytů. Funkce: Vytváří pevnou vazbu mezi leukocyty (exprese VLA-4 integrinu) a endoteliálními buňkami. (22) Exprese: VCAM-1 je exprimován endoteliálními buňkami, makrofágy a hladkosvalovými buňkami. U malých aterosklerotických lézí je VCAM-1 exprimován především endoteliálními buňkami, ale také buňkami hladkosvalovými, které přiléhají k aterosklerotické lézi. U pokročilejších aterosklerotických lézí je VCAM-1 exprimován již většinou buněk v intimě cév. VCAM-1 je tedy exprimován především v oblastech výskytu lézí. Na normálních endotelových buňkách je jen málo nebo není vůbec exprimován. Na zvýšenou expresi má vliv řada faktorů - diabetes mellitus, kouření, hypercholesterolémie, hyperhomocysteinémie, hemodynmický stres, TNFα a IL-1. (23) 2.2. Vláknina Vlákninou rozumíme nestravitelné zbytky rostlinného původu. Tvoří ji heterogenní směs látek různého chemického složení a biologických účinků. Pod pojem dietní vláknina dnes zařazujeme nestravitelná rezidua rostlinného původu v lidské dietě a nejsou to výhradně jen složky rostlinných buněk. Definice dietní vlákniny podle Americké asociace chemiků cereálií (AACC-American Association of Cereal Chemists), přijatá v roce 2001: Dietní vláknina je tvořena poživatelnou částí rostlinných nebo obdobných sacharidů, které jsou rezistentní trávení a absorpci v lidském tenkém střevě s kompletní nebo částečnou fermentací v tlustém střevě. 18

19 Dietní vláknina zahrnuje polysacharidy, oligosacharidy, lignin a ostatní podobné rostlinné substance. Ovlivňuje fyziologické děje svým prokinetickým účinkem a vyvolává pozitivní změny hladin krevního cholesterolu a glukózy. (24) Klasifikace vlákniny Vláknina se dělí na vlákninu nerozpustnou ve vodě (IDF insoluble dietary fibre, též tzv. hrubá vláknina). Patří sem lignin, celulóza a určitý podíl hemicelulóz. A vlákninu ve vodě rozpustnou (SDF soluble dietary fibre, též tzv. měkká vláknina), což jsou pektiny, gumy, slizy, hemicelulózy arabinoxylany obilovin, β-glukany ječmene, glukomannany a galaktomannany luštěnin. (25) Obrázek 6. Dělení dietní vlákniny Rozpustná vláknina Absorbuje vodu, čímž změkčuje stolici a udržuje obsah střev v pohybu. Také na sebe váže toxické látky a tím dochází k jejich omezenému kontaktu se sliznicí. Mírně snižuje kyselost žaludečního obsahu a zpomaluje jeho vyprazdňování. Naopak zvyšuje viskozitu náplně žaludku a střev, tudíž zpomaluje promíchávaní tohoto obsahu. Omezuje přístup pankreatických amyláz a lipáz k substrátům. Zpomalí se tak průchod střevního 19

20 obsahu a sníží se difúze živin, váží se minerální látky (zejména ionty Ca 2+, Fe 2+, Cu 2+, Zn 2+ ) a tím se modifikuje jejich dostupnost. Podmínkou je však dostatečný příjem tekutin. Část vázaných kationtů se uvolní při fermentaci v tlustém střevě. Rozpustná vláknina také ovlivňuje příznivě mikroflóru ve střevě. (14) Účinek na metabolizmus glukózy a na hladinu cholesterolu Pektiny se nacházejí v pletivech vyšších rostlin a jsou složkami všech druhů ovoce a zeleniny. Více pektinu se nachází v jablkách, rybízu, angreštu, rajčatech, mrkvi a cukrové řepě, méně v třešních, višních, bezinkách, borůvkách. Základní struktura je tvořena lineárním řetězcem D-galakturonové kyseliny, jejíž jednotky jsou do různého stupně (průměrně 70%) esterifikovány methanolem. Jejich obsah v ovocné dužnině je okolo 1%. Pro nerozpustné nativní pektiny buněčných stěn asociovaných s celulózou se používá název protopektiny. Enzymovou hydrolýzou komplexem enzymů zvaných protopektináza se přeměňují na rozpustné nízkomolekulární pektinové látky. Pektin ovlivňuje metabolismus glukózy a snižuje množství cholesterolu v krvi. Účinnější je pektin s vyšším obsahem methoxylových skupin (hrozny, broskve). Nerozpustné pektinové látky jsou příčinou tvrdosti a pevnosti nezralého ovoce a zeleniny. (26) Význam vlákniny Dietní vláknina, která dosáhne tlustého střeva, podléhá fermentaci bakteriální flórou za vzniku krátkých mastných kyselin (SCFA short chain fatty acids) kyseliny octové 62%, propionové 25%, máselné 16% a za tvorby CO 2, H 2 a CH 4. Bakteriálním kvašením tak může být metabolizováno až 75% dietní vlákniny, která prochází tlustým střevem. (27) Kyselina propiónová má inhibiční účinek na jaterní 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreduktázu, klíčový enzym při syntéze cholesterolu. Přídavkem vlákniny ke stravě v experimentu na zvířatech bylo prokázáno snížení aktivity tohoto enzymu. Kvašením pektinu dochází k nejvyšší produkci mastných kyselin s krátkými řetězci. (28) Z metabolických a nutričních poruch se nedostatek vlákniny podílí na vzniku obezity, rozvoji diabetu typu 2 a hyperlipidémii. Největší účinek na snížení plazmatického cholesterolu má rozpustná vláknina (např. pektin, guarová guma). Tento pozitivní vliv je vysvětlován vychytáváním žlučových kyselin a jejich vylučováním stolicí, čímž dochází ke zvýšené tvorbě žlučových kyselin z cholesterolu v játrech a k poklesu celkových zásob cholesterolu v organismu. Vláknina mechanismem vazby žlučových kyselin přerušuje jejich 20

21 enterohepatální cyklus a vede k mírnému poklesu cholesterolémie a ke snížení absorbce tuků z potravy. (29) Dietní vláknina také působí na metabolismus sacharidů, přičemž se uplatní vliv vlákniny zpomalením pasáže potravy, inaktivací amylázy a ovlivněním výdeje hormonů GIT. Pektin brzdí absorpci sacharidů z tlustého střeva do krve, čímž upravuje kolísání krevního cukru. Vláknina redukuje sekreci inzulínu tím, že zpomaluje střevní absorpci cukrů. Studie naznačují, že při dietě s vysokým obsahem vlákniny se zvyšuje senzitivita na inzulín. Podle výsledků studie CARDIA (The Coronary Artery Risk Development in Young Adult) lze konstatovat, že dostatečný příjem vlákniny snižuje riziko kardiovaskulárních chorob významněji než změny v množství a druhů lipidů přijímaných v potravě. (30) MDOC oxidovaná celulóza Celulóza je polyanhydroglukóza, tvořená jednotkami β -D-glukopyrynózy vázaných vazbou β-1,4 v přímé řetězce. Jemně rozptýlený, bílý nebo krémově bílý až mírně nažloutlý prášek se slabým zápachem po spálení. (31) Základem oxidované celulózy je anhydroglukuronová kyselina, která vzniká oxidací primární hydroxylové skupiny vázané na 6. uhlíku β-d-glukopyranózy. Oxidovaná celulóza může být popsána jako náhodný (statistický) kopolymer, který se skládá s anhydroglukózy a kyseliny anhydroglukuronové obecného vzorce, kde n značí stupeň polymerace, x průměrný stupeň oxidace celulózy <0,1>: [(C 6 H 10 O 5 ) 1-x (C 6 H 8 O 6 ) x ] n Když x=0 jedná se o čistou celulózu, x=1 jedná se o plně oxidovanou celulózu. X=0,5 poměr oxidované k čisté celulóze je 1:1 a můžeme ji označit vzorcem: CH 2 OH OH O O OH OH * O O O * OH COOH n 21

22 Oxidovaná celulóza, sodnovápenatá sůl, je nerozpustná v běžných organických rozpouštědlech a ve zředěných minerálních kyselinách. Je částečně rozpustná ve vodě, rozsah rozpustnosti záleží na stupni polymerizace. Je rozpustná ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a v některých speciálních rozpouštědlech známých jako rozpouštědla celulózy (jako je například Schweizerovo činidlo, roztok amoniakálního oxidu mědi). (32) 2.3. Myší modely Myši jsou velmi rozšířeným modelem ke studiu aterosklerózy. Normální myši wild type nevyvíjejí léze spontánně. Pokud jsou některé jejich kmeny krmeny dietou obohacenou o žlučové kyseliny a cholesterol, dochází u nich k vývoji atypických aterosklerotických lézí typu tukových proužků. Nadměrným podáváním žlučových kyselin trpí myši chronickým zánětem. Toto není moc srovnatelné s lidskou situací, což tento model v používání vylučuje. (33) Dnes se využívají především různě geneticky upravené kmeny, které vyvíjejí léze buď spontánně (apoe KO myši vyšlechtěné a popsané v roce 1992), nebo po indukci tukovou dietou (LDL KO myši vyšlechtěné a popsané v roce 1993). (34) Kmen myší s cílenou inaktivací apoe, ligandu pro LDL receptor, vyvíjí spontánní hyperlipidémii především VLDL typu a zvýšené cholesterolové hladiny na nízkocholesterolové/nízkotučné dietě. Hladiny cholesterolu jsou 4 až 5krát vyšší oproti normálu. ApoE KO myši vyvíjejí léze všech fází s morfologickými charakteristikami blízce podobnými člověku na stejných místech cévního stromu. Kolem čtvrtého až pátého týdne věku se u ApoE KO myši na těchto k ateroskleróze predisponovaných místech nalézá zvýšená endoteliální exprese VCAM-1. Během šestého až osmého týdne věku se začínají objevovat léze typu tukových proužků. (35) LDL-receptor KO myši mají genetický defekt LDL receptoru, což je nejlépe zdokumentovaná příčina vývoje předčasné aterosklerózy u člověka. Pokud jsou tyto myši udržovány na normální dietě, vyvíjejí jen malé patologické změny a mají jen asi dvakrát zvýšené plasmatické hladiny cholesterolu. (36) Pokud jsou však krmeny aterogenní (tukovou/cholesterolovou) dietou, vykazují masivní zvýšení hladin palzmatického cholesterolu. Rychle u nich vznikají signifikantní tukové proužky s nekrotickým centrem naplněným lipidy. Fibrózní léze nevyvíjejí. 22

23 Více poznatků o kinetice vývoje lézí je u apoe KO myší než u LDL R KO myší. Nicméně léze, které se vyvíjí u obou kmenů, jsou obecně stejné. Vývoj začíná v proximální aortě a rozšiřuje se směrem k aortě distální. Na bázi těchto dvou kmenů bylo vyvinuto a neustále se vyvíjí spousta dalších transgenních či knockout kmenů pro studium genetických závislostí, lipoproteinového metabolismu a vývoje aterosklerotické léze. (34) Myši mají rozdílnou distribuci cholesterolu do lipoproteinových tříd oproti člověku, což může být důvodem toho, že se u wild type myší nevyvíjí ateroskleróza. Dále pak nemají cholesteryl ester transfer protein (CETP) a lipoprotein (a). Jako u ostatních hlodavců se spontanní ruptura plaku u apoe KO myší nevyskytuje. Pravděpodobně je to způsobeno nižším shear stresem působícím na arteriální stěnu a/nebo absencí rizikových faktorů (kouření, hypertenze, diabetes...) Avšak tato situace se studuje a vyvíjí se přesně definované postupy vedoucí ke vzniku nestabilních lézí a rupturám (nejčastěji v arteria brachiocephalica). (37) 23

24 3. Cíl práce 24

25 Cílem této diplomové práce bylo ověřit potenciální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC na experimentalním zvířecím modelu, kterým byly apoe-deficientní myši. K tomu byly sledovány parametry lipidového spektra v krvi a exprese VCAM-1 v cévním endotelu. K hodnocení morfologických nálezů byly použity imunohistochemické a stereologické metody. 25

26 4. Experimentální část 26

27 4.1. Zvířata a předepsaná dieta Samci myši kmene C57BL/6J s deficitem apolipoproteinu E (apoe -/- ), vážící gramů, byli laskavě poskytnuti Prof. Polednem (IKEM, Praha, Česká Republika) a ustájeni v SEMEDu (Praha, Česká Republika). Všechny myši byly v 5-ti týdnech života odstaveny od matky, náhodně rozděleny do 2 skupin. ApoE deficientní myši (n=8) byly krmeny po odstavení aterogenní dietou s obsahem 1,25% cholesterolu po dobu 4 týdnů (kontrolní skupina). V MDOC skupině byly myši krmeny stejnou aterogenní dietou, ke které bylo přidáváno 50 mg/kg MDOC denně. Každá z myší v MDOC skupině byla chována v samostatné kleci. Dostávaly denně 6 g potravy (ve speciálně upravených granulích) a měly volný přístup k vodě po celou dobu studie. Během experimentu nebyly nalezeny změny tělesné hmotnosti v souvislosti se spotřebou potravy. Na konci experimentu byla zvířata přes noc vylačněna a byla provedena euthanasie předávkováním v parách éteru. Zvířatům byly odebrány ze srdce vzorky krve pro biochemické vyšetření. Dále byly odebrány segmenty tkáně tvořené aortou spolu s horní polovinou srdce. Tyto segmenty se ponořily do OCT media (Leica, Praha, Česká republika), následně byly zmraženy v tekutém dusíku a uskladněny při 80 C Biochemická analýza Celkové koncentrace cholesterolu byly hodnoceny enzymaticky na základě konvenčních diagnostických metod (Lachema, Brno, Česká republika) a spektrofotometrické analýzy (cholesterol v 510 nm, triglyceridy v 540 nm vlnové délky) (ULTROSPECT III, Pharmacia LKB biotechnologie, Uppsala, Švédsko) Imunohistochemie Imunohistochemická a stereologická analýza byla provedena v 1 cm aortálního sinu a části aortálního oblouku. Pro hodnocení byly nakrájeny série příčných řezů o tloušťce (7 µm) na zmrazovacím mikrotomu. Řezy byly přeneseny na sklíčka, která byla předem upravena v roztoku želatiny. Řezy se nechaly oschnout (60 minut) a pak se na 15 minut vložily do roztoku acetonu uchovávaného v 20 C. Poté se řezy nechaly usušit (15 minut) a znovu se vložily na 15 minut do acetonu. Tímto procesem došlo k fixaci řezů a jejich lepší adhezi na podložní sklíčko. Dále se řezy po 15 minutovém usušení vložily na 10 minut do destilované vody, následně se vložily do roztoku PBS (2x5 minut). Před inkubací řezů 27

28 s primární protilátkou bylo nutné ještě zablokovat nespecifická vazebná místa, proto se řezy na 30 minut ponořily do roztoku 10% goat séra v PBS (sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Německo). V další fázi byly na sklíčka napipetovány roztoky anti avidinu a anti biotinu, které byly použity k zablokování reaktivity těchto látek v myší tkáni. Sklíčka se pak 1 hodinu inkubovaly s primární protilátkou při pokojové teplotě. Poté se řezy vložily do roztoku PBS (2x5minut), dále do roztoku 3% H 2 O 2 (15 minut). Po oplachu v PBS (2x5minut) se řezy inkubovaly se sekundární protilátkou (30 minut) goat anti-hamster IgG a goat anti-rat IgG (Vector Laboratories), které byly značeny biotinem a opět se řezy vložily do roztoku PBS (2x5 minut). Dále byl na sklíčka nanesen avidin-biotinový komplex obsahující peroxidázový substrát (Vector Laboratoriem). K vizualizaci navázaných protilátek se použil diaminobenzidin (DAB substrát-chromogen roztok, DAKO, Carpinteria, USA). Na závěr byly řezy opláchnuty ve vodě a poté odvodněny v acetonu, aceton xylenu (10:1) asi 3 minuty, aceton xylenu (1:10) také 3 minuty, 3x v xylenu ( po 2 minutách) a sklíčka zamontována do eukittu. Byly použity následující primární protilátky: monoklonální protilátka Rat Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) zředění 1/100 monoklonální protilátka Rat Anti-Mouse CD106 (VCAM-1) zředění 1/100 Všechny protilátky byly zakoupeny ve firmě BD Pharmingen (California, USA) Pracovní postup: oschnutí řezů 60 minut fixace v acetonu (uschovaný v -20 stupních) 15 minut usušení 15 minut PBS 10 minut 10% zvířecí sérum v PBS (900 μl PBS μl séra) 30 minut inkubace s avidin D 15 minut oplach v PBS 5 minut inkubace s biotinem 15 minut PBS oplach primární protilátka (ředí se v BSA) 60 minut PBS 1 2x5 minut 10% sérum v PBS (900 μl PBS μl séra) 15 minut sekundární protilátka (+ mouse serum v PBS) 30 minut 28

29 PBS 3 5 minut 3% H (8 ml H ml H 2 0) 15 minut PBS 4 2x5 minut ABC komplex elite 30 minut PBS 5 5 minut DAB (podle návodu) destilovaná voda aceton aceton-xylen (10:1) aceton-xylen (1:10) 3x xylen nutno určit čas oplach oplach 3 minuty 3 minuty 2 minuty Eukitt montování krycího sklíčka Kvantitativní analýza imunohistochemie a velikost lézí Plochy endoteliální exprese VCAM-1 a PECAM-1 byly kvantifikovány pomocí stereologických metod. (38) Nejprve se nakrájela série řezů o tloušťce 7 µm (0,385 mm dlouhé úseky cévy tvořící tzv. referenční objem). Byl proveden systematický náhodný výběr řezů z referenčního objemu. První řez byl pro každé imunohistochemické barvení vybrán náhodně, a pak se vybral každý jedenáctý řez, takže bylo pro každé barvení použito pět řezů ke stereologickému odhadu. Byla použita metoda bodové testovací mřížky, která se zvolila tak, abychom napočítali více než 200 průsečíků mezi body sítě a aterosklerotickým plátem na jednu cévu. (39) Odhadovaná plocha aterosklerotické léze se vypočetla podle vzorce: esta = a P kde parametr a charakterizuje plochu příslušející jednomu testovacímu bodu a P je počet průsečíků mezi body testovací sítě a aterosklerotickou lézí. Protilátka PECAM-1 byla použita jako marker přítomnosti endotelu. Takže plocha exprese VCAM-1 v endotelu byla vztažena k expresi PECAM-1 a vypočítána jako: area( x) estp = 100% area( PECAM ) kde x je plocha VCAM-1 v endotelu a plocha PECAM je plocha PECAM-1 v endotelu. Fotodokumentace a digitalizace z mikroskopu byla provedena mikroskopem Nikon Eclipse E2000, digitální kamerou Pixelink PL-A642 (Vitana Corp. USA) a za pomoci 29

30 softwaru LUCIA verze 4.82 (Laboratory Imaging Prague, Česká republika). Stereologická analýza byla hodnocena softwarem PointGrid ELLIPSE (ViDiTo, Slovensko) Statistická analýza Všechny hodnoty v grafech jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM (střední chyba průměru) pro 8 zvířat v každé skupině. Ke vzájemnému porovnání parametrů u MDOC a kontrolní skupiny byl použit nepárový T test. Rozdíly mezi skupinami byly statisticky významné v případě, že p α, kde α=0,05. K výpočtu byl použit GraphPad Prism software (verze 4.0). 30

31 5. Výsledky 31

32 5.1. Biochemická analýza U všech myší v experimentu byly stanoveny hladiny celkového cholesterolu a jednotlivých lipidových frakcí. Výsledky ukázaly, že podávání MDOC neovlivnilo hladiny celkového cholesterolu, VLDL cholesterolu ani triacylglycerolů. Naproti tomu jsme zaznamenali statisticky významné snížení hladin LDL cholesterolu a rovněž statisticky významné zvýšení hladiny HDL cholesterolu (viz obr. 7). Obrázek 7. Lipidový profil u kontrolních a MDOC krmených myší. Čtyřtýdenní podávání MDOC statisticky významně snížilo hladiny LDL cholesterolu ( * P 0,05) a zvýšilo hladiny HDL cholesterolu ( x P 0,05). 32

33 5.2. Imunohistochemie Imunohistochemické barvení VCAM-1 v oblasti aortálního sinu V oblasti aortálního sinu a oblouku nebyly u žádné z myší přítomny aterosklerotické léze nebo jiné morfologické abnormality. Exprese PECAM-1 byla zjištěna v endotelových buňkách ve všech skupinách myší. Tato protilátka byla použita jako standard pro detekci intaktního endotelu, protože její exprese by neměla být změněna při změnách hladin cholesterolu. Exprese VCAM-1 byla pozorována převážně v endotelu aorty u obou skupin zvířat. Pouze velmi slabá exprese byla nalezena v kapilárách okolního myokardu. Barvení VCAM-1 bylo v obou skupinách velmi podobné svou lokalizací a také intenzitou z čehož lze usuzovat, že podávání MDOC neovlivnilo expresi VCAM-1 v endotelu zkoumaného úseku aorty (viz obr. 8). Obrázek 8. Exprese VCAM-1 na endotelu v oblasti aortálního sinu u kontrolní (A) a MDOC skupiny (B). Z obrázku je patrná stejná lokalizace a téměř identická intenzita barvení u obou skupin. Zvětšení 100x. 33

34 Stereologická analýza exprese VCAM-1 u ApoE deficientních myší Stereologická analýza imunohistochemického barvení cév ze všech zvířat ukázala, že podávání MDOC signifikantně neovlivnilo expresi VCAM-1 v aortálním oblouku. Z grafu vyplývá že exprese VCAM-1 byla u MDOC skupiny statisticky nevýznamně zvýšena. (viz obr. 9). Obrázek 9. Plocha VCAM-1 exprese v aortálním sinu a oblouku. Endoteliální exprese VCAM-1 byla po podání MDOC mírně zvýšena. VCAM mm kontrolní skupina 34 MDOC skupina

35 6. Diskuze 35

36 Ateroskleróza jako chronické zánětlivé onemocnění je velice rozšířeným onemocněním. Určitým způsobem postihuje všechny věkové skupiny obyvatelstva. Klinické příznaky aterosklerózy, které se ve většině případů objevují až v pozdějších letech života, jsou dnes velmi frekventované a ateroskleróza je v současné době příčinou téměř 50 % všech úmrtí. Rozsáhlý výzkum v oblasti aterosklerózy odhalil v posledních letech řadu nových poznatků přispívajících k pochopení dějů, ke kterým dochází během aterogenního procesu. Mnohé poznatky týkající se aterogenního procesu zdůrazňují úlohu zánětlivé reakce v procesu aterogeneze. (40) Od roku 1986 se vědecké skupiny v různých laboratořích snažily vyvolat aterosklerózu u myší za účelem zavedení nového zvířecího modelu. Myši jsou obvykle vysoce rezistentní vůči ateroskleróze. Při příjmu běžné stravy mají nízkou hladinu celkového cholesterolu a vyšší hladinu protektivního HDL cholesterolu, tudíž se u nich nevyvíjejí aterosklerotické léze. Ovšem pokud jsou myši krmeny stravou s vysokým podílem cholesterolu a tuků, která též obsahuje žlučové kyseliny, hladina jejich celkového cholesterolu roste a po několika měsících se u vybraných kmenů myší začnou tvořit vrstvy pěnových buněk, zejména v subendotelu cév v okolí aortálního sinu. (41) Ačkoli se tento model zprvu vyvíjel slibně, měl dva zásadní problémy. Oproti lidským aterosklerotickým lézím, které se vyskytují ve větvích hlavních cév, kde pláty progredují, myší léze jsou malé a vyskytují se pouze v oblastech aortálního oblouku a nedochází k jejich progresi. Strava, kterou jsou myši krmeny, je nefyziologická, obsahuje 10 20x více cholesterolu a žlučových kyselin. Tato strava vyvolá chronický zánět pouze u citlivých kmenů myší, nikoli u kmenů ateroskleroticky rezistentních, což zvyšuje možnost dohadu, že genetické rozdíly mezi danými kmeny myší jsou dány spíše rozdíly v reakci na podanou stravu. V roce 1992 použily dvě laboratoře speciální genovou technologii, která dala vzniknout myším deficientním v apolipoproteinu E (apoe). (34) ApoE jsou tvořeny primárně v játrech a mají na svém povrchu základní lipoproteinové částice a ligandy pro rozpoznání lipoproteinů a také pro clearance lipoproteinových receptorů. ApoE deficientní myši mají zpožděné vylučování lipoproteinů a při nízkocholesterolové stravě hladina jejich cholesterolu stoupá jako důsledek akumulace chylomikronů a VLDL zbytků, obohacených esterifikovaným i volným cholesterolem. U těchto myší se vyvíjejí nejen lipidní proužky, ale také fibromuskulární pláty, typické pro aterosklerózu u lidí. Tyto léze se formují v aortě, v břišní aortě, v hlavních větvích karotid, interkostálních, mesenterických, renálních a iliálních arteriích a také v proximálních částech koronárních, femorálních a podklíčkových arterií. 36

37 Lipidní proužky se objevují po deseti týdnech, léze obsahující pěnové buňky a hladkosvalové buňky se objevují po patnácti týdnech. Fibromuskulární pláty jsou patrné po dvaceti týdnech, obsahují nekrotické jádro a fibromuskulární čepičku z hladkosvalových buněk obklopených elastickými vlákny a kolagenem. U starších myší se fibromuskulární pláty vyvíjejí, u pokročilých lézí je patrná destrukce buněk medie s příležitostným vývojem aneuryzmat. Rozsáhlá proliferace fibrózní tkáně může zúžit lumen cévy, či dokonce způsobit její úplnou okluzi. Komplikované léze charakterizované trombózou se však nevyskytly. (42) V terapii hyperlipidemií a cévních komplikací (aterosklerózy) jsou dnes asi nejvýznamnějšími léky statiny. Nicméně bylo také prokázáno, že podávání dietní vlákniny má pozitivní vliv na kardiovaskulární systém a to včetně hladiny cholesterolu. (24) Dietní vláknina je tvořena poživatelnou částí rostlinných nebo obdobných sacharidů, které jsou rezistentní trávení a absorpci v lidském tenkém střevě s kompletní nebo částečnou fermentací v tlustém střevě. Dietní vláknina se vyskytuje v zelenině, ovoci, obilninách a dřevě. (25) Vlákninu můžeme rozdělit na nestravitelné oligosacharidy (inulin), trávení rezistentní škrob, nerozpustnou dietní vlákninu (celulóza, beta-glukany), a rozpustnou dietní vlákninu (pektin) (viz kapitola 2.2). Vláknina vykazuje řadu pozitivních účinků, ke kterým patří pozitivní vliv na trávicí procesy, např. urychlí střevní pasáž, pozitivně podporuje peristaltiku, absorbuje vodu, změkčí stolici, působí prevenci divertiklů a zácpy, podílí se na absorbci toxických látek. Mezi velmi důležité účinky patří také vliv na metabolismus živin. Rozpustná dietní vláknina se podílí na snížení resorpce tuků, snížení zpětné resorpce žlučových kyselin, snížení energetického obsahu diety, zpomalení resorpce sacharidů, snížení glykémie a insulinémie, potlačení syntézy cholesterolu v játrech zvýšením přívodu kyseliny propionové portálním oběhem do jater. (26) MDOC tedy modifikovaná oxidovaná celulosa je chemicky de facto polyanhydroglukuronová kyselina. Svými vlastnostmi se pravděpodobně může řadit mezi rozpustnou vlákninu. Tato diplomová práce byla tedy zaměřena na sledování účinků MDOC, podávané apoe-deficientním myším krmeným také aterogenní dietou. V této diplomové práci jsme ukázali, že 8 týdenní aplikace MDOC apoe deficientním myším má za následek signifikantní snížení LDL cholesterolu. Dále bylo zjištěno, že MDOC významně zvyšuje hladinu HDL cholesterolu. Tyto výsledky jsou shodné s prací autorů Trias et al., kteří popsali stejné účinky na potkanech krmených guarovou gumou, což je jiná rozpustná vláknina. (43) 37

38 U lidí i u zvířat bylo prokázáno, že rozpustná vláknina snižuje hladinu LDL cholesterolu. (44) (45) (46). Ale mnoho studií o rozpustné vláknině dokázalo, že společně s redukcí LDL cholesterolu klesá i HDL cholesterol, což je nežádoucí efekt. Snížená hladina HDL cholesterolu totiž nepřímo koreluje s výskytem koronární srdeční příhody. (43; 47-49) Avšak na druhou stranu existuje i řada studií, ve kterých byla prokázáno, markantní zvýšení HDL cholesterolu, zejména ve studiích s potkany, kterým byla podávána dieta s přídavkem (50; 51) rozpustné vlákniny. Naopak endoteliální exprese zánětlivých ukazatelů zúčastněných na počátku aterogeneze, VCAM-1 nebylo po podávání MDOC ovlivněno. VCAM-1 je silně exprimován v endotelu náchylnému k rozvoji aterosklerózy u takového modelu, jako jsou apoe deficientní myši (apoe -/- ), LDL receptor deficientní myši (LDL-R -/- ) a králíci, který je krmen aterogenní dietou. (52) Bohužel, bylo prokázáno (53; 54), že endoteliální exprese VCAM-1 u myší nedostatečně koreluje s hladinou cholesterolu, jako tomu tak je u králíků. (55) Tudíž v této práci změna hladiny cholesterolu není pravděpodobně adekvátní změně VCAM-1 jak v krvi, tak v cévní stěně. 38

39 7. Závěr 39

40 Tato diplomová práce se zabývala existencí potencionálních hypolipidemických a protizánětlivých účinků modifikované oxidované celulózy, MDOC. Výsledky ukázaly na pozitivní vliv MDOC na hladiny LDL a HDL cholesterolu. Na druhou stranu nebyl prokázán vliv na celkový a VLDL cholesterol. Stereologická analýza imunohistochemického barvení dále prokázala že endoteliální exprese VCAM-1 není po podávání MDOC ovlivněna. Dosavadní výsledky studií s MDOC ukazují na jeho potenciální hypolidemické účinky u apoe-deficientního modelu aterosklerózy. Další studie však musí být zaměřeny na ověření mechanizmu účinku MDOC, na jeho vliv na aterogenní proces u pokročilejších aterosklerotických plátů a případnou kombinaci s jiným hypolipidemikem. 40

41 8. Abstrakt 41

42 Ateroskleróza patří mezi kardiovaskulární onemocnění, které tvoří v posledních letech nejčastější příčinu morbidity a mortality ve všech ekonomicky vyspělých zemích Evropy a USA. Cílem této diplomové práce bylo zjistit potencionální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC jako nové potenciální substance patří do skupiny dietární vlákniny. Ve studii byl použit geneticky modifikovaný kmen ApoE deficientní myši (n=8), které byly krmeny po odstavení aterogenní dietou s obsahem 1,25% cholesterolu po dobu 4 týdnů (kontrolní skupina). V MDOC skupině byly myši krmeny stejnou aterogenní dietou, ke které bylo přidáváno 50 mg/kg MDOC denně. Zvířatům byly odebrány ze srdce vzorky krve pro biochemické vyšetření. Dále byly odebrány segmenty tkáně tvořené aortou spolu s horní polovinou srdce. Dále byla provedena biochemická analýza krve a imunohistochemická a stereologická analýza endoteliální exprese VCAM-1 v aortálním sinu a oblouku. Výsledky biochemické analýzy ukázaly, že podávání MDOC neovlivnilo hladiny celkového cholesterolu, VLDL cholesterolu ani triacylglycerolů. Naproti tomu jsme zaznamenali statisticky významné snížení hladin LDL cholesterolu a rovněž statisticky významné zvýšení hladiny HDL cholesterolu. Imunohistochemická detekce exprese VCAM-1 byla pozorována převážně v endotelu aorty u obou skupin zvířat. Pouze velmi slabá exprese byla nalezena v kapilárách okolního myokardu. Barvení VCAM-1 bylo v obou skupinách velmi podobné svou lokalizací a také intenzitou z čehož lze usuzovat, že podávání MDOC neovlivnilo expresi VCAM-1 v endotelu zkoumaného úseku aorty. Stereologická analýza imunohistochemického barvení cév ze všech zvířat ukázala, že podávání MDOC signifikantně neovlivnilo expresi VCAM-1 v aortálním oblouku. Exprese VCAM-1 byla u MDOC skupiny statisticky nevýznamně zvýšena. Tato diplomová práce se zabývala existencí potencionálních hypolipidemických a protizánětlivých účinků modifikované oxidované celulózy, MDOC. Výsledky ukázaly na pozitivní vliv MDOC na hladiny LDL a HDL cholesterolu. Stereologická analýza imunohistochemického barvení dále prokázala že endoteliální exprese VCAM-1 není po podávání MDOC ovlivněna. Dosavadní výsledky studií s MDOC ukazují na jeho potenciální hypolidemické účinky u apoe-deficientního modelu aterosklerózy. Další studie však musí být zaměřeny na ověření mechanizmu účinku MDOC, na jeho vliv na aterogenní proces u pokročilejších aterosklerotických plátů a na případnou kombinaci s jiným hypolipidemikem. 42