Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Senzorické hodnocení nápojů s probiotickou kulturou Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Hana Šulcerová Vypracovala: Bc. Šárka Pícková Brno 2009

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Senzorické hodnocení nápojů s probiotickou kulturou vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně, dne... Podpis diplomanta. Šárka Pícková

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji paní Ing. Haně Šulcerové za odborné vedení při tvorbě diplomové práce, za cenné rady a připomínky. Dále děkuji Ing. Aleně Šulcové za pomoc při statistickém zpracování a kolektivu ústavu technologie potravin MZLU v Brně za senzorické hodnocení nápojů s probiotickou kulturou.

4 ABSTRAKT Cílem diplomové práce na téma Senzorické hodnocení nápojů s probiotickou kulturou bylo zjistit změny senzorické jakosti a ph u nápojů s probiotickou kulturou během skladování. Práce je rozdělena na dvě části a to část teoretickou a praktickou. První částí je literární rešerše na dané téma. Obsahuje základní informace o osídlení gastrointestinálního traktu mikroorganismy, o funkčních potravinách, jsou zde vysvětleny pojmy probiotika, prebiotika a symbiotika, je zde uveden význam probiotik, mikroorganismy s probiotickými účinky a kritéria pro jejich výběr. Dále je zde uvedena výroba kysaných mléčných výrobků a jejich rozdělení, změny, ke kterým dochází v průběhu fermentace, vznik aromatických látek a hygiena výroby kysaných mléčných výrobků. Jsou zde popsány i senzorické vady mléka a kysaných mléčných výrobků a senzorické požadavky na kysané mléčné výrobky. Následně jsou vysvětleny mechanismy účinku kysaných mléčných výrobků s probiotickou kulturou na lidské zdraví a uvedeny probiotické mikroorganismy s prokázaným vlivem na jednotlivé druhy onemocnění. Část literární rešerže se zabývá podmínkami a metodami senzorické analýzy. V praktické části byly senzoricky hodnoceny nápoje s probiotickou kulturou, Revital Aktive a Joghurt Drink, firmy Olma a.s., v průběhu skladování. Dále byla v průběhu skladování sledována změna ph. Získané výsledky byly statisticky vyhodnoceny pomocí analýzy rozptylu a metody mnohonásobného porovnání dle Tukey B testu. Změny deskriptorů u jednotlivých vzorků v průběhu skladování byly graficky znázorněny pomocí paprskových grafů. Klíčová slova: probiotika, kysané mléčné výrobky, Olma, senzorická analýza, ph

5 ABSTRACT The aim of diploma thesis on the theme the Sensory analysis of fermented dairy beverages with probiotics was to find out changes of sensory quality and ph in fermented dairy beverages with probiotics during storage. The diploma thesis is devided into two parts, namely the theoretic and the practical part. The first part is the background research on the topic. It includes the basic information about colonisation of gastrointestinal tract with microorganisms, about functional foods, there are defined concepts probiotics, prebiotics and symbiotics, introduced meaning of probiotics, microorganisms with probiotic effect and criteria for their selection. Further there is mentioned the production of fermented dairy products, their division, changes, which happen during fermentation, rise of aromatic compounds, and the hygiene of production of fermented dairy products. There are also described sensory defects of milk and fermented dairy products and senzory requirements on fermented dairy products. Mechanisms of effect of fermented dairy products with probiotics on human health and probiotic microorganisms with proved effect on individual kind of diseases are mentioned here as well. The part of background research deals with the conditions and methods of sensory analysis. In practical part during their storage beverages with probiotics, Revital Aktive and Joghurt Drink produced by Olma a.s., were evaluated. Furthermore, change of ph was observed. Obtained results were statistically evaluated via the analysis of variance and the method of multiple comparison according to Tukey B test. The changes of descriptors were graphically demonstrated on ray graphs. Key words: probiotics, fermented dairy products, Olma, sensory analysis, ph

6 OBSAH 1 ÚVOD 9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED Gastrointestinální trakt Funkční potraviny Probiotika Definice probiotik Význam probiotik Mikroorganismy s probiotickými účinky Kritéria pro výběr probiotik Koncentrace probiotik Faktory ovlivňující množství probiotik ve výrobku Legislativa a probiotika Prebiotika Oligosacharidy používané jako prebiotika Účinky prebiotik na lidské zdraví Symbiotika Kysané mléčné výrobky Bilance kysaných mléčných výrobků Výroba kysaných mléčných výrobků Rozdělení kysaných mléčných výrobků Změny kysaných mléčných výrobků během fermentace Vliv probiotické kultury na lidské zdraví Produkce vitaminů Stimulace imunitního systému Kolorektální karcinom Jaterní encefalopatie Snižování hladiny cholesterolu Idiopatické střevní záněty Průjmovité onemocnění Syndrom dráždivého tračníku Vaginální infekce Močové infekce Atopická dermatitida 36

7 Laktózová intolerance Senzorická analýza Podmínky pro senzorické hodnocení Hodnotitelé Doba a délka hodnocení Vlastní senzorické hodnocení Hlavní metody senzorické analýzy Senzorické vady mléka Senzorické požadavky na kysané mléčné výrobky Senzorické vady kysaných mléčných výrobků CÍL PRÁCE 49 4 MATERIÁL A METODY Materiál Metody Senzorická analýza Zpracování výsledků Stanovení ph vzorku VÝSLEDKY A DISKUZE Senzorické hodnocení Revital Aktive Yoghurt Drink Statistické vyhodnocení Analýza rozptylu Mnohonásobné porovnání dle Tukey B testu Vyhodnocení stanovených hodnot ph DISKUZE ZÁVĚR 86 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TAKULEK PŘÍLOHY

8 1 ÚVOD Jedním z důležitých faktorů, které ovlivňují lidské zdraví je bezesporu výživa. V posledních letech se společnost stále více snaží zlepšit svůj zdravotní stav a předcházet chronickým degenerativním onemocněním právě vhodným výběrem potravin. Proto se na funkční potraviny soustřeďuje mimořádná pozornost. Konzumace těchto potravin ovlivňuje určité pochody v organismu, zejména posiluje obranné mechanismy proti škodlivým vlivům prostředí, působí preventivně proti nemocem, příznivě ovlivňují fyzický a duševní stav či zpomaluje proces stárnutí. Mezi funkční potraviny řadíme i mléčné výrobky s probiotickou kulturou, které se mezi spotřebiteli stávají čím dál více oblíbené. Pod pojmem probiotikum rozumíme živé mikroorganismy přidávané do potravin, které příznivě ovlivňují zdraví konzumenta zlepšením rovnováhy střevní mikroflóry. V posledních desetiletích se dynamicky rozvíjí výzkum probiotik a jejich využití při výrobě funkčních potravin. Při senzorickém hodnocení se stanovují organoleptické vlastnosti výrobku výhradně lidskými smysly. Jedná se o nejstarší způsob kontroly jakosti. Během fermentace kysaných mléčných výrobků dochází mikrobiální degradaci sacharidů, citrátů, lipidů a proteinů mléčných surovin a tím se zlepšuje nejenom vstřebatelnost a využitelnost jednotlivých složek mléka, ale také dochází k vzniku aromatických látek, které dávají kysaným mléčným výrobkům charakteristické organoleptické vlastnosti. Dochází ke vzniku mnoha látek, které mohou ovlivnit chuť, vůni i texturu finálního výrobku jak pozitivním, tak i negativním způsobem. Za podstatné senzoricky aktivní látky vznikající během fermentace se považuje etanol, acetoin, 2,3-butandiol, mastné kyseliny s krátkým řetězcem, laktony, metylketony, aldehydy, pyraziny, sirné sloučeniny a estery. Chuť, vůně, textura a barva kysaných mléčných výrobku může být dále ovlivněna technologickým postupem, kvalitou mléka a mikroorganismů, kontaminací či podmínkami skladování. Pro spotřebitele mají senzorické vlastnosti výrobku prvořadý význam. Proto je při vývoji nových potravinářských výrobků tato stránka jakosti velmi důležitá. 9

9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Gastrointestinální trakt (GIT) Gastrointestinální trakt je biologicky velice aktivní. Nachází se v něm většina tkání, které slouží jako nositelé imunity. Proto jeho stav významně ovlivňuje zdravotní stav jedince. Sliznice trávicího traktu je vystavena složkám tráveniny včetně mikroorganismů, které se dostávají do těla zvenčí společně s potravou, tudíž je trávicí trakt citlivý vůči onemocněním (KALAČ, 2003). Vedle exogenních mikroorganismů je složení intestinální mikroflóry ovlivněno také stářím, pohlavím, podnebím, dietou, stresem, tělesnou kondicí, a imunitním systémem hostitele. GIT dospělého člověka obsahuje asi živých bakterií (KVASNIČKOVÁ, 2000; MAXA a RADA, 2002). Žaludek U zdravého člověka je žaludek osídlen bakteriemi jen velmi málo. Bakterie přicházejí do žaludku se slinami z dutiny ústní. Vysoce kyselé žaludeční šťávy většinu mikroorganismů ničí. Ze žaludeční šťávy mohou být izolovány grampozitivní bakterie, jako jsou laktobacily a streptokoky a kvasinky. Jejich počet se pohybuje mezi 10 1 až 10 2 na jeden mililitr žaludeční šťávy (MAXA a RADA, 1996). Tenké střevo Počátek tenkého střeva, nazývaný duodenum, je osídlen podobnou mikroflórou jako žaludek. Koncentrace mikroorganismů se zvyšuje na 10 2 až 10 4 v jednom mililitru tráveniny. Jejunum a ileum jsou již osídleny značně. V dolní části tenkého střeva se počet mikroorganismů pohybuje mezi 10 4 až 10 8 v jednom mililitru obsahu. Můžeme zde najít bakterie rodu Enterococcus, Enterobacter, Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Fusobacterium, Bacteroides a Clostridium (MAXA a RADA, 1996; SALMINEN, 1998; KVASNIČKOVÁ, 2000). Tlusté střevo Největší množství mikroorganismů se soustřeďuje do tlustého střeva, které je díky dostatku živin, vysokému obsahu vody a stálé teplotě velmi vhodným prostředím pro osídlení mikroorganismy. U dospělého člověka je tlusté střevo osídleno bakteriemi, které patří do asi 400 druhů systematických skupin. Celkový počet mikroorganismů se odhaduje na stovky bilionů. Část bakterií pravidelně opouští střevo stolicí a jejich populace se zase v krátké době obnovuje (KALAČ, 2003). Nejčastěji se zde vyskytují bakteroidy, eubakterie, bifidobakterie, laktobacily, klostridia, 10

10 peptokoky, peptostreptokoky a fusobakteria (SALMINEN, 1998; MAXA a RADA, 2002). Složení mikroflóry je ovlivněno množstvím a složením potravy, chemickým složením a využitelností živin pro příslušné bakterie a časem, za který projde trávenina. Po narození se vytváří skladba střevní mikroflóry. Prudce narůstá zastoupení enterokoků a bakterií E. coli. Narůstá zastoupení rodů Backteroides a Eubacterium, z pozitivní mikrofóry významně roste zastoupení rodu Lactobacillus a Bifidobacterium (GÖRNER a VALÍK, 2004). Bylo zjištěno, že po 65. roce života se složení mikroflóry tlustého střeva nepříznivě mění. Klesá počet bifidobakterií a bakterií mléčného kvašení a naopak se zvyšuje počet enterobakterií a klostridií (KALAČ, 2003). U kojenců tvoří bifidobakterie 90 % celkového počtu bakterií ve střevě, u zdravých dospělých se to pohybuje kolem 25 %, u starých osob dochází ke snížení na 10 % a u nemocných osob mohou vymizet úplně (MAXA a RADA, 2002). 2.2 Funkční potraviny V minulosti bylo formulováno několik definic, zatím však neexistuje všeobecně platná definice funkčních potravin. Nejsrozumitelněji tento pojem vymezil Goldberg: Funkční potraviny jsou takové potraviny, které mají kromě výživové hodnoty příznivý účinek na zdraví konzumenta, jeho fyzický či duševní stav. Jde tedy o potraviny mající v porovnání s běžnými potravinami zvýšený fyziologický účinek. Jsou vyrobené z přirozeně se vyskytujících složek. Měly by být konzumovány jako součást denní stravy. Konzumace těchto potravin ovlivňuje určité pochody v organismu, zejména posilují obranné mechanismy proti škodlivým vlivům prostředí, působí preventivně proti nemocem, příznivě ovlivňují fyzický a duševní stav či zpomalují proces stárnutí (KALAČ, 2003) Probiotika Probiotika patří mezi stále a velmi rychle se rozvíjející skupinu účinných složek funkčních potravin. Přidávají se nejčastěji do zakysaných mléčných výrobků, ale také do fermentovaných masných výrobků, ovocných a zeleninových šťáv a jiných potravin Definice probiotik Definice probiotik se vyvíjela. V současné době se nejčastěji používá Fullerova (1989) definice: Probiotika jsou živé mikroorganismy přidávané do potravin, které 11

11 příznivě ovlivňují zdraví jejich konzumenta zlepšením rovnováhy jeho střevní mikroflóry. Ukazuje se však, že nejenom živé mikroorganismy, ale i jejich neživé formy a určité složky buněčných stěn mikroorganismů pravděpodobně mohou ovlivňovat hostitele. Navrhuje se proto nová definice probiotik, která by tuto skutečnost zahrnovala (SALMINEN, 1999) Význam probiotik Žaludkem a tenkým střevem prochází trávenina příliš rychle, než aby se mohla uplatnit činnost mikroflóry. V tlustém střevě je však rychlost průchodu tráveniny podstatně nižší. Bakterie přítomné v tlustém střevě tak mohou štěpit složky potravy, které prošly tenkým střevem, aniž by byly stráveny. Ty se pro ně stávají zdrojem živin a energie. Mikroorganismy tlustého střeva o tyto substráty soutěží. Cílem přídavku vhodného probiotika je zvýšit četnost a tím i konkurenceschopnost takových mikroorganismů, které působí pozitivně na lidské zdraví (KALAČ, 2003). Nejintenzivnější ochranný účinek probiotik je odvozen od tvorby organických kyselin ze sacharidů a s tím spojený pokles hodnoty ph prostředí. Díky snižování ph střevního obsahu dochází k potlačení mnoha patogenních, podmíněně patogenních a hnilobných bakterií a snižuje se produkce amoniaku, fenolů, steroidních metabolitů a bakteriálních toxinů jako jsou biogenní aminy. Hnilobné střevní produkty mohou způsobovat průjmy, jaterní poruchy a selhání oběhového systému (MAXA a RADA, 2002). Bakterie mléčného kvašení produkují kyselinu mléčnou, propionibakterie kyselinu propionovou. Druhotný význam má produkce kyseliny mravenčí a benzoové některými mikroorganismy a oxidační působení peroxidu vodíku, který ve větším množství produkují především laktobacily. Důležitá je i tvorba speciálních antagonistických látek bakteriocinů. Jejich produkce je omezená jen na některé kmeny určitého druhu, např. Lc. lactis, který produkuje bakteriocin zvaný nisin (GÖRNER a VALÍK, 2004) Mikroorganismy s probiotickými účinky Bakterie s probiotickými účinky, které se používají při výrobě mléčných výrobků, patří do skupiny bakterií mléčného kvašení (BMK) a bifidobakterií. Spadají sem druhy rodů Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, 12

12 Enterococcus a Bifidobacterium. K nejčastěji používaným druhům, plnících funkci probiotika v mléčných výrobcích, patří Lb. acidophilus, Lb. rhamanosus a B. bifidum. Jako probiotické byly popsány Lb. acidophilus, Lb. delbruckii ssp. bulgaricus, Lb. casei ssp. rhamnosus, Lb. casei Shirota, Lb. paracasei, Lb. fermentum, Lb. gasseri, Lb. helveticus, Lb. johnsonii, Lb. plantarum, Lb. reuteri, Lb. salivarius, B. bifidum, B. adolescentis, B. longum, B. breve, B. infantis, B. lactis, E. faecium, E. faecalis, P. freudenreichii, S. salivarius ssp. thermophilus, Lc. lactis ssp. cremoris, Lc. lactis ssp. lactis a kvasinka S. boulardii (KVASNIČKOVÁ, 2000; TAMIME, 2005; BURDYCHOVÁ, 2007a). Určitý problém byl objeven u probiotického mikroorganismu E. faecium. Je to mikroorganismus, jehož původní použití se v případě potravin omezovalo na výrobu kysaného zelí, ale v současné době se uplatňuje při výrobě kysaných mléčných výrobků. Byly však objeveny i kmeny enterokoků, které prokazatelně probiotické vlastnosti neměly nebo měly schopnost přenášet rezistenci vůči antibiotikům na jiné mikroorganismy. Některé kmeny E. feacium ve fermentovaných potravinách byly popsány jako producenti biogenních aminů. Ve studii provedené Burbychovou (2007a) byla přítomnost genu pro tyrosindekarboxylázu zjištěna u všech analyzovaných kmenů E. feacium, zatímco přítomnost genu pro histidindekarboxylázu nebyla zjištěna u žádného. Při aplikaci testovaných kmenů E. feacium, jako startovacích kultur pro výrobu fermentovaných mléčných výrobků, by měla být ve finálním výrobku a po dobu jejich uchovávání testována produkce biogenního aminu tyraminu Kritéria pro výběr probiotik Probiotické mikroorganismy musí být schopny usídlit se v trávicím traktu. Musí být odolné vůči nepříznivým podmínkám, které panují v žaludku. Jedná se především o nízké ph, přítomnost kyseliny chlorovodíkové a proteolytických enzymů, které by mohly tyto mikroorganismy lyzovat. Dále musí v zažívacím traktu snášet žlučové kyseliny a nízké povrchové napětí. Kromě toho jsou v trávicím traktu přítomny imunitní látky, které mají specifické účinky na některé mikroorganismy. Významným faktorem je i střevní peristaltika, potažmo rychlost, kterou prochází potravinový materiál traktem (KVASNIČKOVÁ, 2000; GÖRNER a VALÍK, 2004). Pokud jde o výběr vhodných kmenů bakterií pro aplikaci do konkrétního výrobku, musí se přihlížet ke třem základním okruhům kritérií. Jako první jmenujme obecná hlediska, které zahrnují původ, spolehlivou identifikaci, bezpečnost a odolnost 13

13 vůči mutacím a stresům vyvolaných prostředím a vůči nepříznivým podmínkám, kterým jsou bakterie vystaveny při průchodu trávicím traktem. U probiotického kmene musí být prokázáno, že je humánního původu a že je pro lidský organizmus neškodný. Dále se musí přihlížet k funkčním hlediskům, které představují přínos pro konzumenta a v neposlední řadě k technickým hlediskům, mezi něž patří růstová schopnost během kultivace, životaschopnost během aplikace do potravin a možnosti ovlivnění rheologických a senzorických vlastností výrobku (GIBSON a WILLIAMS, 2000; PLOCKOVÁ 2002; KALAČ, 2003) Koncentrace probiotik Velmi významná je koncentrace probiotických bakterií ve funkční potravině. Aby bylo dosaženo příznivých účinků na lidském zdraví, je doporučována denní konzumace nejméně 100 g mléčného výrobku s obsahem alespoň 10 6 probiotických bakterií v jednom mililitru nebo v jednom gramu výrobku (BURDYCHOVÁ, 2007b). Jednorázová konzumace funkční potraviny obsahující probiotikum je jen málo účinná, proto by měla být konzumace pravidelná (KALAČ, 2003) Faktory ovlivňující množství probiotik ve výrobku Faktorů ovlivňujících množství probiotik ve fermentovaném mléčném výrobku je několik. Jako první jmenujme kombinaci probiotických kmenů a tradičních zákysových kultur. Bifidobakterie se doporučuje kultivovat se S. salivarius ssp. thermophilus, který snižuje hladinu kyslíku a zvyšuje acidorezistenci bifidobakterií (MAXA a RADA, 2002). Mezi Lb. acidophilus a bifidobakteriemi existuje symbiotický vztah. Jsou-li tedy přidávány do mléka současně, rostou lépe. Lb. acidophilus v mléku tvoří štěpné produkty bílkovin, které stimulují růst bifidobakterií. Opačně však B. bifidum růst a fermentaci Lb. acidophilus nestimuluje. (GÖRNER a VALÍK, 2004). Důležité je také složení mléka a výše tepelného záhřevu mléka. Přídavek kaseinu, hydrolyzátu syrovátkových bílkovin, kvasničného extraktu, glukosy, vitaminů, minerálních látek a prebiotik stimulují růst a přežívání probiotických kmenů. Přítomnost bílkovin zvyšuje pufrační kapacitu fermentovaného mléka a působí tak preventivně na dodatečné nežádoucí změny ph v důsledku prokysávání běhěm skladování. Dalším faktorem je množství rozpuštěného kyslíku, jelikož bifidobakterie jsou obligátně anaerobní a laktobacily mikroaerofilní. 14

14 Neopomenutelná je také velikost inokula a inkubační teplota. Protože probiotické mikroorganismy rostou v mléce často velmi špatně, používá se inokulum až 5 10 %. Optimální teplota pro většinu probiotických mikroorganismů je 37 C. U překysaných výrobků dochází díky vysokému ph a akumulaci kyseliny mléčné k výraznému snížení životaschopnosti probiotických mikroorganismů (PLOCKOVÁ, 2002) Legislativa a probiotika Funkční potraviny představují speciální kategorii potravin. Tato kategorie však zatím není legislativně nijak vymezena. Legislativní vymezení pojmu funkční potravina by bylo velmi významné z důvodu ochrany spotřebitele. Legislativa se však u rychle rozvíjející problematiky rodí velmi pomalu (KALAČ, 2003) Prebiotika Prebiotika jsou definována jako nestravitelné složky potravin selektivně podporující růst a/nebo aktivitu jedné nebo omezeného počtu bakterií tlustého střeva, které mohou zlepšit zdravotní stav konzumenta. Jedná se většinou o oligosacharidy. Oligosacharidy plnící roli prebiotik nesmí být v horní části gastrointestinálního traktu hydrolyzovány nebo absorbovány. Musí se tedy dostat do tlustého střeva nerozložené. Souhrnně se označují jako Non-digetible oligosacharides (NDO). V tlustém střevě se pak stávají substrátem pro probiotika. Probiotika tyto sacharidy fermentují až na kyselinu octovou, propionovou a máselnou. Nejvíce zastoupená kyselina máselná představuje živinu pro buňky sliznice v tlustém střevě. Následkem fermentační činnosti vzniká také významné množství bakteriální hmoty, která zvyšuje hmotnost stolice. Při koncepci funkčních potravin se vyvíjí velké úsilí při výběru vhodných prebiotik. Nesmějí však mít nežádoucí vedlejší účinky, jako je nadýmání, vyvolávání břišních křečí či dokonce průjmů. Fruktooligosacharidy mohou zlepšovat texturu a chuť výrobku (KVASNIČKOVÁ, 2000; KALAČ, 2003; GÖRNER a VALÍK, 2004) Oligosacharidy používané jako prebiotika Oligosacharidy používané jako prebiotika jsou buď přirozené, nebo syntetické. Nejvýznamnějším představitelem přirozených prebiotik je inulin. Částečným štěpením frakcí inulinu s delšími řetězci získáváme oligofruktosany jejichž řetězec se skládá 15

15 z 3 8 molekul fruktosy. Ty se přidávají především do mléčných výrobků, nealkoholických nápojů, trvanlivého pečiva, marmelád a džemů. Druhou skupinou jsou prebiotika syntetická. Ty vychází ze zcela běžných sacharidů, jako je sacharosa, laktosa, škrob či inulin. Z nich se technologickými úpravami získávají sloučeniny, jejichž stavební jednotky jsou sice přirozené, ale jejich vzájemné spojování je jiné, než jaké se vyskytuje běžně v přírodě (KALAČ, 2003). Jedná se například o laktulózu či laktitol. Laktulóza se vyrábí transformací, kde působí hydroxid vápenatý jako katalyzátor. V mléce vzniká až termickým procesem. Laktitol je alkoholický cukr připravený z laktózy. Pro výrobu tohoto bifidogenního faktoru existuje několik technologických postupů. Laktitol je podobný laktulóze, laktitol má však nižší laxativní účinky a vzájemně se liší v podpoře růstu mikroorganismů (MAXA a RADA, 2002) Účinky prebiotik na lidské zdraví Prebiotka mají příznivý vliv na složení mikroflóry tlustého střeva, snížují energetický příjmem, zvětšují objem stolice a snižují riziko vzniku zácpy. Mohou pomáhat při prevenci, zeslabení infekcí a průjmů, i při prevenci kolorektálního karcinomu, posilovat imunitní systém, snížit hladinu krevního cholesterolu a zvýšit využitelnost vápníku. Denní doporučený příjem prebiotik je 0,4 g u žen a 0,3 g u mužů na kilogram tělesné hmotnosti. Vyšší příjem se nedoporučuje, jelikož by mohl vyvolat nadýmání, plynatost a průjmy (KVASNIČKOVÁ, 2000; KALAČ, 2003) Synbiotika Tímto názvem se označuje současný přídavek probiotik a prebiotik do jednoho produktu. Tento název byl odvozen z pozorovaného jevu synergismu. To znamená, že zdravotní přínos kombinace obou účinných složek, probiotik i prebiotik, je větší než součet přínosů každé z nich, pokud by byly aplikované samostatně (KALAČ, 2003). 2.3 Kysané mléčné výrobky Kysaným mléčným výrobkem rozumíme dle Vyhlášky Ministerstva zemědělství č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje, v platném znění, mléčný výrobek získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů, tepelně neošetřený 16

16 po kysacím procesu. Mezi kysané mléčné výrobky řadíme acidofilní mléko, jogurt, kefír, kefírové mléko, kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou a kysané mléko včetně smetanového zákysu, podmáslí a kysané smetany. Ve finálním výrobku musí být mikroorganizmy živé v množství odpovídajícím druhu výrobků. Druhy mikroorganismů použité při výrobě daného druhu výrobku a jejich minimální počet v 1 g výrobku jsou také uvedeny v této vyhlášce (Vyhláška č. 77/2003 Sb., ve znění vyhlášky č. 78/2005 Sb.; DRAGOUNOVÁ, 2003) (Příloha 2) Bilance kysaných mléčných výrobků Vývoj bilance v roce 2007 u tekutých kysaných mléčných výrobků zaznamenal růst výroby, dovozu, celkové nabídky, vývozu a domácí spotřeby. Tento pozitivní vývoj souvisí obecně s životním stylem, orientovaným na zdravou výživu, tedy i na tento sortiment. Na růst domácí poptávky reagují jak domácí výrobci, tak dovozci ze států ES s neustále rozšiřující se kvalitní a pestrou nabídkou. Celková nabídka tohoto sortimentu se v roce 2007 zvýšila na 86,5 tis. tun, což předatavuje meziroční růst o 10,4 %. Domácí výroba se zvýšila meziročně o 6,5 %, dovoz o 20,3 %. Z celkové poptávky se zvýšila domácí spotřeba meziročně o 9,6 % a vývoz o 14,5 %. Došlo také ke zvýšení průměrné ceny (HRUBÁ a VESELÁ, 2008) (Příloha 1, tab. 1, 2, 3) Výroba kysaných mléčných výrobků Prvním krokem je výběr jakostního mléka. Poté se upravuje obsah tuku na 0,5 3,5 % a tukuprosté sušiny na minimálně 8,2 %. Úprava sušiny, respektive tuku se provádí zahušťováním různě tučných mlék, přídavkem sušeného mléka, podmáslí, syrovátky, kaseinátů, modifikovaného škrobu, rostlinných gum a jiných stabilizátorů. Stabilizátory zlepšují konzistenci, zamezují uvolňování syrovátky a nahrazují část mléčné sušiny. Dále se přidávají sacharidy a umělá sladidla. Pokud je přídavek sacharidů vyšší než 10 % může dojít k negativnímu ovlivnění fermentace v důsledku zvýšení osmotického tlaku mléka. Dalším krokem je deaerace. Nízký obsah vzduchu v mléce má pozitivní vliv na růst mikroorganismů, zlepšuje průběh homogenizace, snižuje riziko naplavování při tepelném ošetření, zvyšuje viskozitu a odstaňuje nežádoucí těkavé látky (PLOCKOVÁ, 2002). 17

17 Následná homogenizace ovlivňuje rheologické a senzorické vlastnosti finálního výrobku. Při nízkém a středním tlaku dochází k roztříštění tukových kuliček, které již nevyvstávají. Při vysokém se roztříští i kaseinové micely a vznikají submicely, které mají schopnost vázat tukové kuličky. Finální výrobek se tak zjemní. Také sérové bílkoviny podléhají částečné denaturaci. Po rozpadu kaseinových micel se směs začne srážet již při nižších hodnotách ph, zkracuje se tedy doba srážení (GAJDŮŠEK, 1998). Poté následuje pasterace, která eliminuje riziko pomnožení škodlivých mikroorganismů během fermentačního procesu. Jsou zničeny patogeny, kvasinky a spóry plísní, které by mohly způsobit zkažení finálního výrobku nebo jeho zdravotní závadnost. Přežití bakteriálních spór nepůsobí problémy, jelikož vlivem nízkého ph nemohou vyklíčit. Vysoký ohřev přispívá k inaktivaci přirozených inhibičních látek a umrtvení specifických fágů. Denaturované syrovátkové bílkoviny se naváží na kaseinové micely. Dochází tak ke zvýšení hydratační schopnosti kaseinu, snížení uvolňování syrovátky ve finálním výrobku a zvýšení viskozity. Dochází tak ke zlepšení konzistence výrobku (LUKÁŠOVÁ, 2001). Pasterace se provádí kontinuálně při teplotě 90 až 95 C po dobu 3 až 5 minut nebo diskontinuálně při teplotě 80 až 85 C po dobu 15 až 30 minut (GAJDŮŠEK, 1998). Následujícím krokem je ochlazení, zaočkování příslušnou čistou mlékařskou kulturou a inkubace při vhodné teplotě (Příloha 3). Při výrobě kysaných mléčných nápojů s probiotickou kulturou se 9 dílů standardizovaného, homogenizovaného a pasterizovaného mléka nechá fermentovat po přidání 1 % mezofilního zákysu 15 až 19 hodin při teplotě 21 až 23 C po dosáhnutí kyselosti 36 až 40 SH. Jeden díl mléka se potom fermentuje s 1 % probiotické kultury 12 až 15 hodin po dosáhnutí kyselosti 70 až 90 SH. Obě dvě mléka se potom smíchají a po mírné homogenizaci se ochladí pod 10 C a plní se do spotřebitelských obalů. Jednoduše se také může do mezofilně zkysnutého mléka před koncem fermentace přidat koncentrovaná probiotická kultura. Po fermentaci se kysané mléčné nápoje ještě homogenizují (GÖRNER a VALÍK, 2004; MAXA a RADA, 2002). Tyto výrobky se skladují, přepravují a uvádějí do oběhu při teplotě od 4 C do 8 C. Ochucené kysané mléčné výrobky mohou obsahovat nejvýše 30 hmotnostních % ochucující složky. Kysaný mléčný výrobek se označí názvem druhu nebo skupiny, obsahem tuku, použitou ochucující složkou. Pokud bylo přidáno přírodní sladidlo nebo náhradní sladidlo musí být označen jako slazený (Vyhláška č. 77/2003 Sb., ve znění vyhlášky č. 124/2004 Sb.). 18

18 Hygiena výroby kysaných mléčných výrobků Mléko pro výrobu kysaných mléčných výrobků musí pocházet od zdravých, dobře krmených dojnic, musí být hygienicky získáno, mít optimální složení, dobrou kysací aktivitu. Pro výrobu je vhodné pouze jakostní mléko obsahující nízký celkový počet mikroorganismů. Nežádoucí je vysoký počet psychrotrofních mikroorganismů, které mohou ještě před tepelným ošetřením mléka produkovat metabolity inhibující bakterie mléčného kvašení nebo negativně ovlivňující chuť, vůni a konzistenci výrobku. Mléko rovněž nesmí obsahovat rezidua inhibičních látek, na něž jsou zákysové kultury citlivé (GAJDŮŠEK, 1998; PLOCKOVÁ, 2002). Kysací kultury se musí vyznačovat schopností dobrého růstu ve standardizovaném, tepelně ošetřeném mléce, v němž nastává rychlé snižování ph. Důležitým požadavkem je i mikrobiální a fágová čistota kysacích kultur. Dalším důležitým požadavkem je zajištění hygieny při výrobě. Nesmí dojít ke kontaminaci výrobku z výrobních zařízení, prostoru, rukou pracovníku či jejich oděvu. Důležité je vyloučit kontaminaci plísněmi a kvasinkami, jelikož ty se mohou množit při ph nižším než 4,5 (LUKÁŠOVÁ, 2001) Rozdělení kysaných mléčných výrobků Sortiment kysaných mléčných výrobků je velice pestrý a neustále se rozšiřuje. Finální výrobky poskytují jemnou sraženinu mléčných bílkovin. Příznivé chuťové vlastnosti a vhodná konzistence umožňují nejrůznější kombinace těchto výrobků s různými ochucujícími přísadami, ovocem, minerálními látkami, vitamíny nebo vlákninou (LUKÁŠOVÁ, 2001). Kysané mléčné výrobky s mezofilními kulturami K přípravě kysaných mlék, kysaného podmáslí, kysané smetany a různých jiných kysaných mléčných výrobků se používá mezofilní kultura, označovaná také jako smetanová. Patří sem rody Lactococcus a Leuconostoc. Očkovuje se 0,5 1,5 % provozního zákysu. Fermentace probíhá 16 až 20 hodin při teplotě 21 až 23 C. Nižší teplota zajistí vyšší obsah aromatických látek. Na konci fermentace by mělo být dosaženo titrační kyselosti SH. 19

19 Kysané mléčné výrobky s termofilními kulturami Pro výrobu jogurtů a jogurtových mlék se používají termofilní kultury. Mezi tyto kultury patří S. salivarius subsp. thermophilus a Lb. delbrücki subsp. bulgaricus. Jogurtové výrobky mohou kromě těchto kultur obsahovat i kultury probiotické. Fermentace probíhá ve spotřebitelském balení po dobu 3 až 3,5 hodin při teplotě 42 až 45 C, inokulum 1 2 %, nebo v tanku po dobu 16 až 18 hodin při teplotě 30 C nebo po dobu 7 až 8 hodin při 36 až 38 C, inokulum 0,05 0,1 %. Pokud zvýšíme teplotu, dobu inkubace nebo množství inokula, zvýší se podíl laktobacilů, titrační kyselost, podíl D(-)izomeru kyseliny mléčné a také aromatičnost výrobku (GAJDŮŠEK, 1998; PLOCKOVÁ, 2002; HRABĚ a kol., 2005). Kysané mléčné výrobky s doplňujícími mikroorganismy Kromě klasických mléčných kultur se přidávají i jiné kultury s dieteticko léčebnými účinky, ty však nelze použít samostatně vzhledem k vysoké tvorbě kyselin. Lactobacillus acidophilus v kombinaci se smetanovým zákysem se používá při výrobě acidofilního mléka a kysaných nápojů. Lb. acidophilus, jehož optimální teplota růstu je 37 C roste v kravském mléku pomalu, zvláště pokud je zde očkován jako jednodruhová kultura. B. bifidum se přidává do biokysu, bioghurtu či bifighurtu. Aplikace bifidobakterií je komplikovaná. Jelikož v kravském mléce rostou jen velmi pomalu, musí se přidávat ve větším množství, v kombinaci s jinými mikroorganismy nebo s přídavkem dusíkatých látek organického původu. Jejich optimální teplota růstu je 37 C. Důležité je, že vysoký obsah bifidobakterií může způsobit octovou vůni a chuť výrobku (GAJDŮŠEK, 1998; MAXA a RADA, 2002; GÖRNER a VALÍK, 2004). Kysané mléčné výrobky s bakteriální a kvasinkovou kulturou K výrobě kefíru či kumysu je zapotřebí přidat kefírovou kulturu. Její základ tvoří Lc. lactis subsp. lactis, Lb. kefir, Lb. caucasicus, Lb. acidophilus, Lb. celobiosus, Lb. casei a kvasinky C. kefir a K. lactis. Mléko se zaočkuje 2 3 % inokula. Inkubace trvá 12 hodin při teplotě C, následně je koagulát ochlazen na C a při této teplotě zraje hodin. Vedle mléčného kysání zde probíhá i alkoholické kvašení, za tvorby ethanolu a oxidu uhličitého (GAJDŮŠEK, 1998; PLOCKOVÁ, 2002). 20

20 2.3.5 Změny kysaných mléčných výrobků během fermentace Fermentace je oxidační proces, kdy organická molekula sloužící jako dárce elektronů (obvykle se jedná o sacharid, lipid či protein) je předává jiné molekule. Jedná se o proces anaerobní (VOTAVA, 2003). Během fermentace dochází k mnoha biochemickým reakcím. Tyto reakce jsou ovlivněny druhem mikroorganismu, vlastnostmi suroviny a vnějšími podmínkami jak v průběhu fermentace, tak při skladování. Dochází ke částečnému štěpení sacharidů, proteinů a lipidů. Tím se zlepšuje nejenom vstřebatelnost a využitelnost jednotlivých složek mléka, ale také dochází k vzniku aromatických sloučenin, které dávají kysaným mléčným výrobkům charakteristické organoleptické vlastnosti (GAJDŮŠEK, 2000; FERON and WACHÉ, 2006; TSAKALIDOU and KOTZEKIDOU, 2006). Výběr vhodných probiotických kultur závisí i na jejich schopnosti vytvořit příznivé organoleptické vlastnosti potraviny (TANNOCK, 2005). Fermentace mléka je příkladem prodloužení trvanlivosti výrobků biologickou konzervací. Fermentací vzniklá kyselina mléčná snižuje ph výrobku na hodnoty 3,8 4,6, což zamezuje růstu nežádoucích bakterií, avšak vytváří se vhodné prostředí pro růst kvasinek a plísní (PLOCKOVÁ, 2002; GÖRNER a VALÍK, 2004). Metabolismus laktosy Laktóza se během fermentačních pochodů hydrolyzuje působením bakteriální β-galaktosidasy na D-galaktosu a D-glukosu. Sacharolytické mikroorganismy jsou dále schopny svou enzymatickou činností rozkládat glukosu v procesu zvaném glykolýza nebo v pentosafosfátové cestě (AXELSSON, 1998; CUPÁKOVÁ a kol., 2002). V první fázi glykolýzy dochází k fosforylaci glukosy na glukosa-6-fosfát. Následně podlehne fosforylovaná glukosa isomerase a dochází k nevratné izomerii aldosy na ketosu. Produktem reakce je fruktosa-6-fosfát. Poté dochází ke druhé fosforylaci a vzniká fruktosa-1,6-bisfosfát. Cukerný bisfosfát je dále rozštěpen aldolasou a vznikají dvě triosy a to glyceraldehyd-3-fosfát a dihydroxyacetonfosfát. Glyceraldehyd-3-fosfát je oxidován díky enzymu glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa. Tento enzym katalyzuje reakci zahrnující dehydrogenaci, ale i fosforylaci, kterou vznikne 1,3-bisfosfoglycerát. Odtržené vodíky se přenáší na nikotinamidadenindinukleotid (NAD + ) a vzniká hydrogenovaný nikotinamidadenindinukleotid (NADH+H + ). Následně se uvolní z 1,3-bisfosfoglycerátu 21

21 díky kinase fosfát a přenese se na adenosindifosfát (ADP) za vzniku adenosintrifosfátu (ATP). Produktem je 3-fosfoglycerát. V následující fázi katalyzuje fosfoglycerátmutasa přesun fosfátové skupiny za vzniku 2-fosfoglycerátu, za kterého enolasa odštěpuje vodu a vzniká fosfoenolpyruvát. Fosfátová skupina je z makroergního fosfoenolpyruvátu díky kinase přenášena na ADP a vzniká druhá molekula ATP. Produktem této reakce je pyruvát (Příloha 4, obr. 1). Pentósafosfátová cesta se dělí na dvě fáze. V oxidační fázi se glukosa-6-fosfát oxiduje přes lakton na 6-fosfoglukonát. Enzym glukosa-6-fosfátdehydrogenasa katalyzující tuto reakci spolupracuje s NADP + (nikotinamidadenindinukleotidfosfát), který přeměňuje na NADPH. 6-fosfoglukonát se další specifickou dehydrogenasou za současné dekarboxylace konvertuje na pentosu ribulosa-5-fosfát a CO 2. Tato dehydrogenasa má také koenzym NADP +. V další fázi, označované jako interakční, se ribulosa-5-fosfát přeměňuje izomerací a epimerací na C3 na jiné pentosafosfáty. Poté dochází, za součinnosti anorganického fosfátu k enzymovému štěpení pentosa-5-fosfátu na acetylfosfát a glyceraldehyd-3-fosfát. Z acetylfosfátu vzniká za součinnosti redukovaného kofaktoru acetyl a etanol. Glyceraldehyd-3-fosfát je přeměněn na pyruvát a následně na laktát (LEDVINA a kol., 2004) (Příloha 4, obr. 2). Pyruvát je dále metabolizován za anaerobních podmínek u různých mikroorganismů odlišným způsobem za vzniku různých produktů. Tyto produkty nejsou úplně oxidovány, část energie v nich zůstává nevyužita a jsou vylučovány buňkou do okolí. (VOTAVA, 2003). Cílem přeměny pyruvátu je vždy současná přeměna redukovaného kofaktoru ve formu schopnou dehydrogenovat další molekulu při glykolýze, to znamená přeměnu NADH v NAD + (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Hlavním produktem při přeměně pyruvátu je laktát. V závislosti na stereospecifitě laktátdehydrogenasy tvoří bakterie mléčného kvašení D(-)- kyselinu mléčnou, která je v lidském organismu hůře odbouratelná a L(+)- kyselinu mléčnou, která se odbourává lépe. Tvorba izomerů závisí na účasti bakterií v substrátu, kultivační teplotě, ph prostředí času inkubace a teplotě skladování. Laktát může být za aerobních podmínek dále metabolizován na octan a CO 2 (GÖRNER a VALÍK, 2004). Při nízké koncentraci laktosy a glukosy mohou z pyruvátu vznikat také jiné produkty, jako jsou mravenčan (formát), octan (acetát), etanol, acetaldehyd, acetoin, diacetyl a CO 2. Prvním krokem při alternativní cestě metabolismu pyruvátu je jeho přeměna na acetyl-koenzym A (acetyl-coa) a mravenčan (formát) díky pyruvát-formát lyase. Tento enzym může být u některých streptokoků aktivní i v přítomnosti velkého 22

22 množství sacharidů. Eventuálně může být pyruvát redukován pyruvátdehydrogenasou za vzniku acetyl-coa a CO 2, přičemž je NAD + redukováno na NADH. Acetyl-CoA může být následně konvertován přes acetyl-fosfát na octan (acetát), při čemž dochází k vzniku dalšího ATP, nebo přes acetaldehyd na etanol, kdy se napravuje nerovnováha mezi NAD + / NADH vzniklá při dehydrogenačním kroku. Acetaldehyd je převážně hromaděn bakteriemi mléčného kvašení, které nemají enzym alkohodehydrogenasu. Tyto bakterie tedy nemohou redukovat acetaldehyd vzniklý z pyruvátu na ethanol. Jedná se například o Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis a Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus. Tato aromatická látka vzniká také při degradaci proteinů (WALSTRA et al., 2006). Při jiné cestě může z pyruvátu vznikat α-acetomléčná kyselina. Za anaerobních podmínek je α-acetomléčná kyselina dekarboxylována na acetoin. Za přítomnosti kyslíku podléhá spontánní dekarboxylaci a oxidaci za vzniku diacetylu. Diacetyl může být redukován na acetoin. Konečným krokem této cesty je redukce acetoinu na 2,3-butandiol (VELÍŠEK a CEJPEK, 2008). Tvorba acetoinu a diacetylu je málo výrazná pokud je v substrátu jediným zdrojem uhlíku hexosa, výrazně vzrůstá, pokud je dalším zdrojem pyruvátu organická kyselina, například kyselina mléčná. Tvorba diacetylu roste s obsahem kyseliny citrónové. Rozsah tvorby aromatických látek závisí na redoxním potenciálu substrátu (GÖRNER a VALÍK, 2004) (Příloha 4, obr. 3). Bakterie se dělí do dvou hlavních skupin v závislosti na jejich fermentačních produktech. Lc. lactis, Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. salivarius, rody Streptococccus a Pediococcus patří mezi homofermentativní bakterie mléčného kvašení. Sacharidy transportují do buňky pomocí fosfoenolpyruvát dependentního fosfotransferázového systému (PEP/PTS) či pomocí permeasy a fermentují glykolytickou cestou. Tato skupina mikroorganismů redukuje pyruvát za součinnosti redukovaného kofaktoru prakticky pouze v L(+)- kyselinu mléčnou. Lb. fermentum, Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. reuteri, Lb.casei ssp. rhamnosus, Lb. plantarum Lb. mesenteroides ssp. cremoris. Lb. mesenteroides ssp. dextranicum, B. bifidum a rod Leuconostoc patří mezi heterofermentativní bakterie mléčného kvašení. Sacharidy transportují do buňky pomocí permeasového systému. Tyto mikroorganismy nemají aldolasu štěpící hexosa-1,6-fosfát na dva triosafosfáty, proto převádějí hexosy pomocí pentosa-fosfátové dráhy. Z hexosy tak vzniká kromě kyseliny mléčné i CO 2, ethanol, kyselina octová, mravenčí, glycerol, diacetyl nebo acetaldehyd 23

23 (ŠILHÁNKOVÁ, 2002; VOTAVA, 2003; AXELSSON, 1998; VELÍŠEK a CEJPEK, 2008). Fakultativně heterofermentativní laktobacily mají schopnost fermentovat pentosy heterofermentativně, ale hexosy homofermentativně (GÖRNER a VALÍK, 2004). Senzoricky aktivní látky vznikající při metabolismu laktosy Během fermentace jsou zdroje uhlíku využity pro růst mikroorganismů. Z tohoto důvodu rozmanitost chutí a vůní plynoucí z katabolismu laktosy není příliš široká. Hlavním produktem fermentace je kyselina mléčná. Ta je zodpovědná za výraznou, osvěžující chuť fermentovaných mléčných výrobků a slouží k tvorbě charakteristické chuti a vůně každého výrobku (TSAKALIDOU and KOTZEKIDOU, 2006). Další důležité aromatické látky vzniklé při metabolismu pyruvátu jsou etanol, diacetyl, acetoin a 2-3 butandiol. Při nižších koncentracích vytváří etanol jablečné aroma, ale ve vyšších koncentracích vzniká pronikavé, štiplavé aroma, které je u fermentovaných výrobků nechtěné. Diacetyl, acetoin a 2-3 butandiol přispívají především k aroma máselnému (FERON and WACHÉ, 2006) (Příloha 4, obr. 4). Metabolismus citrátu Metabolismus citrátu hraje také důležitou roli při fermentaci mléka. Ne všechny bakterie mléčného kvašení jsou schopné citrát metabolizovat. Citrát přítomný v mléce může sloužit jako zdroj energie především pro Lc. lactis ssp. lactic biovar. diacetylactis a Lb. mesenteroides ssp. cremoris. Citrát je přenesen do buňky pomocí ph-dependentní PMF-zprostředkovanou citrátovou permeasou. V buňce je štěpen citrát-lyasou na acetát a oxalacetát. Acetát je uvolněn do prostředí, zatímco oxalacetát je dekarboxylován na pyruvát a CO 2. Nadbytek pyruvátu je odstaňován dekarboxylační reakcí katalyzovanou thiamin pyrofosfát-dependentní (TPP) pyruvát dekarboxylasou. Acetaldehyd-thiamine pyrofosfát kondenzuje s jinými molekulami pyruvátu skrz α-acetolaktát synthasu tvořící α-acetolaktát (HUTKINS, 2006). α-acetolaktát je nestabilní molekula, při nízkém ph může být neenzymaticky dekarboxylována na acetoin, nebo za přítomnosti kyslíku oxidována na diacetyl. Tvorba diacetylu z α-acetolaktátu závisí na redoxní rovnováze systému. Obsah diacetylu a acetoinu se zvyšuje tak dlouho, dokud je v mléce přítomný citrát. Pokud je citrát vyčerpán dochází k redukci hladiny diacetylu za tvorby acetoinu a hladina acetoinu je redukován za tvorby 2,3- butandiol (WALSTRA et al., 2006) (Příloha 4, obr. 5). 24

24 Senzoricky aktivní látky vznikající při metabolismu citrátu Některé produkty citrátového metabolismu, jako diacetyl, acetaldehyd a acetoin, mají velice silné aromatické vlastnosti, které charakteristicky ovlivňují jakost fermentovaných potravin. Rozpad citrátu má za následek tvorbu CO 2, který přispívá k textuře fermentovaných mléčných výrobků. (DE FIGUEROA, 1998; KIMOTO, 1999). Metabolismus lipidů K lipolýze dochází díky lipoproteinové lipase, která je přítomna v mléce a lipase a esterázám, které jsou produkovány přidanou mikroflórou. Lipolýzou triacylglycerolů vznikají volné mastné kyseliny a glycerol. Bakterie mléčného kvašení mají obecně nízkou lipolytickou aktivitu. (TSAKALIDOU and KOTZEKIDOU, 2006; WALSTRA et al., 2006). Proces degradace mastných kyselin se nazývá β-oxidace. Jedná se o cyklický pochod, při kterém se postupně zkracují řetězce mastných kyselin vždy o dva atomy uhlíku. Proces oxidace se opakuje tak dlouho, dokud se celá mastná kyselina nerozloží na acetylové zbytky vázané na koenzym A (CoA). Sled reakce během jednoho cyklu zahrnuje oxidaci na třetím atomu uhlíku s následným odštěpením dvouuhlíkového zbytku ve formě acetyl-coa. Závěr reakčního sledu tvoří thiolytické štěpení, při němž produkt β-oxidace β-oxoacyl-coa se za přítomnosti CoA rozpadá na acetyl-coa a na o dva atomy uhlíku kratší molekulu acyl-coa (HOZA a kol., 2006) (Příloha 4, obr. 6). Senzoricky aktivní látky vznikající při metabolismu lipidů Na rozdíl od metabolismu glukosy může vést oxidace a hydrolýza lipidů k velmi důležitým zdrojům aromatických látek. Mastné kyseliny s krátkým řetězcem přispívají přímo k aroma fermentovaných výrobků. Jmenujme například žluklé aroma zapříčiněné kyselinou máselnou, oktanovou a dekanovou, octové způsobené octovou kyselinou nebo kozí způsobené 4-etyloktanovou kyselinou. Volné mastné kyseliny vzniklé při lipolýze triacylglycerolů podléhají snadněji žluknutí. Žluknutí je celý proces chemických změn tuků, jejichž výsledkem je nepříjemný zápach a chuť. Vzdušný kyslík je vázán na mastné kyseliny, především na dvojné vazby za vzniku peroxidů. Peroxidy jsou vysoce reaktivní a jsou dále rozkládány na aldehydy a ketony (GAJDŮŠEK, 1993). Oxidací volných mastných 25

25 kyselin vznikají i další aromatické látky, jako jsou laktony a alkoholy (FERON and WACHÉ, 2006). Laktony pocházejí zejména z β-oxidace hydroxymastných kyselin. Jsou charakteristické svým broskvovým, meruňkovým a kokosovým tónem (DUFOSSÉ, 1994). Metabolická dráha laktonů není zatím dobře prozkoumána, ale je známo, že významně ovlivňují chuť. Při β-oxidaci se z cyklu uvolní β-acetoacyl-coa. Ten je následně hydrolyzován thiolasami a poté dekarboxylován, což vede k methylketonům (MOLIMARD, 1996). Metylketony jsou zodpovědné za ovocné, či zatuchlé aroma (BALTAZAR, et al., 1999). Metylketony mohou být dále redukovány, což vede k tvorbě různých alkoholů, jako jsou 2-pentanol, 2-heptanol nebo 2-nonanol. Oxidace mastných kyselin může také vést k syntéze různých alkoholů a aldehydů. Zejména linolová a linoleová kyselina jsou prekurzory uhlíkových aromatických sloučenin, především 3,1-oktenolu, který dává houbové aroma, 2,1-oktenolu, 1,5-okta-3-dienolu a 1,5-okta-1-dienolu (FERON and WACHÉ, 2006) (Příloha 4, obr. 7). Metabolismus proteinů K proteolýze dochází díky proteasam přítomným v mléce a proteolytickým enzymům přidávané mikroflóry. Proteolytická aktivita vede k tvorbě peptidů, které jsou dále degradovány činností aminopeptidas a karboxypeptidas. Aminokyseliny následně podléhají transaminaci, dehydrogenaci, dekarboxylaci a redukčním reakcím (MOLIMARD, 1996; MARILLEY, 2004). Aminokyseliny a peptidy již mohou být transportovány do buňky a to proti koncentračnímu gradientu (GÖRNER a VALÍK, 2004). Při metabolismu aminokyselin jsou syntetizovány aromatické sloučeny. Jedná se například o aldehydy, alkoholy, sirné sloučeniny, aminy a některé organické kyseliny. Bylo zjištěno, že syntéza těchto sloučenin závisí na transaminační aktivitě bakteriích mléčného kvašení, které vykazují různé substrátové specifity (BANKS, 2001; RIJNEN, 2003). Během oxidační deminace α-aminokyselin katalyzované transaminasami jsou přeměňovány na odpovídající 2-oxokyseliny. 2-oxokyseliny jsou poté transformovány na acyl-coa estery nebo aldehydy. Aldehydy mohou být pomocí alkoholdehydrogenásy přeměňovány na alkoholy. Z Alkoholů a kyselin mohou vznikat estery. Alkohol 26

26 acyltransferasa katalyzuje lýzu acyl-coa esterů, které se tvoří z kyselin díky acid-thiol ligase (VELÍŠEK a CEJPEK, 2008). Senzoricky aktivní látky vznikající při metabolismu proteinů Proteolýza je důležitá pro tvorbu aroma a textury fermentovaného výrobku. Proteolytická aktivita bakterií mléčného kvašení celkem běžná, ale pouze v některých v několika případech byl systém důkladně prozkoumán. (McSWEENEY, 2000). Byly isolovány a naklonovány dvě transaminasy. Jedna byla činná ve větvení řetězce mastných kyselin a po řadě dekarboxylačních nebo dehydrogenačních reakcí vedla k tvorbě alkoholů, jako 2-methylpropanol, 2,3-methylbutanol, a aldehydů, které jsou charakteristické svým ovocným a sladovým aroma. Oxidací vznikají mastné kyseliny s krátkým řetězcem (2-methyl-máselná, izomáselná a izovalerová kyselina), které jsou zodpovědné za žluklé, hnilobné a fekální aroma (MOLIMARD, 1996). Druhá transaminasa působila na aromatické aminokyseliny, jako je fenylalanin, tyrosin a tryptofan. Charakteristický byl vznik sloučenin s květinovým aroma. Degradací fenylalaninu může vzniknout široká škála aromatických sloučenin, jako je například benzaldehyd (mandlové aroma), skořicový aldehyd (skořicové aroma), veratraldehyd (dřevité, vanilkové aroma) nebo fenyletanol (aroma růže) (FERON and WACHÉ, 1996). Peptidázami Lb. delbruckei ssp. bulgaricus uvolněná aminokyselina threonin je významná pro vznik typického jogurtového aroma. Z threoninu vzniká působením theroninaldolasy, kterou produkuje S. thermophilus acetaldehyd, který je nosnou aromatickou látkou jogurtu (GÖRNER a VALÍK, 2004). Z threoninu mohou být dále sérií biochemických reakcí syntetizovány pyraziny (LARROCHE, 1999). Pyraziny jsou aromatické sloučeniny typické pro ohřívané potraviny s charakteristickým pečeným, oříškovým aroma, které vzniká díky Maillardově reakci. Nachází se tedy především v masných potravinách, vínu a v pivu. Degradace methioninu je zodpovědná za syntézu sirných sloučenin ve fermentovaných potravinách (ENGELS, 2002; PERPÈTE, 2003). Sirné sloučeniny jsou nejdůležitějšími aromatickými sloučeninami. Především se jedná o dimethylsulfid, dimethyldisulfid, dimethyltrisulfid, methional, methionol a methanthiol. Jejich aroma je popisováno jako cibulové, česnekové, ředkvičkové či kapustové, ale také jako hnilobné či po exkrementech. 27