Osnova. Základní vlastnosti biologických membrán Transport látek přes membránu

Transkript

1

2 Osnova Základní vlastnosti biologických membrán Transport látek přes membránu úvod pumpy přenašeče kanály transport vody Membránový transport v praxi regulace otevírání a zavírání svěracích buněk

3 Membrány obsahují 1. sensory které umožňují reakci buňky na podněty z okolí 2. pumpy, přenašeče a kanály pro transport látek skrz. Mechanické vlastnosti membrán jsou obdivuhodné (např. Schopnost růstu a změny tvaru bez ztráty integrity

4 Membrány = lipidová dvojvrstva + proteiny

5 Model membrány jako fludní mozaiky

6 Lipidová dvouvrstva je složením ASYMETRICKÁ! Nové membr. lipidy vznikají v ER, např PC a spol na cytosolické straně - flipasy Glykolipidy dosyntetizovány v Golgi, pouze na vnější straně (žádné flipasy) Intracellular signal transduction

7 Transmembránové proteiny

8 Osnova Základní vlastnosti biologických membrán Transport látek přes membránu úvod pumpy přenašeče kanály transport vody Membránový transport v praxi regulace otevírání a zavírání svěracích buněk

9 Co prochází membránou? Runar P. Collander ( ) membránová permeabilita buněk Chara sp. (30. léta)

10 Co prochází membránou samo od sebe? koef. membr. permeability P s = k*v/t 0.5 A objem poločas dosažení rovnováhy povrch - nenabité molekuly!

11 Can I get through please? Depends 12_02_diffusion_rate.jpg YES YES Who are you? How big are you? Are you charged? NO NO

12 Membránový tranport Tvorba turgoru (většinou K+) Příjem minerálů a živin Vyloučení odpadních produktů Vyloučení toxických látek Distribuce metabolitů Kompartmentalizace metabolitů Přenos energie Přenos signálů

13 Membránové transportery obecně: Pumpy pohon ATP, PP Primární aktivní tranport Přenašeče (Carriers) pohon gradienty na membráně (pmf) Sekundární aktivní transport Pasivní transport (usnadněná difuze) Kanály pohon gradienty na membráně Pasivní transport (usnadněná difuze)

14 Kapacita membránových transportů Pumpy: kovalentní reakce 10 2 s -1 Přenašeče: změny konformace 10 3 s -1 Kanály: ani jedno z toho s srovnej zastoupení v buňkách

15 Animal vs Plant cells 12_18_solute_transport.jpg

16 Membránové ATPázy typické pro rostliny

17 Membránový potenciál Vm je rozdíl elektrických potenciálů dvou vodných roztoků iontů oddělených membránou. plasmalema = -150 mv tonoplast = -20 mv

18 Dominantním zdrojem membránového potenciálu Vm rostlin jsou protonové pumpy. Proto jsou protonové pumpy elektrogenní.

19 Membránový potenciál vytvářený protonovou pumpou je součástí tzv. proton-motivní síly (pmf), jejímž zdrojem je také koncentrační rozdíl protonů. Vm a pmf jsou klíčovou složkou všech transportních dějů na membráně.

20 Protože platí, že 1 stupňový rozdíl ph odpovídá asi 59mV, lze vyjádřit netermodynamicky pmf=59.1x(ph o -ph c )+Vm při průměrném Vm -120 až -150 mv a rozdílu ph ve stěně (ph5) a v cytoplasmě (ph7) vychází pak pmf rost. b. až -268mV.

21 Osnova Základní vlastnosti biologických membrán Transport látek přes membránu úvod pumpy přenašeče kanály transport vody Membránový transport v praxi regulace otevírání a zavírání svěracích buněk

22 Membránové transportery konkrétně: Pumpy pohon ATP, PP pro rostliny typické H+ pumpy plasmalemmy, tonoplastu Přenašeče Kanály

23 Plasmalemma: P H+-ATPáza Arabidopsis: genová rodina AHA (11 genů!)

24 Proč má Arabidopsis tolik AHA genů? housekeeping AHA1 (shoots), AHA2 (roots) všude, ale málo (regulace podmínkami?) část. orgán. specif. prašníky a pyl AHA5 AHA3 (floem), AHA11 (list), AHA4 (kořen) AHA6, AHA7,AHA8,AHA9 obal semene AHA10 esenciální mutantní fenotyp

25 ( Myc-tag ) AHA3 exprese ve floému

26 Posttranslační regulace P-ATPázy: fosforylace a protein (transkripční regulace existuje také, ale nevýrazná!)

27 Agonista P H+-ATPázy ( ireversibilní ) fusicoccin z houby Fusicoccum amygdali působí trvalé otevření průduchů a uschnutí. Inhibitorem všech! ATPáz P- typu je ortovanadát

28 možný mechanismus působení fusicoccinu

29 Fyziologické signály regulující fosforylaci? Blue light - phytotropin - aktivace ATPázy- (otevření průduchů špenátu) inaktivace ATPázy - (snížení turgoru - pohyb listů fazolu) Sucho - ABA - defosforylace - inaktivace ATPázy- (zavření průduchů) též odpověď na cukry... v růz. systémech

30 Lokalizace H-ATPasy v pylové láčce tabáku

31 Gradienty ph v rostoucích buňkách: příklad pyl. láček a koř. vlásků

32 + tip growth + plant movements + osmotolerance + acid growth

33 Ca- ATPasa Ca2+ Ca2+ Ca2+ (další pumpa P- ( typu Ca2+

34 Dva typy rostlinných Ca2+ pump 1.IIB (ACA) - v PM, ale i ER, plastidu a tonoplast.mají autoinhibiční regulační doménu (fosforylace, vazba CaM). Obě jsou P-typu, tedy inhibovány ortovanadátem. 2.IIA (ECA) - v ER, není aktivována CaM.

35 V-H+ATPasa

36 Připomeňme si: obrátíme-li elektromotor, dostaneme dynamo. F o F 1 ATP synthasa V - ATPasa

37 Specifické inhibitory V H+ATPázy Streptomyces Concanamycin A (váže se na Vo podjednotku c)

38 det/cop mutanti Dark Light Dark Light Wild Type det Mutant det3 je mutant C podjednotky V-H+-ATPázy

39 V-H+ATPasa mutace letální pro pyl 13 podjednotek, 27 genů... kolik kombinací?? Rozdíly isoforem: např. regulace podmínkami např. exprese E podjednotky je indukovaná stresem

40 V-ATPasa Jméno je trochu zavádějící... Funkce ve vakuole není esenciální (díky PPase) Nezbytná pro strukturu a funkci Golgiho aparátu a TGN Zásadní pro správnou funkci endocytotického systému a traffickingu obecně

41 V-H+-PPasa (membránová pyrofosfatáza) rostlinná specialita v tonoplastu užívá jako zdroj energie pyrofosfát PPi ("odpad" při polymeraci DNA,RNA a biosyntetických proc. např. ADPG či UDPG) příbuzné pumpy ale i v membránách bakterií, hmyzu a parazitů 2 TYPY liší se regulací vápníkem Typ I závislý na cytosolickém K + středně inhibovány Ca 2+ Typ II K + insenzitivní extrémně Ca 2+ senzitivní

42 Evoluce rostlinné vakuoly je těsně spojena s evolucí V H+-PPasy, která je nutnou součástí funkčního tonoplastu (minoritně je ovšem lokalizována i do PM) za normálních podmínek i ve stresu. AVP1 - vak. Ppasa typ I overexprese zvyšuje rezistenci k sol. stresu...

43 ABC transportery (ATP Binding Cassette) (také známy jako MDR nebo ( PGP fungují nejen jako na ATP závislé pumpy, ale také jako iontové kanály, či jejich regulátory.

44 ATP vazebná místa. Mnoho genů = mnoho substrátů ABC transportery jsou klíčové pro řadu detoxifikačních transportů zvl. do vakuoly.

45 ABC a kutikula: CER5 kóduje ABC transp. wt cer5

46 Membránové transportery konkrétně : Pumpy Přenašeče saturovatelné, poháněny gradienty (pmf) Kanály

47 Two forces may be at work in passive transport - if we are dealing with a charged solute across the membrane. 1) Koncentrace 2) Membánový potenciál (mohou fungovat synergicky nebo protichůdně)

48 Přenašeče Hlavní anorganické živiny (NH4+, NO3-, Pi, K+, SO42- Uptake dalších iontů (Cl-) Organické látky (cukry (mono- a di-), aa, baze)

49 Model obecného přenašeče

50 Saturační kinetika přenašeče

51 Typy přenašečů uniport symport antiport Pasivní transport Sekundární aktivní transport Uniport Symport Antiport A A B A B

52 Struktura obecného přenašeče (Major facilitator superfamily)

53 Jak studovat transportní procesy? Heterologní exprese: oocyty, kvasinky

54 H+ symport převažující mechanismus

55 Symport H+/cukry při plnění floemu sucrose-h+ symporters

56 Často různé přenašeče téhož iontu? Proč? Jemné ladění! Regulace aktivity přenašečů: Transkripční (pravděpodobně převládající) Posttranlační - (transinhibice)

57 Jsou i výjimky z pohonu H+ Na + NO 3 - coupling

58 ( IAA ) Přenašeče auxinu ABC transportery (MDR, PGP) PIN AUX/LAX

59 Kudy auxin teče? Přenašeče (influx a efflux carriers): AUX1/LAX1 PINs inhibice fytotropiny (NPA)

60 IAA influx: AUX1 Swarup et al. 2001

61 PIN přenašeče Fenotyp: jako inhibice transportu (efflux) auxinu působením NPA! pin1 mutant

62 PIN proteiny

63 Lokalizace členů PIN rodiny (I. Billou, K. Palme, J. Friml et al.)

64 ABC a transport IAA

65 Modely transportu auxinu Klasicky: přenašeče PIN a AUX/LAX

66 Co pohání transport auxinu???? (Samozřejmě) žádá funkční membránu Interakce s řadou proteinů možná role ABC transportérů (PGP) K+ kanálů (TRH1) Ppasa (AtVP1) a dalších...

67 Membránové transportery konkrétně : Pumpy Přenašeče Kanály řádově vyšší propustnost! tedy je jich málo, biochemie nemusí být dost citlivá... elektrofyziologie!

68

69

70 Další možnost: Planární lipidové dvojvrstvy

71 Patch-clamp techniky mohou měřit i 1 kanál (1 molekulu) Závislost membránového potenciálu na čase I-V křivky

72 I-V křivky

73 I-V křivky (měřený) kationty ven anionty dovnitř anionty ven kationty dovnitř (vložený na membránu)

74 Měření selektivity kanálů - závislost I/V na složení média K+ eflux outside-out patch 100 mm KCl (in and out) 100 mm KCl in 10 mm KCl out K+ influx

75 Co můžeme měřit - shrnutí Recordings of K+ currents in whole cells and in single K+-selective channels of guard cell protoplasts. (1) K+ currents recorded in the whole-cell configuration (see Web Figure 6.2.B) when the membrane potential is clamped at different values. Upward deflections show outward currents; downward deflections show inward currents. K+ concentrations were 105 mm in the pipette and cytoplasm, and 11 mm in the bathing solution outside the cell. (2) Data from the same experiment plotted as an I/V (current/voltage) curve, before and after the addition of Ba2+, an ion that blocks K+ channels. (3) Inward K+ current through a single channel in a membrane patch. (From Schroeder et al )

76 Různé způsoby regulace otvírání a zavírání kanálů 12_24_Gated _ion_chan.jpg

77 Může být i regulace ligandem (ligand gated) nebo obojím Iontové kanály plasmalemmy: ( gated regulace napětím (voltage I křivky whole cell I-V

78 K+ kanály v Arabidopsis K až 10 % sušiny rostlin 35 genů pro K+ transportní systém 15 kanálů Plasmalema (shaker, TPK4) Tonoplast ( ostatní TPK, Kir)

79 inward rectifying K+ kanál aktivován při hyperpolarizaci membrány (Vm < -120mV) ve svěracích buňkách regulován G proteiny a fosforylací inhibován zvýšenými konc cytosolického Ca2+ inhibitor - tetraethylammonium

80 ( rectifying K+ kanály typu shaker (inward Tetramer! + regulační podjednotky! + fosforylace!! (ABA sig.?)

81 KAT1 K+ kanály typu shaker AKT1

82 GORK (guard cell outward rectifying K+ channel, ( shaker (exprese v oocytech)

83 typ KCO1 (outward rectifying K+) TPK regulace Ca2 +! aktivován při depolarizaci membrány

84 Funkce K+ kanálů in planta

85 Ca2+ kanály plasmalemy obecně má transport vápníku přes membrány převážně regulační funkce (na rozdíl od H+ a K+) (wheat root plasma membrane, aktivace depolarizací)

86 Ca2+ kanály plasmalemy aktivované hyperpolarizací (HACC) regulovány ROS, fosforylací selektivnější (Ca; Ca, K; Ca, Ba) aktivované depolarizací (DACC) (např. DAC, rca) různě selektivní (Ca; Ca, K; Ca, Ba, Sr, Mg; maxication Rb až Mn) mechanosensitivní (MCC) aktivované cyklickými nukleotidy (CNGC) 20x v At glutamate receptor-like (GRL) 20x v At

87 ... ale buňka má vápníkových kanálů mnohem víc, a k tomu ještě pumpy... (i na vakuole a ER)

88 Verret et al. 2010, New Phytologist, 187:23-43

89 Iontové kanály tonoplastu a dalších endomembrán

90 Tonoplastový kanál pro jednomocné kationty (K+): regulace ph a Ca 2+ FV fast vacuolar channel: aktivace ph, inhibice Ca2+ VK vacuolar K+: inhibice ph, aktivace Ca2+, nezávislé na napětí (zřejmě TPK1)

91 Vápníkové kanály tonoplastu a dalších endomembrán tonoplastový, aktivace IP3, IP6 tonoplastový, aktivace cadpr voltage-activated, Ca2+ insensitive (VVCa) voltage-activated Ca2+ sensitive (SV, slow vacuolar, TPC1)

92 CICR calcium induced calcium release Ca2+ stimuluje SV (TPC1) calcium channel

93 ( VMAL ) Tonoplastové kanály pro malát Rostlinná specialita! malát 10 mm 20 mm 50 mm 100 mm

94 Tonoplastové kanály pro malát (VMAL) (pohon H+ gradientem)

95 Kanály v regulaci vývojových dějů Příklad: vrcholový růst Zygota Fucus - relokalizace Ca2+ kanálů jako 1. krok

96 Gradienty Ca2+ a ph při vrcholovém růstu 100 nm Ca Fucus rhizoid 450 nm Ca... dtto kořenové vlásky... pylová láčka Ca2+ - CNGC18 - GLR H+ - HATPase

97 Osnova Základní vlastnosti biologických membrán Transport látek přes membránu úvod pumpy přenašeče kanály transport vody Membránový transport v praxi regulace otevírání a zavírání svěracích buněk

98 Transport vody přes membrány: aquaporiny

99 ... ale musí to jít rychle!

100 Akvaporiny Patří do rodiny MIP (Major Instristic Proteins)

101

102

103 Akvaporiny u rostlin Arabidopis - 35 MIP genů 4 podrodiny Plasmatická membrána (PIPs) Tonoplast (TIPs) Small basic intristic proteins (SIPs) nodulin26-like intristic proteins (NIPs)

104 K čemu jsou akvaporiny? SPH simple permeability hypothesis regulace buněčného objemu (jsou nutné?) homeostáze objemu cytoplasmy (model??) zprostředkování pohybu vody... radiálně kořenem Vnímání a regulace osmotického (turgorového) tlaku? Úloha v transportu živin? Akvaporiny přenášejí i NH3 a CO2 a H2O2 (a bór a křemík a...)

105 Osnova Základní vlastnosti biologických membrán Transport látek přes membránu úvod pumpy přenašeče kanály transport vody Membránový transport v praxi regulace otevírání a zavírání svěracích buněk

106 Stomatologie

107 Průduchy: integrace transportních systémů

108

109 Přenašeče, pumpy a kanály - Integrace

110 Otvírání H+ ATPasy (p) pmf hyperpolarizace K+ uptake přes inward rectifier (k) Cl- uptake (asi symportem s H+) (t) a NO3- uptake (symport s H+) (t) produkce malátu (fotosyntesa) pmf na tonoplastu (H+ ATPasa, PPasa (p) Cl- do vakuoly po spádu (k) malát do vakuoly (k, t) H+/K+ antiport (t) voda jde za solemi do vakuoly zvýšení objemu (vakuola) OTEVŘENÍ pumpa, tranporter, kanál

111 Zavírání výtok K+ z vakuoly po spádu a depolarizace (k) výtok Cl- po spádu (k, t) otevření aniont. kanálů depolarizuje plasmalemu (k) aktivace outward rectifying K+ kanálu (k) voda následuje (vytéká ven) snížení objemu ZAVŘENÍ pumpa, tranporter, kanál

112 Membránový tranport ve svěracích buňkách od funkce ke genu

113 Signalizace a regulace ABA, modré světlo, CO 2 zprostředkování změnami v ph a Ca 2+ Signální molekuly - ROS, NO, sfingosin-1- fosfát a další fosfolipidy

114 Signalizace a regulace

115 The Clickable Guard Cell: Electronically linked Model of Guard Cell Signal Transduction Pathways