Membránové transportery - pokračování:

Transkript

1 Membránové transportery - Pumpy pohon ATP, PP pokračování: pro rostliny typické H+ pumpy plasmalemmy, tonoplastu Přenašeče Kanály

2 Plasmalemma: P H+-ATPáza Arabidopsis: genová rodina AHA (11 genů!)

3 Gradienty ph v rostoucích buňkách: příklad pyl. láček a koř. vlásků

4 P-H+ATPázy a "loading"

5

6 Ca- ATPasa (další pumpa P- typu)

7 Dva typy rostlinných Ca2+ pump 1. IIA (ECA) - v ER, není aktivována CaM. 2. IIB (ACA) - v PM, ale i ER a tonoplast.mají autoinhibiční regulační doménu (fosforylace, vazba CaM). Obě jsou P-typu, tedy inhibovány ortovanadátem.

8

9 IIA - ECA IIB -ACA : CaM reg.

10 Fosforylace Ser45 CDPK blokuje aktivaci CAM! - tj. možnost jemného nastavení funkce.

11 V-H+ATPasa

12

13 Připomeňme si: obrátíme-li elektromotor, dostaneme dynamo. F o F 1 ATP synthasa V - ATPasa

14 Specifický inhibitor V H+ATPázy

15 det/cop mutanti Dark Light Dark Light Wild Type det Mutant

16 det3 je mutant C podjednotky V- H+-ATPázy

17 V-H+ATPasa mutace letální pro pyl 13 podjednotek, 27 genů... kolik kombinací??

18 NaCl Rozdíly isoforem: např. regulace podmínkami E-subunit induk. stresem

19 V H+ATPáza se podílí na detoxikaci Cd

20 sůl teplo chlad... a samozřejmě i rozrůznění anatomické, vývojové...

21 Další možné role? kvasinky - homotypic vacuole fusion Drosophila - synaptic vesicle fusion savci - A4 jako ph sensor Arabidopsis - VHA-B1 v Glu signalling!! (Cho, Yoo, Sheen 2006)

22 glucose mannitol low light low nutrient high light

23 V-H+-PPasa (membránová pyrofosfatáza) rostlinná specialita v tonoplastu užívá jako zdroj energie pyrofosfát PPi ("odpad" při polymeraci DNA,RNA a syntetických proc. např. ADPG či UDPG) příbuzné pumpy ale i v plasmalemě bakterií a hmyzu

24 Evoluce rostlinné vakuoly je těsně spojena s evolucí V H+-PPasy, která je nutnou součástí funkčního tonoplastu (minoritně je ovšem lokalizována i do PM) za normálních podmínek i ve stresu.

25 AVP1 - vak. PPasa část proteinu v plasmalemě role v transportu auxinu? overexprese zvyšuje rezistenci k sol. stresu...

26

27 ABC transportery (ATP Binding Cassette) fungují nejen jako na ATP závislé pumpy, ale také jako iontové kanály, či jejich regulátory.

28 ATP vazebná místa.

29 Fungují jako pumpy či "flipázy"? jejich specifita kolísá a jsou klíčové pro řadu detoxifikačních transportů zvl. do vakuoly.

30 Transport dinitrofenolu konjugovaného glutathionem (A) a tetrapyrolového katabolitu chlorofylu (B) ABC transporterem AtMRP2 Zatímco AtMRP1 transportuje jen konjugáty glutathionu

31 ABC a kutikula: CER5 kóduje ABC transp. wt cer5

32

33

34 ABC a transport IAA

35 Modely transportu auxinu Klasicky: přenašeče PIN a AUX/LAX

36 Co dělají PGP (ABC) transportery?

37 ABC a IAA "fenotypy" jen malé

38 Lokalizace klasických PIN IAA výtokových přenašečů není narušena

39 PGP1 je nepolárně lokalizován v mladých pletivech, ale polárně v diferencovaných b.kořene (f). Jeho exprese je aktivována IAA

40 Membránové transportery konkrétně : Pumpy Přenašeče saturovatelné, poháněny gradienty (pmf) Kanály

41 Saturační kinetika přenašeče

42 Model obecného přenašeče

43 Typy přenašečů uniport symport antiport

44

45 Jak studovat transportní procesy?

46 Heterologní exprese: oocyty, kvasinky

47

48 Symport H+/cukry při plnění floemu sucrose-h+ symporters

49 Arabidopsis SUC2 v průvodních buňkách

50 Bramborový SUT1 v sítkovicích

51 Vývojová regulace SUT1/2 mrkve sink source SUT1 SUT2

52 Proč různé přenašeče téhož iontu? Jemné ladění!

53 Jsou i výjimky z pohonu H+ Na + NO 3- coupling

54 Přenašeče auxinu (IAA) ABC transportery (MDR, PGP) PIN AUX/LAX

55 Kudy auxin teče? Přenašeče (efflux carriers): AUX1/LAX1 PINs inhibice fytotropiny (NPA)

56 IAA influx: AUX1 Swarup et al. 2001

57 PIN přenašeče Fenotyp: jako inhibice transportu (efflux) auxinu působením NPA! pin1 mutant

58 PIN proteiny

59 Lokalizace členů PIN rodiny (I. Billou, K. Palme, J. Friml et al.)

60 Co pohání transport auxinu???? (Samozřejmě) žádá funkční membránu Interakce s řadou proteinů možná role ABC transportérů (PGP) K+ kanálů (TRH1) a dalších...

61 Přenašeče na tonoplastu (nejen CAM rostlinám se hodí odkládat malát do vakuoly a jde to nejen přes kanály)

62

63

64

65 Membránové transportery konkrétně : Pumpy Přenašeče Kanály řádově vyšší propustnost! tedy je jich málo, biochemie nemusí být dost citlivá... elektrofyziologie!

66 Měření membránových potenciálů

67

68 Micrograph of a patch pipette attached to the surface of a barley aleurone cell protoplast. (Photo courtesy of J. Schroeder and D. Bush.)

69 Patch-clamp

70

71 Patch-clamp techniky mohou Závislost membránového potenciálu na čase I-V křivky měřit i 1 kanál

72 I-V křivky (měřený) kationty ven anionty dovnitř anionty ven kationty dovnitř (vložený na membránu)

73 Měření selektivity kanálů - závislost I/V na složení média (outside-out patch, K+ kanály)

74 outside-out patch 100 mm KCl (in and out) 100 mm K+ in 10 mm K+ out

75 Co můžeme měřit - shrnutí Recordings of K+ currents in whole cells and in single K+-selective channels of guard cell protoplasts. (1) K+ currents recorded in the whole-cell configuration (see Web Figure 6.2.B) when the membrane potential is clamped at different values. Upward deflections show outward currents; downward deflections show inward currents. K+ concentrations were 105 mm in the pipette and cytoplasm, and 11 mm in the bathing solution outside the cell. (2) Data from the same experiment plotted as an I/V (current/voltage) curve, before and after the addition of Ba2+, an ion that blocks K+ channels. (3) Inward K+ current through a single channel in a membrane patch. (From Schroeder et al )

76 Podobně lze sledovat jakýkoli elektrogenní transport na membráně tedy třeba i činnost H+ pumpy! (Gehwolf et al. FEBS Lett 512:152, 2002)

77 Iontové kanály plasmalemmy: regulace napětím I křivky whole cell I-V

78 Závislost otvírání obec. kanálu na napětí

79 inward rectifying K+ kanál inhibitor - tetraethylammonium

80 K+ kanály typu shaker (inward rectifying) + regulační podjednotky! + fosforylace!! (ABA sig.?)

81 K+ kanály typu shaker (inward rectifying) KAT1 - isoformy! AKT1

82 akt1-1 mutant Rb+ uptake wt akt1-1 10, 100, 1000 µm Rb+ růst

83 KCO1 (outward rectifying K+) regulace Ca2 +! inhlibice Ba+, vápník snižuje prahové napětí pro aktivaci

84 GORK (guard cell outward rectifying K+ channel) (exprese v oocytech)

85 Na napětí nezávislý (a méně selektivní) Na+ kanál příjem sodíku??

86 Ca2+ kanály plasmalemy (wheat root plasma membrane, aktivace depolarizací)

87 Ca2+ kanály plasmalemy aktivované depolarizací (např. DACC, rca) různě selektivní (Ca; Ca, K; Ca, Ba, Sr, Mg; maxication Rb až Mn) aktivované hyperpolarizací mechanosenzitivní nebo induk. elicitory (ROS!) selektivnější (Ca; Ca, K; Ca, Ba) nezávislé na napětí... touch reaction in Arabidopsis

88 ... ale buňka má vápníkových kanálů mnohem víc, a k tomu ještě pumpy... (i na vakuole)

89 Iontové kanály tonoplastu a dalších endomembrán (pohon H+ gradientem)

90 Tonoplastový kanál pro jednomocné kationty (K+): regulace ph a Ca 2+ FV fast vacuolar channel: aktivace ph, inhibice Ca2+ VK vacuolar K+: inhibice ph, aktivace Ca2+

91 Vápníkové kanály tonoplastu a dalších endomembrán tonoplastový, aktivace IP3 tonoplastový, aktivace cadpr ( ryanodin. receptor ) voltage-activated, Ca2+ insensitive voltage-activated Ca2+ sensitive (SV)

92 CICR calcium induced calcium release Ca2+ stimuluje SV calcium channel

93 Aniontové kanály (Cl-) plasmalemmy (svěracích buněk) rychlý (R) pomalý (S) aktivace Ca2+!

94 Tonoplastové kanály pro malát (VMAL) Rostlinná specialita! CAM rostliny! (Kalanchoe) malát 10 mm 20 mm 50 mm 100 mm

95 Kanály v regulaci vývojových dějů Příklad: vrcholový růst Zygota Fucus - relokalizace Ca2+ kanálů jako 1. krok

96 Gradienty Ca2+ a ph při vrcholovém růstu 100 nm Ca 450 nm Ca Fucus rhizoid... dtto kořenové vlásky... pylová láčka (Feijo et al.)

97 Obecný rys vrcholového růstu?... dále sekreční dráha a cytoskelet... (také TRH1 K+ transporter)

98 Transport vody přes membrány: aquaporiny

99 ... ale musí to jít rychle!

100 změny osmolarity Měření transportu vody

101 Jak měřit turgor?

102

103 Tonoplast Intrinsic Proteins různé TIPs v různých typech vakuol! Arabidopsis: 35 genů, 10 prot. ve vakuole, kolik kombinací?

104

105 K čemu jsou akvaporiny? SPH simple permeability hypothesis regulace buněčného objemu (jsou nutné?) homeostáze objemu cytoplasmy (model??) zprostředkování pohybu vody... radiálně kořenem (ALE antisense PIP mutanti?) Vnímání a regulace osmotického (turgorového) tlaku TIPs přenášejí i NH3! (Hill et al. 2004, Martinoia et al. 2007)

106 Osmotické senzory rostlinné buňky

107 Model regulace akvaporinu turgorem

108 Stomatologie

109 Průduchy: integrace transportních systémů

110

111

112 Kanály v plasmalemě svěracích buněk

113 Otvírání 1. H+ ATPasy pmf 2. hyperpolarizace K+ uptake přes inw. rect. 3. Cl- uptake symportem s H+ 4. produkce malátu 5. pmf na tonoplastu (H+ ATPase) 6. Cl- do vakuoly po spádu 7. malát do vakuoly přenašečem? 8. H+/K+ antiport 9. voda jde za solemi do vakuoly

114 Zavírání výtok K+ z vakuoly po spádu a depolarizace 2. výtok Cl- po spádu 3. otevření aniont. kanálů depolarizuje plasmalemu 4. aktivace outward rectifying K+ kanálu 5. voda následuje

115 Regulace ABA, světlo, CO 2 (... via ph...) zprostředkování Ca 2+