UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra anorganické a organické chemie

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra anorganické a organické chemie Diplomová práce Studium lipidových membrán obsahujících prekurzory ceramidů jako modelů atopické dermatitidy Vedoucí práce: Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Hradec Králové 2014 Klára Staňková

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Hradec Králové 2014 Klára Staňková 2

3 PODĚKOVÁNÍ Poděkování patří především mé školitelce doc. PharmDr. Kateřině Vávrové, Ph.D. za její ochotu, trpělivost a cenné rady při zpracování tématu diplomové práce. Dále patří dík Mgr. Petře Pullmannové, Ph.D. a celé katedře anorganické a organické chemie. Za finanční pomoc děkuji Grantové agentuře České republiky ( S), grantu Specifického vysokoškolského výzkumu ( ) a Grantové agentuře Univerzity Karlovy (652412). 3

4 Obsah PROHLÁŠENÍ... 2 PODĚKOVÁNÍ... 3 ABSTRAKT... 6 ABSTRACT ÚVOD A CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST Kůže Stratum corneum (SC) Korneocyty Epidermální lipidy Ceramidy Prekurzory ceramidů a jejich degradace Glukosylceramidy Sfingomyeliny ph Poruchy bariéry SC Atopická dermatitida Psoriáza Ichtyózy Gaucherova choroba Niemann-Pickova choroba EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiály a chemikálie Příprava směsi mastných kyselin Příprava lipidových směsí Příprava lipidových membrán Franzovy difúzní cely Měření elektrické impedance

5 3.7 Permeační pokusy Modelová léčiva Permeace Podmínky HPLC analýzy TEWL Statistické hodnocení dat VÝSLEDKY DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK LITERATURA

6 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra anorganické a organické chemie Kandidát: Klára Staňková Školitel: doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Název diplomové práce: Studium lipidových membrán obsahujících prekurzory ceramidů jako modely atopické dermatitidy Důležitou složkou stratum corneum (SC) jsou ceramidy (Cer), které plní funkci kožní bariéry a brání nadměrným ztrátám vody. Jsou syntetizovány z jejich prekurzorů, sfingomyelinů (SM) a glukosylceramidů (GC), pomocí enzymů sfingomyelinázy a β-glukocerebrosidázy. Jejich snížené množství bylo nalezeno u řady kožních onemocnění, jako je atopická dermatitida, kdy jsou klíčovým faktorem pro suchou kůži a porušenou kožní bariéru. Cílem mé práce bylo studovat permeabilitu u modelů lipidové kožní bariéry obsahujících prekurzory Cer v porovnání s modely zdravé kůže. Modely lipidových membrán SC byly připraveny jako ekvimolární směs Cer nebo jejich prekurzorů (SM nebo GC), cholesterolu, mastných kyselin a z 5 % cholesterol-sulfátu. Permeabilitu modelových membrán jsme vyhodnotili pomocí prostupu theofylinu a indometacinu, transepidermální ztráty vody a elektrické impedance ve Franzových difúzních celách. Množství modelových léčiv, které prostoupilo přes membrány, jsme stanovili HPLC analýzou. Výsledky naší práce byly překvapivé. Permeabilita membrán s obsahem prekurzorů Cer (SM a GC) byla buď srovnatelná, nebo dokonce nižší než permeabilita modelů představujících zdravou kůži. Důvod, proč tomu tak je, potřebuje další studie s modely obsahující celou frakcí Cer lidské SC. 6

7 ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of pharmacy in Hradec Králové Department of inorganic and organic chemistry Candidate: Klára Staňková Supervisor: doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Title of diploma thesis: Study of lipids membranes containing ceramide precursors as models of atopic dermatitis Ceramides (Cer) are important determinants for both water-retention function and permeability-barrier function in the stratum corneum (SC). They are synthesized from their precursors, i.e. sphingomyelin (SM) and glycosylceramide (GC) by the enzymes sphingomyelinase (SMase) and glucocerebrosidase (GCase). Their reduced levels have been found in the skin diseases e.g. in atopic dermatitis, and are also a causative factor for the dry and barrier-disrupted skin. The aim of this study was to prepare model skin lipid membranes simulating the defect of SMase and GCase and study their permeability. Models of SC lipid membranes were prepared as an equimolar mixture of Cer or their precursors (either SM or GC) in different ratios, cholesterol, fatty acid mixture and 5 % of cholesterol sulfate. The permeability of these model membranes was evaluated using permeation of theophylline and indometacin, transepidermal water loss and electrical impedance in Franz diffusion cells. The amount of model drug permeated through the membranes was evaluated using HPLC analysis. The results of our experiment were surprising. The permeability of the membranes with the precursors (SM and GC) was comparable or even lower than the permeability of membranes simulating healthy skin. The reason for this finding will need further study, probably using a model containing the full skin Cer fraction. 7

8 1. ÚVOD A CÍL PRÁCE Stratum corneum (SC) je nejsvrchnější vrstva epidermis. Představuje účinnou bariéru nejen proti vnějším vlivům, jako jsou alergeny, UV záření, mikroby, fyzikální a chemické vlivy, ale i proti nadměrným ztrátám vody z organismu. Vnitřní strukturu SC tvoří korneocyty zakotvené do lipidové lamelární matrix. Lipidy, které se nacházejí ve SC, jsou tvořeny z 95 % ekvimolární směsí ceramidů (Cer), mastných kyselin (MK) a cholesterolu (Chol) a zbylých 5 % tvoří cholesterol-sulfát (CholS). Právě Cer je přisuzována největší role v zajištění správné funkce SC. Díky struktuře molekuly Cer je možné jejich těsné uspořádání a vytvoření několikavrstevné lamelární vrstvy. V dřívějších studiích bylo prokázáno, že epidermální Cer vznikají z jejich prekurzorů a to ze sfingomyelinu (SM) a glukosylceramidu (GC). Přeměna probíhá pomocí hydrolytických enzymů sfingomyelinázy (SMáza) a β-glukocerebrosidázy (GCáza). Právě defekty v těchto dvou enzymech mají za následek snížené množství Cer ve SC, tedy zvýšené množství prekurzorů SM a GC. Tento jev byl popsán u řady kožních onemocnění jako je atopická dermatitida, ichthyosy či u komplexních onemocnění metabolismu sfingolipidů jako je Gaucherův syndrom. Společným znakem těchto chorob je porušená funkce kožní bariéry SC. Tato skutečnost nás vedla k vytvoření hypotézy, že zvýšené množství prekurzorů Cer ve SC (SM, GC) vede ke zvýšené permeabilitě této vrstvy epidermis. Cílem naší práce bylo prokázat či vyvrátit negativní vliv nedostatečné přeměny prekurzorů Cer, SM a GC na Cer. Zjistit, zda ovlivňují funkci membrán složených z lipidů SC jako modelů kožní bariéry. Z parametrů, které charakterizují bariérové vlastnosti SC, jsme sledovali transepidermální ztrátu vody (TEWL), propustnost pro ionty a v neposlední řadě propustnost pro modelová léčiva theofylin and indometacin. 8

9 2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Kůže Kůže je největším orgánem lidského těla. Skládá se ze dvou základních vrstev, dermis a epidermis. Dermis je bohatě prokrvená tkáň zajišťující fyziologickou podporu pro vnější, avaskulární epidermis. 1 Epidermis (pokožka) je epitel skládající se ze 4 vrstev. Ty jsou definovány pozicí, tvarem, morfologií a fázi diferenciace keratinocytů Stratum basale 2. Stratum spinosum 3. Stratum granulosum 4. Stratum corneum Primární funkcí epidermis je tvořit účinný ochranný štít, který se nachází v nejsvrchnější vrstvě SC (Obr. 1). 3 Obr. 1 Funkce SC 9

10 2.2 Stratum corneum (SC) SC slouží jako hlavní bariéra proti vniknutí škodlivin přes kůži, proti vnějším vlivům, které by mohly poškodit organismus (mikroby, alergeny, UV záření, chemikálie atd.). Další funkcí SC je chránit organismus před nadměrnými ztrátami vody. 3 SC se tvoří během epidermální diferenciace kůže. Hlavními komponenty SC jsou extracelulární lipidy a korneocyty Korneocyty Korneocyty jsou nepostradatelné při tvorbě chemické a mechanické bariéry SC. Vznikají z keratinocytů jejich diferenciací, kdy dochází k jejich významným strukturním změnám. V poslední fázi této diferenciace jsou keratinová vlákna seřazena a uspořádaná do svazků vláken. Tento děj je umožněn díky interakci s filaggrinem, který slučuje tyto keratinová vlákna do úzkých svazků. Tím dojde ke změně tvaru buňky na zploštělý. Korneocyty jsou tedy mrtvé, ploché buňky bez organel, vyplněné keratinem. 5, 6 Jsou zakotveny v lipidové lamelární vrstvě, která je složena zejména z Cer, volných mastných kyselin (VMK) a Chol (Obr. 1). 7,8 Povrh korneocytů je tvořen buněčnou obálkou, která se skládá ze dvou částí. Z proteinového (zesíťované proteiny) a lipidového obalu (kovalentně vázán na proteinovou část). Korneocyty jsou navzájem propojeny korneodesmozómy, čímž je zajištěna soudržnost SC Epidermální lipidy Jsou syntetizovány keratinocyty a uchovávány v lamelárních tělískách, které se poprvé objevují ve stratum spinosum. Ty obsahují polární lipidy, fosfolipidy, steroly, glykosfingolipidy a hydrolytické enzymy GCázu a SMázu. 4 Tělíska v poslední fázi diferenciace kerationcytů (na rozhraní stratum granulosum (SG) a SC) migrují k vnější části buňky. Zde se jejich membrána spojí s plazmatickou a dojde k uvolnění lipidů a enzymů do mezibuněčného prostoru. Zde dochází k přeměně polárních lipidů na Cer a VMK. 1, 9 10

11 Obr. 2 Stratum corneum 2.3 Ceramidy Cer jsou hlavní lipidovou složkou lamelární vrstvy SC a je jim přisuzována zásadní role v zajišťování kožní bariéry. 10 Cer jsou hlavními polární lipidy SC, které se liší polární hlavou a průměrnou délkou postranního řetězce. Cer patří do skupiny sfingoidních bazí (sfingozin, fytosfingozin, 6-hydroxysfingozin). Tyto baze tvoří základ molekuly Cer, na jejichž primární aminoskupinu v poloze 2 je amidově vázaná MK. 1 Ta je buď nesubstituovaná, α-hydroxylovaná nebo ω-hydroxylovaná s esterově vázanou kyselinou linolovou. Kombinací sfingoidních bazí a kyselin vzniká 12 strukturních typů Cer (Obr. 3). 11, 12 Původní značení Cer bylo pomocí arabských číslic, podle pořadí eluce při chromatografii. Při objevu nových Cer se toto značení stalo nevýhodným a dnes je více používána nomenklatura podle Motty. Cer jsou označeny kombinací písmen. 13, 14 11

12 Obr. 3 Strukturní typy Cer a jejich názvosloví 12

13 Cer v kombinaci s Chol a MK formují extracelulární lamelární strukturu ve SC, která je nezbytná pro zajištění kožní bariéry. 4 Cer vznikají dvěma hlavními cestami. První zahrnuje degradaci GC a SM za účastí GCázy a SMázy. Druhou cestou Cer vznikají ze serinu a kyseliny palmitové. Děj je katalyzován enzymy palmitoyltransferázou a ceramidsyntázou (Obr. 4). 2 Obr. 4 Syntéza Cer. 15 PC = fosfatidylcholin, DG = diacylglycerol, UDP = uridin difosfát 13

14 Molekula Cer, která se obecně skládá z polární hlavy (malá) a dvou hydrofobních řetězců (dlouhé) umožňuje vytvoření několikavrstevných lamelárních struktur. Funkce jednotlivých Cer zatím není zcela známa. Výjimku tvoří Cer EOS (Cer 1) u kterého se ukázalo, že je hlavní složkou při formaci této lamelární struktury ve SC. 16 Kovalentně se váže na proteiny na povrchu korneocytů a tvoří jeho lipidový obal. 17 Nicméně bylo dokázáno, že na tvorbu nemá vliv pouze celkové množství Cer, ale i jejich distribuce ve SC Prekurzory ceramidů a jejich degradace Jak bylo zmíněno dříve, Cer jsou významnou součástí SC a tvoří přibližně % epidermálních lipidů. 18 Cer jsou nezbytné pro tvorbu kožní bariéry ve SC. 19 Dřívější studie ukázaly, že všechny Cer ve SC, včetně Cer obsahující ω-hydroxy kyselinu jsou odvozeny od GC a Cer 2 a 5 od SM. Oba tyto sfingolipidy jsou zodpovědné za formování epidermální bariéry a jsou také zřejmě regulátory růstu a diferenciace keratinocytů Glukosylceramidy GC jsou jednoduché glykosfingolipidy složené z jednoho molu glukózy a Cer (Obr. 5). 20 Mezi glykosfingolipidy se řadí i acylglukosfingolipidy, které se nachází, stejně jako GC, v lidské SC. 21 Dřívější experimenty ukázaly, že epidermální GC jsou molekulárně heterogenní. Ω-hydroxy GC s esterově vázanou MK nebyly nalezeny v žádné jiné tkáni než v epidermis. 20 Obr. 5 Glukosylceramidy. R se liší v závislosti na budoucím typu Cer. Na rozhrání SC a SG dochází hydrolýzou k odštěpení glukózy za účasti GCázy za vzniku Cer ve SC. Bylo zjištěno, že inhibicí tohoto enzymu dochází k hromadění GC ve SC a tím k mnohonásobnému zvýšení TEWL. Důležitost konverze GC na Cer je v zachování kožní bariéry nepostradatelná. 22 GC jsou hlavními prekurzory několika Cer, 14

15 důležitost má především Cer 1, který je klíčový při tvorbě lamelární vrstvy SC. 20 aktivitu GCázy při degradaci glykosfingolipidů s krátkým uhlovodíkovým zbytkem je potřebný esenciální kofaktor. Jedná se o malý, enzymaticky inaktivní protein SAP-C (sfingolipidy aktivující protein, saposin), který pro svou správnou funkci potřebuje kyselé ph. Degradace glykosfingolipidů s dlouhými uhlovodíkovými zbytky probíhá jednodušeji díky terminálnímu cukru, který se nachází daleko od lipidové dvojvrstvy. Díky tomu je 23, 24 lépe dostupný pro GCázu. Pro Sfingomyeliny SM stejně jako GC, hrají důležitou roli při zajištění Cer ve SC a tím přispívají k tvorbě kožní bariéry. Molekula SM se skládá z Cer, cholinu a H3PO4 (Obr. 6). Obr. 6 Sfingomyelin. R1,2 v molekule SM se liší dle typu subtypu SM v epidermis. Pro SM- 1 se R1=C13 a R2=C23, SM-2 R1=C14, R2=C15 pro SM-3 se R1=C13, R2=α-hydroxy C15 V předchozích studiích bylo zjištěno, že epidermální SM obsahují 3 hlavní podskupiny. SM obsahující MK s dlouhým řetězcem (SM-1, C22-26), MK s krátkým řetězcem (SM-2, hlavně C16) a obsahující α-hydroxy MK s krátkým řetězcem (SM-3, C16-18). Ve všech podskupinách byly jako sfingoidní baze identifikovány sfingozin nebo sfinganin (fytosfyngozin detekován nebyl). Prokázalo se, že pouze epidermální podskupiny SM-1 a SM-3 jsou prekurzory dvou Cer ve SC, Cer 2 (NS) a Cer 5 (AS). Ostatní Cer včetně ω-hydroxy Cer nevznikají ze SM, nýbrž z GC. 25 SM, stejně jako GC a hydrolytické enzymy, jsou uchovávány v lamelárních tělíscích. Na rozhraní SC a SG dochází k exocytóze těchto sfingolipidů a enzymů. Přeměna SM na Cer probíhá pomocí specifické hydrolázy, kyselé SMázy. 26 Pro svoji aktivitu potřebuje SMáza aktivační protein SAP-C, SAP-D. Jak bylo řečeno dříve, pro svou správnou funkci potřebuje optimální kyselé ph

16 2.4.3 ph Hodnoty ph ve SC se různí. V nejsvrchnější vrstvě se ph pohybuje od a ve spodních vrstvách SC se blíží k neutrálním hodnotám. 27 Faktory ovlivňující hodnoty ph můžeme rozdělit do tří skupin: 28 Endogenní faktory, které nesouvisí s patologickými stavy (vývojové změny ph) Endogenní faktory související s klinickými patologickými stavy (vyšší hodnoty ph u atopické dermatitidy) Exogenní faktory (vliv detergentů na ph) Pro optimální aktivitu obou hydrolytických enzymů (SMáza, GCáza) je hodnota ph 5.5. Na zajištění správného ph ve SC se podílí několik fyziologických mechanismů. Jedním z nich je degradace filaggrinu na příslušné aminokyseliny (AK) včetně histidinu. AK jsou vysoce hygroskopické a tvoří základ přirozeného hydratačního faktoru, který je důležitý pro správnou funkci kožní bariéry a hydrataci epidermis. 29,30 Dalším mechanismem okyselování ph je pomocí membránového přenašeče (NHE), který mění sodíkové ionty za protony. Nachází se v plazmatické membráně keratinocytů v epidermis. Acidifikace SC probíhá i prostřednictvím přeměny fosfolipidů na VMK. Hydrolýza 28, 31 probíhá za účasti extracelulární fosfolipázy. 2.5 Poruchy bariéry SC Poruchy v metabolismu lipidů mají za následek strukturální změny ve SC u kožních onemocnění. Výsledkem je selhání funkce SC jako kožní bariéry Atopická dermatitida AD je zánětlivé kožní onemocnění, které je charakterizováno poruchou v bariéře SC. Díky tomu je umožněn vstup alergenů, dráždivých látek a mikrobů do kůže, kdy dochází k zánětu a k dalšímu poškození bariéry SC. Kůže je proto náchylná k podráždění a 10, 32 k vysušení. U pacientů s AD (v porovnání se zdravou epidermis) bylo zjištěno snížené množství lipidů a sterolů, změny v uspořádání Cer ve SC a v neposlední řadě také zvýšené množství VMK. Dále se ukázalo, že množství kovalentně vázaných ω-hydroxycer, je u 16

17 AD asi o polovinu sníženo. V důsledku této změny dochází ke zvýšeným hodnotám TEWL 33, 34, 35 a snížené hydrataci SC (Obr. 7). Jedním z vysvětlení pro tento stav je snížená aktivita SMázy, která hydrolyzuje SM na Cer (Obr. 7). Dalším mechanismem změny Cer ve SC u AD je zvýšené množství enzymů GC-deacylázy a SM-deacylázy. Pro tyto enzymy jsou substrátem SM a GC stejně jako pro GCázu a SMázu. Dochází k jejich redukci na VMK a sfingosyl-fosforylcholin. 36 Obr. 7 TEWL, hydratace a aktivita SMázy u AD. 36 * označuje statisticky významné rozdíly v hodnotách oproti kontrole U pacientů s AD nacházíme zvýšené hodnoty ph, které jsou spojovány s vysušenou pokožkou, podrážděním a symptomy typickými pro ekzematózní stavy. 37 Mezi faktory, které přispívají ke změnám ph SC u AD, patří nedostatek VMK, redukované množství 31, 38, 39 filaggrinu a také změna v membránovém přenašeči. Důležitým modulátorem koncentrace Cer ve SC je i SAP. U AD bylo zjištěno snížené množství jeho prekurzoru, prosaposinu. Tyto výsledky by mohly vysvětlovat abnormální formaci SC prostřednictvím snížené aktivity SMázy a GCázy. 40 Na sníženém množství Cer ve SC se podílí i bakteriální osídlení. Pseudomonas aeruginosa a příbuzné kmeny produkují enzym ceramidázu. Ten štěpí Cer na VMK a sfingozin. Tento jev je dalším faktorem, který negativně ovlivňuje funkci kožní bariéry SC u pacientů s AD

18 2.5.2 Psoriáza Psoriáza je chronické zánětlivé onemocnění. U pacientů s psoriázou nacházíme změnu složení Cer ve SC, zvýšenou proliferaci keratinocytů a nekompletní diferenciaci, která vede k rozrušení rohové vrstvy. Stejně jako u AD i u psoriázy se našlo snížené množství prosaposinu, prekurzoru SAP. V jiné studii bylo zjištěno snížené množství hydrolázy GCázy v porovnání s kontrolními vzorky. Co se týče složení Cer ve SC s psoriázou, byl popsán deficit Cer1 a Cer obsahující jako sfingoidní bazi fytosfingozin. Naopak bylo nalezeno vyšší množství Cer s obsahem sfingozinu. Následkem jsou zvýšené hodnoty TEWL, které jsou přibližně 3x vyšší. 42, 43, Ichtyózy Ichtyózy zahrnují velkou skupinu jak genetických tak získaných hyperkeratóz charakterizované ztluštělou a šupinatou SC. Patří sem mírné formy jako je ichthyosis vulgaris i život ohrožující stavy jako je harlekýnská ichtyóza. Ichtyóza se vyvíjí také u komplexních onemocnění metabolismu lipidů jako je např. Gaucherova choroba, Nieman-Pickova choroba, Faberova choroba a další Gaucherova choroba Jedná se o vzácné genetické onemocnění charakterizováno sníženým množstvím nebo funkční nedostatečností GCázy. Dochází ke zvýšené koncentraci GC a sníženému množství Cer ve SC, ale také ve slezině, játrech, ledvinách, mozku, plicích a kostní dřeni. Co se týče funkce kožní bariéry, ta je snížená. Hodnoty TEWL jsou oproti kontrole (zdravá 45, 46 SC) mnohonásobně vyšší Niemann-Pickova choroba Onemocnění je způsobeno mutací v hydroláze SMáze. Snížená aktivita je vysvětlována i akumulací sfingozinfosforylcholinu, který vzniká ze SM pomocí enzymu SM-deacylázy. Ukázalo se, že i aktivita tohoto enzym je u Nieman-Pickovy choroby ovlivněna. Zvýšenou koncentraci SM pak nacházíme ve SC a v makrofázích v játrech, 47, 46 slezině a kostní dřeni. 18

19 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Materiály a chemikálie N-lignoceroyl-D-erythro-sfingosin (CerNS, syntetický, čistota > 99 %) sfingomyelin (SM, z vaječného žloutku, čistota > 99 %, 86 % N-hexadekanoyl-Derythro-sfingosylfosforylcholin) a cerebrosid (GC, z prasečího mozku, čistota >99 %, směs 58 % ceresinu s nehydroxylovanými acyly, převážně C24, a 42 % frenosinu s hydroxylovanými acyly) byly zakoupeny z firmy Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA). Ostatní látky a rozpouštědla jsme objednali z Sigma-Aldrich Chemie Gmbh (Schnelldorf, Německo). NucleoporeTM polykarbonátové membrány s velikosti pórů µm byly od Whatman (Kent, Maidstone, Velká Británie). Vodu, kterou jsme použili k přípravě vodných roztoků, jsme připravili systémem čištění Millipore Q. 3.2 Příprava směsi mastných kyselin Směs mastných kyselin (MK) byla připravena v molárním % zastoupení, které koresponduje se složením v lidské kůži: 1,8 % palmitová kyselina, 4,0 % stearová kyselina, 7,6 % arachidová kyselina, 47,8 % behenová kyselina, 38,8 % lignocerová kyselina. 47 Navážené množství MK (ᴓMW = 345,57 g/mol) jsme rozpustili v jedné vialce ve směsi hexan: 96% ethanol v poměru 2:1 (v/v), aby došlo k vytvoření homogenní směsi MK. Na vakuové odparce jsme poté rozpouštědlo odpařili a pro úplné odstranění organických rozpouštědel jsme vzniklou směs nechali dosušit do druhého dne ve vakuovém exsikátoru nad parafínem a P2O Příprava lipidových směsí Kontrolní vzorek, který svým složením simuloval správnou funkci SC, jsme připravili jako ekvimolární směs Cer, Chol a připravených MK, s přídavkem 5 hmotnostních % CholS. Pro další vzorky, které představovaly modely SC s porušenou funkcí kožní bariéry, jsme Cer nahradili prekurzory (SM a GC), a to v různém % molárním zastoupení (Tab. 1). Hmotnosti každé jednotlivé složky (Cer, SM, GC, MK, Chol, CholS) ve všech vzorcích jsme sečetli, navážili a poté rozpustili. 19

20 Cer, Chol a MK jsme rozpustili ve směsi hexan:96% ethanol v poměru 2:1 (v/v) (1mg/100 µl), SM a GC ve směsi hexan:96% ethanol v poměru 1:1 (v/v) (1mg/100 µl), CholS v 96% ethanolu (1mg/100 µl). Z takto vzniklých roztoků jsme poté připravili požadované lipidové směsi. Do každého vzorku jsme rozpipetovali taková množství, která odpovídala jejich procentuálnímu zastoupení. Organické rozpouštědlo jsme odstranili pod proudem dusíku a dosušením ve vakuovém exsikátoru (parafín, P2O5) do druhého dne. Tab. 1 Molární % Cer, SM a GC z celkového množství sfingolipidů v modelech s porušenou funkcí kožní bariéry SM nebo GC Cer 25% 75% 50% 50% 75% 25% 100% 0% 3.4 Příprava lipidových membrán Lipidové směsi jsme naředili ve směsi rozpouštědel hexan:ethanol 96% v poměru 2:1 (v/v) na koncentraci 4,5 mg/1 ml. Poté jsme si připravili podkladové polykarbonátové filtry Nucleopore s póry o velikosti 0,015 µm (Whatman, Kent, Velká Británie). Filtry jsme upravili na požadovanou velikost (1,5 x 1,5 cm) a před nanesením lipidové směsi jsme filtry promyli v lázni hexan: ethanol 96% v poměru 2:1 (v/v) po dobu 5 minut kvůli odstranění případných nečistot. Po usušení na filtračním papíře v Petriho misce jsme membrány upevnili do kovových držáků s kruhovou výsečí o průměru 1cm. V dalším kroku jsme nanesli roztoky lipidů na filtry. Nástřik byl proveden pod proudem dusíku za použití Linomatu IV (Camag, Muttenz, Švýcarsko). Přístroj byl pro naše účely nastaven tak, aby nanesená plocha byla 1x1 cm a nanášecí hlava se pohybovala i v ose y. Rychlost 170 nl/s a dávkování 100 µl byly nastaveny v programu wincats. Z každého vzorku (SM, GC, kontrola) jsme připravili 7 membrán. Celkem ze všech vzorků tedy 63 membrán. Nanášení lipidové směsi vzorku na jednu membránu jsme prováděli celkem 3x z různých úhlů. Objem nanesený v jednom nástřiku byl 100 µl pomocí dávkovací stříkačky o stejném objemu. Tímto způsobem nám vznikla souvislá lipidová vrstva o tloušťce přibližně 11 µm. Vzniklé modely membrán SC jsme uchovávali v mrazáku při -20 C. 20

21 Den před pokusy jsme lipidové membrány zahřáli na 90 C (teplota nad hlavním fázovým přechodem, která byla zjištěna diferenční skenovací kalorimetrií). Při této teplotě jsme membrány zahřívali po dobu 10 minut. Následným pomalým chladnutím (cca 4 hodiny) na pokojovou teplotu jsme zajistili vznik lamelární struktury. Membrány jsme poté 24 hodin inkubovali v Petriho miskách v termostatu při konstantní teplotě 32 C. 3.5 Franzovy difúzní cely Pomocí Franzových difúzních cel jsme mohli studovat permeabilitu modelů SC. Jedná se o cely z borosilikátového skla skládající se ze dvou hlavních částí. Z části donorové (vrchní díl) s difúzní donorovou plochou 0,5 cm 2 a z části akceptorové (spodní díl) s objemem akceptorové fáze 6,5 ml. Lipidové membrány SC jsme vložili mezi teflonové držáky. Takto upevněné membrány jsme poté vložili mezi 2 hlavní kompartmenty cely a po stranách upevnili k cele gumičkami. Membránu jsme orientovali lipidovou vrstvou směrem k donorové části. Akceptorovou část jsme naplnili izotonickým fosfátovým pufrem o ph 7,4 s gentamycinem o koncentraci 50 mg/l. Objem pufru (přibližně 10 ml) byl pro každý jednotlivý vzorek individuální a byl zahrnut do konečného výpočtu. K zajištění míchání jsme do akceptorové části vložili míchadlo. Takto sestavené Franzovy cely s membránami jsme poté vložili do vodní lázně o teplotě 32 C a nechali ustálit teplotu akceptorové fáze a hydrataci lipidových membrán do druhého dne. 3.6 Měření elektrické impedance Elektrická impedance charakterizuje membrány z hlediska jejich propustnosti pro ionty. Před samotným měřením jsme na membránu v donorové části aplikovali 500 µl fosfátového pufru (ph = 7,4). Poté jsme provedli vlastní měření pomocí LCR přístroje 4080 (Conrad Electronic, Hirschau, Německo, měřící rozpětí 20 Ω - 10 MΩ, chyba v kω hodnotách < 0,5 %), v nastaveném paralelním režimu s frekvencí 120 Hz). Přístroj byl vybaven dvěma sondami. Jednu jsme opatrně ponořili do pufrovací fáze v donorové části a druhou jsme ponořili přes raménko Franzovy cely do části akceptorové. Měření probíhalo pro každou celu nejméně 2x a všechny hodnoty byly po ustálení zaznamenány. Po dokončení měření jsme pufr z membrány v donorové části opatrně odstranili pomocí celulozových tampónů. 21

22 3.7 Permeační pokusy Modelová léčiva Jako modelová léčiva jsme zvolili teofylin (TH, M = g/mol, log P ~ 0) pro svou vyváženou lipofilitu a malou molekulu a indometacin (IND, M = g/mol, log P ~ 4.3) jako léčivo lipofilnější s větší molekulou. Připravili jsme si jejich suspenze v 60% vodném roztoku propylenglykolu. TH v koncentraci 5 % (w/v) a IND v koncentraci 2 % (w/v). Po naředění ve vialce jsme vzorky zahřáli po dobu 5 minut a poté vložili do termostatu o teplotě 32 C. Před použitím pro permeační pokusy jsme suspenze obou modelových léčiv homogenizovali vložením do automatické třepačky Permeace Po změření elektrické impedance jsme membrány důkladně vyčistili a poté aplikovali 100 µl modelového léčiva na povrch membrány. Prvně jsme aplikovali TH. Po skončení experimentu s TH jsme provedli pokusy s IND. Po dobu 8 hodin jsme každé 2 hodiny odebírali vzorky raménkem akceptorové části. Celkem 4x během 8 hodin (v čase 0, 2, 4, 8 hod). Pipetou jsme odebírali přesně 300 µl a tento objem napipetovali do vialky s insertem. Odpipetovaných 300 µl pufru jsme poté do Franzových cel doplnili pufrem novým. Po posledním odběru (po 8 hod) jsme pufr z akceptorové části opatrně vylili. Membránu jsme promyli fosfátovým pufrem pro odstranění TH a poté pufr vysušili pomocí celulozových tampónů. Takto očištěné Franzovy cely jsme znovu naplnili čistým pufrem a nechali v lázni (32 C) temperovat do druhého dne. Druhý den jsme napipetovali 100 µl druhého modelového léčiva, IND. Postup byl stejný jako u TH. Měření množství léčiva probíhalo pomocí HPLC analýzy. Výstupem byly hodnoty udávající kumulativní množství TH a IND (µg), které prošlo do akceptorové fáze přes membránu v daných časech (0, 2, 4, 8 hod). Data jsme zpracovali do permeačních profilů pro membrány se SM, GC a pro kontrolní vzorek (Obr. 9). Lineární regresí jsme z nich poté vyhodnotili flux TH a IND [µg/cm 2 /h] Podmínky HPLC analýzy Vzorky modelových léčiv, TH a IND, byly měřeny za izokratický podmínek na revezrní fázi HPLC. Měření probíhalo na přístroji Shimadzu Prominence (Shimadzu, Kyoto, Japonsko). Přístroj se skládal z pumpy LC-20AS s odplyňovačem DGU-20A3, autosampleru SIL-20A HT, kolonového termostatu CTO-20AC, diode array detektoru 22

23 SPD-M20A a komunikačního modulu CBM-20A. Analýza probíhala pomocí softwaru LCsolutions Metody pro IND a TH byly validovány dříve. Separaci TH jsme provedli na koloně LiChroCART (LiChrospher 100 RP-18, 5 µm, Merck) při 35 C a průtoku 1,2 ml/min. Jako mobilní fázi jsme použili methanol/0,1m NaH2PO4 4:6 (v/v). UV absorpce vzorků s TH byla analyzovaná při vlnové délce 272 nm. Na kolonu bylo nastříknuto 20 µl. Retenční čas TH byl 2,9 ± 0,1 min. Analýza IND probíhala na koloně LiChroCART (LiChrospher 100 RP-18, 5 µm, Merck) při 40 C a průtoku 2 ml/min. Jako mobilní fázi jsme při tomto měření použili acetonitril/voda/kyselina octová 90:60:5 (v/v/v). Měření UV absorpce vzorku bylo provedeno při vlnové délce 270 nm. Na kolonu jsme nanesli 100 µl vzorku. Retenční čas IND byl 3,1 ± 0,1 min. 3.8 TEWL Transepidermální ztráta vody (TEWL) je dalším důležitým parametrem pro hodnocení funkce SC jako kožní bariéry. Udává množství vody, které projde jednotkou plochy za jednotku času [g/h/m 2 ]. Měření jsme prováděli ve Franzových celách, u kterých jsme odstranili vrchní donorovou část. Měření probíhalo tzv. otevřenou metodou. Okolní podmínky během měření byly srovnatelné pro všechny vzorky. Relativní vlhkost byla v rozmezí % a teplota vzduchu C. Pomocí přístroje Tewameter TMP 300 připojeného k Multi Probe Adapter Cutometer MPA 580 (CK electronic GmbH, Köln, Německo) jsme zjistili hodnoty pro jednotlivé modely. Měřící sondu jsme přiložili na povrch membrány umístěné v teflonovém držáku. Tlakový gradient vypařované vody byl nepřímo změřen za pomocí dvou senzorů měřící sondy (teplota a relativní vlhkost), které se nacházely v různých výškách dutého válce o průměru 1 cm a výšce 2 cm. Po dobu s jsme měřili jednotlivé hodnoty. Po ustálení jsme hodnoty pro jednotlivé modely zaznamenali. Pro přesné výsledky jsme výsledné hodnoty vynásobili koeficientem 1,3, který byl zjištěn kalibrací tohoto způsobu měření. 48 Důvodem bylo umístění membrány v teflonovém držáku. Tím došlo ke zmenšení otvoru (průměr 0,8 cm) a zvětšení vzdálenosti k povrchu membrány (6 mm). 23

24 3.9 Statistické hodnocení dat K porovnání kontrolního vzorku a vzorků s různým obsahem SM nebo GC byla použita analýza rozptylu s Dunettovým post-testem (na hladině pravděpodobnosti p < 0,05). Data jsou prezentována jako průměr ± střední chyba průměru. 24

25 4. VÝSLEDKY Cílem naší práce bylo prokázání či vyvrácení spojitosti mezi obsahem prekurzorů Cer (SM, GC) a sníženou funkcí kožní bariéry ve SC. Připravili jsme lipidové membrány, ve kterých jsme v různých molárních % nahradili Cer jejich prekurzory (SM, GC). Pro hodnocení permeability těchto modelů SC jsme použili 4 markery a to elektrickou impedanci [kω cm 2 ], flux TH [µg/cm 2 /h], flux IND [µg/cm 2 /h] a stanovení TEWL (g/m/h 2 ). Prvním parametrem, který jsme zjišťovali, byla elektrická impedance jako ukazatel propustnosti modelových lipidových membrán pro ionty (Obr. 8). Hodnota elektrické impedance byla vztažena na jednotku plochy. Výsledky jsme uváděli v jednotkách [kω x cm 2 ]. Čím byly hodnoty vyšší, tím nižší byla propustnost lipidových membrán pro ionty. Impedance kontrolního vzorku byla 85 kω x cm 2. Jak u vzorků se SM, tak u vzorků s obsahem GC jsme zjistili, že se zvyšujícím se množstvím prekurzorů Cer (SM, GC) ve vzorku propustnost membrány pro ionty klesá. Výraznější efekt jsme zaznamenali u GC, kdy maximální hodnota elektrické impedance dosáhla hodnoty 514 kω x cm 2 u vzorku se 75 molárními % GC. Nejvyšší hodnota u modelů obsahujících SM byla zaznamenána také u 75 molárních % SM a činila 521 kω x cm 2. Obr. 8 Elektrická impedance. Závislost elektrické impedance na množství SM (A) a GC (B) ve vzorku. * značí statisticky významný výsledek ve srovnání s kontrolním vzorkem (p < 0,05). 25

26 Dalším markerem pro hodnocení permeability lipidových membrán byl flux modelových léčiv (IND, TH) [µg/cm 2 /h] (Obr. 3, Obr. 4). Flux jsme vyhodnotili lineární regresí z permeačních profilů modelů se SM, GC a kontrolního vzorku (Obr. 9). Jednotlivé profily znázorňují závislost kumulativního množství léčiva, které prošlo membránou za jednotku času. V každém grafu je znázorněn pro srovnání kontrolní vzorek (0 % SM, GC). Směrnicemi přímek jsme stanovili flux TH a IND. Obr. 9 Permeační profily modelových léčiv. Permeační profil vzorků s obsahem SM pro TH (A) a IND (B) a vzorků s obsahem GC pro TH (C) a IND (D). U obou grafů pro flux TH první černý sloupeček charakterizuje kontrolní vzorek (100 % CerNS): flux TH = 0,32 µg/cm 2 /h. U modelů obsahujících SM (A) se flux v porovnání s kontrolou výrazně neměnil. Pouze u modelů se 75 molárními % SM jsme zaznamenali nižší hodnotu, která činila 0,13 µg/cm 2 /h. Tudíž, i nižší propustnost membrány pro TH. U vzorků s obsahem GC pozorujeme statisticky významné změny. Se 26

27 vzrůstajícím množstvím GC ve vzorku výrazně klesla propustnost membrán pro TH až na hodnotu 0,05 µg/cm 2 /h u vzorku, kde bylo 100 % Cer nahrazeno GC. Obr. 10 Flux teofylinu. V grafech je zaznamenán flux [µg/cm 2 /h] TH v modelech obsahujících SM (A) a GC (B). * značí statistický významnou změnu v porovnání s kontrolou (p < 0,05) Co se týče druhého modelového léčiva, IND, u membrán obsahujících SM (C) (kromě vzorků s 25 % SM = 0,40 µg/cm 2 /h) jsme zjistili klesající tendenci hodnot fluxu, tedy klesající propustnost membrán pro IND v porovnání s kontrolou (100 % CerNS = 0,19 µg/cm 2 /h, černý sloupeček). V grafu modelů obsahující GC vidíme podstatně výraznější změny oproti kontrolnímu vzorku. Hodnoty fluxu IND významně klesají s vyšším % molárním zastoupením GC, kdy u vzorků se 100 % GC se flux přibližoval hodnotám blízkým nule (100 % GC = 0,01 µg/cm 2 /h). 27

28 Obr. 11 Flux indometacinu. V grafech jsou znázorněny hodnoty fluxu [µg/cm 2 /h] IND pro modely s obsahem SM (C) a GC (D). * značí statistický významné změny hodnot v porovnání s kontrolou. TEWL u membrán se SM má pozvolnou tendenci se zvyšovat, tedy dochází k vyšším ztrátám vody přes tyto membrány. Výraznější efekt nastal u modelů s 50 % SM s hodnotou 5,85 g/h/m 2 a v modelech obsahující 100 % SM s hodnotou 7,28 g/h/m 2. U modelů s GC jsme zaznamenali efekt zvýšené transdermální ztráty pouze u modelů s 50 % GC, kdy hodnota činila 6,76 g/h/m 2. Další (25, 75, 100 %) se od kontroly liší nepatrně (100 % CerNS = 3,9 g/h/m 2, černý sloupeček). Obr. 12 TEWL. Grafy znázorňují transepidermální ztrátu vody [g/h/m2] (TEWL) pro modely se SM (A) a GC (B). 28

29 AD. 36 Dosavadní výsledky nás vedly k úsudku, že se sníženým zastoupením Cer ve SC a 5. DISKUZE Naším úkolem bylo zjistit vliv prekurzorů Cer (SM a GC) na funkci SC jako kožní bariéry. V dřívějších studiích bylo zjištěno, že právě Cer se nachází v menším množství ve SC u pacientů s AD, než je tomu u kůže zdravé. Jedná se hlavně o Cer 1(EOS), 2(NS) a 3(NP). 49 V dalších experimentech se potvrdila domněnka, že SM a GC jsou prekurzory Cer. Jejich přeměna na Cer probíhá za účasti specifických hydroláz SMázy a GCázy. 15,20 Právě defekty v těchto enzymech mohou zapříčinit hromadění SM a GC ve SC a tím způsobit defekty v kožní bariéře. Snížená specifická aktivita SMázy byla detekována u vyšším obsahem jejich prekurzorů SM nebo GC, bude kožní bariéra narušena. Proto jsme pro naše pilotní studie zvolili složení lipidových směsí, které napodobují poruchy uvolnění Cer z jejich prekurzorů. Postupně jsme v daných molárních % nahradili Cer ve vzorku SM nebo GC. Jako kontrola nám sloužil vzorek se 100 % Cer. Zastoupení Cer se poté snižovalo postupně na 75 %, 50 %, 25 % a 0 %, zbylá procenta tvořily SM nebo GC. Pro naše pokusy byl zvolen Cer2(NS), který, jak bylo zmíněno dříve, je u AD zastoupen v menším množství. Pro hodnocení permeability kožní bariéry SC jsme použili 4 markery: TEWL, elektrickou impedanci a flux modelových léčiv TH a IND. Předpokládali jsme, že u modelů s vyšším % molárním zastoupením SM nebo GC budou výsledné hodnoty potvrzovat hypotézy o jejich negativním vlivu na kožní bariéru navržené na základě in vivo pokusů. Naše výsledky však naši hypotézu nepotvrdily. Při hodnocení SC pomocí TEWL jsme dle předchozích studií 38 očekávali, že výsledné hodnoty vzorků s obsahem SM nebo GC budou výrazně vyšší než u kontrolního vzorku. Tuto domněnku jsme v naší analýze nepotvrdili. U vzorků obsahujících SM, jsme zaznamenali pouze mírný nárůst hodnot se zvyšujícím se % zastoupením SM. Modely s obsahem GC žádné výrazné změny v hodnotách TEWL oproti kontrole nejevily. Z toho vyplývá, že SM a GC v modelech lipidových membrán nemají významný vliv na transepidermální ztrátu vody. Dle minulých studií, kdy byly zjištěny snížené hodnoty elektrické impedance u AD 50, jsme v našem experimentu předpokládali nižší hodnoty. Výsledné hodnoty však ukazují, že vzorky se zvyšujícím se % zastoupením SM nebo GC, vykazují nižší 29

30 propustnost pro ionty. To představuje potencovanou funkci bariéry pro modely simulující kožní onemocnění. Významné rozdíly v hodnotách jsme nalezli u vzorku s obsahem GC. Kdy se zvyšujícím se množstvím GC v modelech, propustnost pro ionty klesala. Odchylky od vzorků se SM tak výrazné nebyly. Další hodnocení lipidových membrán jsme prováděli pomocí fluxu modelových léčiv, TH a IND. Výsledky znázorňují prostup exogenních látek přes kůži. Vzhledem k faktu, že bylo u pacientů s AD nalezeno snížené množství Cer, kterým je přisuzována největší role při zajišťování kožní bariéry, jsme předpokládali zvýšený flux modelových léčiv. 10, 51 Naše hypotéza, pro zvýšenou permeabilitu SC s větším obsahem GC nebo SM, se však nepotvrdila. U vzorků se SM jsme výrazné změny oproti kontrole nezaznamenali. Znamená to, že SM plní stejnou funkci jak Cer v zajištění kožní bariéry. Naopak, se zvýšeným obsahem prekurzorů GC, se výrazně zlepšovala funkce proti modelovým léčivům. Platí pravidlo, že čím vyšší je % molární zastoupení GC v membránách, tím je nižší propustnost. Výsledkem naší práce tedy je, že není přímá souvislost mezi zvýšenou permeabilitou modelů SC a obsahem prekurzorů Cer, SM a GC. Naopak, SM a GC dle našeho experimentu permeabilitu snižují. Vysvětlením může být příliš jednoduchý model, ve kterém jsme použili pouze jeden typ Cer (Cer2,NS). Je však třeba zmínit, že v další navazující práci, kdy byla izolována frakce Cer z lidské SC, byly potvrzeny hypotézy, navrhující negativní vliv nedostatečné hydrolýzy SM na Cer na propustnost lipidové kožní bariéry. Hodnoty fluxu, elektrické impedance i TEWL nasvědčovaly jejich nepříznivému vlivu na funkci kožní bariéry

31 6. ZÁVĚR Cílem této práce bylo potvrzení či vyvrácení hypotézy o negativním vlivu prekurzorů Cer (SM, GC) na kožní bariéru SC. Pro studium byly zvoleny vzorky s obsahem 100 molárních % Cer a dále vzorky, ve kterých byly Cer postupně nahrazovány SM nebo GC v daném % zastoupení (25, 50, 75, 100 %). Permeabilitu našich lipidových modelů jsme hodnotili pomocí elektrické impedance, TEWL a fluxu modelových léčiv (TH, IND). Výsledky naší práce nepotvrdily náš předpoklad o zvýšené permeabilitě vzorku s obsahem SM nebo GC. Právě naopak, se zvyšujícím se obsahem prekurzorů Cer se funkce kožní bariéry zlepšovala. Pro modely s obsahem GC byl tento efekt výraznější než u modelů obsahující SM. Závěrem práce je tedy nepotvrzení naší domněnky o záporném vlivu prekurzorů Cer (SM, GC) na základní funkci SC jako kožní bariéry. Část této práce je součástí publikace: Pullmannová, P., Staňková K., Pospíšilová, M., Školová, B., Zbytovská, J., Vávrová, K. Effects of sphingomyelin/ceramide ratio on the permeability and microstructure of model stratum corneum lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 2014, in press. 31

32 7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AP Cer CerNS DG GC GCáza HPLC IND MK PC SAP SC SG SM SMáza TEWL TH VMK UDP atopická dermatitida ceramidy N-lignoceroyl-D-erythro-sfingosin diacylglyceroly glukosylceramidy β-glukocerebrosidáza vysokoúčinná kapalinová chromatografie indometacin mastné kyseliny fosfatidylcholin sfingolipidy aktivující protein stratum corneum stratum granulosum sfingomyeliny sfingomyelináza transepidermální ztráta vody theofylin volné mastné kyseliny uridin difosfát 32

33 8. LITERATURA 1 Vávrová K., Hrabálek A., Role ceramidů v kůži. Prakt. lékárensví 2006; 2: Bouwstra JA, Honeywell-Nguyen PL, Gooris GS, et. al. Structure of the skin barrier and its modulation by vesicular formulations. Prog Lipid Res 2003; 42: Kligman A.M. The biology of the stratum corneum, V knize The epidermis 1964; Elias P. M., Menon G.K. Structural and lipid biochemical correlates of the epidermal permeability barrier. Adv Lipid Res 1990; 24: Palmer, C. N., Irvine, A. D., Terron-Kwiatkowski, et al. Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis. Nat Genet 2006; 38: Proksch, Ehrhardt, Brandner J.M., Jensen J.M.. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol 2008; 17(12): Downing D. T., Lipid and protein structures in the permeability barrier of mammalian epidermis. J Lipid Res 1992; 33(3): Elias P.M., Menon G.K., Structural and lipid biochemical correlates of the epidermal permeability barrier. Adv Lipid Res 1991; 24: Schurer, N. Y., Elias P.M. The biochemistry and function of stratum corneum lipids. Adv Lipid Res 1990; 24: Coderch, L., López, O., de la Maza, A., et al. Ceramides and skin function. Am J Clin Dermatol 2003; 4(2): Squier C.A., Cox P., Wertz P.W. Lipid content and water permeability of skin and oral mucosa. J Invest Dermatol 1991; 96: Wertz P.W., Downing D.T. Ceramides of pig epidermis: structure determation. J Lipid Res 1983; 24: Squier, C. A., Cox, P., Wertz, P. W. Lipid content and water permeability of skin and oral mucosa. J Invest Dermatol (1) 14 Motta, S., Monti, M., Sesana, S., et al. Ceramide composition of the psoriatic scale. BBA-Mol Basis Dis 1993; 1182(2): Uchida, Y., Hara, M., Nishio, H., et al. Epidermal sphingomyelins are precursors for selected stratum corneum ceramides. J Lipid Res 2000; 41(12): Bouwstra, Joke A., et al. Role of ceramide 1 in the molecular organization of the stratum corneum lipids. J Lipid Res 1998; 39(1):

34 17 Wertz P.W., Downing D. T. Covalently bound ω-hydroxyacylsphingosine in the stratum BBA-Lipid Lipid Met 1987; 917(1): Imokawa, G., Akasaki, S., Hattori, M., et al. Selective recovery of deranged waterholding properties by stratum corneum lipids. J Invest Dermatol 1986; 87(6) 19 Geilen, C. G., Wieder T., Orfanos C.E. Ceramide signalling: regulatory role in cell proliferation, differentiation and apoptosis in human epidermis. Arch Dermatol Res 1997; 289(10): Hamanaka, S., Hara, M., Nishio, H., et al. Human epidermal glucosylceramides are major precursors of stratum corneum ceramides. J Invest Dermatol 2002; 119(2): Gray, G. M., R. J. White, J. R. Majer. 1-(3 -O-acyl)-glucosyl-N-dihydroxypentatriacontadienoylsphingosine, a major component of the glucosylceramides of pig and human epidermis. BBA-Lipid Lipid Met 1978; 528(1): Holleran, W. M., Takagi, Y., Menon, G. K., et al. Processing of epidermal glucosylceramides is required for optimal mammalian cutaneous permeability barrier function. J Clin Invest 1993; 91(4): Holleran W. M., Ginns E. I., Menon G. K., et al. Consequences of beta-glucocerebrosidase deficiency in epidermis. Ultrastructure and permeability barrier alterations in Gaucher disease. J Clin Invest 1994; 93: Schuette C. G., Pierstorff B., Huettler S., et al. Sphingolipid activator proteins: proteins with complex functions in lipid degradation and skin biogenesis. Glycobiology 2001; 11(6): Uchida Y., Hara M., Nishio H,.et al. Epidermal sphingomyelins are precursors for selected stratum corneum ceramides. J Lipid Res 2000; 41(12): Rabionet M., Gorgas K., Sandhoff R. Ceramide synthesis in the epidermis. BBA-Mol Cell Biol L Öhman H., Vahlquist A. The ph gradient over the stratum corneum differs in X-linked recessive and autosomal dominant ichthyosis: a clue to the molecular origin of the acid skin mantle?. J Invest Dermatol 1998; 111(4): Fluhr J. W., Elias P. E. Stratum corneum ph: formation and function of the acid mantle. Curr Probl Dermatol 2002; 1(4): Vávrová K., Henkes D., Strüver K., et al. Filaggrin Deficiency Leads to Impaired Lipid Profile and Altered Acidification Pathways in a 3D Skin Construct J Invest Dermatol

35 30 Rawlings, A. V., Harding C.R.. Moisturization and skin barrier function. Dermatol Ther 2004; 17: Behne MJ., Meyer J., Hanson K.M., et al. NHE1 regulates the stratum corneum permeability barrier homeostasis: microenviroment acidification assessed with fluorescence lifetime imaging. J Biol Chem, 2002; 277: Ishikawa J. et al. Changes in the ceramide profile of atopic dermatitis patients. J Invest Dermatol (2010): Mustakallio K. K., Kiistala U., Piha, H. J. et al., Epidermal lipids in Besnier's prurigo (atopic eczema). Ann Med Exp Biol Fen : Melnik B.C., Hollmann J., Decreased stratum corneum ceramides in atopic individuals a pathobiochemical factor in xerosis? J Invest Dermatol 1991; Macheleidt O., Kaiser HW., Sanshoff K., et al. Deficiency of epidermal protein-bound omega-hydroxyceramides in atopic dermatitis, J Invest Dermatol 2002; 117: Jensen JM., Folster-Holst R., Baranowsky A. et al. Impaired sphingomyelinase aktivity and epidermal differentiation in atopic dermatitis, J Invest Dermatol 2004; 122: Eberlein-Köning B., Schäfer, T., Huss-Marp J., et al. Skin surface ph, stratum corneum hydration, trans-epidermal water loss and skin roughness related to atopic eczema and skin dryness in a population of primary school children. Acta Derm-Venereol 2000; 80: Melnik B., Hollmann J, Hofmann U., et al. Lipid composition of outer stratum corneum and nails in atopic and control subjects. Arch Dermatol Res 1990; 113: Seguchi T., Chang-Yi C., Kusuda S., et al. Decreased expression of filaggrin in atopic skin. Arch Dermatol Res 1996; 288: Chang-Yi C., Kusuda S., Seguchi T., et al. Decrease level of prosaposin in atopic skin. J Invest Dermatol 1997; 109: Ohnishi Y., Okino N., Ito M., et al. Ceramidase aktivity in bacterial skin flora as a possible cause of ceramide deficiency in atopic dermatitis. Clin Diagn Lab Immun 1999; 6: Motta S., Monti M., Sesana S., et al. Abnormality of water barrier function in psoriasis: role of ceramide functions. Arch Dermato Res 1994; 130: Motta S., Sesana S., Monti M., et al. Interlamellar lipid difference between normal and psoriatic stratum corneum. Acta Derm-Venereol Supplementum 1994; 186:

36 44 Alessandrini F., Pfister S., Kremmer E., et al. Alternation of glucosylceramide-βglucosidase levels in the skin of patients with psoriasis vulgaris. J Invest Dermatol 2004; 123: Sidtransky E., Fartasch M., Lee R.E., et al. Epidermal abnormalities may distinguish type 2 from type 1 and type 3 of Gaucher disease. Pediatric reseach 1996; 39: Myeong J.CH., Maibach H.I., Role of ceramides in barrier function of healthy and diseased skin. Am J Clin Dermatol 2005; 6: D. Groen, G.S. Gooris, J.A. Bouwstra, Model Membranes Prepared with Ceramide EOS, Cholesterol and Free Fatty Acids Form a Unique Lamellar Phase, Langmuir 2010; 26: Pullmannová, P., Staňková K., Pospíšilová, M., et al. Effects of sphingomyelin/ceramide ratio on the permeability and microstructure of model stratum corneum lipid membranes. BBA - Biomembranes 2014, in press 49 Di Nardo A., Wertz P., Giannetti A., et al. Ceramide and cholesterol composition of the skin of patients with atopic dermatitis. Acta Derm-Venereol 1998; 78(1) 50 Finlay A. Y., Nicholls S., King C. S, et al. The dry non eczematous skin associated with atopic eczema. Brit J Dermatol 1980; 103(3): Imokawa G., Abe A., Jin K., et al. Decreased Level of Ceramides in Stratum Corneum of Atopic Dermatitis: An Etiologic Factor in Atopic Dry Skin. J Invest Dermatol 1991; 96(4) 36