PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ GENETICKÉ MARKERY U NEUROEKTODERMÁLNÍCH NÁDORŮ DĚTSKÉHO VĚKU

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie ODDĚLENÍ GENETIKY A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ GENETICKÉ MARKERY U NEUROEKTODERMÁLNÍCH NÁDORŮ DĚTSKÉHO VĚKU Brno 2007 Jan Škoda

2 Rád bych na tomto místě poděkoval své školitelce doc. RNDr. Renatě Veselské, Ph.D. za odborné vedení a čas, který mi věnovala při řešení této bakalářské práce. Také bych chtěl poděkovat MUDr. Karlu Zitterbartovi za poskytnutí některých článků. 2

3 OBSAH 1. SEZNAM ZKRATEK ÚVOD DETEKČNÍ METODY VYUŽÍVANÉ V CYTOGENETICE NÁDORŮ Fluorescenční in situ hybridizace M-FISH SKY CGH a Array CGH SNP array PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ MARKERY DLE TYPU NÁDORU Ependymomy Nádory choroidního plexu Papilom choroidního plexu Karcinom choroidního plexu Astrocytomy Pleomorfní xanthoastrocytom Vysoce maligní astrocytomy Intrakraniální a intraspinální embryonální nádory Meduloblastom Oligodendrogliomy Neuroblastom ZÁVĚR LITERATURA

4 1. SEZNAM ZKRATEK array CGH array comparative genomic hybridization, array komparativní genomová hybridizace BAC bacterial artificial chromosomes; artificiální bakteriální chromozomy c-myc lidský homolog v-myc genu izolovaného z viru ptačí myelocytomatózy Alternativní zkratky: MYC, MYCC Lokalizován v oblasti 8q Kóduje jaderné proteiny, ovlivňující v buňce jak proliferaci tak i apoptózu. Tyto proteiny fungují jako transkripční faktory regulující transkripci specifických cílových genů. Mutace, nadměrná exprese, přeskupení a translokace tohoto genu je spojena s celou řadou hematopoetických nádorů, leukémií a lymfomů. CGH comparative genomic hybridaziton; komparativní genomová hybridizace DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole; 4',6-diamidino-2-fenylindol DMs double-minute chromatin bodies; extrachromozomální acentrické chromatinové fragmenty EFS event free survival; čas přežívání bez příznaků choroby EGFR epidermal growth factor receptor; gen pro receptor pro epidermální růstový faktor Alternativní zkratky: c-erbb1, ErbB, ErbB1, HER1 Protoonkogen lokalizovaný na 7p12. FISH fluorescence in situ hybridization; fluorescenční in situ hybridizace FITC fluorescein isothiocyanate, fluorescein-isothiokyanát HR-CGH high resolution comparative genomic hybridization; komparativní genomová hybridizace s vysokým rozlišením HSRs homogeneously stained regions; homogenně se barvící oblasti I-FISH interphase fluorescence in situ hybridization; interfázní fluorescenční in situ hybridizace LC/A large cell/anaplastic; velkobuněčný/anaplastický morfologický podtyp meduloblastomu 4

5 LOH loss of heterozygosity; ztráta heterozygosity ztráta jedné alely (normální, nemutované, nemetylované) z dvojice na chromozomu M-FISH multiplex-fluorescence in situ hybridization; mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace N-myc onkogen odvozený z neuroblastomu, příbuzný s v-myc genem izolovaným z viru ptačí myelocytomatózy Alternativní zkratky: MYCN, NMYC, ODED, MODED Protoonkogen nacházející se na 2p24.1. Kóduje jaderný transkripční faktor. Amplifikace genu je často spojena s různými nádory především s neuroblastomem. OS overall survival; celkové přežití PFS progression free survival time; čas přežívání bez známek progrese onemocnění PNET primitive neuroectodermal tumors; primitivní neuroektodermální nádory Původní skupina zahrnující veškeré intrakraniální a intraspinální embryonální nádory. V současné klasifikaci SZO (2000) rozdělena na jednotlivé typy. PTEN phosphatase and tensin homolog; gen pro tyrosinfosfatázu a homolog tensinu Alternativní zkratky: MMAC1 (mutated in multiple advanced cancer 1), PTEN1, BZS, MHAM, TEP1, MGC11227 Tumor-supresorový gen lokalizovaný na 10q23.3. PXA pleomorfní xanthoastrocytom simycn malá interferující (small interfering) RNA proti genu N-myc sirna small interfering RNA; malá interferující RNA SKY spectral karyotyping; spektrální karyotypování SNP single nucleotide polymorphism; jednonukleotidový polymorfismus SNP array single nucleotide polymorphism array; vyšetření jednonukleotidového polymorfismu TP53 tumor protein p53; gen pro protein p53 5

6 Lokalizován na 17p13.1. Důležitý při regulaci buněčného cyklu především při přechodu z G0 do G1 fáze. Zatímco v běžném stavu se v buňkách nachází v malém množství, v buňách transformovaných se vyskytuje ve vysokém množství a zřejmě přispívá k malignitě a transformaci buňky. Předpokládá se, že p53 se váže jako tetramer na specifické vazebné místo na DNA a aktivuje expresi downstream genů, které inhibují růst a nebo invazi buňky. Proto působí jako nádorový supresor. Mutantní produkty genu TP53, které se často vyskytují u mnoha lidských nádorů, se nemohou vázat na vazebné místo pro p53 a ztrácejí tak svou supresorovou aktivitu. TRITC tetramethyl rhodamine isothicyanate; tetramethyl-rhodamin-isothiokyanát WHO World Health Organization; Světová zdravotnická organizace 6

7 2. ÚVOD Průběh nádorových onemocnění je komplikovaný a u jednotlivých druhů nádorů bývá roz- dílný. Často dokonce stejný typ nádoru vykazuje odlišné chování vzhledem ke svému stádiu vývoje, a proto je stanovení prognózy a predikce důležitou součástí klinické diagnostiky nádorů. Prognózou rozumíme odhad dalšího průběhu onemocnění bez ohledu na případnou léčbu. Predikce pak odhaduje průběh onemocnění v závislosti na konkrétní léčbě. Prognostické a prediktivní faktory jsou z hlediska dalšího osudu pacienta zásadní, poskytují potřebné informace pro zařazení pacientů do rizikových skupin a pro zvolení vhodné strategie léčby. Cílem je individualizace léčby pacientů. Tzv. terapie podle rizika (risk adapted therapy) by měla být dostatečně účinnou léčbou s minimálními vedlejšími účinky. Kromě histologických a morfologických charakteristik nádorů se především v posledních letech začínají uplatňovat i markery genetické a molekulární. Výzkum nádorů na této úrovni poukázal na jejich biologickou odlišnost u dětské populace a dospělých. Genetické abnormality, které nacházíme v nádorech dospělých, často u dětí chybí a také incidence nádorů se významně liší mezi oběma věkovými skupinami. Na základě těchto poznatků se výzkum nádorů dětského věku zaměřuje na jiné charakteristiky, než je tomu u dospělých. Tato bakalářská práce má za cíl přinést ucelený přehled dosud popsaných prognostických a prediktivních cytogenetických markerů neuroektodermálních nádorů dětského věku. Právě neuroektodermální nádory, vzhledem ke svému původu a lokalizaci, představují v dětském věku enormní riziko. Léčebné postupy jsou omezené a intenzivní léčba samotná je u dětských pacientů špatně snášena. Úmrtí pacienta nebylo mnohdy důsledkem nádorového onemocnění, ale došlo k němu právě následkem agresivní léčby. Určení kvalitních cytogenetických a molekulárně genetických markerů se tak zdá být nezbytnou podmínkou pro individualizaci léčby podle rizika. V této práci je věnována pozornost právě cytogenetickým abnormalitám, které mají spojitost s prognózou nebo predikcí. První část textu je věnována metodickým možnostem jejich detekce, další kapitoly pak ukazují souvislosti mezi těmito změnami a prognózou nádorů. 7

8 3. DETEKČNÍ METODY VYUŽÍVANÉ V CYTOGENETICE NÁDORŮ Chromozomové aberace mohou být s různou úspěšností detekovány pomocí různých metod (Obr. 1). Potřeba lepšího rozpoznání chromozomálních aberací v různých, někdy ne zcela příznivých podmínkách, vedla v posledních 20 letech k rozvoji nových detekčních metod. Některé starší jsou již široce používané a jejich uplatnění v nádorové genetice je v dnešní době nezbytné. Novější, které vznikají jako jejich modifikace, pak přináší vyšší rozlišení a umožňují tak zkoumat vliv velice malých chromozomálních abnormalit na biologii nádoru. Obr. 1 Porovnání cytogenetických metod z hlediska identifikace chromozomových aberací (Speicher a Carter, 2005; upraveno) Použité zkratky: + metoda je schopna zaznamenat danou chromozomální abnormalitu; - chromozomová aberace by zůstala nezjištěna; DMs double-minute chromatin bodies, tzv. double minutes ; HSRs homogeneously stained regions, homogenně se barvící oblasti; M-FISH multiplex fluorescence in situ hybridization, mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace; SKY spectral karyotyping, spektrální karyotypování; LOH loss of heterozygosity, ztráta heterozygozity, SNP array single nucleotide polymorphism array, vyšetření polymorfismu jednotlivých neukleotidů; array CGH array comparative genomic hybridization, array komparativní genomová hybridizace; * potřeba ověřit použitelnost metody 3.1. Fluorescenční in situ hybridizace Fluorescenční in situ hybridizace (FISH, fluorescence in situ hybridization) je velmi používanou metodou v nádorové genetice. Její princip je znázorněn na obr. 2 a je základem mnoha 8

9 dalších modifikací (Obr. 3). Velkou předností FISH je možnost detekovat chromozomové aberace nejen na metafázních chromozomech, ale i v interfázním jádře (I-FISH, interphase fluorescence in situ hybridization). Díky tomu, že v interfázi je chromatin téměř desetkrát méně kondenzovaný, umožňuje I-FISH navíc použití sond pro kratší cílové sekvence (50 kb 2 Mb) oproti asi 5 Mb při použití metafázních chromozomů (Speicher a Carter; 2005). Při vhodném zvolení sondy je možné zachytit dokonce strukturní přestavby jako translokace a inverze. Obr. 2 Princip fluorescenční in situ hybridizace (Speicher a Carter, 2005; upraveno) a Základem fluorescenční in situ hybridizace jsou DNA sonda a cílová sekvence. b Před hybridizací jsou DNA sondy různým způsobem označeny obvykle nick-translací, pomocí náhodných nukleotidů nebo PCR. Běžně se používají dvě strategie značení: nepřímé značení (levý sloupec) a přímé značení (pravý sloupec). U nepřímého značení se využívá nukleotidů obsahujících hapten, zatímco u značení přímého se použijí nukleotidy, které přímo obsahují fluorochrom. c Značená sonda a cílová DNA jsou denaturovány. Výsledkem je zisk jednotlivých vláken DNA. d Jejich smíchání umožní spojení komplementárních sekvencí. e Pokud je sonda značena nepřímo, je potřeba další krok k vizualizaci. Navázání fluorochromu na hapten probíhá buď enzymaticky nebo s využitím protilátek konjugovaných s fluorochromem. Zatímco přímé značení je rychlé, nepřímé značení umožňuje amplifikaci signálu a zviditelnění i kratších sond. Konečnou fázi představuje zhodnocení signálů a nasnímání preparátu pod fluorescenčním mikroskopem. Nejvyšší rozlišení FISH lze dosáhnout použitím rozvolněných chromatinových vláken (Obr. 3g). Ta se skládají z chromatinu, ze kterého byly odstraněny histony, což umožňuje rozvinutí a prodloužení vlákna. Tato metoda, známá jako fibre FISH, poskytuje rozlišení kb. Kromě poskytovaného vysokého rozlišení umožňuje fibre FISH navíc přesné určení mezer a překryvů mezi jednotlivými sondami. Představuje tak účinný nástroj pro mapování DNA sekvencí ve specifických oblastech genomu. Klasická FISH je omezena fluorescenčními spektry použitých fluorochromů. Neschopnost opticky odlišit překrývající se spektra fluorescenčních sond vede k praktickému použití maximálně 2 sond (např. zelená FITC a červená TRITC) spolu s barvením pozadí (např. modrá DAPI). Pro celogenomový screening je proto klasická FISH nevhodná. 9

10 Obr. 3 Použití sond FISH pro různé aplikace (Speicher a Carter, 2005; upraveno) a Malovací sonda pro celý chromozom. V normálním diploidním interfázním jádře jsou viditelné dvě oblasti. b Lokus-specifické sondy. Zde například pro krátké a dlouhé raménko téhož chromozomu. c Centromerické sondy. Pro své jednoduché použití a vysokou intenzitu signálu jsou velmi oblíbené pro určování počtu chromozomů v intefázním jádře. d Subteloromerické sondy jsou často využívány k zjišťování kryptických translokací, které nebývají obvykle viditelné při konvenčních pruhovacích technikách. e Speciální set sond může být vytvořen k diagnóze známých přestaveb. Zde například sonda pokrývající místo zlomu (červená) a dvě sondy ohraničující místo zlomu (zelená a modrá). Takto je možné pozorovat strukturální přestavby i v interfázním jádře. f Použití genomové DNA jako sondy v komparativní genomové hybridizaci. Převažující zelená (DNA vzorku) označuje amplifikované oblasti. Naopak převažující červená fluorescence (kontrolní DNA) vyjadřuje oblasti se ztrátou genetického materiálu ve vzorku. Žluté oblasti jsou v poměru DNA balancované. g Použití rozvolněných chromatinových vláken pro fibre FISH. Zde se použité sondy (červená a zelená) navíc překrývají (žlutá oblast). h Microarray skla (DNA čipy) jsou v poslední době častým cílem hybridizace. Poskytují vysoké rozlišení až jednoho nukleotidu. Zde například BAC (bacterial artificial chromosomes) čip, ke kterému hybridizuje zároveň testovaná i kontrolní DNA. Jednotlivé klony pak dle poměru obsahu DNA vzorku a kontroly vykazují odpovídající barvy (obdobně jako při komparativní genomové hybridizaci) M-FISH V roce 1996 Speicher et al. vyvinuli metodu tzv. mnohobarevné FISH (M-FISH, multiplex-fluorescence in situ hybridization), díky které je možné najednou detekovat až 27 odlišných DNA sond. Princip metody spočívá v kombinatorním značení sond. Při M-FISH se používají metafázní preparáty, kdy každý chromozom hybridizuje se specifickou sondou označenou jedním a více fluorochromy. Snímání obrazu CCD kamerou za použití úzkopásmových filtrů probíhá pro jednotlivé fluorochromy odděleně a výsledný obraz je počítačovým složením těchto snímků. Kombinace fluorochromů jsou pak softwarově odlišeny přiřazením pseudobarev. Za použití kombinace minimálně 5 fluorochromů pro značení sond a 6. fluorochromu pro obarvení pozadí lze identifikovat všech 24 lidských chromozomů. Pomocí M-FISH lze detekovat interchromozomové aberace s rozlišením až 1 Mb (Jalal a Law, 1999). 10

11 3.3. SKY Spektrální karyotypování (SKY, spectral karyotyping), které bylo vyvinuto Schröckovou et al. v roce 1996, umožňuje (obdobně jako M-FISH) současnou vizualizaci všech lidských chromozomů ve 24 odlišných barvách. Podstatou techniky SKY je současná hybridizace preparátu (metafázních chromozomů) se směsí 24 chromozomově specifických celochromozomových sond. Ty jsou vytvořeny na základě kombinačního značení za použití pěti různých fluorochromů stejný princip jako u M-FISH. Každá sonda je charakterizována specifickým spektrem. Obrazová analýza je založená na spektrálním snímání, které kombinuje Fourierovu spektroskopii, snímání obrazu pomocí vysoce citlivých CCD kamer a klasickou mikroskopii (Obr. 4). Měření fluorescenčního spektra probíhá pro všechny body obrazu současně a je vyhodnocováno speciálním softwarem. Na základě emisního spektra sond pak software přiřadí příslušné klasifikační barvy. Obr. 4 Schéma spektrálního snímání a analýzy. Metafázní chromozomy jsou hybridizovány a zobrazeny pomocí flourescenčního mikroskopu. Světlo putuje do Sagnacova interferometru, kde se vytvářejí rozdíly v optických drahách. Světelný paprsek poté dopadá na CCD kameru, kde jsou pro každý pixel kamery zaznamenávány rozdíly v drahách jednotlivých svazků. Z výsledných interferogramů jsou pomocí Fourierovy transformace vypočítána emisní spektra. Zdroj obrázku: Applied Spectral Imaging (Carlsbad, Kalifornie). Obdobně jako u M-FISH se citlivost SKY pohybuje okolo 1 Mb (Schröck et al., 1996; Fan et al., 2000). M-FISH i SKY jsou používány k rychlému a snadnému screeningu rozmanitých strukturních a numerických aberací (Obr. 1). Jejich výhodou je poměrně vysoká rozlišovací schopnost, avšak nejsou použitelné pro detekci intrachromozomálních aberací a navíc také vyžadují použití metafázních preparátů. Získat buňky (a tedy chromozomy) v metafázi je u některých nádorů velmi obtížné a tato skutečnost je limitujícím faktorem obou metod. 11

12 3.4. CGH a Array CGH Komparativní genomová hybridizace (CGH, comparative genomic hybridization) byla popsána Kallioniemiovou et al. v roce Výhodou této metody je fakt, že k vyšetření se používá izolovaná DNA. Není tedy nutné získat dělící se buňky a díky tomu odpadá nutnost často obtížné kultivace nádorových buněk. DNA lze navíc izolovat i z materiálu fixovaného parafinem. Podstata vyšetření spočívá v sledování poměru intenzit fluorescencí. Kontrolní a vyšetřovaná DNA jsou každá označena jiným fluorochromem (kontrolní červeně a nádorová zeleně) a jsou současně hybridizovány na normální lidské chromozomy v metafázi (chromozomy z periferní krve od zdravého dárce). Fluorescence se snímá CCD kamerou a je vyhodnocena počítačem. Poměr intenzit fluorescencí podél jednotlivých chromozomů určí místa s nedostatkem nebo nadbytkem vyšetřované DNA (Obr. 3f). Pomocí klasické CGH lze detekovat změny o velikosti 5 10 Mb. Tato metoda je ideální ke zjišťování ztráty nebo zmnožení chromozomů či jejich částí. Nelze ji však využít k detekci balancovaných translokací (Obr. 1). Zavedení softwarového porovnání vzorku s profilem kontrol přineslo vyšší rozlišovací schopnost a vyšší specifitu metody CGH (Kirchhoff et al., 1997). Z 15 kontrolních CGH se vytvoří 99,5% dynamický standardní referenční interval, ke kterému se pak porovnává interval spolehlivosti testovaného vzorku. Tato metoda, nazývaná jako komparativní genomová hybridizace s vysokým rozlišením (HR-CGH, high resolution comparative genomic hybridization), zvyšuje rozlišení na 3 Mb a je schopna detekovat chromozomové aberace již při 20% klonálním zastoupení (oproti 50 % u běžné CGH). Array komparativní genomová hybridizace (array CGH) je inovace vycházející z klasické CGH. Na rozdíl od CGH se značené DNA nehybridizují na metafázní chromozomy ale na tzv. microarray skla (DNA čipy). Ta mají na svém povrchu velké množství fragmentů DNA, které jsou na něj speciálně tištěny. Jejich počet, původ a velikost se liší podle potřeb konkrétní array CGH. Celé sklo je po hybridizaci snímáno speciálním skenerem a vyhodnocení probíhá softwarově. Výhodou této metody je výrazné zlepšení rozlišení, které je limitované použitou velikostí fragmentů DNA a také nároky na kvalitu a množství vyšetřované DNA. Obecně platí, že při použití menších fragmentů DNA se nároky na kvalitu i kvantitu DNA zvyšují. 12

13 V dnešní době jsou široce používané array CGH využívající BAC (bacterial artificial chromosomes) čipy (Ishkanian et al., 2004; Krzywinski et al., 2004). Skládají se z více než 30 tisíc BAC klonů, které pokrývají celý lidský genom, a jsou ideálním DNA čipem pro celogenomové analýzy s rozlišením pod 1 Mb SNP array Jednonukleotidový polymorfismus (SNP, single nucleotide polymorphism) je nejčastější přirozeně se vyskytující sekvenční variace v lidském genomu. Četnost SNP je průměrně jeden na každých 200 párů bazí DNA (Tamber et al., 2006). Vyšetření jednonukleotidového polymorfismu (SNP array) umožňuje určit ztrátu heterozygosity jednotlivých nukleotidů a také změny počtu kopií (Matsuzaki et al., 2004). Na rozdíl od CGH hybridizuje k čipu pouze testovaná DNA. Ta je nejprve naštěpena specifickými restrikčními enzymy a navázána na adaptér, který umožní amplifikaci fragmentů. Amplifikovaná DNA je následně štěpena DNázou I a značena před hybridizací k čipu. Po hybridizaci a omytí se pak čip naskenuje a výsledky intenzit signálů se porovnají s daty kontrolních vzorků z téhož typu SNP čipu. SNP čip se obvykle skládá ze sond o délce 25 nukleotidů. Pro každé SNP místo je přítomen jak pozitivní tak negativní řetězec DNA pro obě alely (např. A a B). Srovnání signálů sond pro alelu A v porovnání se signály sond pro obě alely A i B určuje genotyp (AA, AB nebo BB). Aby však bylo možné odstranit falešné signály od skutečných, jsou oligonukleotidy uspořádány do párů, které se liší v 1 nukleotidu. Jeden řetězec tedy dokonale odpovídá SNP oblasti a druhý této oblasti neodpovídá právě 1 nukleotidem. Tak je možné odlišit případné falešné signály vyvolané podobnými sekvencemi. Moderní SNP čipy dosahují velmi vysokého rozlišení při pokrytí celého genomu. Medián mezery mezi jednotlivými oblastmi SNP se pohybuje od 8,5 kb (čip pro SNP) až po 2,5 kb ( SNP) (Tamber et al., 2006). To je více než tisíckrát lepší rozlišení oproti klasické CGH. Díky tomu umožňuje SNP array určit i mikroamplifikace a mikrodelece. Navíc jako jediná z výše jmenovaných metod je SNP array také vhodná pro určení LOH, která má charakter uniparentální disomie (Obr. 1). Ačkoliv metoda SNP array je prozatím finančně nákladnou záležitostí, její výhody ji předurčují k budoucímu širokému použití. 13

14 4. PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ MARKERY DLE TYPU NÁDORU Incidence mnoha neuroektodermálních nádorů je v dětském věku velmi nízká, což často znemožňuje statisticky významné zhodnocení vztahu zjištěných genetických abnormalit k prognóze. Zřejmě proto nebyly prozatím u velké části těchto nádorů identifikovány žádné prediktivní ani prognostické markery. Další příčinou pak může být také benigní charakter některých druhů nádorů, který určení prognostických či prediktivních markerů přímo nevyžaduje. Vzhledem k různorodosti léčebných protokolů aplikovaných na stejné druhy nádorů je navíc obtížné i určení predikce. S výjimkou neuroblastomu jsou proto identifikované markery výlučně prognostického charakteru. Následující kapitoly přináší pouze ty typy nádorů, u kterých byly zjištěny alespoň určité prognostické markery. Struktura textu tedy neodpovídá klasifikačnímu systému. K lepšímu pochopení vztahů mezi jednotlivými skupinami a druhy nádorů slouží tab. 1. Tab. 1 Systém neuroektodermálních nádorů dětského věku podle 3. vydání International Classification of Childhood Cancer (Steliarova-Foucher et al., 2005) Stupeň malignity (grade) podle systému Světové zdravotnické organizace (WHO; Kleihues a Cavanee, 2000) naznačují u některých nádorů římské číslice v horním indexu. 14

15 Tab. 1 pokračování 4.1. Ependymomy Ependymomy jsou třetím nejčastějším nádorem postihujícím CNS dětí s výskytem okolo 9,5 % (Peris-Bonet et al., 2006). Tyto nádory vycházejí z ependymových buněk, které spojují mozkové komory. Chování dětských ependymomů je těžké předvídat a léčba je dnes postavena na klinických kritériích jako je věk při diagnóze a míra chirurgické resekce nádoru. Biologická data, která by pomohla lépe určit prognózu a přežití, je velmi těžké identifikovat a výsledky různých studií jsou velmi často sporné. Navzdory tomu se v poslední době zřejmě podařilo určit některé možné prognostické faktory. Plodie DNA Jako jeden z možných prognostických znaků se jeví ploidie DNA. Zatímco jedna studie 22 ependymomů nenašla žádnou statisticky významnou korelaci mezi indexem DNA a průběhem onemocnění (Reyes-Mugica et al., 1994), druhá studie založená na 17 dětských ependymomech dokládá, že přítomnost diploidního obsahu DNA souvisí se špatným klinickým průběhem nemoci a kratším časem přežívání (Kotylo et al., 1997). Profil CGH Dyerová et al. v roce 2002 přinesli zajímavé výsledky studie 53 dětských ependymomů pomocí CGH. Na základě zjištěných chromozomálních imbalancí byly ependymomy rozděleny do třech skupin: numerická skupina (s 13 a více chromozomálními imbalancemi), strukturální skupina (s maximálně 6 chromozomální imbalancemi) a balancovaná skupina (s balancovaným profilem dle CGH). Všech 14 ependymomů u pacientů mladších 3 let vykazovalo balancovaný profil, zatímco 24 nádorů z 28 (86 %) u pacientů starších 3 let vykazovalo strukturální nebo 15

16 numerický profil. Tento fakt silně podporuje hypotézu, že ependymomy vyskytující se u novorozenců jsou odlišné od těch, které jsou diagnostikovány u starších dětí a dospělých. Strukturní nádory měly podle multivariační analýzy horší pětileté přežívání (10%) než nádory balancované (55%, p = 0,05) a dokonce i než nádory numerické (77%, p = 0,02). Počet chromozomových imbalancí u ependymomů by tak mohl sloužit jako prognostický marker. Mnohem silnějším prognostickým znakem se však jeví přítomnost zisku 1q. Zisk (gain) 1q Špatný výsledek strukturních nádorů lze totiž vysvětlit jejich vztahem k zisku genetického materiálu na dlouhém raménka chromozomu 1. Zisk 1q byl identifikován u 10 z 11 strukturních nádorů. Podle Dyer et al. (2002) tento zisk souvisí s rekurencí nádoru a také, ačkoliv statisticky nevýznamně (p = 0,45), s horším pětiletým přežíváním (15 % oproti 50 % bez zisku 1q). V roce 2006 Mendrzyk et al. potvrdili svou studií nezávislost zisku 1q (1q25) jako prognostického znaku. Je spojen s rekurencí nádoru a s celkově špatnou prognózou. Závěrem autoři uvádějí, že sledování této změny by pomohlo při zařazování pacientů s ependymomy do skupin dle rizika Nádory choroidního plexu Nádory choroidního plexu jsou vzácná skupina nádorů s výskytem okolo 0,9 % nádorů CNS v dětské populaci (Rickert a Paulus, 2001). Vycházejí z choroidního plexu tkáně nacházející se uvnitř mozkových komor a vytvářející mozkomíšní mok Papilom choroidního plexu Ačkoliv chirurgický zákrok je obecně účinným prostředkem léčby této benigní formy nádoru, analýza DNA přesto ukázala, že aneuploidní papilomy choroidního plexu mají agresivnější průběh progrese (Qualman et al., 1992). Počet aberací podobně jako zmnožení či ztráty DNA jako takové nemají pro papilom choroidního plexu na rozdíl od karcinomu choroidního plexu žádný prognostický význam (Rickert et al., 2002) Karcinom choroidního plexu CGH 15 karcinomů choroidního plexu ukázala, že delší přežívání je spojeno se ziskem 9p nebo ztrátou 10q (Rickert et al., 2002). Dále pak Qualmann et al. (1992) uvádí, že karcinomy 16

17 choroidního plexu s aneuploidní sadou DNA mají horší prognózu než se sadou diploidní a jsou spojeny s agresivním chováním a s 10krát vyšší úmrtností. Naproti tomu stojí výsledky dvou pozdějších studií, které ukazují, že ploidie DNA nekoreluje s příznivým výsledkem (Coons et al., 1992) a dokonce vůbec neexistuje korelace mezi obsahem DNA a výsledkem léčby (Centeno et al., 1993) Astrocytomy Astrocytomy jsou nádory vycházející z podpůrných mozkových buněk astrocytů. Představují nejčastější nádor postihující CNS dětí s 40% výskytem (Peris-Bonet et al., 2006). Dle Ben Arushe et al. (1999) je diploidie příznivým a nezávislým prognostickým faktorem. Ve studii 21 diploidních a 9 aneuploidních astrocytomů přežilo 81 % pacientů s diploidním obsahem DNA oproti 33 % u pacientů s aneuploidním astrocytomem (p < 0,011) Pleomorfní xanthoastrocytom Pleomorfní xanthoastrocytom (PXA) je vzácný nádor, který u dětí představuje asi 1,9 % nádorů postihujících CNS (Rickert a Paulus, 2001). Vzhledem k jeho nízkému výskytu bylo zatím uskutečněno málo genetických studií, které by naznačily více o prognostických, natož prediktivních znacích. Ukazuje se, že DNA ploidie není u PXA na rozdíl od ostatních astrocytomů spojena s výsledkem léčby (Rostomily et al., 1997). Navíc, na rozdíl od vysoce maligních astrocytomů, výzkumy vlivu mutace genu TP53 (tumor protein p53; gen pro protein p53) u PXA nenašly žádnou spojitost mezi mutací tohoto genu a progresí či rekurencí nádoru (Paulus et al., 1996; Giannini et al., 2001). Náznak prognostického znaku přináší studie jednoho PXA, který při CGH vykazoval vícečetné chromozomové aberace. Tento nález byl spojený se špatnou prognózou smrt nastala během 11 měsíců (Yin et al., 2002). Je však nezbytné provést širší studie, které by nejen ověřily spojitost mezi počtem aberací a prognózou, ale celkově se zaměřily na vztah prognózy a chromozomálních abnormalit u výhradně pediatrických PXA. 17

18 Vysoce maligní astrocytomy Podle systému gradingu Světové zdravotnické organizace (WHO) do této skupiny spadají nádory stupně III (anaplastický astrocytom) a IV (multiformní glioblastom). Vývoj těchto nádorů u dětí a dospělých se liší a některé způsoby léčby, které jsou odvozené na základě molekulárních poznatků u dospělých, zde selhávají. U dospělých dochází v těchto nádorech k amplifikaci EGFR (epidermal growth factor receptor; gen pro receptor pro epidermální růstový faktor), zatímco tento jev se u dětí nachází velmi ojediněle (Raffel et al., 1999). Léčba na základě zvýšené exprese, ať již mutantního nebo standardního genu pro epidermální růstový receptor, zde zřejmě nenajde uplatnění. Naopak míra mutace genu TP53 je velmi podobná u obou věkových skupin a lze předpokládat, že terapie využívající funkci aberantního TP53, by mohla být efektivní. Pollack et al. (1997) popsali významný vztah mezi mutací genu TP53 a kratším časem přežívání bez známek progrese onemocnění (PFS, progression free survival time). Mutace TP53 u vysoce maligních astrocytomů naznačují také horší celkové přežití (OS, overall survival). Pozdější výzkum na rozsáhlém vzorku 121 případů našel opět podobný vztah mezi mutací TP53 a průběhem nemoci, přestože tento nedosáhl statistické významnosti (PFS: p = 0,13; OS: p = 0,08) (Pollack et al., 2002). Na druhou stranu, výzkum Raffela et al. (1999) neprokázal žádný významný rozdíl v přežití u pacientů s mutací a bez mutace TP53. Mutace PTEN (phosphatase and tensin homolog; gen pro protein-tyrosinfosfatázu a homolog tensinu) jsou spojeny s vyšším stupněm malignity (stupeň III a IV) a horším přežitím u vysoce maligních astrocytomů (p = 0,006) (Raffel et al., 1999). Pollack et al. (2006) však uvádí, že tyto mutace nejsou časté oproti dospělým. To opět dokazuje odlišnost těchto nádorů u dětí a dospělých a podporuje myšlenku, že je potřeba najít lepší markery přímo pro dětské nádory. Anaplastický astrocytom Tento nádor představuje asi 7,2 % nádorů CNS u dětí (Rickert a Paulus, 2001). Rickert et al. (2001) pomocí CGH odhalili, že zisk genetického materiálu 1q představuje u anaplastického astrocytomu prognózu významně kratší doby přežívání. Podobně je tomu u zisku 7q nebo 7p (Kunwar et al., 2001). Dále autoři uvádějí, že ačkoliv je zisk 7p nepříznivým prognostickým faktorem nezávislým na věku, tato aberace je častější u starších pacientů. Vysvětlují tak vztah vyššího věku ke špatné prognóze a předkládají chromozom 7 jako přesnější marker než věk pacienta. 18

19 Multiformní glioblastom Multiformní glioblastom podobně jako anaplastický astrocytom představuje 7,2 % nádorů CNS dětské populace (Rickert a Paulus, 2001). Ačkoliv se u multiformního glioblastomu dětského věku vyskytují různé genetické změny, byl prozatím odhalen pouze jediný prognostický marker specifický pro tento druh vysoce maligního astrocytomu. Delece 10q23 (lokus pro gen PTEN) byla u multiformního glioblastomu prokázána jako prognostický znak negativně ovlivňující celkové přežití (Korshunov et al., 2005). Tento výsledek potvrzuje výše uvedený výzkum Raffela et al. (1999) a vyšetření delece 10q23 pomocí FISH lze podle Korshunova et. al. (2005) doporučit pro lepší stratifikaci multiformního glioblastomu dle rizika Intrakraniální a intraspinální embryonální nádory Tato skupina je poměrně problematická vzhledem ke změnám ve členění a klasifikaci neuroektodermálních nádorů. Původně byly všechny intrakraniální a intraspinální embryonální nádory řazeny do široké skupiny označované jako primitivní neuroektodermální nádory (PNET, primitive neuroectodermal tumors). Později se ukázalo, že tyto nádory se vyznačují rozdílným morfologickým, imunohistochemickým a molekulárně genetickým profilem. Jejich klinické charakteristiky a biologické chování se také odlišuje. Proto byla kategorie PNET v současné klasifikaci WHO (2000) rozdělena na jednotlivé typy (Tab. 1). Embryonální nádory představují druhou nejčastější skupinu nádorů postihujících CNS s incidencí kolem 20 % (Peris-Bonet et al., 2006). Vzhledem k tomu, že všechny embryonální nádory jsou charakterizovány stupněm IV (grade IV) dle WHO, představují tak nejčastější skupinu maligních mozkovým nádorů v této věkové skupině vůbec Meduloblastom Meduloblastom představuje nejčastější embryonální nádor s incidencí 17,7 % (Rickert a Paulus, 2001). Obvykle vyrůstá z dolní části vermis, infiltruje postupně celou IV. komoru a někdy prorůstá i do mozečkových hemisfér. Vysoká incidence a malignita meduloblastomu vedla k intenzivnímu výzkumu genetických abnormalit provázejících tento typ nádoru. Přestože se podařilo určit některé prognostické markery, ne všechny jsou prozatím dostatečně silné. 19

20 Ploidie DNA Mnoho autorů dokládá, že diploidie je u meduloblastomu spojena s agresivnějším průběhem nemoci a prokazatelně vyšší tendencí k rozsáhlým metastázím a smrti (Tomita et al., 1988; Gajjar et al., 1993). Ramachandran et al. (2002) navíc prokázali, že pacienti s aneuploidním meduloblastomem reagují lépe na léčbu (chirurgické odstranění, radioterapie a nebo chemoterapie) než pacienti, jejichž nádor vykazuje diploidní obsah DNA. Genetické aberace postihující chromozom 17 Částečná a nebo kompletní delece krátkého raménka chromozomu 17 (17p) je nejčastější genetická aberace postihující % pacientů s meduloblastomem (Griffin et al., 1988; Bigner et al., 1997; Burnett et al., 1997; Nicholson et al., 2000). Ztráta heterozygozity (LOH, loss of heterozygosity) 17p se může vyskytovat jako samostatná delece 17p, ale mnohem častěji je doprovázena amplifikací 17q za vzniku izochromozomu dlouhého raménka chromozomu 17 [i(17q)] (Bigner et al., 1997; Nicholson et al., 2000; Gilhuis et al., 2000). Současné studie poukazují na fakt, že delece 17p a současně tvorba i(17q) je častější u velkobuněčné/anaplastické formy (LC/A, large cell/anaplastic) meduloblastomu než u formy klasické (Eberhart et al., 2002; Lamont et al., 2004). Lamont et al. (2004) dále uvádějí, že LC/A meduloblastom má v porovnání s klasickým meduloblastomem významně horší výsledek. Metastatická choroba a horší výsledek léčby je podle těchto autorů spojen se ztrátou 17p a nebo výskytem i(17q). Vzhledem k tomu, že delece 17p a tvorba i(17q) se zdá být častější u LC/A meduloblastomů, je prognostický vliv těchto chromozomových aberací ve shodě se špatnou prognózou agresivní LC/A formy meduloblastomu. Izochromozom 17q Význam výskytu i(17q) jako nezávislého negativního prognostického znaku byl podpořen studií 35 meduloblastomů (Pan et al., 2005), která prokázala spojitost tvorby i(17q) [i(17)(q10)] s kratším OS a také s kratší dobou přežívání bez příznaků choroby (EFS, event free survival). Proti těmto výsledkům však stojí některé předchozí studie. Nam et al. (2000) uvádí, že délka dlouhodobého přežití není spojena s přítomnost i(17q). Podobně DeChiara et al. (2002) nenachází i(17q) jako prognostický znak. Výskyt i(17q) podle této skupiny autorů pouze reflektuje nekontrolovanou proliferaci buňky a nejlepšími prognostickými znaky zůstávají míra chirurgické resekce a načasování (timing) radioterapie. 20

21 Delece 17p Podobně jako u i(17q) je prognostický význam delece 17p prozatím nejasný. Cogen et al. (1990) zjistili, že delece 17p u meduloblastomu je ukazatelem špatné reakce pacientů na léčbu. Batra et al. (1995) podobně jako Steichen-Gersdorf et al. (1997) uvádí tuto aberaci jako negativní prognostický znak spojený s kratším přežitím. Navíc Scheurlen et al. (1998) a také Lamont et al. (2004) dokládají podobný výsledek ve své studii, kdy delece 17p je spojena s metastatickou chorobou. Naproti tomu výsledky jiných autorů jsou v rozporu s výše uvedenými závěry. Emadian et al., (1996) neprokázali významnou spojitost mezi LOH na krátkém raménku chromozomu 17 a prognózou. V roce 1997 testovali Biegel et al. prognostický význam delece 17p na poměrně velkém vzorku 56 meduloblastomů. Delece 17p podle této studie nemá prognostický význam a není spojena s kratším přežitím ani s metastatickou chorobou. Navíc autoři v závěru své práce napadají výsledky Batry et al. (1995), když považují použití jednostranného testu místo oboustranného za neoprávněné. Pokud by byl použit oboustranný test, závěry obou prací by byly ve shodě delece 17p není prognostickým znakem. Analýza LOH v oblasti chromozomu 17p provedená Jungem et al. (2004) opět neprokázala korelaci s výsledkem. Výše uvedené výsledky vytvářejí potřebu multicentrické studie, která by díky velkému vzorku a shodným podmínkám analýzy zhodnotila vztah delece 17p k prognóze. Mutace TP53 Mutace tumor-supresorového genu TP53, nacházejícího se v oblasti 17p13.1, jsou u meduloblastomu málo obvyklé (Adesina et al., 1994; Saylors et al., 1991). Přesto Woodburn et al. (2001) prokázali snížené přežití bez známek onemocnění (DFS, disease free survival) u pacientů se zvýšenou expresí p53. Amplifikace c-myc a N-myc Amplifikace c-myc (MYCC, lokalizován na 8q24.21) a nebo N-myc (MYCN, lokalizace na 2p24.1) se u meduloblastomu vyskytuje asi v 5 10 % a je nejčastěji spojena s prognosticky nepříznivou LC/A variantou (Eberhart et al., 2002; Lamont et al., 2004). Existují jasné důkazy toho, že nádory vykazující amplifikaci c-myc mají horší výsledek léčby, jsou rezistentní vůči terapii, mají agresivní průběh s krátkým přežitím a končí smrtí 21

22 pacienta. Badiali et al. (1991) pozorovali amplifikaci c-myc u 1 z 27 meduloblastomů. Přesto byl tento nález spojený s agresivním průběhem, krátkým přežitím a špatnou odpovědí na chemoterapii. Sheurlen et al. (1998) uvádějí, že meduloblastomy s amplifikací c-myc špatně reagovaly na terapii a pro pacienty znamenaly fatální výsledek léčby. Aldosari et al. (2002) zjistili amplifikaci c-myc u 4 pacientů (5,2 %) ze 77 případů a všichni tito pacienti zemřeli během 7 měsíců po diagnóze. Ačkoliv amplifikace c-myc není příliš častá, její nález lze u meduloblastomu považovat za velmi významný prognostický znak. Role amplifikace N-myc v patogenezi meduloblastomu je mnohem méně objasněna. Ačkoliv amplifikace N-myc nebyla prokázána jako prognostický znak, jeho zvýšená exprese bývá spojena se špatnou prognózou (Moriuchi et. al., 1996). Ostatní chromozomové aberace Nicholson et al. (1999) uvádí jako další možný prognostický znak monosomii chromozomu 22, která je spojena s horším průběhem onemocnění. Ztráta 9q naopak podporuje lepší EFS a OS (Pan et al., 2005) a podobně nejnovější výzkumy identifikovaly deleci chromozomu 6 jako marker lepší prognózy (Clifford et al., 2006). Přesto je nutné význam těchto abnormalit ověřit Oligodendrogliomy Pediatrické oligodendrogliomy jsou vzácné nádory postihující CNS. Poslední výzkumy ukazují, že se podstatně liší od oligodendrogliomů, které nacházíme u dospělých. Zatímco u dospělých představují delece 1p a 19q nejčastější genetické aberace a mají vztah k prognóze, v dětské populaci jsou tyto aberace vzácné (Raghavan et al., 2003; Kreiger et al., 2005). Tyto poznatky podporují potřebu identifikace jiných genetických markerů přímo pro pediatrické oligodendrogliomy Neuroblastom Podle Matthayové (1995) je neuroblastom třetím nejčastějším nádorem postihujícím dětskou populaci a je zodpovědný za 15 % všech dětských úmrtí spojených s rakovinou. Tento typ rakoviny je velmi dobře znám pro svou značnou biologickou variabilitu. Nádory nízkého rizika často samovolně regredují, případně spontánně či při léčbě diferencují v ganglioneuroblastom a dokonce i v benigní ganglioneurom. Vysoce maligní forma se vyznačuje mimořádně agre22

23 sivním průběhem s neovlivnitelnou progresí, nádor rychle roste a časně metastazuje především do kostí, kostní dřeni, mízních uzlin a u nejmenších dětí do kůže a jater (Weinstein et al., 2003). Od poloviny 90. let 20. století je International Neuroblastoma Staging System (INSS) celosvětově používaným nástrojem pro určení klinického stádia neuroblastomu (Brodeur et al., 1993). Variabilita neuroblastomu vedla k intenzivnímu studiu biologických charakteristik se zaměřením na prognózu a predikci. Díky tomu se podařilo u neuroblastomu určit velmi silné prognostické znaky, které se běžně uplatňují v klinické praxi. Ploidie DNA Již od roku 1984 je známé, že neuroblastomy s triploidním nebo hyperdiploidním obsahem DNA dobře reagují na chemoterapii a mají příznivou prognózu (Look et al., 1984). Neuroblastomy s diploidním nebo skoro diploidním obsahem DNA, kterých je většina, mají prognózu nepříznivou a zařazují se do skupiny nádorů s vysokým stupněm rizika. Bohužel ploidie DNA ztrácí svůj prognostický význam u pacientů starších 1 2 let (Obr. 5) (Look et al., 1991; George et al., 2005). V současnosti je obsah DNA jedním z obecně užívaných prognostických znaků a umožňuje lepší stratifikaci pacientů podle rizika (Tab. 2). V poslední době se začínají objevovat studie, které vyvracejí nezávislost ploidie jako prognostického znaku (Spitz et al., 2006). Příznivý výsledek triploidních neuroblastomů přikládají autoři spíše nízké míře chromozomových aberací. Podle této studie bylo možné detekovat aberace pouze u 15 % triploidních nádorů, což je ve shodě s předešlými výsledky jiných autorů (Kaneko et al., 1987). Možnou příčinu příznivého fenotypu triploidních neuroblastomů vysvětluje hypotéza navržená Kanekem a Knudsonem (2000). Tato hypotéza je založena na předpokladu, že diploidní i triploidní nádory vznikají na základě stejné genetické události, kterou by mohla být mutace v nádorově supresorovém genu doprovázená tetraploidizací. Při následném multipolárním dělení, způsobeném nadpočetnými centrozomy, mohou vznikat diploidní a tetraploidní buňky, které neobsahují žádnou standardní alelu daného genu. Naopak triploidní buňky obsahují v závislosti na segregaci chromo-zomů přinejmenším jednu standardní kopii. Zřejmě díky genetické konstituci (přítomnost mutantní i standardní alely) jsou pak triploidní nádory odolnější vůči sekundárním cytogenetickým aberacím oproti nádorům s diploidním obsahem DNA a mají tedy příznivější fenotyp. Regrese a maturace, které vyžadují integritu chromozomů, jsou proto často pozorovány u skoro triploidních nádorů. 23

24 Obr. 5 Čas přežívání bez příznaků choroby (EFS) podle ploidie DNA u pacientů s neuroblastomem stádia 4 dle INSS (George et al., 2005) Ploidie DNA ztrácí prognostický význam u pacientů starších 2 let. a Porovnání EFS u pacientů mladších než 12 měsíců (p = 0,0003). b Pacienti mezi 12 a 24 měsíci (p = 0,0092). c Pacienti starší než 24 měsíců. Rozdíl mezi mírou EFS na základě obsahu DNA je u těchto pacientů statisticky nevýznamný (p = 0,501). DI index DNA. Tab. 2 Rizikové skupiny neuroblastomu podle Children's Oncology Group (COG) Stádium Nízké riziko Střední riziko Vysoké riziko 1 všechny nádory není není není věk 1 21 let, N-myc amplifikovaný a nepříznivá histologie věk < 1 rok 2A, 2B nebo věk 1 21 let a N-myc bez amplifikace nebo věk 1 21 let, N-myc amplifikovaný a příznivá histologie 3 není 4 není 4S N-myc bez amplifikace, příznivá histologie a index DNA > 1 věk < 1 rok a N-myc bez amplifikace nebo věk 1 21 let, N-myc bez amplifikace a příznivá histologie věk < 1 rok a N-myc bez amplifikace N-myc bez amplifikace, nepříznivá histologie a index DNA = 1 věk 0 21 let, N-myc amplifikovaný nebo věk 1 21 let, N-myc bez amplifikace a nepříznivá histologie věk < 1 rok a N-myc amplifikovaný nebo věk 1 21 let N-myc amplifikovaný V současnosti platná klasifikace severoamerické COG. Stratifikace léčby pacientů dle rizika probíhá na základě klinického stádia INSS, věku pacienta, amplifikace N-myc, ploidie a histologie dle International Neroblastoma Pathology Clasification (Shimada et al, 1999). Pacienti s nejpříznivější formou neuroblastomu jsou léčeni pouze chirurgicky. Děti s neuroblastomy středního rizika podstupují chirurgický zákrok a 4 až 8 cyklů chemoterapie. U pacientů s neuroblastomem nejvyššího rizika je indukována intenzivní chemoterapie, chirurgická léčba, radioterapie, autologní transplantace hematopoetických progenitorových buněk a léčba kyselinou 13-cis-retinovou (London et al., 2005) 24

25 Amplifikace onkogenu N-myc V roce 1983 byla na buněčných liniích neuroblastomu popsána Schwabem et al. amplifikace onkogenu příbuzného c-myc N-myc. Jeho produktem, stejně jako u ostatních genů rodiny myc, je jaderný fosfoprotein s vazebnou afinitou k DNA, který ovlivňuje transkripci a replikaci DNA. N-myc je důležitý během vývoje a diferenciace neuroektodermu. Jeho nadměrná exprese vede k deregulaci růstu a proliferace a výrazně přispívá k malignímu potenciálu buňky. Amplifikovaný N-myc se vyskytuje ve dvou formách (Obr. 6): 1) extrachromozomální acentrické chromatinové fragmenty, tzv. double minutes (DMs, double-minute chromatin bodies), 2) intrachromozomální, homogenně se barvící oblasti (HSRs, homogenously staining regions) lokalizované na jiných chromozomech než v původním místě (2p24) genu N-myc (Brodeur, 2003). Obvykle není počet kopií N-myc stejný v celé buněčné populaci. Pomocí FISH lze pozorovat směs buněk, které obsahují od méně než 10 do stovek kopií genu (Squire et al., 1996). DMs jsou acentrické struktury a může tak docházet během mitózy k jejich ztrátám a nebo nerovnoměrné segregaci. Zajímavé však je, že počet kopí N-myc je konzistentní ve vzorcích z různých míst nádoru téhož pacienta, ale také nestoupá během progrese onemocnění (Brodeur et al., 1987). Pokud tedy není N-myc amplifikovaný v době diagnózy, nepostihuje tato abnormalita neuroblastom ani později. Obr. 6 Detekce amplifikace N-myc u neuroblastomu pomocí FISH (Mathew et al., 2001; převzato) A Bez amplifikace. B N-myc amplifikovaný v podobě DMs. C N-myc amplifikovaný jako HSRs. 25

26 Roku 1985 Seeger et al. jako první poukázali na možnou spojitost mezi zvýšeným počtem N-myc a agresivní progresí neuroblastomu. Mnoho studií poté potvrdilo, že amplifikace N-myc u neuroblastomu koreluje s agresivním růstem a velmi nepříznivou prognózou bez ohledu na klinické stádium (shrnuto v Brodeur, 2003). Analýza počtu kopií N-myc představuje velmi účinný a všeobecně používaný prostředek pro určení prognózy pacientů s neuroblastomem (Tab. 2). Amplifikace N-myc vede ke zvýšené expresi proteinu N-myc. Význam tohoto proteinu pro tumorigenezi neuroblastomu byl prokázán výzkumem Weisse et al. (1997) na transgenních myších. Zvýšená exprese N-myc vedla u myší ke vzniku neuroblastomu. Navíc myši vykazovaly další chromozomální aberace, které postihují lidské neuroblastomy. Poslední výzkumy naznačují, že inhibice N-myc by mohla být významným prvkem léčby. Kang et al. (2006) s využitím malé interferující RNA (sirna, small interfering RNA) proti N-myc (simycn) dosáhli umlčení tohoto genu v lidských buněčných liniích (metoda interference RNA ). To vedlo k diferenciaci buněk, inhibici růstu a zvýšení apoptózy. Navíc použití simycn nemělo žádný významný efekt na buňky bez amplifikace N-myc. Tyto výsledky podporují možnost využití sirna jako léčebného prostředku pro cílenou inhibici transkripce N-myc. Ostatní chromozomální změny Prakticky vždy je amplifikace N-myc doprovázena delecí 1p nebo ziskem 17q (Cohn a Tweedle, 2004). Zisk genetického materiálu dlouhého raménka chromozomu 17 je zřejmě nejčastější genetická abnormalita postihující neuroblastom. Byla zjištěna u více než poloviny neuroblastomů a původně byla spojována se špatnou prognózou (Lastowska et al., 1997; Bown et al., 1999; Abel et al., 1999). Pozdější studie na vzorku 193 neuroblastomů však tyto závěry vyvrací (Spitz et al., 2003a). Ačkoliv zisk 17q jako takový nemá pro neuroblastom prognostický význam, je podle autorů spjatý s amplifikací N-myc, delecí 1p, 3p a 11q. Delece 1p Ztráta genetického materiálu 1p představuje poměrně častou chromozomovou aberaci, která postihuje asi 35 % neuroblastomů (Brodeur, 2003). Ačkoliv delece zasahuje různé oblasti 1p, většina studií identifikovala deleci na 1p36. Ztráta alely je spojena s rekurencí nádoru a špatnou prognózou (Caron et al., 1996). Rozsáhlá studie LOH v oblasti 1p36 potvrzuje prognostický význam této abnormality (Attiyeh et al., 2005). Ztráta heterozygosity v oblasti 1p36 je spojena se špatnou prognózou a představuje nezávislý prognostický znak horšího PFS u nádorů nízkého a středního rizika dle COG (Tab. 2). Ačkoliv je tato aberace asociována s amplifikací N-myc, její 26

27 klinický význam spočívá především v přesnějším odlišení rizika u pacientů s lokalizovanými nádory (stádium 1 a 2) bez amplifikace N-myc. Delece 11q a 3p Attiyeh et al. (2005) dále ve své práci uvádějí, že ztráta heterozygosity 11q23 je nezávislý marker sníženého EFS a PFS. Podporují tak předchozí práci Spitze et al. (2003b), kteří předkládají deleci nebo imbalanci 11q jako špatný prognostický faktor pro nádory klinického stádia 1 3 a 4S. Zejména u nádorů bez amplifikace N-myc by tyto aberace mohly pomoci rozhodnout mezi dobrou a špatnou prognózou (3letý EFS: 43 ± 18% oproti 84 ± 6% u pacientů bez delece nebo imbalance, p = ). Stejná prognóza byla zjištěna u delece nebo imbalance 3p (3p26). Protože abnormality postihující 3p a 11q spolu úzce korelují, vyšetření 11q23 a 1p36 pomocí I-FISH by spolu s vyšetřením počtu kopií N-myc mohlo být dostatečně účinné pro stratifikaci pacientů dle rizika. 27

28 Tab. 3 Přehled diskutovaných cytogenetických abnormalit se vztahem k prognóze nádoru Nádor / Genetická charakteristika Prognostický význam EPENDYMOMY diploidie vs. aneuploidie horší OS 6 chromozomálních imbalancí oproti balancovanému profilu a nebo oproti > 13 chromozomálním imbalancím dle CGH horší pětileté přežívání zisk 1q (1q25) rekurence nádoru a horší OS PAPILOM CHOROIDNÍHO PLEXU aneuploidie vs. diploidie agresivní progrese KARCINOM CHOROIDNÍHO PLEXU zisk 9p nebo ztráta 10q delší OS aneuploidie vs. diploidie agresivní progrese, horší OS ASTROCYTOMY aneuploidie vs. diploidie horší OS PLEOMORFNÍ XANTHOASTROCYTOM vícečetné chromozomové aberace dle CGH * špatná prognóza VYSOCE MALIGNÍ ASTROCYTOMY mutace TP53 kratší PFS a horší OS mutace PTEN vyšší stupeň malignity a horší OS Anaplastický astrocytom zisk 1q, 7q nebo 7p kratší OS Multiformní glioblastom delece 10q23/PTEN horší OS 28

29 MEDULOBLASTOM agresivní progrese, tendence k metastázím, horší OS diploidie vs. aneuploidie horší reakce na léčbu (chirurgické odstranění, radioterapie a nebo chemoterapie) delece 17p, výskyt i(17q) * vztah k vysoce maligní LC/A formě meduloblastomu i(17q) * kratší OS a EFS, metastatická choroba delece 17p * horší OS, špatná reakce na léčbu, metastatická choroba mutace TP53 (zvýšená exprese p53) horší DFS amplifikace c-myc a nebo N-myc vztah k prognosticky nepříznivé LC/A formě meduloblastomu amplifikace c-myc krátký OS, agresivní progrese, rezistence vůči léčbě, špatná odpověď na chemoterapii amplifikace N-myc * špatný výsledek monosomie chromozomu 22 * špatný výsledek delece 9q, monosomie chromozomu 6 * lepší EFS a OS NEUROBLASTOM triploidní obsah DNA dobrá reakce na chemoterapii, příznivá prognóza diploidie vs. triploidie (věk < 1 rok) horší EFS a špatná prognóza; zařazení do rizikových skupin amplifikace N-myc velmi nepříznivá prognóza nezávisle na klinickém stádiu; silný prognostický znak zisk 17q * špatná prognóza delece 1p (1p36) rekurence nádoru, horší PFS a špatná prognóza; odlišení rizika u lokalizovaných nádorů bez amplifikace N-myc delece 11q (11q23) a delece 3p (3p26) horší EFS a PFS; zejména k odlišení rizika u nádorů klinického stádia 1 3 a 4s bez amplifikace N-myc * Význam dané aberace není jednoznačný nebo je potřeba ověřit 29