Genetické metody identifikace a ověřování paternity koní

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Genetické metody identifikace a ověřování paternity koní Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík Vypracovala: Jitka Modlitbová Brno 2011

2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Genetické metody identifikace a ověřování paternity koní vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis.

4 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala vedoucímu bakalářské práce Ing. Liborovi Stehlíkovi, za odborné vedení při zpracování bakalářské práce. Dále svým rodičům a příteli za podporu ve studiu a životě. A v neposlední řadě mé kamarádce za pomoc při úpravě textu bakalářské práce.

5 ABSTRAKT Předkládaná bakalářská práce se zabývá genetickými metodami identifikace a ověřování parentity u koní. Cílem je popsat genetické metody na základě literárních zdrojů. Začátek práce je věnován legislativě, která určuje základní povinnosti určování původu související s ověřováním parentity. Tyto povinnosti jsou formulovány v zákoně č. 154/2000 Sb., O šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat. Dále je popsána obecná charakteristika mikrosatelitů. Mezinárodní společnost pro genetiku zvířat (International Society of Animal Genetics ISAG ) doporučuje pro ověřování parentity u koní 17 mikrosatelitů (VHL20, HTG4, ATH4, HMS7, HTG6, AHT5, HMS6,ASB23, ASB2, HTG10, HTG7, HMS3, HMS2, ASB17, LEX3, HMS1, CA425). V následující části jsou uvedeny metody pro testování polymorfismů DNA a zmíněny vybrané akreditované laboratoře v České republice, ale i zahraniční, jejich metody, nákladovost a srovnání. V poslední řadě je provedeno ověřování parentity u koní na základě doložených podkladů, které jsou interpretovány dle zákona. KLÍČOVÁ SLOVA: kůň, mikrosatelit, parentita

6 ABSTRACT This Bachelor thesis deals with genetic methods for identification and authentication of horse parentity. The aim is to introduce and describe genetic methods based on knowledge of literary sources. The beginning is devoted to the legislation, which defines the basic obligations associated with determining the origin of parentity authentication. These obligations are formulated in the Act No. 154/2000 Coll. on breeding and registration of livestock. It describes the general characteristics of microsatellites. International Society for Animal Genetics (International Society of Animal Genetics - ISAG) recommended parentity authentication at these 17 microsatellites (VHL20, HTG4, ATH4, HMS7, HTG6, AHT5, HMS6, ASB23, ASB2, HTG10, HTG7, HMS3, HMS2, ASB17, LEX3, HMS1, CA425). The following part are the methods for testing of DNA polymorphisms and discussed selected accredited laboratories in the Czech Republic but also abroad, their methods, cost, and comparisons. The last par contains horse parentity verification on the based on of supporting documents, which are interpreted according to law. KEY WORDS: horse, microsatellit, parentita

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Legislativa v ČR Označování koní a oslů a jejich kříženců Ověřování a osvědčování původu a stanovování genetického typu plemenných zvířat Vyhláška č. 448 / 2006 Sb Mikrosatelity Obecná charakteristika mikrosatelitů Detekce polymorfizmů v genomech Metody pro testování polymorfismů DNA Získávání DNA Izolace DNA Polymerázová řetězová reakce PCR RFLP (polymorfizmus délky restrikčních fragmentů) Stanovení sekvence DNA (sekvencování DNA) Fragmentační analýza Akreditované laboratoře v České republice Laboratoř agrogenomiky Českomoravská společnost chovatelů, a. s Veterinary genetic laboratory (VGL) Dr. Van Haeringen Laboratorium b. v

8 3.4.5 Srovnání vybraných laboratoří OVĚŘENÍ PARENTITY U KONÍ ZÁVĚR PŘEHLED POUŽITÝCH ZDROJŮ Literární zdroje Internetové zdroje SEZNAM TABULEK PŘÍLOHY... 38

9 1 ÚVOD V současné době je genetika považována za jednu z hlavních biologických disciplín, která se uplatněním svých poznatků stala důležitým prostředkem pro dosažení lepší produkce v zemědělství. Dnes už si snad nikdo nedokáže představit šlechtitelskou práci bez využití molekulární genetiky. Molekulárně genetické metody umožňují zjišťovat polymorfismus na úrovni DNA. Testy DNA zajišťují rychlou identifikaci alel určitého genu zvířete, které je testováno. Základní součástí procesu šlechtitelské práce jsou údaje o rodičovství (parentitě) a jejich ověření. Zákon stanovuje, že šlechtitelská opatření spočívají v ověřování a osvědčování původu, ve zjišťování a evidování původu nebo stanovování genetického typu plemenných zvířat. Podle vyhlášky č. 136/2004 Sb., musí každý kůň chovaný v České republice mít Průkaz koně a po jeho vydání musí být u koně proveden výžeh nebo stanoven genetický typ. Celosvětově užívanou molekulárně genetickou metodu při určování identifikace a ověřování rodičovství je analýza polymorfizmu mikrosatelitů. Mikrosatelity, nazývané také STR short tandem repeats, jsou krátké tandemové repetice složené z: mono-, di-, tri nebo tetranukleotidových motivů. Významnou vlastností je vysoký stupeň polymorfizmu způsobený variabilním počtem tandemových repetic. Ověřování původu u koní provádí pouze oprávněná osoba, které k této činnosti udělilo souhlas Ministerstvo zemědělství. Původ je ověřován porovnáním genotypů matky, otce a potomka, kdy polovinu genů dědí potomek po otci a polovinu po matce. Genotypy se zjišťují různými metodami, které jsou dále popsány v této práci. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce je: popsat způsoby genetických metod pro identifikaci a ověřování parentity u koní. Legislativním podkladem pro provádění určování a ověřování původu je zákon č. 154/2000 Sb. O šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat, seznámit se s laboratořemi, které se zabývají testy DNA v České republice, ale také v zahraničí, srovnávat způsoby, nákladovost a dostupnost pro identifikaci a ověřování parentity u koní jednotlivých laboratoří. Po domluvě s vedoucím bakalářské práce byly zadány výsledky testů pro ověření parentity u koní a na základě podkladů byla určena parentita u potomků a výsledky byly interpretovány podle zákona. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Legislativa v ČR Základní povinnosti určování původu související s ověřováním parentity jsou formulovány v zákoně č. 154/2000 Sb., O šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon). Vyhláška č. 202/2010 Sb., kterou se mění vyhláška č. 136/2004 Sb., kterou se stanoví podrobnosti označování zvířat a jejich evidence hospodářství a osob stanovených plemenářským zákonem a znění pozdějších předpisů. Vyhláška č. 448/2006 Sb., o provedení některých ustanovení plemenářského zákona Označování koní a oslů a jejich kříženců Plemenní koně se označují způsoby uvedenými v jednotlivých řádech plemenných koní, a to: a) slovním a grafickým popisem a elektronickým identifikátorem, nebo b) slovním a grafickým popisem, elektronickým identifikátorem a výžehem, a to v případě, kdy tento výžeh bude uveden v příslušném řádu plemenné knihy koní. U plemenných koní starokladrubský kůň, lipický kůň, Shagya-arab, norik, slezský norik, českomoravský belgický kůň a moravský teplokrevník lze označovat: a) slovním a grafickým popisem a elektronickým identifikátorem, nebo b) slovním a grafickým popisem, elektronickým identifikátorem a výžehem, a to v případě kdy tento výžeh bude uveden v příslušném řádu plemenné knihy koní. Koně neregistrovaní v plemenné knize osli a jejich kříženci se označují slovním a grafickým popisem a elektronickým identifikátorem v souladu s nařízením komise (ES) č.504/2008. Každé hříbě koně, osla a jejich kříženců se označuje před odstavem, tak aby byl vydán průkaz koně po označení nejpozději do 31. prosince roku narození 11

12 daného hříběte, nebo během 6 měsíců od data narození podle toho, který z těchto termínů nastane později. Osoba provádějící označování koní označí koně, osla nebo jejich křížence do 28 dnů ode dne, kdy k tomu byla majitelem vyzvána (154/2000 Sb.) Ověřování a osvědčování původu a stanovování genetického typu plemenných zvířat Původ plemenných zvířat a jejich genetické typy ověřují a stanovují oprávněné osoby. Oprávněná osoba je povinna: a) doložit způsobilost k ověřování a osvědčování původů a stanovování genetických typů plemenných zvířat osvědčením o akreditaci, b) doložit účast v mezinárodních srovnávacích testech, pokud se tyto testy provádějí, a trvale splňovat jejich kritéria, c) ověřovat původ a stanovovat genetický typ plemenného zvířete, požádá-li o to Česká plemenářská inspekce nebo orgány veterinární správy pro výkon kontrolní činnosti nebo uznané chovatelské sdružení, d) vydávat osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu a poskytovat České plemenářské inspekci nebo orgánům veterinární správy pro výkon kontrolní činnosti nebo uznaným chovatelských sdružením. Původ musí být ověřen u: a) hříbat narozených po inseminaci nebo po přenosu embryí, b) hříbat plemene anglický plnokrevných a klusák, c) namátkově u potomstva testovaných plemeníků, d) pro výkon dozorčí činnosti. Genetický typ musí být stanoven u hřebců vybraných do plemenitby. O ověření původů nebo o stanovení genetického typu je povinen požádat majitel zvířete. Osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu musí obsahovat identifikační údaje majitele zvířete, identifikační údaje zvířete, identifikační údaje rodičů zvířete a výsledek ověření původu nebo výsledek stanovení genetického typu zvířete (154/2000 Sb.) 12

13 3.1.3 Vyhláška č. 448 / 2006 Sb. Osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu obsahuje: a) laboratorní číslo, pod kterým je plemenné zvíře vedeno v databázi oprávněné osoby, b) identifikační číslo testovaného zvířete, jméno, je-li známo, plemeno, rok narození, pohlaví, c) identifikaci rodičů d) zdroj DNA, kterým se rozumí biologický materiál, ze kterého byla DNA získána, e) datum ověření původu nebo stanovení genetického typu, f) výsledek ověření původu nebo stanovení genetického typu. Výsledek ověření původů nebo stanovení genetického typu se vyjadřuje slovy a) původ souhlasí s uvedenými rodiči, pokud kombinace genetických typů rodičů je kompatibilní s genetickým typem potomka, b) původ nesouhlasí s uvedenými rodiči, pokud kombinace genetických typů rodičů je nekompatibilní s genetickým typem potomka, a to: 1. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí otec 2. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí matka 3. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče 4. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nelze určit, který z rodičů nesouhlasí, c) původ souhlasí s otcem uvedeným na prvním místě za předpokladu správné matky, pokud bylo udáno více možných otců a všichni byli vyloučeni až na jednoho, který se uvede na prvním místě, d) původ nelze ověřit, pokud není k dispozici genetický typ jednoho nebo obou rodičů (448/2006 Sb.). 13

14 3.2 Mikrosatelity Obecná charakteristika mikrosatelitů Mikrosatelity, nazývané také STR short tandem repeats, jsou krátké tandemové repetice složené z: mono-, di-, tri nebo tetranukleotidových motivů. Významnou vlastností je vysoký stupeň polymorfizmu způsobený variabilním počtem tandemových repetic (obvykle 10-30) (Knoll, Vykoukalová, 2002). Polymorfizmus mikrosatelitů může být rychle a spolehlivě testován pomocí PCR a PAGE. Díky těmto metodám jsou mikrosatelity vhodnými markery pro vazbové mapování genů a studium diverzity včetně určování rodičovství (paternity) (Knoll, Vykoukalová, 2002). Pro jejich extrémní variabilitu (polymorfismu) a relativně snadné detekci, jsou považovány za jedny z nejvhodnějších genetických markerů. V koňském genomu je jeden z nejvíce zastoupených repetičních motivů (TG) n motiv, který vykazuje značně velký stupeň polymorfismu. Jeho frekvence je odhadována zhruba 1 na bp v genomu koní. Oproti tomu frekvence (TC) n repetic je vůči zmíněným (TG) n repeticím daleko nižší, i když jsou zhruba stejně polymorfní (Hamanová, 2006). Základní charakteristikou mikrosatelitů jsou proto jedinečné sekvence nukleotidů, přiléhající nebo vymezující mikrosatelitní sekvenci tzv. flanking sequences. Tyto přiléhající sekvence určují jedinečnou pozici mikrosatelitů v genomu. Každý jedinec má dvě kopie každého mikrosatelitu, jeden zděděný po otci a druhý po matce. Délka každého mikrosatelitu děděna mendelisticky, dělá mikrosatelity ideálními polymorfními markery při mapování genomu, testování paternity a identifikaci (Hamanová, 2006). Mikrosatelity velmi rychle nahrazují metody spočívající na RFLP a RAPD (random amplified polymorphic DNA = náhodně amplifikovaná polymorfní DNA) ve většině aplikací v populační biologii, od identifikování příbuzných jedinců, až po odvozování demografických parametrů (Hamanová, 2006). Pro stanovení genetického typu skotu a koní platí mezinárodní minimální standardní sada mikrosatelitů. Tyto mikrosatelity povinně testují všechny laboratoře, takže výsledky jsou mezinárodně porovnatelné. Je-li tedy zvíře importováno 14

15 ze zahraničí, kde již bylo testováno, je jeho test použitelný pro potřeby ověřování původů i v ČR a není nutné jej přetestovávat (Přibáňová, 2005). Tab. č. 1 Testované mikrosatelity pro koně (Instruction Manual, Equine Genotypes, Panel 1. 1.F-850S/L) Lokus Chromozom Opakující motiv Rozsah velikosti (bp) VHL20 30 di HTG4 9 di ATH4 24 di HMS7 1 di HTG6 15 di AHT5 8 di HMS6 4 di ASB23 3 di ASB2 15 di HTG10 21 di HTG7 4 di HMS3 9 di HMS2 10 di ASB17 2 di LEX3 X di HMS1 15 di CA di Detekce polymorfizmů v genomech V genetice může být polymorfismus definován jako výskyt více než dvou alternativních alelických variant určitého genu. Pokud se v genu vyskytují 2 alternativní alely, hovoříme o jednoduchém alelismu. Mnohočetný alelismus je základem genetického polymorfismu (Dvořák, 1992). Polymorfismus DNA mikrosatelitů lze využít k mapování genomu, ověřování parentity a konstrukci chromozomových map (Dvořák, 2002). 15

16 Pro studium sekvenčního polymorfizmu DNA se používají přímé metody, u kterých se stanovuje sekvence variabilní oblasti DNA. Tyto metody jsou bohužel časově náročné a tím nevhodné pro rutinní provádění. Proto se častěji používají nepřímé metody, kterými lze zobrazit profil DNA konkrétního organizmu ve formě otisku DNA (fingrprintu). Otisky DNA mohou mít podobu spekter restrikčních fragmentů nebo produktů PCR rozdělených gelovou elektroforézou. Nepřímé metody se rozdělují na techniky založené na amplifikaci DNA a na techniky, u kterých se amplifikace neprovádí. Mezi tyto řadíme restrikční endonukleázovou analýzu (REA) a selektivní hybridizaci restrikčních fragmentu (SRFH) ke specifickým sondám (Doškař, Šmarda, 2005). 3.3 Metody pro testování polymorfismů DNA Techniky založené na hybridizaci Na genomovou DNA štěpenou restrikční endonukleázou se hybridizuje značná sonda obsahující sekvenci genu (RFLP), minisatelitu (VNTR) a mikrosatelitů (DNA fingerprinting). Techniky analyzující produkt PCR Do této skupiny patří např. metody PCR-RFLP, DGGE, TGGE, SSCP a jiné. Techniky založené na využití náhodných nebo málo specifických primerů při PCR pro nespecifickou detekci více lokusů. Používají se málo specifické primery, nebo primery za určitých podmínek PCR, kdy zahajují syntézu, i když vazba na templátovou DNA není dokonalá. Patří sem například RAPD, AP-PCR (arvitrarly primed PCR), DAF (DNA amplification fingerprinting) a detekce DNA restrikčních fragmentů pomocí PCR amplifikace (Knoll, Vykoukalová, 2002). Metody jsou pro testování polymorfismu založeny na několika po sobě jdoucích krocích: izolace DN, polymerázová reakce (PCR), RFLP a sekvencování (Knoll, Vykoukalová, 2002). 16

17 3.3.1 Získávání DNA Téměř z jakéhokoliv biologického materiálu lze teoretický získat DNA z krve, z cibulek žíní, masa, mléka apod. Nejspolehlivějším zdrojem DNA je krev. U koní se DNA získává z krve, ale nejčastěji z cibulek žíní (GENOMIA s. r. o., 2010). Odběr krve provádí veterinář. Krev se odebírá nesrážlivě do EDTA zkumavek, kdy dostačující množství je 0,5 1ml plné krve. Zkumavkou zatřeseme, aby se krev promísila s antikoagulantem. Zkumavku vložíme do sáčku se štítkem a hlavně dobře uzavřeme. Krev uchováváme v lednici a odešleme co nejdříve po odběru na uvedenou adresu laboratoře. Cibulek se nesmíme dotýkat. Odběr žíní provádí chovatel. Žíně se nestříhají, ale natrhají a po vytržení se zkontrolují, zda byly vytrženy i s neporušenou cibulkou. Po vytržení jsou přilepeny na čistý papír, označeny a odeslány na adresu laboratoře s přiloženou adresou zpáteční (GENOMIA s. r. o., 2010) Izolace DNA Izolovat DNA lze teoreticky z jakékoliv živočišné tkáně obsahující nativní buňky. U savců je izolace DNA z krve problematičtější a vyžaduje poměrně velké množství krve. Při použití speciálních technik je možné izolovat DNA i z takových zdrojů, jako jsou například jednotlivé chlupy nebo trus (Zima et al., 2004). Pro izolaci DNA z krve využívá laboratoř agrogenomiky kitu od společnosti GENOMED. Postup je dodržován podle přiloženého protokolu: Do Eppendorfových zkumavek je napipetováno 200 µl krve a ke každému vzorku přidánou 20 µl GENOMED proteázy, propipetováno a ještě přidáno 200 µl pufru K1 a opět znovu celé propipetováno. Pořadí se nezamněnuje. Proteáza je enzym, který štěpí peptidové můstky mezi aminokyselinami a pufr je látka, která udržuje stabilní ph po celou dobu reakce. Poté inkubováno 10 minut při 58 C. Po inkubaci přidáno 200 µl absolutního etanolu a velmi důkladně a krátce vortexováno. Etanolem se vzorek pročistí. Mezitím jsou připraveny centrifugační zkumavky, do kterých jsou vloženy kolonky. Těmito kolonkami se zachytí DNA na speciální křemičité membráně. Do těchto připravených zkumavek je přefiltrován celý objem vzorku a centrifugován při rychlosti rpm po dobu 1 minuty. Poté je kolonka vložena do čisté 17

18 centrifugační zkumavky, je přidáno 500 µl pufru KX a centrifugováno při stejné rychlosti. Kolonka je vyjmuta a opět vložena do čisté centrifugační zkumavky a je k ní přidáno 500 µl pufru K2 a centrifugováno při stejné rychlosti jako u předešlého. Celý vzorek je dále centrifugován ještě na sucho bez přidání pufrů a jiných chemikálií. Po 1 minutě je kolonka vyjmuta a vložena do čisté Eppendorfovy zkumavky (1,5 ml) DNA, která se usadila na kolonce, byla promyta 100 µl elučního pufru předehřátého na 70 C. Tento pufr byl aplikován přímo do středu křemičité membrány a tím byl zajištěn kontakt celé membrány s pufrem a zároveň byla důkladně promyta DNA z membrány. Vše se inkubovalo 2 minuty při pokojové teplotě a poté centrifugováno při rychlosti rpm po dobu 2 minuty. Ve zkumavce zůstala izolovaná DNA, která se nejlépe uchovává v ledničce či mrazicím boxu (GENOMED). K izolaci DNA z chlupových cibulek jsou nachystány a popsány Eppendorfovy zkumavky (1,5 ml). Do každé zkumavky je nastříháno asi 20 ks chlupových cibulek pouze jednoho jedince. Před stříháním každého dalšího vzorku musí být nůžky i pinzeta důkladně očištěny etanolem. Ke každému vzorku je přidáno 200 µl T1 pufru, který obsahuje detergent k pročištění vzorků, rozkládá buňky a denaturuje proteiny. Po té je přidáno 20µl proteinázy K a propipetováno. Proteináza K rozkládá denaturované proteiny na menší fragmenty a s pufrem T1 zbarvuje DNA všech navázaných proteinů. Vzorky jsou přes noc inkubovány v termostatu při teplotě 58 C. Do čistých Eppendorfových zkumavek jsou napipetovány jednotlivé vzorky, již bez chupů. Dále je přidáno 200 µl T2 pufru a důkladně propipetováno dokud není vzorek homogenní. Poté se inkubuje 10 minut při 70 C. Pak se vzorek 1 minutu chladí v lednici a je přidáno 200 µl etanolu, krátce a důkladně vortexováno, aby se předešlo sražení DNA kvůli vysoké koncentraci alkoholu. Mezitím byly připraveny centrifugační zkumavky, do kterých se vložily kolonky. Těmito kolonkami je zachyceno DNA na speciální křemičité membráně. Do takto připravených zkumavek je přepipetován celý objem a centrifugován při rychlosti rpm po dobu 1 minuty. Poté je kolonka vložena do čisté centrifugační zkumavky a je přidáno 500 µl pufru TX a centrifugováno při stejném čase a rychlosti jako předchozí. Kolonka se opět vyjme, vloží se do čisté centrifugační zkumavky a je přidáno 500 µl T3 pufru. Vše je znovu centrifugováno po stejnou dobu i rychlost. Celý vzorek se poté centrifuguje na sucho stejně jako u krve. 18

19 Kolonka se vyjme a vloží do čisté Eppendorfovy zkumavky (1,5 ml) a vše se opakuje jako u krve (GENOMED) Polymerázová řetězová reakce PCR Základní molekulárně-genetickou metodu lze považovat polymerázovou řetězovou reakci (PCR), sloužící k získání dostatečného množství specifické DNA pro další analýzy. V některých svých modifikacích může sloužit i přímo i identifikaci polymorfismů (Knoll, Vykoukalová, 2002) Amplifikace genů a dalších sekvencí DNA in vitro lze provádět polymerázovou řetězovou reakcí (obvykle označovanou jako PCR). K PCR potřebujeme syntetické oligonukleotidy komplementární ke známým sekvencím ohraničujícím oblast zájmu, aby mohla být ve zkumavce zahájena enzymatická amplifikace části DNA mezi těmito sekvencemi. Metodu PCR vyvinul Kary Mullis, který za tuto práci obdržel v roce 1993 Nobelovu cenu za chemii (Snunstad,Simmon, 2009). Metoda PCR zahrnuje tři kroky, které se mnohokrát opakují. V prvním kroku je genomová DNA obsahující sekvence, které mají být amplifikovány, denaturována zahřátím na C po dobu asi 30 sekund. Ve druhém kroku je denaturovaná DNA hybridizována s nadbytkem syntetických oligonukleotidových primerů, tak, že se inkubují společně při C po dobu 30 sekund. Ideální teplota pro připojení primerů závisí na tom, z kolika a z jakých bází jsou složeny. Ve třetím kroku je použita DNA polymeráza pro replikaci úseku DNA mezi místy komplementárními k oligonukleotidovým primerům. Primer poskytuje volnou 3 OH skupinu potřebnou pro kovalentní navázání dalšího nukleotidu a následné prodlužování řetězce. Denaturovaná genomová DNA přitom zajišťuje funkci templátu. K polymeraci obvykle dochází při C po dobu 1,5 minuty. V následujícím cyklu se produkty prvního cyklu replikace denaturují a po připojení primerů replikují DNA-polymerázou. Proces se mnohokrát opakuje, dokud není dosaženo požadovaného stupně amplifikace (Snustad,Simmons, 2009). 19

20 Obr. č. 1 Schéma PCR ( RFLP (polymorfizmus délky restrikčních fragmentů) Pomocí polymorfismu délky restrikčních fragmentů se identifikují alely na základě absence nebo přítomnosti specifického restrikčního místa. Genomová DNA je štěpena příslušnou restrikční endonukleázou, separována elektroforézou na agrarózovém gelu a přenesena na pevnou membránu pomocí Southernova přenosu (Knoll, Vykoukalová, 2002). Příčinou vzniku polymorfismů jsou mutace v původních restrikčních místech, kvůli kterým dochází ke ztrátě, nebo ke vzniku nového restrikčního místa. RFLP analýza je závislá na dostupnosti specifických sond. To jsou jednořetězcové, většinou naklonované úseky DNA (získané z rekombinantní genomové DNA knihovny), popř. uměle nasyntetizované oligonukleotidové sekvence, určité části genomu. Sondy musí být vybírány s ohledem na dostatečný polymorfismus cílových míst 20

21 a jednoznačnost hybridizace. Ke značení sond se obvykle používá radioizotopů. Detekce se provádí autoradiograficky. RFLP markery na jaderné DNA vykazují kodominanci a jsou využívány pro genetické analýzy určování otcovství tzv. fingerprinting a pro tvorbu genetickým map. Širšímu využití RFLP na nukleární DNA ve fylogenetických studiích většinou brání jejich pracnost, časová a finanční náročnost (Bachman, 1992) Stanovení sekvence DNA (sekvencování DNA) Cílem sekvencování DNA je stanovení primární struktury neboli pořadí nukleotidu v molekulách DNA (Pantůček, 2005). Znalost sekvence DNA je používána k odvození informace o aminokyselinové sekvenci kódovaných proteinů, o regulaci jejich tvorby a též umožňuje detailně stanovit charakter mutací (Pantůček, 2005) Sekvencování je metoda, kde se stanovuje přímo sekvence nukleotidů DNA. Metody jsou založeny na enzymatické reakci. Do sekvenční reakce se dává směs normálních nukleotidů s modifikovanými nukleotidy, které nemají OH skupinu nutnou pro navázání dalšího nukleotidu. Jejich zařazením do řetězce DNA se reakce zastaví a tím jsou získány fragmenty různé délky. Značení při sekvenční reakci se provádí radioaktivně, stříbrem nebo fluorescenčně a to i několika způsoby: značení primerů, od kterého se odvíjí sekvencovaná DNA přímé značení sekvencovaných nukleotidů přímé značení koncových nukleotidů Při fluorescenčním znační je dobré použít čtyři barvy (na každý ddntp jinou), a pak je možné provádět jen jednu společnou sekvenační reakci. Sekvencování je dnes už rutinní záležitostí a lze postupovat podle manuálů výrobců jednotlivých zařízení (Knoll, Vykoukalová, 2005) Fragmentační analýza Vyhodnocení sledovaných polymorfismů je stanoveno prostřednictvím fragmentační analýzy DNA v automatickém sekvestoru. Výstupy jsou umožněny pomocí genetických softwarových programů. 21

22 Obr. č. 2 Sekvenátor ABI PRISM 310 (Anonym, 2009) Obr č. 3 Výsledky fragmentační analýzy 22

23 3.4 Akreditované laboratoře v České republice Laboratoř agrogenomiky Tato laboratoř je akreditovaná ČIA dle normy ČSN EN ISO/IEC a jejím předmětem je molekulární analýza struktury a funkce živočišného genomu DNA technologiemi pro výzkum, vývoj a inovace genetických markerů a pro stanovování genetických typů a ověření parentity zvířat. DNA analýzy: DNA testy koní DNA testy skotu DNA testy psů U koní je to: ověření původu určení genetického typu hříběte a matky určení genetického typu hřebce zařazovaného do plemeniteb DNA testy pro zbarvení koní. Analýza DNA u koní se může provádět z krve, ale nejčastěji se používají chlupové cibulky. Pro skot: ověření původu paternita určení genetického typu analýza dvojího osvalení analýza bezrohosti U psů se provádí určení DNA profilu a ověření původu psů. A nově také nabízí DNA profily ověřování původu koček. Cena za DNA profil (genetický typ) je 700 Kč a ověření původu 100 Kč ( 23

24 Kontakt: LAMGen a laboratoř agrogenomiky Mendelova Univerzita v Brně Zemědělská BRNO irenav@mendelu.cz Českomoravská společnost chovatelů, a. s. Hlavní náplní práce laboratoře imunologie je ověřování původu zvířat. Od roku 1986 je tato laboratoř členy ISAG (International Society for Animal Genetics). Laboratoř imunogenetiky je akreditovaná zkušební laboratoř č. 13, kde akreditaci provedl Český institut pro akreditaci, o. p. s. Praha. Laboratoř imunogenetiky testuje především: původ, na základě porovnání genetických typů rodičů a potomka testace citlivost prasat na stres (MHS) testace kappa kaseinu vyhledání geneticky podmíněných vad ( Ceník služeb poskytovaných Laboratoří imunogenetiky: Stanovení genotypu mikrosatelitů u koní 900 Kč Ověření správnosti původu (použití genomu již testovaného zvířete) koně 100 Kč Vystavení kopie protokolu 500 Kč ( Kontakt je: Českomoravská společnost chovatelů, a.s. Praha Laboratoř imunogenetiky Hradištko pod Medníkem 123, ČR Fax: , Tel.: IČO DIČ CZ ( 24

25 3.4.3 Veterinary genetic laboratory (VGL) VGL (Veterinary genetic laboratory) poskytuje ověření zvířecího původu, identifikaci, forenzní služby, genetické diagnostiky a genetický výzkum nemocí jako jednotka školy veterinární medicíny na University of California, Davis. VGL je mezinárodně uznávaná jako průkopník a odborník na DNA založené testování na zvířatech. Laboratoř nabízí rozsáhlé služby v oblasti forenzního programu zvířat, diagnostické testy na genetické choroby, a podporu pro genetický výzkum domácích druhů, primátu a volně žijících zvířat. VGL nabízí své odborné znalosti v oblasti ověření rodičovství, identifikaci, genetických chorob a diagnostických testů. Laboratoř testuje kromě koní i lamy, bizony, kozy, ovce, prasata, buvoly, jeleny, kočky, psy a mnoho dalších. U koní testují: paternitu a ověření původu barvu srsti na onemocnění Cereberální abiotrofie (CA) Dun gen nemoc GBED u hříbat chybí enzym k ukládání glykogenu, smrtelná nemoc kožní onemocnění Herda onemocnění svalů HYPP Jako vzorky se používají především žíně a chlupové cibulky. Cena za služby poskytující u koní se pohybuje okolo 40 až 50 dolarů za jedno zvíře (www. vgl.ucdavis.edu). Kontakt: Veterinary Genetics Laboratory University of California, Davis One Shields Avenue Davis, CA

26 3.4.4 Dr. Van Haeringen Laboratorium b. v. Dr. Van haeringen Laboratorium BV (VHL) byla založena v roce 1986 a je to nezávislá soukromá společnost. Pomoci DNA technologií od roku 1993 má VHL exponenciální růst. VHL nabízí zkušené laboratorní služby v oblasti DNA testů u zvířat. V posledních letech společnost investuje do výzkumu a vývoje, kvality (ISO pro akreditacia certifikaci ISO 9001) a nejmodernější automatizační techniky. VHL je společnost v rámci skupiny Van Haeringen. Skládá se ze dvou laboratoří. Dr. Van Haeringen Global BV (VHL), která je holdingovou společností a Dr. Van Haeringen poly bvba v Belgii, která je servisní laboratoří, laboratoří s pěti zaměstnanci, kteří nabízejí stejné zkoušky jako VHL. VHL je akreditován podle ISO / IEC 17025:2005 standart. Certifikát je zapsán pod číslem L475. Akreditace je platná pro různé DNA testování, přehled je k dispozici na Laboratorní testy se provádí u skotu, koní, prasat, ovcí a koz, psů koček, ptáků a ostatních. U koní se provádí analýzy: ověření původu a rodičovství barva srsti onemocnění (HYPP) nemoc (GBED) cerebeální abiotrofie (CA) polysacharidové skladování myopatie (PSSM) Fell pony syndrom a mnoho dalších v kombinacích. Jako vzorky používají nejčastěji chlupové cibulky, ale také i často krev. Cenově se testy u koní pohybují okolo 30 až 35 euro ( 26

27 Kontakt: Agro Business Park PW Wageningen Nederland Postbus AK Wageningen Nederland Telefon: +31 (317) info@vhlgenetics.com Srovnání vybraných laboratoří Vybrala jsem si 4 laboratoře genetiky. Dvě z České republiky a dvě světové. Po srovnání jsem zjistila, že cenově se testy na ověření původu a určování parentity pohybují stejně, tedy od 700 do 800 Kč. Jako vzorky se používají chlupové cibulky, žíně a krev. Tab. č. 2 Srovnání vybraných laboratoří Název laboratoře Používané vzorky Cena DNA testů Laboratoř agrogenomiky chlupové cibulky, žíně, krev 700 Kč Laboratoř imunogenetiky Chlup.cibulky,žíně, krev 900 Kč VLG, California Chlup. cibulky, žíně, krev Kč (40-50 dolarů) VHL, Nizozemí Žíně, krev Kč (30-35 euro) 27

28 4 OVĚŘENÍ PARENTITY U KONÍ Cílem mé práce mimo jiné bylo i vyhodnocení správnosti určení genetického typu a ověření původu u testovaných koní. Koně jsou plemene český teplokrevník. Obdržela jsem výsledky, kde byl jeden otec, dvě matky a čtyři potomci. Výsledky jsou interpretovány podle zákona. Tab. č. 3 Polymorfní lokusy potomek č. 1 Jméno Pohlaví Plemeno ATH4 ATH5 HMS1 HMS2 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT H J M N M M H L MATKA1 GRACIE klisna ČT O O M N M M K K MATKA2 VIANA klisna ČT I K J M J M I M POTOMEK 1 GAMA klisna ČT O O M N M M H K Jméno Pohlaví Plemeno HMS3 HMS6 HMS7 HTG4 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT I - K P J J K M MATKA1 GRACIE klisna ČT - P P P M O L M MATKA2 VIANA klisna ČT I P L P J O M M POTOMEK 1 GAMA klisna ČT - P P P L M L M Jméno Pohlaví Plemeno HTG6 HTG7 HTG10 VHL20 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT M P O O L L L M MATKA1 GRACIE klisna ČT G O N O I O L M MATKA2 VIANA klisna ČT J O K N N N L L POTOMEK 1 GAMA klisna ČT G O N O I O M N Jméno Pohlaví Plemeno ASB2 ASB17 ASB23 CA425 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT K M G N L - N N MATKA1 GRACIE klisna ČT M Q F M J L J M MATKA2 VIANA klisna ČT N O N N N N N N POTOMEK 1 GAMA klisna ČT M R G M L S M N 28

29 Jméno Pohlaví Plemeno LEX3 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT H H MATKA1 GRACIE klisna ČT K L MATKA2 VIANA klisna ČT N N POTOMEK 1 GAMA klisna ČT K L Interpretace výsledků dle Zákona č. 154/2000 Sb., pro kombinaci Otec, Matka 1, Potomek 1: původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí otec Interpretace výsledků dle Zákona č. 154/2000 Sb., pro kombinaci Otec, Matka 2, Potomek 1: původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče Tab. č. 4 Polymorfní lokusy potomek č. 2 Jméno Pohlaví Plemeno ATH4 ATH5 HMS1 HMS2 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT H J M N M M H L MATKA1 GRACIE klisna ČT O O M N M M K K MATKA2 VIANA klisna ČT I K J M J M I M POTOMEK 2 FALKA klisna ČT H H M N J M H L Jméno Pohlaví Plemeno HMS3 HMS6 HMS7 HTG4 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT I - K P J J K M MATKA1 GRACIE klisna ČT - P P P M O L M MATKA2 VIANA klisna ČT I P L P J O M M POTOMEK 2 FALKA klisna ČT I P P P J J K M Jméno Pohlaví Plemeno HTG6 HTG7 HTG10 VHL20 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT M P O O L L L M MATKA1 GRACIE klisna ČT G O N O I O L M MATKA2 VIANA klisna ČT J O K N N N L L POTOMEK 2 FALKA klisna ČT J M O O - L I M 29

30 Jméno Pohlaví Plemeno ASB2 ASB17 ASB23 CA425 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT K M G N L - N N MATKA1 GRACIE klisna ČT M Q F M J L J M MATKA2 VIANA klisna ČT N O N N N N N N POTOMEK 2 FALKA klisna ČT M N G G I L N O Jméno Pohlaví Plemeno LEX3 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT H H MATKA1 GRACIE klisna ČT K L MATKA2 VIANA klisna ČT N N POTOMEK 2 FALKA klisna ČT H M Interpretace výsledků dle Zákona č. 154/2000 Sb., pro kombinaci Otec, Matka 1, Potomek 2: původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí matka 1 Interpretace výsledků dle Zákona č. 154/2000 Sb., pro kombinaci Otec, Matka2, Potomek 2: původ souhlasí s uvedenými rodiči Tab. č. 5 Polymorfní lokusy potomek č. 3 Jméno Pohlaví Plemeno ATH4 ATH5 HMS1 HMS2 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT H J M N M M H L MATKA1 GRACIE klisna ČT O O M N M M K K MATKA2 VIANA klisna ČT I K J M J M I M POTOMEK 3 VIKA klisna ČT J K M N M M I J Jméno Pohlaví Plemeno HMS3 HMS6 HMS7 HTG4 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT I - K P J J K M MATKA1 GRACIE klisna ČT - P P P M O L M MATKA2 VIANA klisna ČT I P L P J O M M POTOMEK 3 VIKA klisna ČT I P L P J L M M 30

31 Jméno Pohlaví Plemeno HTG6 HTG7 HTG10 VHL20 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT M P O O L L L M MATKA1 GRACIE klisna ČT G O N O I O L M MATKA2 VIANA klisna ČT J O K N N N L L POTOMEK 3 VIKA klisna ČT G J N N N O I L Jméno Pohlaví Plemeno ASB2 ASB17 ASB23 CA425 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT K M G N L - N N MATKA1 GRACIE klisna ČT M Q F M J L J M MATKA2 VIANA klisna ČT N O N N N N N N POTOMEK 3 VIKA klisna ČT K O Jméno Pohlaví Plemeno LEX3 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT H H MATKA1 GRACIE klisna ČT K L MATKA2 VIANA klisna ČT N N POTOMEK 3 VIKA klisna ČT Interpretace výsledků dle Zákona č. 154/2000 Sb., pro kombinaci Otec, Matka 1, Potomek 3: původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí Matka 1 Interpretace výsledků dle Zákona č. 154/2000 Sb., pro kombinaci Otec, Matka 2, Potomek 3: původ souhlasí s uvedenými rodiči Tab. č. 6 Polymorfní lokusy potomek č. 4 Jméno Pohlaví Plemeno ATH4 ATH5 HMS1 HMS2 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT H J M N M M H L MATKA1 GRACIE klisna ČT O O M N M M K K MATKA2 VIANA klisna ČT I K J M J M I M POTOMEK 4 LORNA klisna ČT J K K N M M J L 31

32 Jméno Pohlaví Plemeno HMS3 HMS6 HMS7 HTG4 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT I - K P J J K M MATKA1 GRACIE klisna ČT - P P P M O L M MATKA2 VIANA klisna ČT I P L P J O M M POTOMEK 4 LORNA klisna ČT P P P P L L M M Jméno Pohlaví Plemeno HTG6 HTG7 HTG10 VHL20 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT M P O O L L L M MATKA1 GRACIE klisna ČT G O N O I O L M MATKA2 VIANA klisna ČT J O K N N N L L POTOMEK 4 LORNA klisna ČT G O N O O S I L Jméno Pohlaví Plemeno ASB2 ASB17 ASB23 CA425 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT K M G N L - N N MATKA1 GRACIE klisna ČT M Q F M J L J M MATKA2 VIANA klisna ČT N O N N N N N N POTOMEK 4 LORNA klisna ČT K M Jméno Pohlaví Plemeno LEX3 OTEC 2591 AMON-36 hřebec ČT H H MATKA1 GRACIE klisna ČT K L MATKA2 VIANA klisna ČT N N POTOMEK 4 LORNA klisna ČT Interpretace výsledků dle Zákona č. 154/2000 Sb., pro kombinaci Otec, Matka 1, Potomek 4: původ souhlasí s uvedenými rodiči Interpretace výsledků dle Zákona č. 154/2000 Sb, pro kombinaci Otec, Matka 2, Potomek 4: původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí Matka 2 32

33 5 ZÁVĚR V bakalářské práci jsou zpracovány literární podklady na téma Genetické metody identifikace a ověřování parentity u koní. Zabývala jsem se metodami, které se v současné době používají pro ověřování parentity u koní. V práci je uvedena legislativa, týkající se problematiky šlechtění a plemenitby. V další kapitole je zmíněna obecná charakteristika mikrosatelitů, pomocí kterých používáme genetické metody pro potvrzování původu a stanovení genetického typu. Dále jsou zde shrnuty a popsány metody pro testování polymorfismu DNA, získávání DNA a její izolace. Poslední část je věnována akreditovaným laboratořím v České republice, ale i zahraniční, které tyto metody vykonávají a taky se jimi zabývají. U vybraných laboratoří byly srovnány používané metody a jejich nákladovost. Na poslední část navazuje část týkající se ověřování parentity u koní, konkrétně u plemene Český teplokrevník. Dle zadaných výsledků a podkladů byly porovnávány genotypy mikrosatelitů potomků a genotypy mikrosatelitů jejich potenciálních rodičů. Výsledky byly interpretovány dle zákona č. 154/2000 Sb., a vyhlášky č. 448/2006 Sb. Je zřejmé, že identifikace a ověřování rodičovství jedince má nenahraditelný význam v chovu koní, ale i všech hospodářských zvířat. V moderním šlechtění má nezastupitelnou roli. 33

34 6 PŘEHLED POUŽITÝCH ZDROJŮ 6.1 Literární zdroje BOWLING, A./. The genetics of the Horses.Wallingford: CABI Publishing, s. ISBN DOŠKAŘ, Jiří; PANTŮČEK, Roman. Fyzikální mapování DNA: Detekce polymorfizmů v genomech. In ŠMARDA, Jan, et al. Metody molekulární biologie Brno -Kraví Hora: Masarykova univerzita v Brně, s ISBN DVOŘÁK, J., ČEPICA, S., DVOŘÁK, P., HRUBAN, V., KUCIEL, J., MÁCHA, J., RUBEŠ, J. Genetika hospodářských zvířat. MZLU Brno, 1992, ISBN , s. 95 DVOŘÁK, J., PUTNOVÁ, L., VRTKOVÁ, I. Ověřování parentity u prasat, skotu a koní. MZLU Brno, 2002 KNOLL, A. - URBAN, T. Aktuální metody používané v molekulární genetice zvířat. In Xxth Genetic days Brno vyd.Brno: MZLU v Brně, 2002, s ISBN KNOLL, Aleš; VYKOUKALOVÁ, Zuzana. Molekulární genetika zvířat: Metody detekce polymorfzmů DNA genů Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně : [s.n.], s. ISBN MARKLUND, S. Applied Molecular Genetics in Domestic Animals with Particulas Focus : on the Horse. Uppsala: SUAS, s. ISBN SNUSTAD, D. Peter, SIMMONS, Michael J. GENETIKA. Brno: Masarykova univerzita, Metody molekulární genetiky, s ISBN ZIMA, Jan, et al. Genetické metody v zoologii Univerzita Karlova v Praze: Karolium, Praha1, s. ISBN

35 6.2 Internetové zdroje BACHMAN, K. (1992) Nuclear DNA markers in angiosperm taxonomy. Acta Botanica Neerlandica 39: , Polymorfismus délky restrikčních fragmentů [cit ] Dostupný z WWW: < > Česká republika. Označování zvířat a jejich evidence. In Vyhláška č , 44, s Dostupný také z WWW: < Česká republika. Plemenářský zákon. In Sbírka zákonů. 2006, 106, s Dostupný také z WWW: < ISSN Česká republika. Plemenářský zákon. In Zákon 344/2006 Sb. 2006, 106, s Českomoravská společnost chovatelů: [online] [cit ]. Dostupné z WWW: < GENOMIA s.r. o. - genetická laboratoř. 2010: online [cit ] Dostupné na: GENOMED [online] [cit ]. GENOMED. Dostupné z WWW: < HAMÁNOVÁ, K. Polymorfizmus DNA se zaměřením na mikrosatelity u koní. In [online].[cit ]. Dostupné z WWW: < LAMGen a laboratoř agrogenomiky [online] 2010 [cit ]. Dostupné z WWW: <.lamgen.cz> PŘIBÁŇOVÁ, M. Zákonný podklad stanovení genetického typu_id=174 [online] [cit ]. Dostupný z WWW:< 35

36 Vhl.genetics. com [online] [cit ]. Dr. van haeringen laboratorium b.v. Dostupné z WWW: < UC Davis Veterinary genetic laboratory [online] [cit ]. Veterinary genetic laboratory. Dostupné z WWW: < GeneTiCa s. r. o.[online] 2009 [cit.10.dubna 2011] Dostupné z : 36

37 7 SEZNAM TABULEK Tab. č. 1 Testované mikrosatelity pro koně (Instruction Manual, Equine Genotypes, Panel F-850S/L) Tab. č. 2 Srovnání vybraných laboratoří Tab. č. 3 Polymorfní lokusy potomek č. 1 Tab. č. 4 Polymorfní lokusy potomek č. 2 Tab. č. 5 Polymorfní lokusy potomek č. 3 Tab. č. 6 Polymorfní lokusy potomek č. 4 37

38 8 PŘÍLOHY Příloha č. 1 Průvodní tiskopis pro vzorky koní ( Objednávám: O 1. ověření původu 2. zjištění DNA typu * označte křížkem vámi požadovanou službu Identifikační číslo koně Nar.... Lab.č. Jméno zvířete... Barva... Plemeno... Pohlaví... OTEC Identifikační číslo koně: Lab.č. MATKA Identifikační číslo koně: Lab.č. Jméno... Jméno... OTEC (vyplňte pouze v případě krytí klisny dvěma hřebci) Nar... Barva... Jméno... Plemeno... Zasílám vzorek výše uvedeného zvířete. Zkumavka (obálka) je označena jménem zvířete. Potvrzuji, že vzorek byl odebrán od výše uvedeného zvířete. Případ fakturujte na adresu: 38

39 ... PSČ... DIČ... Banka... č.ú... IČO... Telefon:... Datum odběru podpis chovatele nebo majitele (objednavatele) Poznámky: (lze uvést i na druhé straně)... Upozornění: Lab. č. udejte pouze v případě, že zvíře již bylo testováno. Pro každý vzorek vyplňte samostatný tiskopis. Průvodní tiskopis nahrazuje objednávku. Bez řádného a čitelného průvodního tiskopisu nelze vzorky zpracovat a budou bez náhrady vyřazeny. Identifikační č. koně podle vyhl. Mze č. 357/2001 Sb. 39