MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2012 RADEK KREJČÍ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Studium antioxidačního profilu u vysoce produkčních krav Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. René Kizek, Ph.D. Vypracoval: Radek Krejčí Konzultant: Ing. Jiří Sochor, Ph.D. Brno 2012

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Studium antioxidačního profilu u vysoce produkčních krav, vypracoval samostatně a použil jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne... podpis...

4 Výzkum popsaný v této bakalářské práci byl realizován v laboratořích podpořených z projektu SIX; registrační číslo CZ.1.05/2.1.00/ , operační program Výzkum a vývoj pro inovace.

5 PODĚKOVÁNÍ Velice rád bych poděkoval za odborné vedení mé práce a cenné rady Ing. Jiřímu Sochorovi, Ph.D., a také celé pracovní skupině doc. Ing. René Kizeka, Ph.D. za vytvoření příjemných pracovních podmínek. Školnímu zemědělskému podniku v Žabčicích děkuji za poskytnutí vzorků prostřednictvím Ing. Petra Mareše, Ph.D. Na závěr bych rád poděkoval přítelkyni a rodičům za podporu při studiu.

6 ABSTRAKT Antioxidační aktivita je veličina, kterou se hodnotí schopnost organismu vychytávat volné radikály, bránit jejich vzniku nebo je převádět do méně reaktivní formy. Snížená antioxidační aktivita vede k oxidačnímu stresu, který je spjat s ohrožením celého organismu, únavou, nízkou výkonností, náchylností k infekcím, ale přispívá i ke vzniku zánětlivých onemocnění nebo rakoviny. Cílem této práce bylo sledování oxidačního stresu vyvolaného březostí a porodem vysoce produkčních krav. Bylo sledováno dvanáct březích jalovic Holštýnského plemene, které byly chovány ve Školním zemědělském podniku v Žabčicích. Zaměřili jsme se na sledování oxidačního stresu pomocí antioxidačních enzymů superoxid dismutázy, katalázy, glutathion peroxidázy, glutathion reduktázy a dále na studium antioxidační aktivity, která byla sledována pomocí čtyř principiálně rozdílných metod (DPPH, ABTS, FRAP, Free Radicals). Parametry byly sledovány v krevní plazmě v době deset a pět dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. Výsledky antioxidační aktivity poukázaly na snižující se hodnoty do doby porodu, po porodu byl tento parametr postupně vyrovnáván. Aktivita antioxidačních enzymů v době březosti narůstala, což bylo pravděpodobně zapříčiněno vyšším příjmem kyslíku, ze kterého je tvořen superoxid, který je antioxidačními enzymy odbouráván. Klíčová slova: březost, antioxidační aktivita, antioxidační markery

7 ABSTRACT An antioxidant activity is a value that determines organism s ability to absorb free radicals, prevent their formation, or transform into the less reactive form. Reduced antioxidant activity causes an antioxidant stress. Threat of whole organism, tiredness, low efficiency, liability to the infection, pavement and cancer are results of the antioxidant stress. The target of thesis is monitoring of an oxidant stress elicited by gravidity and birth of a high productive cows. Twelve pregnant Holštýn heifers, feeded in Agronomical School company in Žabčice village, were observed. We focused on the oxidant stress monitored by antioxidant enzymes; superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase and on study of the antioxidant activity monitored by four different methods (DPPH, ABTS, FRAP, Free Radicals), as well. The parameters were monitored in blood plasma in the time of ten and five days before birth, in the day of birth, five and ten days after birth. Results of antioxidant activities showed decreased values till birth, after birth where the parameters gradually adjusted. Increase of the antioxidant enzyme activity during gravidity were caused by higher oxygen intake, which is creating superoxide, degraded by antioxidant enzymes. Keywords: gravidity, antioxidant activities, antioxidant markers

8 Bibliografická citace KREJČÍ, R. Studium antioxidačního profilu u vysoce produkčních krav. Brno: Mendelova univerzita v brně, Fakulta agronomická, s. Vedoucí bakalářské práce doc. Ing. René Kizek, Ph.D.

9 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ ČÁST Volné radikály Vznik volných radikálů Reakce volných radikálů Působení volných radikálů Zdroje volných radikálů Reaktivní formy Singletový kyslík Superoxidový anion Hydroxylový radikál Peroxid vodíku Oxid dusnatý Oxidační stres Antioxidanty Působení antioxidantů Antioxidační mechanismy Superoxid dismutáza Glutathion peroxidáza Glutathion reduktáza Kataláza Metody stanovení antioxidační aktivity Metoda ABTS Metoda DPPH Metoda FRAP Metoda Free radicals MATERIÁL A METODY

10 4.1 Experimentální zvířata Krmné dávky Odběry vzorků krve Zpracování vzorků krve Stanovení antioxidační aktivity Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody DPPH Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody Free radicals Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody FRAP Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS Stanovení aktivity Superoxid dismutázy Stanovení aktivity Glutathion peroxidázy Stanovení aktivity Glutathion reduktázy Stanovení aktivity Katalázy VÝSLEDKY A DISKUZE Stanovení antioxidační aktivity Stanovení antioxidační aktivity metodou DPPH Stanovení antioxidační aktivity metodou Free radicals Stanovení antioxidační aktivity metodou FRAP Stanovení antioxidační aktivity metodou ABTS Stanovení antioxidačních enzymů Stanovení aktivity Superoxid dismutázy Stanovení aktivity Katalázy Stanovení aktivity Glutathion peroxidázy Stanovení aktivity Glutathion reduktázy ZÁVĚR LITERATURA SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM ZKRATEK

11 1 ÚVOD Volné radikály jsou chemické částice obsahující jeden nebo více nepárových elektronů, které neustále vznikají v organismu nebo jsou přijímány z okolního prostředí nesprávnou výživou, ultrafialovým a ionizujícím zářením, výfukovými plyny, pobytem ve znečištěném prostředí nebo také stárnutím, psychickou či fyzickou zátěží. Nejčastěji se jedná o sloučeniny kyslíku a dusíku. Vznik volných radikálu, se ale také váže na fyziologické či biologické procesy v organismech, jako je březost a následný porod. V době březosti množství radikálů, díky vyšším nárokům na kyslík a energii, stoupá. Intenzivní příjem a zpracování kyslíku zapříčiňuje navyšování oxidačního stresu, který se projeví sníženou antioxidační aktivitou. Zvýšený oxidační stres v době porodu je dán více faktory, jako jsou psychický stres, reprodukční stres, nízký příjem krmiva, snížený imunitní systém a vyšší příjem kyslíku. Dochází k poškozování buněk, pružnosti vaziva, oslabují imunitní systém a napomáhají ke vzniku mnoha nemocem. Pro snížení oxidačního stresu si organismy vyvinuly velmi důležité obranné antioxidační mechanismy, kterými likvidují volné radikály v těle, a tak zeslabují oxidační stres. Jedná se především o enzymy chránící organismus před oxidačním poškozením tím, že převádí nebezpečné radikály na méně účinné deriváty. Naše práce byla pilotní studií mapování oxidačního stresu v době porodu u jalovic. V návaznosti na naše zjištění budou v dalším experimentu jalovicím přidávána aditiva pro zlepšení zdravotního stavu v době březosti. Bude sledováno, zda bude docházet ke snižování oxidačního stresu. 11

12 2 CÍL PRÁCE V literární části zpracovat rešerši zabývající se volnými radikály, antioxidačními enzymy a použitými metodami pro stanovení antioxidační aktivity u námi sledovaných vzorků. V experimentální části bylo cílem připravit a následně stanovit u vybraných vzorků krevní plazmy březích jalovic antioxidační aktivitu pomocí metod DPPH, ABTS, Free radicals a FRAP a antioxidační enzymy superoxid dismutázu, katalázu, glutathion peroxidázu a glutathion reduktázu. Úkolem bylo zjistit, do jaké míry se projeví vliv porodu na vybrané antioxidační enzymy a antioxidační aktivitu u jalovic. 12

13 3 LITERÁRNÍ ČÁST 3.1 Volné radikály Volné radikály jsou atomy, molekuly nebo ionty s nespárovanými elektrony v elektronovém obalu, většinou značeny tečkou (např.: CH 3 ). Jsou neúplné, nestálé, vysoce reaktivní, škodlivé látky, které jsou schopné přijmout vazebný elektron jiné sloučeniny, velmi ochotně se spojují s jinými sloučeninami a mění je (Vergely, a kol., 1998). Nejznámějším a nejprostudovanějším radikálem je kyslík. Jeho nejnebezpečnějšími formami jsou superoxidový a hydroxylový radikál. Je známo, že kyslík je nezbytný pro buněčný metabolismus a tvorbu energie. Nicméně je významným zdrojem volných radikálů, kdy na místo nepárového elektronu se okamžitě naváže molekula kyslíku a vzniká tak peroxylový radikál, který se snaží získat z jiné sloučeniny chybějící elektron, čímž vytváří jiný volný radikál. Tato řetězová reakce je přerušena reakcí dvou radikálů nebo reakcí radikálu s antioxidantem (Ghibu, a kol., 2012). Volné radikály neustále vznikají v organismu samovolně např.: jako produkt oxidačního metabolismu, při buněčném dýchání, při látkové přeměně, při obraně před bakteriemi, ultrafialovým či ionizujícím zářením nebo jsou přijímány ze znečištěného okolního prostředí. Tyto faktory přispívají ke zvýšení tvorby volných radikálů (Blomhoff, a kol., 2006). Protože v organismu se neustále tvoří nové buňky, volné radikály je mohou poškodit, snížit imunitní systém organismu a vést k řadě onemocnění. Pro organismus je nutné, aby tyto škodlivé částice byly ihned po svém vzniku zachyceny a zničeny (Halvorsen, a kol., 2002). Látky, mající schopnost volné radikály v těle zničit nebo blokovat, se nazývají antioxidanty. I přesto volné radikály v těle jsou a nelze se jim vyhnout, jejich množství v nemoci, stresu či fyzické zátěži může i stoupat. Také stárnutí zvyšuje tvorbu volných radikálů a snižuje schopnost jejich eliminace. Stárnutí se projevuje v podkožní vazivové tkáni, a to změnou vazivové tkáně, v poruše pružnosti vaziva a vzniku vrásek. Ale ke změnám dochází i u vnitřních orgánů, cév, šlach a svalů (Halliwell a Gutteridge, 1986). Některé volné radikály jsou součástí zdravého metabolismu a umí je využít např.: bílé krvinky obsahují volné radikály, kterými ničí mikroorganismy, kvasinky, parazity (Wentworth, a kol., 2000). 13

14 3.1.1 Vznik volných radikálů Volné radikály vznikají homolyticky, kdy každý vazebný partner si ponechá jeden elektron chemické vazby, a tak dojde ke vzniku dvou radikálů. Pokud se atom rozpadá na dva radikály, tak dochází k homolýze př.: CH 4 CH 3 + H, opačný proces, kdy dochází ke spojení dvou radikálů, se nazývá koligace př.: CH 3 + H CH 4. Dále redukcí, při které dochází k přidání jednoho elektronu (e - ) nebo oxidací, při které je odebrán jeden elektron (e - ) (Hey a Waters, 1964) Reakce volných radikálů Reakce volných radikálů v organismu probíhá ve třech krocích, kterými dochází k šíření volných radikálů. 1. Iniciace reakce, kdy rozdělením atomu či molekuly vzniknou volné radikály. 2. Propagace reakce, při které je nepárový elektron předáván na další atomy či molekuly, přičemž původní volný radikál se mění na neradikálovou částici za vzniku nového volného radikálu z částice, která elektron převzala. 3. Terminace touto reakcí dochází k zániku volných radikálů vstupem nepárových elektronů do reakce (Krishna a Bell, 1993) Působení volných radikálů Volné radikály působí na biologicky důležité makromolekuly zejména na bílkoviny, sacharidy, tuky a DNA. U DNA může docházet ke ztrátám informace, a tím k ovlivnění buněčného dělení a nových buněk. Poškození přepisu buněk může vést až k různým mutacím nebo zániku buněk. Dále může docházet ke ztrátám enzymatické aktivity bílkovin, které následně neplní své funkce (Halliwell a Gutteridge, 1990). Pokud jsou tukové části buněčných membrán ponechány bez dostatečné ochrany a bez dostatečného množství antioxidantů, tak peroxidují nebo-li žluknou. Tato činnost může poničit strukturu buněčné membrány. Každá peroxidovaná molekula tuku je schopna peroxidovat jinou molekulu tuku, se kterou se setká, a tak podpoří řetězovou reakci (Sousa, a kol., 2009). 14

15 3.1.4 Zdroje volných radikálů Volné radikály jsou všude kolem nás, ať už ve vzduchu, vodě nebo potravě. Už samotný kyslík působí na tvorbu volných radikálů. Ve vzduchu jsou obsaženy jako částečky prachu nebo ve výfukových plynech, ze kterých se uvolňují uhlovodíky např.: benzpyren a těžké kovy např.: olovo. V pitné vodě se mohou objevit dusitany, chlór, herbicidy, pesticidy, těžké kovy a jiné kovy (Faust a Hoigné, 1990). I potrava obsahující vitamíny, jakož to antioxidanty, může být zdrojem volných radikálů. Tuky obsahující antioxidanty např.: vitamín E, mohou být zdroje volných radikálů už jenom proto, že obsahují nevyužité vazebné elektrony, které jsou typické pro volné radikály. U tuků na vzduchu dochází ke vzniku peroxidů, a ty jsou zdroje volných radikálů. Tento proces je podpořen působením světla, vzduchu a tepla. Také dlouhodobým skladováním dochází ke žluknutí tuků. Žluknutí nemusí probíhat jen u tuků, ale probíhá i u potravin obsahující je, jako např.: ořechy, sušené mléko, smetana. I přepálené tuky jsou zdroje volných radikálů, proto by se neměly používat k opakovanému smažení (Halliwell, 1995). Významným zdrojem volných radikálů jsou mitochondrie, které pro svoji činnost spotřebovávají kyslík za tvorby superoxidu, peroxidu vodíku a hydroxylového radikálu. Superoxid a hydroxylový radikál jsou nejškodlivějšími volnými radikály, ale i peroxid vodíku je velmi nebezpečný, jelikož reakcí s přechodnými kovy může tvořit hydroxylový radikál (Wickens, 2001) Reaktivní formy Mezi reaktivní formy se neřadí pouze volné radikály, ale také sloučeniny, ze kterých mohou volné radikály vznikat. Mají silný oxidační účinek a nežádoucí vliv na živé organismy. Nejvýznamnějšími jsou reaktivní formy kyslíku (Reactive oxygen species ROS) a dusíku (Reactive nitrogen species RNS). Radikálovými reaktivními formami kyslíku jsou superoxidový anion O - 2, hydroxylový radikál HO, peroxylový radikál ROO, alkoxylový radikál RO, hydroperoxylový radikál HO 2. Neradikálovými látkami jsou peroxid vodíku H 2 O 2, kyselina chlorná HClO, ozón O 3 a singletový kyslík 1 O 2 (Prior a Cao, 1999). Dusíkovými reaktivními formami jsou oxid dusnatý NO, oxid dusičitý NO 2, nitrosyl NO +, peroxynitrit ONOO - a alkylperoxynitrit ROONO - (Chaves, a kol., 2000). Ani nejreaktivnější kyslíkatá forma, kterou je hydroxylový radikál není nebezpečná, pokud je vázán ve vazbě. Ale každý nevazebný radikál je nebezpečný, 15

16 protože reaguje s jakoukoli molekulou. Z ní odebere elektron, a tím je schopna tvořit další radikál (Valentão, a kol., 2003) Singletový kyslík Singletový kyslík označovaný 1O 2, je excitovaný stav molekulárního kyslíku. Singletový kyslík má oproti molekulárnímu kyslíku antiparalelní spin. Bylo prokázáno, že singletový kyslík je produkt fotooxidace zprostředkované pomocí pigmentů po absorpci světla, ale také vzniká enzymatickou reakcí katalyzovanou laktoperoxidázou nebo lipoperoxidázou. Je reaktivní a toxickou formou kyslíku, způsobující poškození nukleových kyselin s mutagenními účinky (Agnez-Lima, a kol.) Superoxidový anion - Superoxidové anionty O 2 jsou produkovány enzymy xantin oxidázou v cytoplazmě a NADPH oxidázou v cytoplazmatické membráně, ale také jako vedlejší produkt při dýchání mitochondrií (Lu, a kol., 2003). Superoxidový radikál je nestabilní ve vodném prostředí a je reaktivnější než kyslík, kvůli nepárovému elektronu. Ze suproxidu se vytvářejí další reaktivní formy kyslíku jako peroxid vodíku a hydroxylový radikál. Superoxid je v organismu odbouráván enzymem superoxid dismutázou, která superoxid přeměňuje na peroxid vodíku (Diaz-Uribe, a kol., 2010) Hydroxylový radikál Hydroxylový radikál OH je vysoce toxickou a nebezpečnou látkou způsobující nejrůznější poškození tkáně. Hydroxylový radikál je velice reaktivní, má nejvyšší redoxní schopnosti mezi radikály, a tedy nejkratší životnost ze všech radikálů. Vzniká při hromadění peroxidu vodíku přes kovové katalyzátory. Hydroxylové radikály lze zneškodnit dodáním chybějícího elektronu antioxidanty (Das, a kol., 1997, Elia, a kol., 2012) Peroxid vodíku Vzniká jako vedlejší produkt oxidačního metabolismu, ale také přeměnou ze superoxidového aniontu enzymem superoxid dismutázou. Má velmi silnou oxidační schopnost, vedoucí k neurotickým poruchám. Každý organismus má ale enzymy, 16

17 schopné peroxid vodíku odbourávat. Těmito enzymy jsou kataláza a glutathion peroxidáza, které peroxid vodíku štěpí na vodu (Ferrero-Gutiérrez, a kol., 2008) Oxid dusnatý Oxid dusnatý NO v organismech vzniká katalytickou činností NO syntázy z L-argininu. Jelikož oxid dusnatý obsahuje nepárový elektron, chová se jako potenciální antioxidační látka, protože brání peroxidaci lipidů. NO inhibuje agregaci krevních destiček, má antimikrobiální účinky, brání proti patogenům a nádorovým buňkám. Reakcí oxidu dusnatého se superoxidem tvoří peroxinitrit ONOO -. Peroxinitrit je vysoce reaktivní a může zapříčinit značné škody u proteinů, lipidů a hlavně DNA molekul (Baskol, a kol., 2012) Oxidační stres Volné radikály jsou vysoce reaktivní molekuly nebo chemické látky, obsahující nepárové elektrony, způsobující oxidační stres. Ten je definován jako nepoměr mezi volnými radikály a antioxidanty ve prospěch volných radikálů, což může vést k postižení. K oxidačnímu stresu dochází nízkou hladinou antioxidantů nebo nadměrnou tvorbou volných radikálů v organismu (Prior a Cao, 1999). Jedním z nejvýznamnějších neblahých účinků volných radikálů je oxidační poškození deoxyribonukleové kyseliny DNA, vedoucí k ovlivnění schopnosti replikace DNA při opravě buněk či tvorbě nových buněk. Toto poškození přepisu buněk může vést až ke smrti buňky, k různým mutacím a v nejhorším případě až ke tvorbě nádorů (Martin a Grotewiel, 2006). Reaktivní formy nepoškozují pouze DNA, poškození způsobují i u bílkovin, kde způsobují změny v jejich biologické aktivitě, způsobující jejich nefunkčnost. Velmi důležitým poškozením je peroxidace lipidů, které jsou obsaženy v membránách, ale i v lipoproteinových molekulách. Peroxidací dochází k tvorbě vysoce reaktivních aldehydů. Koncovým produktem jsou toxické látky malondialdehyd nebo hydroxynonenal. Proto je pro zdraví organismu nutné, aby tyto částice byly ihned po svém vzniku zachyceny a zničeny. Antioxidanty mají schopnost volné radikály včas zničit, a snížit tak možnost poškození DNA oxidací při replikaci DNA či tvorbě nových buněk (Salmon, a kol., 2010). 17

18 3.2 Antioxidanty Antioxidanty jsou látky, jejíž molekuly omezují aktivitu volných radikálů, snižují pravděpodobnost jejich vzniku nebo je převádějí do méně reaktivních nebo nereaktivních stavů, a chrání tak organismus proti oxidaci a poškození jimi způsobené (Sun, 1985). Antioxidanty mohou výrazně snížit nepříznivé poškození v důsledku oxidace tím, že volné radikály jsou zneškodněny dříve, než reagují s biologickými cíli. Zabraňují tak řetězové reakci i aktivaci kyslíku na vysoce reaktivní formy, tudíž přispívají k ochraně imunitního systému (Azzi, a kol., 2004). Antioxidanty likvidující volné radikály se nacházejí na různých místech, některé jsou v intracelulárním a jiné v extracelulárním prostředí. Mohou být hydrofilní i lipofilní povahy. Antioxidanty brání oxidaci biologických molekul přímo nebo působí na jiné antioxidanty. Až na anaeroby, je kyslík důležitý pro všechny živé systémy, proto jsou oxidanty přirozeným produktem aerobního organismu. Z tohoto důvodu jsou antioxidanty důležitou složkou organismu, která je nezbytně nutná pro životní pochody a zdraví organismu (Sies, 1997). Antioxidanty jsou rozdělovány do dvou hlavních skupin, tj. enzymatické a neenzymatické antioxidanty. Enzymatickými antioxidanty jsou enzymy produkované organismy a jsou jimi superoxid dismutáza, kataláza, glutathion peroxidáza a glutathion reduktáza. Antioxidanty jako koenzym Q 10, melatonin a glutathion nejsou enzymy, ale jsou také syntetizovány v lidském organismu. Zbylé antioxidanty jako vitamíny, karotenoidy a minerální látky jsou přijímány pouze potravou a jsou děleny podle výskytu v přírodě na přirozené, vyskytující se přirozeně v potravinách, ovoci, nápojích i koření a na syntetické, připraveny uměle z farmaceutického hlediska (Ratnam, a kol., 2006). Síla antioxidantů likvidovat volné radikály je označena antioxidační kapacitou, která znamená dvě věci. První je schopnost antioxidační látky zhášet volné radikály a druhou antioxidační schopnost, což znamená, jak moc a jak dlouho trvá antioxidační látce nebo látce obsahující antioxidanty potlačit oxidaci. Jedná se o více faktorů, proto na vyjádření antioxidační kapacity nelze použít pouze jeden univerzální test, ale je zapotřebí antioxidační kapacitu sledovat pomocí více principiálně rozdílných metod (Niki, 2010). 18

19 Antioxidanty Enzymové (SOD, Kat, GSHPx, GR, ) Endogenní (Melatonin, koenzym Q 10, Glutathion, ) Neenzymové Exogenní (Vitamíny, minerální látky, karotenoidy, polyfenoly, ) Obr. 1: Základní rozdělení antioxidantů dle Wootton-Beard (Wootton-Beard a Ryan, 2011) Působení antioxidantů Existuje velmi mnoho druhů antioxidantů, kdy jejich působení je velmi rozdílné. V přítomnosti kyslíku se na místo nepárového elektronu okamžitě naváže molekula kyslíku a vzniká radikál, který se snaží z jiné sloučeniny získat postrádající elektron, čímž vytváří jiný volný radikál, a dochází tak k řetězové reakci. Tato řetězová reakce je přerušena buďto vazbou dvou radikálů na sebe nebo reakcí s antioxidantem. Některé antioxidanty uvolňují kyslík na potřebném místě, a tím zabraňují vzniku škodlivých volných radikálů. Jiné zháší volné radikály darováním svého atomu vodíku (Navarro, a kol., 2011). Antioxidanty také převádějí singletový kyslík do základního stavu, brání proti vzniku oxo-hemoglobinu vznikající reakcí hemoglobinu s peroxidy, lipoperoxidaci membrány erytrocytů a lýze erytrocytů peroxidací. Podílejí se na funkci imunitního systému, mají antimikrobiální účinky a podporují funkci antioxidačních enzymů. Také brání katalytickému působení kovových iontů železa nebo mědi, omezují reaktivní formy kyslíku, likvidují vznikající volné radikály a jsou schopny zastavit řetězovou reakci radikálů (Azzi, a kol., 2004, Lu, a kol., 2003, Petti a Scully, 2009, Stahl a Sies, 2003) Antioxidační mechanismy Každý organismus neustále přijímá nebo se v něm tvoří volné radikály. Proti nadměrnému množství těchto volných radikálů si každý organismus vyvinul 19

20 mechanismy, ať enzymové nebo neenzymové, napomáhající likvidovat volné radikály a snižovat oxidační stres (Machlin a Bendich, 1987). Obr. 2: Schéma reakčního mechanismu enzymových antioxidantů, upraveno dle Luo, Nicholls, Imai, Kocsy, Kharrazi (Imai a Nakagawa, 2003, Kharrazi, a kol., 2008, Kocsy, a kol., 2001, Luo a Rando, 2003, Nicholls) Superoxid dismutáza (SOD) Superoxid dismutáza je základní antioxidační enzym. Superoxid (O 2 - ) vzniká jednoelektronovou redukcí kyslíku. Superoxid je asi nejčastěji se vyskytující radikál v organismech. Vzniká při autooxidaci flavinů, hydrochinonu, katecholaminů, thiolů, tetrahydroproteinů a hemoproteinů. Tvoří se i při mnohých enzymových reakcích - např.: katalytickým účinkem xanthinoxidasy, lipoxygenasy, cyklooxygenasy, při přenosu elektronů v dýchacím řetězci a při fotosyntéze v chloroplastech (Miller, 2012). Ve většině organismů se vyskytuje Cu 2+ /Zn 2+ SOD, nacházející se v mitochondriích. Existují i další formy Mn 2+ SOD a Fe 2+ SOD, vyskytující se u prokaryot a rostlin (Xu, a kol., 2010). Tento enzym přeměňuje superoxidový radikál na méně nebezpečný peroxid vodíku. Superoxid sám není příliš škodlivý. Nebezpečí superoxidu spočívá v tom, že z něj mohou vznikat další, mnohem škodlivější reaktivní formy kyslíku např.: hydroxylový radikál, peroxynitrit či kyselina chlorná (Kharrazi, a kol., 2008). Reakční mechanismus superoxid dismutázy: SOD 2O H + H 2 O 2 + O 2 20

21 Glutathion peroxidáza (GSHPx) Glutathion peroxidáza je enzym navazující na produkt superoxid dismutázy, a tedy katalyzující štěpení peroxidu vodíku na vodu se současnou oxidací cysteinu obsaženého v glutathionu (GSH) (Imai a Nakagawa, 2003). Reakční mechanismus glutathion peroxidázy: GSHPx H 2 O GSH 2 H 2 O + GSSG GSHPx se vyskytuje ve třech různých formách, a to cgshpx, egshpx a pgshpx, které se vyskytují v různých částech buňky. První dvě formy se nacházejí v cytoplazmě buněk a v krevní plazmě, tedy v extracelulární tekutině. Obsahují v aktivním centru speciální aminokyselinu, selenocystein. Třetí typ GSHPx se od předchozích liší. Je vázaná v membráně a odtud i získala název fosfolipidová glutathion peroxidáza. Tento typ glutathion peroxidázy redukuje nejen peroxid vodíku, ale na rozdíl od předchozích dvou typů GSHPx i lipidové hydroperoxidy, čímž chrání fosfolipidy buněčné membrány. Ke slabšímu poklesu aktivity GSHPx dochází i při nedostatku selenu (Cockell, a kol., 1996, Imai a Nakagawa, 2003) Glutathion reduktáza (GR) Glutathion reduktáza je enzym, který je velmi úzce spjat s enzymem glutathion peroxidázou, jelikož regeneruje glutathion v redukované formě tím, že redukuje oxidovaný glutathion, za současné oxidace koenzymu NADPH na NADP +. Tím zajišťuje plynulou funkci glutathion peroxidázy, zajišťující likvidaci peroxidu vodíku v organismu. Činností glutathion reduktázy je zabezpečena rovnovážná hladina redukovaného a oxidovaného glutathionu (Kocsy, a kol., 2001). Reakční mechanismus glutathion reduktázy: GSSG + NADPH + H + 2 GSH + NADP + Výsledkem reakcí glutathion peroxidázy a glutathion reduktázy je tedy rozštěpení peroxidu vodíku a současná oxidace koenzymu NADPH (Prasad, a kol., 2008). GR 21

22 Výsledný reakční mechanismus glutathion peroxidázy a glutathion reduktázy: H 2 O 2 + NADPH + H + 2 H 2 O + NADP Kataláza Kataláza stejně tak jako glutathion peroxidáza navazuje na produkt superoxid dismutázy, čili na vzniklý peroxid vodíku. Ten štěpí na vodu a kyslík. Tím brání hromadění peroxidu vodíku v organismu a toxickým důsledkům reakcí s dalšími buňkami, či možnému vzniku jiných volných radikálů (Luo a Rando, 2003, Nicholls). Reakční mechanismus katalázy: KAT GSHPx 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Na rozdíl od GSHPx kataláza nepotřebuje kromě peroxidu vodíku další kosubstrát, který je v reakci oxidován. Kataláza přitom působí na peroxid vodíku ve vysokých koncentracích, čímž se také liší od GSHPx, protože ta působí pouze na nízké koncentrace peroxidu vodíku. V organismu se nachází v mitochondriích a peroxizomech hepatocytů a v cytoplazmě erytrocytů. Význam pro organismus spočívá v ochraně uvedených buněk před toxickým vlivem peroxidu vodíku (Röhrdanz, a kol., 2001) Metody stanovení antioxidační aktivity Metod pro stanovení antioxidační aktivity je velké množství, ale nejpoužívanější metodou stanovení antioxidační aktivity jsou metody spektrofotometrické. U těchto metod snadná a rychlá příprava vzorků i samotné stanovení je rychlé, poměrně levné a snadné (Charalampidis, a kol., 2009). Metody spektrofotometrického stanovení antioxidační aktivity se dělí do dvou skupin, založené na různém principu reakcí. Mechanismus reakcí je založen na přenosu atomu vodíku a na přenosu elektronů. U testů se používá konkurenční boj, ve kterém antioxidant a substrát bojují o radikály. Po reakci volného radikálu s antioxidantem nastává změna barvy, způsobená rozkladem azosloučeniny. Koncentrace antioxidantů závisí na intenzitě barevné změny. Metody jsou založeny na principu použití činidel, která vytváří s volnými radikály barevné produkty. Antioxidanty intenzitu zbarvení snižují, a tím poukazují na množství 22 GR

23 antioxidantů ve vzorku. Intenzita barevných produktů se měří spektrofotometricky (Charalampidis, a kol., 2009, Ozyurt, a kol., 2007). Není žádná oficiální metoda pro sledování celkové antioxidační aktivity. Antioxidační aktivita nelze sledovat pouze pomocí jedné metody, protože každá metoda zháší jiný volný radikál a také pracuje na jiném principu vychytávání volných radikálů (Frankel a Meyer, 2000). Těmito metodami lze také stanovit rychlostní konstanty reakcí mezi antioxidanty a volnými radikály a stupeň poškození organismu volnými radikály, jako je oxidativní poškození biomolekul a deoxyribonukleové kyseliny a peroxidace biomembrán (Halliwell, a kol., 1995). Stanovení je závislé na mnoha faktorech, ovlivňující průběh analýzy. Těmito faktory jsou použitá technologie, přítomnost antioxidantů, stupeň oxidace, vlastnosti vzorku. Použité metody poukazují na celkovou antioxidační aktivitu vzorku TAC (total antioxidant capacity) (Frankel a Meyer, 2000). Je známo velké množství spektrofotometrických metod jako ABTS, DPPH, FRAP, Free radicals, DMPD, ORAC, TRAP a mnoho dalších (Charalampidis, a kol., 2009). Pro naše spektrofotometrické stanovení jsme vybraly metody DPPH (1,1-difenyl-2- pikrylhydrazil), FRAP (Ferric reducing antioxidant power), ABTS (2,2-azinobis-3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina) a Free radicals Metoda ABTS Metoda ABTS je jednou z nejvíce používaných metod pro stanovení volných radikálů. Principem metody je neutralizace radikál kationtu vzniklého jedno elektronovou oxidací syntetického chromoforu ABTS (2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfát) na radikál ABTS - e - ABTS + (Re, a kol., 1999). Metoda ABTS je založena na barevné změně, kdy dojde k odbarvení. Dochází k aktivaci metmyoglobinu v přítomnosti peroxidu vodíku nebo jiných iniciátorů v přítomnosti ABTS za tvorby radikál kationtu (Miller, a kol., 1993). Přídavkem antioxidantů nebo přítomností antioxidantů ve vzorku dochází ke snížení koncentrace radikálu ABTS, při reakci závisí na koncentraci antioxidantů ve vzorku, jejich aktivitě a době trvání reakce (Riceevans a Miller, 1994). Iniciátorem reakce, při které dochází k přeměně ABTS na modrozelený radikál kationt ABTS +, aby následně mohlo dojí k odbarvování antioxidanty, jsou peroxid vodíku, K 4 [Fe(CN) 6 ], nebo K 2 S 2 O 8 (Azzi, a kol., 2001). Směs ABTS se inkubuje v acetátovém pufru a po přidání vzorku nebo standardu pro stanovení slepého vzorku je monitorována 23

24 spektrofotometricky, sledováním změny absorbance při vlnové délce 734 nm. Jako standard se používá Trolox nebo kyselina galová (Babior, 1997). Při experimentálním stanovení lze použít dva postupy. V prvním případě je antioxidant přidáván do reakční směsi, kde již byl vytvořen radikál ABTS +. Ve druhém případě je antioxidant obsažen v reakční směsi při generování radikálu ABTS + (Dejong, a kol., 1993). Radikál ABTS je velmi stabilním radikálem při pokojové teplotě do 35 C a při ph do 7,5. Tato metoda je vhodná pro stanovování lipofilních i hydrofilních antioxidantů (Fogliano, a kol., 1999) Metoda DPPH Metoda DPPH patří s metodou ABTS k nejpoužívanějším metodám a slouží ke kvantifikaci radikálového obsahu ve vzorku. Principem metody DPPH je schopnost volného radikálu DPPH (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl) reagovat s donory vodíku. Dochází k redukci antioxidantem (AH) nebo radikálem (R ) projevující se odbarvením dle následující reakce: DPPH + AH DPPH-H + A, DPPH + R DPPH-R (Parejo, a kol., 2000). Antioxidační aktivita a reakční rychlost závisí na rychlosti a úbytku DPPH. V porovnání s jinými metodami má metoda DPPH mnoho výhod, jako je selektivnost při reakci s donory vodíku oproti jiným metodám, stabilita, jednoduchost, proveditelnost a citlivost pro detekci látek při nízkých koncentracích. Metoda DPPH je založena na neutralizaci radikálu DPPH antioxidanty poskytující vodík (Fogliano, a kol., 1999).Antioxidační aktivita je dána schopností vychytávat radikál DPPH. V prostředí methanolu tvoří fialové zbarvení s absorpčním maximem při 515 nm. Přítomnost antioxidantů se projevuje odbarvováním fialového zbarvení, které je sledováno spektrofotometricky při vlnové délce 515 nm. DPPH vykazuje silnou absorpci v UV-VIS spektru (Parejo, a kol., 2000). Reakce je závislá na ph, proto musí být vzorky neutrální. Metoda DPPH lze provádět na dvou principech, prvním se sleduje rychlost rozkladu DPPH po přidání vzorku a druhou se stanovuje množství inaktivovaného radikálu DPPH vzorkem. V tomto testu se jako standard používá Trolox nebo kyselina gallová (Sanchez-Moreno, a kol., 1999). 24

25 Metoda FRAP Metoda FRAP (Ferric reducing antioxidant power) probíhá v prostředí pufru. Metoda je založena na redukci železitých komplexů na železnaté. Kromě vzorku nebo standardu se přidává roztok TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazin) nebo hexakyanoželezitandraselný (K 3 [Fe(CN) 6 ]) nebo chlorid železitý (FeCl 3 ) jako okysličovadlo (Benzie a Strain, 1996). Tyto roztoky jsou samy o sobě bezbarvé, redukce železitých solí na železnaté se projeví vznikem modrého zbarvení. Toto zbarvení se stanovuje spektrofotometricky, při vlnové délce 700 nm. Jako standard se používá Trolox nebo kyselina gallová. Výsledky se vyjadřují jako ekvivalentní množství standardu. Metoda FRAP poukazuje pouze na schopnost látek redukovat železitý ion Fe 3+ na železnatý Fe 2+ a s celkovou antioxidační aktivitou nemusí vždy pozitivně korelovat (Fogliano, a kol., 1999) Metoda Free radicals Tato metoda využívá schopnosti chlorofylinu (sodno-měďnatá sůl chlorofylu) přijímat a odevzdávat elektrony za současné stabilní změny absorpčního maxima. Tento děj je závislý na přítomnosti katalyzátoru a alkalického prostředí. Kvantifikace hodnot absorbancí je umožněna kalibrací, která je založena na schopnosti iontů železa přecházet v alkalickém prostředí z dvojmocného na trojmocné. Stanovení probíhá spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Jako standard se používá Trolox nebo kyselina galová (Sochor, a kol., 2010). 25

26 4 Materiál a metody 4. 1 Experimentální zvířata Experiment zahrnoval 12 vysoce březích jalovic, které byly ustájeny ve skupině. Sledované jalovice byly Holštýnského plemene pocházející ze zemědělské farmy v Žabčicích Mendelovy univerzity v Brně. Jalovice byly pozorovány v pěti obdobích 10 dní před otelením, 5 dní před otelením, v den otelení, 5 dní po porodu, 10 dní po porodu. Monitorované jalovice byly krmeny stejnou krmnou dávkou složenou z vlákniny a koncentrovaných krmiv Krmné dávky Krmné dávky byly stejné v průběhu jak 10 dnů před otelením, tak 10 dní po otelení. Diety byly složeny z kukuřičné siláže, vojtěškové senáže, cukrovkových řízků, trávy nebo sena z vojtěšky. Podrobný seznam krmných dávek je uveden v Tab. 1 a 2. Tab. 1: Složení krmných dávek jalovic krmené od 10. dne před otelení až 10. den po porodu [kg čerstvé hmoty / kráva / den] Komponenty [kg čerstvé hmoty / kráva / den] Kukuřičná siláž 7,30 Řepné řízky silážní 5,50 Vojtěška senáž 3,00 Tráva seno 1,00 Ječmenná sláma 0,50 Sojová moučka 0,25 Kukuřičná mouka 0,04 Pšeničná mouka 0,04 Ječné mouky 0,02 Vápenec 0,26 PO 9 * 0,10 Glycerol 0,30 Laktofeed 0,20 Fosforečnan vápenatý 0,06 Síran hořečnatý 0,05 Krmná sůl 0,03 26

27 * PO 9 obsahuje (v kg) 1 g lysinu, 1 g metioninu, 1 g threoninu, 78 g Ca, 44 g P, 109 g Mg, 1 g K, 1 g S, 2,5 g Cu, 6,2 g Fe, 10,4 g Zn, 10,1 g Mn, 81 mg Co, 351 mg I, 35 mg Se, mg vit. A, mg vit. D3, mg vit. E, 10 mg niacinamid, 230 mg cholin chlori, 9 mg BHT, 2 mg BHA a 18 mg etoxyguin. Tab. 2: Živiny z krmných dávek jalovic krmené od 10. dne před otelením až 10. den po porodu Živiny Jednotky NEL 1 [MJ / kg] 6,76 Dusíkaté látky [g / kg] 139,96 Hrubá vláknina [g / kg] 166,19 Škrob [g / kg] 243,54 Tuky [g / kg] 24,17 Cukry [g / kg] 1,12 ADF 2 [g / kg] 162,43 NDF 3 [g / kg] 286,03 Ca [g / kg] 15,91 P [g / kg] 4,57 Na [g / kg] 1,67 Mg [g / kg] 4,39 K [g / kg] 12,42 Ca : P 3,77 K : Na 7,44 Zn [mg / kg] 142,68 Cu [mg / kg] 33,94 I [mg / kg] 3,91 Se [mg / kg] 0,54 Vit. A [mg / kg] 11,66 Vit. D [mg / kg] 1,98 Vit. E [mg / kg] 101,64 1 NEL (netto energy lactation) 2 ADF (acid detergent fiber) 3 NDF (neutral detergent fiber) 27

28 Všechny komponenty byly začleněny v určitém poměru do celkové krmné směsi každého dne během našeho pozorování. Krmná směs byla podávána krávám dvakrát denně a přihrnována ke žlabům několikrát denně. Zbytky se pohybovaly v množství do 1 %. Průměrné množství příjmu sušiny stravy bylo 13,1 kg / krávu / den. Odebraný vzorek krve Zpracování krve centrifugací 2000ot./min., 10 min., 4 C Odpipetování krevní plazmy DPPH FREE RADICALS FRAP ABTS GR GSHPx KAT SOD Automatizovaný fotometr Bs 400 Připravený supernatant Ke stanovení Obr. 3: Postup přípravy a analýzy vzorků. Nejprve byla jalovicím odebrána krev z ocasní žíly, vzorek byl dopraven do laboratoře, kde z něj byla připravena plazma, kterou jsme analyzovali na automatickém analyzátoru Odběr vzorků krve Vzorky krve byly odebrány každé jalovici z ocasní žíly vždy 10. den a 5. den před otelením, pak v den otelení, 5. den a 10. den po porodu. Vzorky krve byly odebrány do zkumavky, obsahující antikoagulační látku heparin a byla převezena do laboratoře Ústavu chemie a biochemie MENDELU, kde byla krev zpracována a analyzována Zpracování vzorků krve Získané vzorky krevních sér byly ochlazeny na teplotu 4 C, následně proběhla centrifugace také při 4 C, otáčkách/minutu po dobu 10 minut (Eppendorf 5402, USA), čímž jsme docílili odseparování krevní plazmy od erytrocytů. Odseparovaná 28

29 plazma byla odpipetována pomocí mikropipety do mikrozkumavek o objemu 1,5 ml. Takto připravený supernatant byl připraven k analýzám, které jsme provedly na automatickém fotometru BS-400 (Mindray, Čína). 4.5 Stanovení antioxidační aktivity K analýzám byl použit automatizovaný fotometr BS 400 (Mindray, Čína), který se skládá z kyvetového prostoru (temperovaný na 37±0,1 C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4±1 C) a optického detektoru. Zdrojem světla je halogeno-wolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí zabezpečuje robotické rameno s dávkovací jehlou. Obsah kyvet je promíchán automatickým míchadlem ihned po přidání činidla nebo vzorku o objemu 2-45 µl. Kontaminace je minimalizována díky proplachování jak dávkovací jehly, tak míchadla MilliQ vodou. Pro detekci bylo možné využít vlnových délek: 340, 380, 412, 450, 505, 546, 570, 605, 660, 700, 740, 800 nm. Zařízení je plně kontrolováno softwarem BS400 (Mindray, Čína). Výsledek antioxidační aktivity byl vyjádřen jako ekvivalent Troloxu Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody DPPH Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie R1 (0,095 mm 2,2-difenyl-1- pikrylhydrazyl- DPPH ), následně bylo přidáno 15 µl měřeného vzorku. DPPH test je založen na schopnosti stabilního volného radikálu 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu reagovat s donory vodíku. DPPH vykazuje silnou absorpci v UV-VIS spektru. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 505 nm. Dle kalibrační křivky byla absorbance přepočítána na ekvivalentní obsah Troloxu Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody Free Radicals Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie R1 (0,1 M HCl, extrakt chlorofylinu, reakční pufr, katalyzátor) a následně bylo přidáno 6 µl vzorku. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 450 nm. Dle kalibrační křivky byla absorbance přepočítána na ekvivalentní obsah Troloxu. 29

30 4.5.3 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody FRAP Příprava reagencie: mm roztok TPTZ, doplnit po rysku 40 mm kyselinou chlorovodíkovou (HCl); 2. roztok 20 mm FeCl 3 ; 3. acetátový pufr 20 mm, ph 3,6; tyto tři roztoky se smíchají v poměru TPTZ: FeCl 3 : acetátový pufr 1:1:10. Reagence je použitelná týden při uskladnění v temném prostředí a teplotě 4 C. Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie a následně bylo přidáno 3 µl vzorku. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 605 nm. Dle kalibrační křivky byla absorbance přepočítána na ekvivalentní obsah Troloxu Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie R1 (7 mm ABTS (2,2 -azinobis 3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina a 4,95 mm peroxodisíran draselný), následně bylo přidáno 3 µl vzorku. Absorbance byla měřena při λ = 660 nm po dobu 12 minut. Dle kalibrační křivky byla absorbance přepočítána na ekvivalentní obsah Troloxu Stanovení aktivity Superoxid dismutázy (SOD) Ke stanovení aktivity superoxid dismutázy (SOD, EC ) byl použit kit (19160 SOD, Sigma Aldrich, USA). Měření se provádělo v plastové kyvetě na automatickém analyzátoru BS 400 (Mindray, Čína). Do kyvety bylo nejdříve pipetováno 200 µl reagence R1 (20x pufrem ředěný WST roztok) a činidlo se inkubovalo při 37 C 108 s (1 min, 48s). Poté bylo pipetováno 20 µl vzorku a v 378 s (6 min, 18s) byla reakce spuštěna přidáním 20 µl reagence R2 (167x pufrem ředěný enzymový roztok). Inkubovalo se 72 (1 min, 12s) a poté byla absorbance měřena při λ = 450 nm. Měřila se reakční kinetika po dobu 180 s (3 min) a absorbance se odečítala každých 9 s Stanoveni aktivity Glutathion peroxidázy (GSHPx) Ke stanovení aktivity glutathion peroxidázy (GPx, EC ) byl použit kit (CGP1, Sigma Aldrich, USA). Měření se provádělo v plastové kyvetě na automatickém analyzátoru BS 400 (Mindray, Čína). Do kyvety bylo nejdříve pipetováno 260 µl reagence R1 (0,3 mm NADPH v GPx pufru) a činidlo se inkubovalo při 37 C 108 s (1 min, 48s). Poté bylo pipetováno 10 µl vzorku a v 378 s (6 min, 18s) byla reakce 30

31 spuštěna přidáním 30 µl reagence R2 (3 mm tert-butyl hydroperoxid). Inkubovalo se 18 s a poté byla absorbance měřena při λ = 340 nm a měřila se reakční kinetika po dobu 126 s (2 min, 6s) a absorbance se odečítala každých 9 s Stanovení aktivity Glutathion reduktázy (GR) Ke stanovení aktivity glutathion reduktázy (GR, EC ) byl použit kit firmy (Sigma Aldrich, USA). Měření se provádělo v plastové kyvetě na automatickém analyzátoru BS 400 (Mindray, Čína). Činidla R1 a R2 se připravila rozpuštěním chemikálií v reakčním pufru (100 mm fosfátový draselný pufr, 1mM EDTA, ph 7.5). Do kyvety bylo nejdříve pipetováno 260 µl reagence R1 ( mm oxidovaný glutathion v reakčním pufru) a činidlo se inkubovalo při 37 C 108 s (1 min, 48s). Poté bylo pipetováno 10 µl vzorku a v 378 s (6 min, 18s) byla reakce spuštěna přidáním 30 µl reagence R2 (1 mm NADPH v reakčním pufru). Inkubovalo se 18 s a poté byla absorbance měřena při λ = 340 nm a měřila se reakční kinetika po dobu 126 s (2 min, 6s) a absorbance se odečítala každých 9 s Stanovení aktivity Katalázy (KAT) Ke stanovení aktivity kataláza byl použit kit firmy (Sigma Aldrich, USA). Měření se provádělo v plastové kyvetě na automatickém analyzátoru BS 400 (Mindray, Čína). Činidlo A (fosfátový pufr) se používalo na ředění peroxidu, přípravu standardů a ředění vzorku. Konečné koncentrace chemikálií v činidle A byly 50 mm dihydrogen fosforečnanu draselného a 0,5 mm EDTA v ACS vodě; ph činidla bylo upraveno pomocí 1 M KOH na hodnotu 7.0. Činidlo B byl roztok peroxidu vodíku (substrátu) o koncentraci 10 mm (0,045%), který byl připraven ředěním 30%-ního vodního roztoku peroxidu vodíku v činidle A. Do kyvety bylo nejdříve napipetováno 950 µl činidla B (10mM H 2 O 2 v 50 mm fosfátovém pufru a 0,5 mm EDTA), činidlo bylo vytemperováno na teplotu 37 C a poté bylo pipetováno 50 µl vzorku, obsah kyvety byl promíchán a ihned byla měřena absorbance při λ = 240 nm. Reakční kinetika byla měření po dobu 60 s v intervalech po 5 s. 31

32 5. Výsledky a diskuze Je známo, že v době březosti dochází ke zvýšené tvorbě volných kyslíkových radikálů, což je zapříčiněno vyšší spotřebou kyslíku v tomto období (Moretti, a kol., 2004). Důkazy pro toto pojetí zahrnují studie poukazující na zvýšené markery oxidačního stresu (Behne a Wolters, 1979, Genc, a kol., 2011, Makedou, a kol., 2011, Toescu, a kol., 2002). Vytváření reaktivních forem kyslíku brání antioxidační systém, který tvoří nízkomolekulární antioxidanty (jako selen, vitamín C, glutathion, tokoferol a další) přítomné v organismu, ale především enzymy interagující s reaktivními formami kyslíku, jako jsou peroxidázy, katalázy a superoxid dismutáza (Imai a Nakagawa, 2003, Kharrazi, a kol., 2008, Kocsy, a kol., 2001, Luo a Rando, 2003, Mistry, a kol., 2012). Našim úkolem bylo zjistit, do jaké míry se projeví vliv porodu na vybrané antioxidační enzymy a antioxidační aktivitu stanovované z krevní plazmy jalovic. Hladinu antioxidačních enzymů a antioxidační aktivity jsme sledovali v pětidenních časových intervalech. Neexistuje jednoduchá a univerzální metoda, kterou by mohla být antioxidační kapacita posouzena správně a kvantitativně, protože je více reaktivních druhů s různými reakčními vlastnosti a mechanismy, podílející se na oxidačním stresu (Frankel a Meyer, 2000). Z tohoto důvodu jsme v našem experimentu použili čtyři metody, abychom mohli co nejobjektivněji tento parametr posoudit Stanovení antioxidační aktivity Oxidační stres v době březosti, jakožto původce mnoha komplikací, byl pozorován a diskutován v mnoha publikacích. Výše oxidačního stresu a množství antioxidační aktivity bylo sledováno i pomocí více metod, poukazující na vyrovnanost výsledků (Garrel, a kol., 2010, Hung, a kol., 2010, Karacay, a kol., 2010, Leal, a kol., 2011, Mistry, a kol., 2012, Mutlu, a kol., 2011, Roes, a kol., 2006, Vannucchi, a kol., 2007). Jednou z metod byla HPLC, kterou Vannucchia (Vannucchi, a kol., 2007) sledoval přítomnost přijímaných antioxidačních látek jako vitamínů a minerálních prvků. Jeho výsledkem bylo, zvýšené množství těchto látek v době porodu jako projev zvyšujícího se oxidačního stresu. Další studie byly pomocí spektrofotometrických metod. Mutlu (Mutlu, a kol., 2011) studoval celkovou antioxidační kapacitu TAC a jeho výsledky 32

33 poukázaly sníženou antioxidační aktivitu a tedy navyšující oxidační stres. Snížená antioxidační aktivita byla po porodu vyrovnávána. Antioxidační aktivita byla sledována metodami DPPH, Free Radical, FRAP a ABTS. Kvůli porovnatelnosti jednotlivých vzorků a metod byly výsledky přepočítány na ekvivalentní jednotky standartní látky Trolox TE (Trolox ekvivalent). Hodnoty jsou uvedeny v μg na ml vzorku (krevní plazmy) Stanovení antioxidační aktivity metodou DPPH Metoda DPPH je založena na schopnosti stabilního volného radikálu 2,2-difenyl-1- pikrylhydrazylu reagovat s donory vodíku (Parejo, a kol., 2000). Na obr. 4 je znázorněno 12 vzorků krevní plazmy sledovaných jalovic. U 11 vzorků je zřejmý pokles antioxidační aktivity do porodu, přičemž v den porodu je antioxidační aktivita na nejnižších hodnotách, což poukazuje zvýšený oxidační stres. U deseti vzorků bylo v době pět dnů po porodu sledováno zvyšování antioxidační aktivity, u jednoho se antioxidační hladina začala zvyšovat až po deseti dnech, jeden vzorek měl klesající trend i v době deset dnů po porodu. 33

34 Obr. 4: Grafy hodnot antioxidační aktivity u 12 jalovic sledované pomocí metody DPPH v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. Hodnoty všech 12 vzorků byly zprůměrovány, výsledek je znázorněn na obr. 5. Je patrné, že antioxidační aktivita byla v době porodu nejnižší, což poukazuje na zvýšený oxidační stres, který byl po porodu vyrovnáván. V den porodu byly hodnoty antioxidační aktivity o 30 % nižší, než v době 10 dnů před porodem. Ode dne porodu docházelo k postupnému zvyšování těchto hodnot, kdy v době 10 dnů po porodu byla průměrná antioxidační aktivita o 14 % nižší vůči hodnotám v době 10 dnů před porodem. 34

35 Obr. 5: Graf průměrných hodnot antioxidační aktivity všech 12 jalovic sledované pomocí metody DPPH v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu Stanovení antioxidační aktivity metodou Free radicals Metoda Free radicals je založena na možnosti chlorofylinu, což je sodno-měďnatá sůl chlorofylu přijímat a odevzdávat elektrony za současné stabilní změny absorpčního maxima (Sochor, a kol., 2010). Výsledné hodnoty antioxidační aktivity stanovené touto metodou jsou znázorněny na obr. 6. Všech 12 vzorků mělo při stanovení touto metodu stejnou tendenci - do doby porodu antioxidační aktivita klesala, ode dne porodu je patrný její vzestupný trend. 35

36 Obr. 6: Grafy hodnot antioxidační aktivity u 12 jalovic sledované pomocí metody Free radicals v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. Obr. 7: Graf průměrných hodnot antioxidační aktivity všech jalovic sledované pomocí metody Free radicals v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. V den porodu byla průměrná hladina antioxidační aktivity snížena o 18 % vůči hodnotám v době 10 dnů před porodem. V době 10 dnů po porodu se hladina 36

37 antioxidační aktivity vyrovnala na hladinu, která byla o 13 % nižší než v době 10 dnů před porodem Stanovení antioxidační aktivity metodou FRAP U metody FRAP (Ferric reducing antioxidant power) dochází k redukci železitých komplexů za použití chloridu železitého (FeCl 3 ) jako okysličovadla na železnaté (Benzie a Strain, 1996). Metoda FRAP poukazuje na schopnost látek redukovat železitý ion Fe 3+ na železnatý Fe 2+ a s celkovou antioxidační aktivitou nemusí vždy pozitivně korelovat (Fogliano, a kol., 1999). Trend hodnot byl, podobně jako u metod DPPH a Free Radical, do doby porodu klesající, od dne porodu se hladiny antioxidační aktivity zvyšovaly. Obr. 8: Grafy hodnot antioxidační aktivity u 12 jalovic sledované pomocí metody FRAP v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. 37

38 Obr. 9: Graf průměrných hodnot antioxidační aktivity všech jalovic sledované pomocí metody FRAP v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. V den porodu byla průměrná hladina antioxidační aktivity sledovaná metodou FRAP snížena o 30 % vůči hodnotám v době 10 dnů před porodem. V době 10 dnů po porodu se hladina antioxidační aktivity vyrovnala na hladinu, která byla o 16 % nižší než v době 10 dnů před porodem Stanovení antioxidační aktivity metodou ABTS Metoda ABTS je založena na neutralizaci radikálkationtu vzniklého jednoelektronovou oxidací chromoforu ABTS (2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfát)) (Luo a Rando, 2003, Re, a kol., 1999). Hodnoty antioxidační aktivity stanovené touto metodou jsou znázorněny na obr. 10. Všech 12 vzorků mělo při stanovení touto metodu klesající trend. 38

39 Obr. 10: Grafy hodnot antioxidační aktivity u 12 jalovic sledované pomocí metody ABTS v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. Metoda ABTS také potvrdila projev oxidačního stresu v době porodu úbytkem antioxidační aktivity. Jediná ze všech však poukázala na přetrvávající oxidační stres i v době po porodu. Toto je způsobeno tím, že každá metoda představuje jiný volný radikál a právě radikál ABTS je zhášen jinou skupinou antioxidantů (Sochor, a kol., 2010). 39

40 Obr. 11: Graf průměrných hodnot antioxidační aktivity všech jalovic sledované pomocí metody ABTS v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. V den porodu byla průměrná hladina antioxidační aktivity, sledovaná metodou FRAP, snížena o 18 % vůči hodnotám v době 10 dnů před porodem. V době 10 dnů po porodu se hladina antioxidační aktivity snížila až na hodnotu o 30 % nižší, než byla v době 10 dnů před porodem. Mezi jednotlivými metodami byly, pomocí Pearsonova korelačního koeficientu, zjišťovány závislosti (Tab. 3). Metody DPPH, FR a FRAP mezi sebou vykazovaly vysoké korelace, metoda ABTS vykazovala nízké korealční koeficienty (Tab. 3). Tab. 3: Hodnoty korelačních koeficientů mezi jednotlivými metodami pro stanovení antioxidační aktivity. DPPH FR FRAP ABTS DPPH 0,989 0,981 0,468 FR 0,989 0,991 0,398 FRAP 0,981 0,991 0,432 ABTS 0,468 0,398 0, Stanovení antioxidačních enzymů Antioxidační působení enzymů zabezpečuje ochranu buněk a jejich struktur před nežádoucím působením radikálů. Hladina reaktivních forem kyslíku je díky jejich působení v organismu udržována v určitých mezích ochrany. Při vychýlení této rovnováhy směrem k oxidaci nastává oxidační stres. 40

41 Sledování antioxidačních enzymů v době březosti není doposud podrobně zmapováno. Obecně se uvádí fakt, že jejich aktivita v této době narůstá, jelikož se zvyšuje oxidační stres způsobený vyšším příjmem kyslíku a vyššími energetickými požadavky, což ve svých experimentech potvrdili Garrel a kol. a Hung a kol. (Garrel, a kol., 2010, Hung, a kol., 2010), kteří takto sledovali hladiny antioxidačních enzymů SOD, KAT, GSHPx, GR. Navyšovalo se i množství selenu, který je významným stopovým prvkem. Tato korelace byla způsobena příznivým působením na funkci antioxidačních enzymů odbourávat superoxid a peroxid vodíku z organismu (Mistry, a kol., 2012). Pro komplexnost této studie byla sledována aktivita důležitých antioxidačních enzymů eliminujících volné radikály a to SOD, KAT, GSHPx, GR. Výsledné hodnoty byly vyjádřeny jako enzymatická aktivita v katalech (kat) na litr (l) Stanovení aktivity superoxid dismutázy Superoxid dismutáza je enzym přeměňující superoxidový radikál na peroxid vodíku, který nepředstavuje pro organismus takové nebezpečí (Kharrazi, a kol., 2008). Výsledky stanovení tohoto enzymu jsou prezentovány na obrázku 12. U deseti vzorků se hodnoty SOD zvyšovaly, u jednoho vzorku (D) byl v době pět dnů před porodem zaznamenán prudký nárůst (19 %), následně se jeho hodnoty snižovaly. Další ze vzorků, které se odchylovaly od průměru, byl vzorek J, kde byl do doby porodu zaznamenán mírný nárůst (o 6 % vůči hodnotě 10 dnů před porodem), v době po porodu aktivita enzymu klesala. 41

42 Obr. 12: Grafy hodnot enzymu SOD u 12 jalovic sledované v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. Obr. 13: Graf průměrných hodnot enzymatické aktivity SOD všech jalovic v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. 42

43 V den porodu byla průměrná hladina SOD zvýšena o 6 % vůči hodnotám v době 10 dnů před porodem, v době 10 dnů po porodu se zvýšila až o 13 % oproti hodnotám v době 10 dnů před porodem. V době březosti jsou zvýšené nároky matky na kyslík a z tohoto důvodu se zvyšuje i hladina oxidačního stresu. Po porodu by se, z důvodu nižších nároků matky na kyslík, měl snižovat i oxidační stres. Proto byl předpoklad, že hodnoty SOD se budou ode dne porodu snižovat, tak jak ve své publikaci uvádějí Genz a kol. (Genc, a kol., 2011). Průměrné hodnoty SOD však měly stoupající trend (Obr 13). Toto lze vysvětlit krátkou dobou sledování, kdy se organismus nedostal do běžného stavu (Toescu, a kol., 2002) Stanovení aktivity katalázy Kataláza je enzymem navazujícím na produkt superoxid dismutázy, kdy štěpí peroxid vodíku na vodu a kyslík (Luo a Rando, 2003, Nicholls). Tento enzym je vysoce účinný při vyšších úrovních oxidačního stresu a poskytuje buňkám ochranu před nebezpečným peroxidem (Muhsan, a kol., 2012). Výsledné hodnoty jsou znázorněny na obr. 14. U 11 jalovic byl trend hodnot katalázy stoupající, u jedné jalovice (J) byl v době pět dnů před porodem zaznamenán nárůst (9 %), následně se hodnoty enzymu snižovaly. 43

44 Obr. 14: Grafy hodnot enzymu KAT u 12 jalovic sledované v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. Obr. 15: Graf průměrných hodnot enzymatické aktivity KAT všech jalovic v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. V den porodu byla průměrná hladina KAT zvýšena o 8 % vůči hodnotám v době 10 dnů před porodem, v době 10 dnů po porodu se zvýšila až o 16 % oproti hodnotám v době 44

45 10 dnů před porodem. Mezi KAT a SOD byla nalezena velmi vysoká korelace (r 2 =0,986), což je dáno tím, že KAT štěpí vzniklý produkt SOD (peroxidu vodíku) (Chelikani, a kol., 2004) Stanovení aktivity Glutathion peroxidázy Glutathion peroxidáza je enzym štěpící, stejně jako kataláza, produkt superoxid dismutázy peroxid vodíku, na vodu za současné oxidace glutathionu (Imai a Nakagawa, 2003). Hodnoty GSHPx jsou znázorněny na obr. 16. U sedmi jalovic (B, C, E, H, I, K) byl trend hodnot do doby porodu klesající, od dne porodu se hladiny antioxidační aktivity zvyšovaly. U tří jalovic (A, F, L) se hodnoty snižovaly do doby pěti dnů před porodem, následně bylo zaznamenáno jejich navýšení. U jalovice (J) se hodnoty snižovaly až do pátého dne porodu, pak nastalo jejich vyrovnání. Jalovice D měla vzestupný trend hodnot. Obr. 16: Grafy hodnot enzymu GSHPx u 12 jalovic sledované v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. 45

46 Obr. 17: Graf průměrných hodnot enzymatické aktivity GSHPx všech jalovic v době 10 dnů před porodem, 5 dnů před porodem, v den porodu, pět dnů po porodu a deset dnů po porodu. V den porodu byla průměrná hladina GSHPx snížena o 3 % vůči hodnotám v době 10 dnů před porodem, v době 10 dnů po porodu se zvýšila o 5 % oproti hodnotám v době 10 dnů před porodem. GSHPx, stejně jako KAT, štěpí peroxid vodíku, ale jeho rozklad není tak intenzivní, jelikož GSHPx není schopna rozkládat peroxid vodíku při vyšším množství (koncentraci) v organismu oproti KAT. Z obr. 17 je vidět úbytek aktivity GSHPx v době porodu, což je pravděpodobně způsobeno vyšším množstvím produkovaného peroxidu, jak ve svých publikacích uvádějí Preziosi a kol. (Preziosi, a kol., 2000) a Flohe a kol. (Flohe, a kol., 1971) Stanovení aktivity glutathion reduktázy Glutathion reduktáza je enzym, který úzce souvisí s glutathion peroxidázou, jelikož oxidovaný glutathion navracejí do redukované formy za pomoci koenzymu NADPH, který je oxidován na NADP + (Kocsy, a kol., 2001). Tomuto také odpovídaly získané výsledky, které jsou prezentovány na obrázku 18. U sedmi vzorků (C, D, E, H, I, K, L) se hodnoty GR do dne porodu snižovaly, ode dne porodu byl zaznamenán vzrůstající trend. U tří vzorků (A, B, F) se hodnoty snižovaly do doby pěti dnů před porodem, následně bylo zaznamenáno jejich navýšení. U jalovice (J) se hodnoty snižovaly až do pátého dne po porodu, pak nastalo jejich vyrovnání. 46