HYDRAGEL 7 ISO-CK HYDRAGEL 15 ISO-CK HYDRAGEL 30 ISO-CK

Transkript

1 HYDRAGEL 7 ISO-CK Ref HYDRAGEL 15 ISO-CK Ref HYDRAGEL 30 ISO-CK Ref /03

2 HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 POUŽITÍ KITU HYDRAGEL 7, 15 a 30 ISO-CK kity jsou určeny k elektroforetické identifikaci a kvantifikaci tří izoenzymů kreatinkinázy lidského séra na alkalicky pufrovaných (ph 8.4) agarózových gelech. Kity se používají ve spojení s poloautomatizovaným, elektroforetickým systémem HYDRASYS. Výsledným produktem jsou gely, jež lze okamžitě interpretovat. Po osušení jsou agarózové plotny připraveny k vyhodnocení vizuálnímu i denzitometrickému. Denzitometrie poskytuje přesnou relativní kvantifikaci jednotlivých zón. Každý agarózový gel je určen k analýze : 7-mi vzorků (HYDRAGEL 7 ISO-CK kit), 15-ti vzorků (HYDRAGEL 15 ISO-CK kit), 30-ti vzorků (HYDRAGEL 30 ISO-CK kit). Pouze pro diagnostické použití in vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRInCIP TESTU Isoenzymy CK jsou složeny ze dvou podjednotek (dimerů) : M ("muscle") a B ("brain"). Jejich kombinace umožňují vznik třem izoenzymům : MM (myokard a svaly kosterní), MB (myokard) a BB (mozkové tkáně). Každá podjednotka má specifický elektrický náboj, který uděluje charakteristickou mobilitu jednotlivým CK izoenzymům. Na HYDRAGEL 7 ISO CK/LD a HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 gelech je BB frakce umístěna nejblíže anodě, MM je nejblíže katodě a MB je uprostřed. Největší význam elektroforézy izoenzymů spočívá v diagnostice infarktu myokardu (IM). CK-MB se zvyšuje za 4-8 hodin po začátku IM. Analýza izoenzymů CK se obvykle provádí současně s analýzou izoenzymů LD nebo jiných časných markerů IM k jeho vyloučení nebo potvrzení, stanovení jeho vážnosti a monitorování pacientova stavu. Všechny izoenzymy CK katalyzují tutéž reverzibilní reakci, která je využita při jejich vizualizaci. V kitu HYDRAGEL 7 ISO-CK, HYDRAGEL 15 ISO-CK a HYDRAGEL 30 ISO-CK je k vizualizaci izoenzymů CK využito následujících reakcí : Kreatin - P + ADP ATP + D-glukóza Glukózo-6-P + NADP NADPH + PMS PMSH + TNBT CK HExOKInÁZA G-6-PDH kreatin + ATP Glukózo-6-P+ ADP NADPH + 6-fosfoglukonolakton NADP+ PMSH PMS + reduk. TNBT precip. formazán. Modři Množství výsledného formazánového precipitátu je přímo úměrné enzymatické aktivitě. ZKRATKY : CK : Kreatinkináza HK : Hexokináza G-6-PDH : Glukózo-6-Fosfát Dehydrogenáza ADP : Adenosin 5 Difosfát ATP : Adenosin 5 Trifosfát NADP : Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfát NADPH : Redukovaný Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfát PMS : Fenazin Metosulfát PMSH : Redukovaný Fenazin Metosulfát TNBT : Modrý Tetranitro Tetrazolium REAGEnCIE A MATERIÁL OBSAŽEnÝ V KITECH HYDRAGEL 7, 15 A 30 ISO-CK VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY KAT. Č KAT. Č KAT. Č Agarózové gely (připraveno k použití) 10 ks 10 ks 10 ks Houbičky s pufrem (připraveno k použití) 10 bal. po 2 ks 10 bal. po 2 ks 10 bal. po 2 ks Aktivační roztok (připraveno k použití) 1 lahv ml 1 lahv ml 2 lahv ml Rozpouštědlo substrátu (připraveno k použití) 1 lahv. 40 ml 1 lahv. 40 ml 2 lahv. po 40 ml Chromogen (zásobní roztok) 1 lahv. 3 ml 1 lahv. 3 ml 2 lahv. po 3 ml Substrát ISO-CK (zmražený, sušený) 10 lahv. 10 lahv. 20 lahv. Zastavovací rozt. ISO CK/LD (připraveno k použití) 1 lahv., 40 ml 1 lahv. 40 ml 2 lahv. 40 ml Aplikátory (připraveno k použití) 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks 2 bal. po 10 ks Tenké filtrační papíry 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks Tlusté filtrační papíry 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti SEBIA NÁVOD - Czech

3 OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 8.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Podpůrné medium pro elektroforézu isoenzymů CK. Skladujte v horizontální poloze v originálním ochranném obalu při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Stabilní do data exspirace (šipka na čelní straně krabice musí směřovat vzhůru). Neukládejte v blízkosti oken nebo tepelných zdrojů. Teplota skladování nesmí mít velké výkyvy. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFROVAnÉ STRIPY Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s ph 8.3 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufrované stripy slouží jako rezervoár pufru pro elektroforézu a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami. Stripy se skladují v ledničce nebo při pokojové teplotě. Jsou stabilní nejméně do data exspirace vyznačeného na štítcích balení. NEMRAZIT! Otevřená balení a vyschlé proužky okamžitě vyřaďte z používání. 3. AKTIVAČnÍ ROZTOK* Aktivační roztok je připraven k okamžitému použití. Obsahuje : ß-Merkaptoetanol. K aktivaci vzorků séra před elktroforézou. Skladuje se v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu nebo na štítku lahvičky. Roztok vyřaďte z používání při změně jeho vzhledu, tj. vzniku zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace. POZN. : ISO-CK Aktivační Roztok normálně vykazuje silný ß-merkaptoetanolový zápach. Jestliže je tento zápach slabý nebo chybí, je to symptom snížení nebo celkové ztráty aktivity. Aktivační roztok můžete regenerovat přidáním čistého ß-merkaptoetanolu. Přidejte obj. 7 % zbývajícího množství Aktivačního Roztoku. 4. ROZPOUŠTĚDLO SUBSTRÁTU Ředicí roztok pro substrát je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 6.7 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K přípravě vyvíjecího roztoku - viz odstavec 6. Skladuje se při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu nebo na štítku lahvičky. Roztok vyřaďte z používání při změně jeho vzhledu, tj. vzniku zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace. Rozpouštědlo substrátu nesmí obsahovat precipitáty. 5. CHROMOGEn* Je připraven k okamžitému použití. Obsahuje TNBT (Tetra-Nitro-Blue Tetrazolium) v DMF (dimetylformamid). K přípravě vyvolávacího roztoku - popsáno v odstavci 6. Skladuje se v chladničce (2-8 C). Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu nebo na štítku lahvičky

4 6. ISO-CK SUBSTRÁT* Každá lahvička substrátu obsahuje : Hovězí albumin, Glukózu, ADP (Adenosin 5' Difosfát), NADP (Nikotinamid Adenine Dinukleotid Fosfát), Hexokinázu (z pekařského droždí), Glukózo-6-Fosfát Dehydrogenázu (z pekařského droždí), PMS (Fenazin Metosulfát) a přísady neškodné v použité koncentraci, nezbytné pro optimální provedení testu. Vyvíjecí roztok připravte mimo dosah přímého světla ihned po zahájení migrace. Gel HYDRAGEL 7 ISO CK/LD : Do lahvičky se substrátem (1/2) přidejte 2 ml rozpouštědla substrátu. Zavřete lahvičku a jemně promíchejte. Ponechejte při pokojové teplotě. Těsně před použitím přidejte 0.15 ml chromogenu a promíchejte. Gel HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 (15 vzorků) : Do lahvičky se substrátem přidejte 4 ml rozpouštědla substrátu. Lahvičku uzavřete a jemně promíchejte. Ponechejte při pokojové teplotě. Těsně před použitím přidejte 0.3 ml chromogenu a promíchejte. Gel HYDRAGEL ISO CK/ LD 15/30 (30 vzorků) : Do každé ze dvou lahviček se substrátem přidejte 4 ml rozpouštědla substrátu. Lahvičky uzavřete a zlehka promíchejte. Ponechejte při pokojové teplotě. Těsně před použitím přidejte do každé lahvičky 0.3 ml chromogenu a promíchejte. K vyvolání elektroforeticky rozdělených izoenzymů CK. Substrát je nutno skladovat v chladničce (2-8 C). Je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo přímo na lahvičkách se substrátem. 7. ISO CK/LD ZASTAVOVACÍ ROZTOK Blokovací roztok je připraven k použití. Obsahuje kyselý roztok ph 2. K zastavení enzymatické reakce po inkubaci gelů po specifickou dobu. Zastavovací roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v ledničce a je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky. Zastavovací roztok vyřaďte z používání při změně jeho vzhledu, tj. vzniku zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace. 8. APLIKÁTORY Na jedno použití, k aplikaci vzorků. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 9. TEnKÉ FILTRAČnÍ PAPÍRY K odstranění přebytku tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK / TLUSTÉ FILTRAČnÍ PAPÍRY Bločky silného absorpčního papíru na jedno použití, určené k odsání přebytečného zastavovacího roztoku z povrchu gelu před sušením. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. * POZN. : ISO-CK substrát, aktivační roztok i chromogen je možno ponechat až 15 dní při pokojové teplotě bez nepříznivých efektů na provedení - tohoto poznatku lze využít při transportu kitu. POTŘEBnÉ REAGEnTY neobsažené V BALEnÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. ODBARVOVACÍ ROZTOK (volitelná položka) Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat.č. 4540, 10 lahviček po 100 ml) je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 5 litrů pracovního roztoku doplněním 5 ml zásobního roztoku do 5 litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Dále k vyplachování barvícího prostoru po promývacím kroku. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH ( 19 M NaOH). Skladování při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný! Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička, 5 ml)

5 HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. nutné VYBAVEnÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRA- SYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č nebo kat. č nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č Manuální nebo automatizovaný mikropipetor, SEBIA HYDRAPLUS, kat. č nebo SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č nebo SEBIA ASSIST, kat. č jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká Zásobní Komora kat. č. 1270, dodávaná s HYDRASYS systémem. 4. Vodící Tyčka Šablony Dodávaná s HYDRASYS systémem. 5. HYDRASYS Accessory kit ISO-CK, SEBIA kat. č Pipety 10 µl, 200 µl, 5 ml. 7. Densitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm nebo 82 x 102 mm : Software HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS pro plochý skener. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. 8. Materiály ke kontrole kvality (Enzycontrol SEBIA, PN 4790). 9. Držák gelu pro poloviční gely SEBIA, kat. č VZORKY K AnALÝZE Odběr vzorků a skladování Pro analýzu jsou vhodné čerstvé vzorky séra. Odběr proveďte způsobem obvyklým v dané laboratoři. Odebrané vzorky pro skladování ihned vložte do chladničky (2-8 C) do max. 7-mi dnů. vzorku Smíchejte 500 µl séra s 5 µl aktivačního roztoku a inkubujte 10 minut při pokojové teplotě. Pokud aktivita celkové CK přesahuje hodnotu 750 IU/L, je nutno vzorek ředit fyziologickým roztokem tak, aby se výsledek pohyboval přibližně kolem hodnoty 750 IU/L. nepoužívejte zmražené nebo hemolyzované vzorky. Erytrocytární enzymy mohou v reakci interferovat. Analýzu nelze provádět ve vzorcích obsahujících inhibitory aktivity CK. Patří sem heparin, EDTA, citrát, fluoridy nebo jodoacetát (24). POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVnÍ POSTUP HYDRASYS je multiparametrický poloautomatický systém. Automatizované kroky zahrnují postupně nanesení vzorku, elektroforetickou migraci, inkubaci se substrátem, odsávání, oplach a osušení gelové plotny. Manipulace se vzorky, gely, vkládání reagencií a nastavení přístroje k uvedení do chodu se provádí ručně. Teplota migračního modulu je řízena na principu Peltierova efektu. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. I. nastavení MIGRACE 1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte jeden aplikátor - HYDRAGEL 7 ISO CK/LD (7 vzorků), HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 (15 vzorků) nebo 2 aplikátory - HYDRAGEL ISO-CK/LD 15/30 (30 vzorků) na rovnou plochu s čísly jamek směrem nahoru (viz Obr. 1). - naneste v průběhu 2 minut 10 µl čirého vzorku séra do každé jamky aplikátoru, - vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček), - nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Detaily naleznete v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámrček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POzOR : Nikdy nezavírejte víko pokud je migrační rámeček nahoře! 4. Z menu na přístroji zvolte program migrace "7 ISO-CK" nebo "15/30 ISO-CK" dle použitých gelů. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy - uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - Plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej po povrchu gelu narolujete, aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POzOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! - Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody při použití HYDRAGEL 7 ISO CK/LD gelu nebo 200 µl pro HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 gel na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše

6 - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do kontaktu s kapkou vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem bez vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU! 8. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Pro analýzu 7 a 15 vzorků umístěte aplikátor na nosič do pozice č V případě analýzy 30 vzorků umístěte 2 aplikátory na nosič do pozic č. 3 a 8. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVAnÝCH ČInnOSTÍ Všechny části migračního rámečku jsou sníženy - stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu - probíhá aplikace vzorků do gelu. Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v kontaktu s povrchem gelu. Proběhne migrace při konstantních 10 W pro HYDRAGEL 7 ISO-CK, při konstantních 20 W pro HYDRAGEL ISO CK 15/30, při 20 C, řízených pomocí Peltierova efektu až do 27 Vh (asi po dobu 6-ti minut). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a odjistí se víko. Signál trvá do zásahu operátora. Na displeji se objeví blikající zpráva : "e SUBST." / "e SUBSTRATE". POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků. II. PŘÍPRAVA InKUBACE SE SUBSTRÁTEM ISO-CK 1. Po ukončení migrace otevřete víko na displeji přestane blikat "e SUBST." / "e SUBSTRATE". 2. Vyjměte aplikátory vzorků a odstraňte je. 3. Zvedněte migrační rámeček a vyjměte jej. - Odstraňte proužky s pufrem. - Pečlivě podélně otřete elektrody měkkým zvlhčeným hadříkem nebo gázou. - Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Připravte reagenční, aplikační šablonu pro CK R1, R2 nebo R4 pro analýzu 7, 15 nebo 30 vzorků následujícím postupem (viz Obr. 5) : - Umístěte vodič aplikační šablony na ukotvující svorky (může být ponechán). - Podržte šablonu za ouško a vložte ji vruby na značky vodiče. - Přiložte tuto šablonu na gel. 5. Aplikujte 1.8 ml roztoku ISO-CK substrátu promíchaného s chromogenem pro HYDRAGEL 7 ISO-CK, 4 ml roztoku substrátu ISO-CK pro HYDRAGEL ISO-CK 15/30 (15 vzorků) nebo 7.5 ml pro HYDRAGEL ISO-CK 15/30 (30 vzorků) dle následovným postupem (viz Obr. 6) : - Držte vertikálně pipetu. - Lehce vtiskněte její špičku do otvoru v šabloně. - Postupně pečlivě pipetujte substrátovou směs bez napipetování bublin pod šablonou. 6. Uzavřete víko HYDRASYSu. 7. Stisknutím klávesy se zelenou šipkou "START" na levé straně klávesnice proces nastartujete. Na displeji se zobrazí nápis : "[INCUBATION]". InKUBACE - POPIS AUTOMATIZOVAnÝCH KROKŮ Inkubace při teplotě 37 C, řízené Peltierovým efektem, po dobu 30-ti minut. Zazní pípnutí a víko se odjistí. Signál trvá až do zásahu obsluhy. Na displeji se objeví následující blikající zpráva : "a SUBST. + e BLOC." / "a SUBSTRATE, e BLOCKING SOLUTION". POZN. : Během inkubace zůstává víko migračního modulu uzamčeno. III. ODSTRAnĚnÍ SUBSTRÁTU A APLIKACE ZASTAVOVACÍHO ROZTOKU 1. Otevřete víko. Zpráva "a SUBST. + e BLOC." / "a SUBSTRATE, e BLOCKING SOLUTION". přestane blikat. 2. Odstraňte zbývající roztok substrátu : - držte pipetu vertikálně a lehce vtlačte její špičku do jamky (viz Obr. 6), - pečlivě odsajte zbylý substrát. 3. Napipetujte 2 ml zastavovacího roztoku pro HYDRAGEL 7 ISO-CK, 4 ml pro HYDRAGEL ISO-CK 15/30 (15 vzorků) nebo 8 ml pro HYDRAGEL ISO-CK 15/30 (30 vzorků) do šablony (viz Obr. 6). Pozor na vniknutí bublin při pipetování. 4. Uzavřete víko HYDRASYSu. 5. Po stisknutí tlačítka "START" (zelená šipka na levé straně klávesnice) se na displeji zobrazí nápis "[BLOCKING]". ZASTAVOVACÍ REAKCE - POPIS AUTOMATICKÝCH KROKŮ Inkubace při 37 C po dobu 10-ti minut. Pípnutí signalizuje odjištění víka. Na displeji se zobrazí následující blikající zpráva "a BLOC. + e PAP." / "a BLOCKING SOLUTION, e THICK FILTER PAPER". POZN. : Během inkubace zůstává víko migračního modulu uzavřeno. IV. ODSTRAnĚnÍ ZASTAVOVACÍHO ROZTOKU A APLIKACE FILTRAČnÍHO PAPÍRU 1. Otevřete víko. 2. Odstraňte zastavovací roztok pipetou (viz ODSTRANĚNÍ SUBSTRÁTU). 3. Vyjměte šablonu : - Uchopte šablonu za ouško. - Zvedněte šablonu a vyjměte ji. 4. Položte jeden silný filtrační papír na gel : - Filtrační papír držte v úhlu Jeho dolní část zarovnejte s okrajem gelu. - Položte jej na gel. - Jemným tlakem přitiskněte filtrační papír tak, aby přilnul celým svým povrchem k gelu. HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /

7 5. Uzavřete víko HYDRASYSu. 6. Odsávací procedura se nastartuje po stisknutí tlačítka "START" (zelená šipka na levé straně klávesnice). Na displeji je zobrazena následující zpráva "[BLOTTING]". 7. Opláchněte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a důkladně osušte savým papírem. Před opakovaným použitím musí být šablona vždy dokonale suchá. ODSÁVÁnÍ (BLOTTInG) - POPIS AUTOMATIZOVAnÝCH KROKŮ Odsávání při 37 C po dobu 3 minut. Do zásahu obsluhy zní pípání. Na displeji se zobrazí nápis "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER". POZN. : V průběhu sušení zůstává víko migračního modulu zajištěno. V. SUŠEnÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. 3. Zavřete víko. 4. Sušení nastartujete stiskem klávesy "START" (zelená šipka vlevo na klávesnici). Na displeji se zobrazí následující zpráva : "[DRYING]". SUŠEnÍ - POPIS AUTOMATIZOVAnÝCH KROKŮ Gel se suší po dobu 2 minut, při 60 C. Zazní pípnutí a víko se odjistí. Teplota plotny zůstává až do otevření víka na 50 C. POZN. : V průběhu sušení zůstává víko migračního modulu zajištěno. HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 VI. SKEnOVÁnÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte osušený gel. 3. Očistěte zadní stranu (plastiková podpůrná) osušené plotny pomocí zvlhčeného měkkého hadříku nebo buničiny. 4. Pozor na vlákna buničiny. 5. Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. POZN. : Délka jednotlivých elektroforeogramů se může lehce lišit na gelech obsahujících vzorky ve 2 nebo 3 řadách, bez následku na provedení testu. 6. Teplota migrační plochy klesne v méně než 5-ti minutách na 20 C a může být započato další dělení. 7. Umístěte migrační rámeček zpět na své místo do HYDRASYSu. 8. Otřete migrační plochu měkkým, vlhkým hadříkem. VII.OPLACH GELU Po skenování lze gel opláchnout pro lepší konzervaci elektroforeogramů a prevenci vzniku zbarvení pozadí. 1. Vyjměte gel k dalšímu zpracování. 2. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz Obr. 7). 3. Držák vložte do modulu pro vyvíjení a barvení. DŮLEŽITÉ : Před nastartováním programu pro vyvíjení / barvení zkontrolujte : - zda kontejner s promývacím roztokem obsahuje minimálně 400 ml odbarvovacího roztoku, - zda kontejner na odpad je prázdný (není plný). Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody. 4. Zvolte mycí program "WASH ISOENZ/GEL" z menu přístroje a stiskněte klávesu "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice). Během mycích a sušících procedur je tento modul uzavřen. Po ochlazení slyšitelné pípnutí signalizuje odjištění této části (ventilace je udržována až do vynětí držáku gelu). 5. Vyjměte držák gelu, uvolněte svorky a suchý gel vytáhněte ven. Je-li potřeba, očistěte zvlhčeným hadříkem nebo buničinou zadní plastikovou část gelové plotny. KOnTROLA KVALITY Doporučuje se zařadit kontrolní vzorek se známými hodnotami (např. Enzycontrol SEBIA, kat. č. 4790) do každé série měření. VÝSLEDKY Hodnoty 19 Nejsou-li přítomny frakce MB a BB, elektroforeogram není nutné skenovat. Lidská séra mohou vykazovat tři frakce : MM - v lidském séru predominantní s velmi nízkou pohyblivostí (zóna gama), MB - se střední pohyblivostí (v zóně beta), BB - s vysokou mobilitou (v zóně alfa-1). Normální hodnoty : CK MM : % CK MB : 0-3 % pokud je aktivita CK zahrnuta mezi 15 a 500 IU/L CK MB : 0-4 % pokud je aktivita CK vyšší než 500 IU/L CK BB : 0 % Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty

8 HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Frakce se zvyšuje MB po 4-8 hodinách po infarktu myokardu. Frakce BB je primárně zvýšena u některých onemocnění a traumat nervového systému. Celková kreatinfosfokináza (hlavně MM) je zvýšena v následujících případech : - chirurgické trauma, - namáhavé tělesné cvičení, - svalová dystrofie, - myopatie, - polymyositis, - hypotyreoidismus, - léky, intramuskulární injekce. Makro CK (typ 1) je komplex mezi CK a imunoglobulíny. Je detekovatelný mezi MM a MB frakcemi (viz Obr. 8). Mitochondriální CK (typ 2) je detekovatelný na katodické straně MM frakce (viz Obr. 8). Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : HODnOTY HYRYS Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení. Reprodukovatelnost na gelu Tři různé vzorky séra (A, B a C) byly analyzovány elektroforézou na HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 gelech dvou šarží. Vzorek A byl normální, pouze s MM, B měl zvýšenou MB a C byla Enzykontrola fy SEBIA. Každý vzorek byl testován na všech 15ti drahách jednoho gelu obou šarží. Elektroforeogramy byly hodnoceny denzitometricky. Následující tabulka ukazuje průměry, SD a CV pro každou CK frakci (vzorek B a C) pro každý gel obou šarží a pro směsná data obou šarží (všech 15 drah každého gelu/šarže bylo kombinováno pro každý vzorek). Vzorek A měl pouze MM frakci, která byla detekována ve všech drahách na každém gelu obou šarží. PARAMETR MM MB BB Vzorek B : šarže č. 1 / šarže č. 2 / směsná data PRŮMĚR % 92.9 / 93.5 / / 6.5 / 6.8 / SD 0.4 / 0.2 / / 0.2 / 0.3 / CV % 0.4 / 0.2 / / 3.4 / 4.5 / Vzorek C : šarže č. 1 / šarže č. 2 / směsná data PRŮMĚR % 49.0 / 48.9 / / 17.7 / / 33.4 / 33.5 SD 0.5 / 0.4 / / 0.3 / / 0.4 / 0.4 CV % 1.0 / 0.8 / / 1.8 / / 1.3 / 1.3 Reprodukovatelnost mezi gely Patnáct (15) různých vzorků séra bylo podrobeno testům každý na 10 ti gelech HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 3 různých šarží. Průměr, SD a CV (n = 10) byly kalkulovány pro každý vzorek a každou CK frakci. Výsledky byly obecně stejné pro všechny vzorky. Následující tabulka ukazuje rozsahy SD a CV reprezentující všechny vzorky a průměrné CV vypočítané ze směsného CV pro všechny vzorky (n = 15). CK FRAKCE SD CV % PRŮMĚR CV % MM MB BB Přesnost srovnávací studie Sedmdesát (70) různých vzorků séra (normálních i patologických) bylo analyzováno pomocí HYDRAGEL 15 & 30 ISO-CK soupravy fy SEBIA a jiného, komerčně dostupného elektroforetického systému pro stanovení izoenzymů CK pomocí fluorescence. Hodnoty stanovené vizuálně byly na obou systémech ve shodě. Výsledky lineární regresní analýzy denzitometrických hodnot MB frakce (n = 70) jsou vyneseny v následné tabulce. PARAMETR Korelační koef. y - úsek Sklon Rozsah % hodnot (na SEBIA testu) MB frakce y = hodnoty SEBIA

9 Citlivost Patologický sérový vzorek s MB frakcí (aktivita : 40 IU/L) byl následně ředěn a tato ředění byla elektroforeticky analyzována na HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 gelu. Po denzitometrickém zhodnocení, nejnožší detekovaná activita MB frakce byla 2.5 IU/L. Linearita Následné ředění vzorku obsahujícího MM a MB frakce byly testovány, od celkové CK aktivity 750 IU/L až na 20 IU/L. Systém byl lineární v požadovaném rozsahu studie. GELSCAn HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 Pro veškerá denzitometrická měření byl použit Denzitometr GELSCAN SEBIA. Tyto výsledky získané postupy HYDRAGEL 7 ISO-CK, HYDRAGEL 15 ISO-CK a HYDRAGEL 30 ISO-CK ukazují velmi dobrou reprodukovatelnost mezi jednotlivými gely i mezi jednotlivými snímáními s průměrným variačním koeficientem okolo 1.5 % pro každou frakci kreatinkinázy. Reprodukovatelnost v rámci gelu Zařízení GELSCAN snímalo tři různé vzorky sér postupy HYDRAGEL 7 ISO-CK, HYDRAGEL 15 ISO-CK a HYDRAGEL 30 ISO-CK. Každý vzorek měl analyzovány všechny stopy každého gelu. Pro každý vzorek, frakci a gel byl spočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient (n = 7, 15 nebo 30, podle použitého gelu). Tabulka ukazuje hodnoty 3 testovaných vzorků, pro jednotlivé frakce kreatinkinázy spočítané ze tří postupů nasnímaných zařízením GELSCAN. FRAKCE BB MB MM Vzorek A : HYDRAGEL 7 ISO-CK - 15 ISO-CK - 30 ISO-CK PRŮMĚR (%) / SD / CV (%) / Vzorek B : HYDRAGEL 7 ISO-CK - 15 ISO-CK - 30 ISO-CK PRŮMĚR (%) / SD / CV (%) / Vzorek C : HYDRAGEL 7 ISO-CK - 15 ISO-CK - 30 ISO-CK PRŮMĚR (%) SD CV (%) Reprodukovatelnost mezi jednotlivými snímáními bez posunování gelu na držáku na GELSCAnu Reprodukovatelnost byla stanovena analýzou jednoho vzorku séra postupem HYDRAGEL 15 ISO-CK (15 analýz na gel) na zařízení HYDRASYS se šesti následujícími denzitometrickými snímáními GELSCANem bez posunování gelu v jeho držáku. Pro každý rozbor tohoto vzorku séra a každou zónu byl ze šesti snímání spočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient. Tabulka ukazuje limitní hodnoty testovaného vzorku a průměrný variační koeficient spočítaný z variačních koeficientů pro jednotlivé sledované frakce kreatinkinázy (n = 15). FRAKCE CK PRŮMĚR (%) SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) BB MB MM Reprodukovatelnost mezi jednotlivými snímáními po přenastavení gelu v držáku na GELSCAnu Reprodukovatelnost byla stanovena analýzou jednoho vzorku séra postupem HYDRAGEL 15 ISO-CK (15 rozborů na gel) na zařízení HYDRASYS se šesti následujícími denzitometrickými snímáními GELSCANem s přenastavením gelu v jeho držáku. Pro každý rozbor tohoto vzorku séra a každou zónu byl ze šesti snímání spočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient. Tabulka ukazuje limitní hodnoty testovaného vzorku a průměrný variační koeficient spočítaný z variačních koeficientů pro jednotlivé sledované frakce kreatinkinázy (n = 15). FRAKCE CK PRŮMĚR (%) SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) BB MB MM Přesnost Srovnávací studie Rozbor 119 různých patologických a normálních vzorků sér elektroforézou na agarózovém gelu postupy HYDRAGEL 7, 15 a 30 ISO-CK na systému HYDRASYS s denzitometrickým snímáním na GELSCANu nebo HYRYSu ukázal dobrou shodu mezi oběma kvantifikačními systémy pro různé frakce BB,MB a MM isoenzymu kreatinkinázy

10 HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 Korelační parametry pro jednotlivé zóny vypočítané ze směsných hodnot pro gely HYDRAGEL 7, 15 a 30 ISO-CK a GELSCAN vs. srovnávací systém (y = HYDRAGEL 7, 15 a 30 ISO-CK a GELSCAN) byly: Frakce CK Korelační koeficient y-úsek Sklon Rozsah hodnot (%) HYDRAGEL ISO-CK (GELSCAn) BB MB MM Citlivost Vzorek patologického séra s frakcí MB (aktivita: 40 IU/L) byl postupně ředěn a tato ředění byla elektroforeticky analyzována na gelu HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30. Po denzitometrickém stanovení byla nejnižší detekovaná aktivita frakce MB 2.5 IU/L. Linearita Byla testována postupná ředění vzorku obsahujícího frakce MM a MB, od celkové aktivity CK 750 IU/L do 20 IU/L. Systém byl lineární v celém studovaném rozsahu

11 HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Abbott LB, Van Lente F, Procedure for characterization of creatine kinase variants on agarose electrophoretograms. Clin Chem, 31, 3 : Anido VA, Conn RB, Mengoli HF, Anido G, Diagnostic efficacy of myocardial creatine phosphokinase using polyacrylamide disk gel electrophoresis. Am J Clin Pathol, 61 : Cawley LP, Electrophoresis and immunoelectrophoresis. Little, Brown and Company, Boston. 4. Christenson RH, Azzazy HME, Biochemical markers of the acute coronary syndromes. Clin Chem, 44 : Doran GR, Wilkinson JH, The origin of elevated activities of creatine kinase and other enzymes in the sera of patients with myxedema. Clin Chim Acta, 62 : Dubo H, Park DC, Pennington RJT, Kalbag RM, Walton JN, Serum-creatine-kinase in cases of stroke, head injury and meningitis. Lancet, 2 : Jockers-Wretou E, Pfleiderer G, Quantitation of creatine kinase isoenzymes in human tissues and sera by an immunological method. Clin Chim Acta, 58 : Kachmar JF, Moss DW: Enzymes. In Fundamentals of Clinical Chemistry. NW Tietz, Editor, Saunders, Philadelphia, 1976, pp Keffer JH, Myocardial markers of injury. Clin Chem, 105, 3 : King JO, Zapf P, A review of the value of creatine phosphokinase estimations in clinical medicine. Med J Aust, 1 : Konttinen A, Somer H, Specificity of serum creatine kinase isoenzymes in diagnosis of acute myocardial infarction. Br Med J, 1, Konttinen A, Somer H, Auvinen S, Serum enzymes and isoenzymes. Extrapulmonary sources in acute pulmonary embolism. Arch Intern Med, 133 : LaFair JS, Myerson RM, Alcoholic myopathy. Arch Intern Med, 122 : Mair J, Morandell D, Genser N, Lechleitner P, Dienstl F, Puschendorf B, Equivalent early sensitivities of myoglobin, creatine kinase MB mass, creatine kinase isoform ratios, and cardiac troponins I and T for acute myocardial infarction. Clin Chem, 41, 9 : Morin LG, Creatine kinase : stability, inactivation, reactivation. Clin Chem, 23, 4 : Nealon DA, Henderson AR, Measurement of brain-specific creatine kinase isoenzyme activity in serum. Clin Chem, 21 : Rao PS, Mueller HS, Evaluation of the chemical activation procedure (Rao s method) for the measurement of the MB isoenzyme of creatine kinase. Clin Chem, 22 : Rock RC, Dreskin R, Kickler T, Wimsatt T, Creatine kinase isoenzymes in serum of patients with Reye s syndrome. Clin Chim Acta, 62 : Roe CR, Limbird LE, Wagner GS, Nerenberg ST, Combined isoenzyme analysis in the diagnosis of myocardial injury : Application of electrophoretic methods for the detection and quantitation of the creatine phosphokinase MB isoenzyme. J Lab Clin Med, 80 : Thompson WG, Mahr RG, Yohannan WS, Pincus MR, Use of creatine kinase MB isoenzyme for diagnosing Myocardial infarction when total creatine kinase is high. Clin Chem, 34, 11 : Vassella F, Richterich R, Rossi E, The diagnostic value of serum creatine kinase in neuromuscular and muscular disease. Pediatrics, 35 : Vincent WR, Rapaport E, Serum creatine phosphokinase in the diagnosis of acute myocardial infarction. Am J Cardiol, 15 : Weime RJ, Agar Gel Electrophoresis, Elsevier, Amsterdam. 24. Wolf PL, Kearns T, Neuhoff J, Lauridson J, Identification of CPK isoenzyme MB in myocardial infarction. Lab Med, 5 : Young DS, Pestaner LC, Gibberman V. Clin Chem, 21 : 1D (1975). 26. Zimmerman HJ, Henry JB: Clinical Enzymology. In Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 16th ed., JB Henry, Editor, Saunders, Philadelphia, 1979, pp Zsigmond EK, Starkweather WH, Abnormal serum and muscle creatine phosphokinase (CPK) isoenzyme pattern in a family with malignant hyperthermia. Anaesthesis, 22 : Zsigmond EK, Starkweather WH, Duboff GS, Flynn KA, Elevated serum creatine phosphokinase activity in a family with malignant hyperpyrexia. Anesth analg, 51 : Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, Septembre

12 HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure Figure 3 Figure Figure 5 Figure

13 HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-CK /03 SCHÉMAS / FIGURES Figure 7 HYDRASYS HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) HYDRASYS 2 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)

14 Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0) Fax : 32 (0) benelux@.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : Fax : GmbH Münsterfeldallee, Fulda Deutschland Tel. : 49 (0) Fax : 49 (0) Hispania S.A. C/Sicilia, n Barcelona España Tel. : Fax : Inc Corporate Drive Norcross, GA U.S.A. Tel. : Fax : info@-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : Fax : info@.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0) Fax : 44 (0) info@.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0) Shanghai Representative Office Cross Tower, Room Fuzhou Road Shanghai China Tel. : (21) Fax : (21)