HYDRAGEL 15 LIPO + Lp(a) HYDRAGEL 30 LIPO + Lp(a) Ref Ref Ref /12

Transkript

1 HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) Ref HYDRAGEL 15 LIPO + Lp(a) Ref HYDRAGEL 30 LIPO + Lp(a) Ref /12

2 POUŽITÍ KITU HYDRAGEL 7, 15 a 30 LIPO + Lp(a) kit je určen ke stanovení profilů liporoteinů a ke skríningu Lp(a) v lidském séru. Každý agarózový gel je určen k analýze : 7-mi vzorků (HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) kit), 15-ti vzorků (HYDRAGEL 15 LIPO + Lp(a) kit), 30-ti vzorků (HYDRAGEL 30 LIPO + Lp(a) kit). Určeno pro diagnostické použití in vitro. Schválení FDA pro aplikaci v USA v jednání. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRINCIP TESTU 1-14 Analýza je provedena elektroforezou na agarózových gelech o ph 7.5. Separované lipoproteiny jsou obarveny roztokem Sudanové černi. Přebytek barvičky je odstraněn alkoholovým roztokem. Vyhodnocení je buď vizuální nebo denzitometrické (relativní kvantifikace jednotlivých zón). Lipoproteiny jsou cirkulující komplexy sestávající z lipidů a proteinů. Jejich klasifikace je založena na vlastnostech, jež umožňují stanovení následujícími separačními technikami : utracentrifugace (využívá rozdílných hustot), zónová elektroforéza (el. náboj), molekulární filtrace polyakrylamidovou elektroforézou (velikost molekuly). Klasifikace hyperlipemie je založena na hodnocení zónové elektroforézy. Na agarózových gelech se lipoproteiny dělí na následující frakce : Chylomikrony : velké molekuly s vysokým obsahem triglyceridů, přítomny v plazmě jako malé částice způsobují opalescenci séra a zůstávají v místě aplikace. Beta-lipoproteiny (LDL-Low Density Lipoproteins) migrují v pozici beta-2 globulinů. Pre-beta lipoproteiny (VLDL-Very Low Density Lipoproteins) : mají vyšší mol. hmotnost, nižší denzitu a jsou rychlejší než LDL migrují v pozici beta-1 globulinů. Rychlé pre-beta lipoproteiny (pokud jsou přítomny) jsou tvořeny Lp(a), které jsou velikostí a složením podobné LDL. Pokud jsou přítomny v dostatečně vysoké koncentraci, migrují mezi VLDL a HDL. Alfa lipoproteiny HDL (High Density Lipoproteins) : nejrychlejší frakce. Migrují v pozici alfa-2 globulinů. Elektroforéza lipoproteinů je běžnou technikou rutinně používanou klinickými laboratořemi ke stanovení abnormalit lipoproteinů a rizikových faktorů ICHS v séru. Rozlišení lipoproteinů dle jejich elektroforetické pohyblivosti je základem Fredricksonovy klasifikace, dle níž lze léčit poruchy metabolizmu lipoproteinů dietou a medikamentózně. Předností gelů HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) a HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 je, současné určení lipoproteinového profilu i rychlé pre-beta Lp(a) frakce. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITECH HYDRAGEL 7, 15 A 30 LIPO + Lp(a) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY KAT. Č KAT. Č KAT. Č Agarózové gely (připraveny k použití) 10 gelů 10 gelů 10 gelů Houbičky s pufrem (připraveny k použití) 10 bal. po 2 ks 10 bal. po 2 ks 10 bal. po 2 ks Sudanová čerň (zásobní roztok) 1 lahv. 20 ml 1 lahv. 20 ml 1 lahv. 20 ml Aplikátory (připraveny k použití) 1 bal. po 10 ks (7 zubů) 1 bal. po 10 ks (15 zubů) 2 bal. po 10 ks (15 zubů) Tenké filtrační papíry 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. 1. AGARÓZOVÉ GELY Příprava Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 7.5 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu lipoproteinů. Skladování, stabilita a známky poškození Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). NEMRAZIT! Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či na obalech gelů SEBIA NÁVOD - Czech

3 Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). HYDRAGEL 7, 15 & 30 LIPO + Lp(a) /12 2. PUFROVANÉ STRIPY Příprava Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s ph 7.5 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Slouží jako rezervoár pufru a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami. Skladování, stabilita a známky poškození Skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Jsou stabilní nejméně do data exspirace vyznačeného na balení kitu či na štítcích jednotlivých balení. NEMRAZIT! Nepoužívejte stripy z otevřených balení nebo stripy vyschlé! 3. SUDANOVÁ ČERŇ Příprava Připravte pracovní roztok barviva Sudan Black alespoň 30 minut před použitím. Za jemného míchání přidejte přesný objem jednotlivých složek v následujícím pořadí : 1) Čistý ethanol (96 %), 120 ml ; barvivo Sudan Black, zásobní roztok, 1.45 ml. Počkejte, dokud se Sudan Black úplně nerozpustí, a pak přidejte 100 ml destilované nebo deionizované vody. nebo 2) Čistý isopropanol (100 %), 100 ml ; barvivo Sudan Black, zásobní roztok, 1.45 ml. Počkejte, dokud se Sudan Black úplně nerozpustí, a pak přidejte 120 ml destilované nebo deionizované vody. Míchejte alespoň 30 minut. Nenechávejte v blízkosti tepelného zdroje. Na každé barvení připravujte nový roztok. DŮLEŽITÉ : jiného alkoholu nebo alkoholu denaturovaného může vést k atypickým výsledkům. Při použití čistého alkoholu jiné koncentrace je nutno upravit objemy alkoholu i vody. K barvení gelů s rozdělenými lipoproteiny po elektroforéze. Skladování, stabilita a známky poškození Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě. Je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky barvicího roztoku. Pracovní roztok vydrží 12 hodin v uzavřeném zásobníku. POZNÁMKA : Zásobní roztok barvicího roztoku může gelovatět. Snadno se znovu rozpustí při pokojové teplotě vyšší než 15 C bez negativního vlivu na jeho funkci. Zamíchejte před použitím. 4. APLIKÁTORY K nanesení vzorků - připraveny k použití. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 5. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. ODBARVOVACÍ ROZTOK (& PROMÝVACÍ ROZTOK č. 1) Příprava Nejméně 15 minut před použitím, připravte 440 ml roztoku obsahujícího (obj. / obj.) : 1) 45 % čistého alkoholu a 55 % destilované nebo deionizované vody, nebo, 2) 30 % čistého izopropanolu a 70 % destilované nebo deionizované vody. DŮLEŽITÉ : jiného alkoholu nebo etanolu denaturovaného může vést k atypickým výsledkům. Při použití čistého alkoholu jiné koncentrace je nutno upravit objemy alkoholu i vody. Slouží k čištění barvícího modulu HYDRASYSu před jeho použitím pro barvení HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) a HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 gelů. K odbarvení, tj. odstranění přebytku barvičky z gelu a z jeho zadní strany. Skladování, stabilita a známky poškození Skladovat při pokojové teplotě v těsně uzavřené láhvi. Stabilní jeden měsíc při laboratorní teplotě. Roztok odtraňte při změně vzhledu, tj., mikrobiální kontaminací vzniklého zákalu

4 2. PROMÝVACÍ ROZTOK č. 2 Příprava Připravte 1 litr roztoku obsahujícího (obj./obj.) : 1) 75 % čistého etanolu a 25 % destilované nebo deionizované vody, nebo, 2) 70 % čistého izopropanolu a 30 % destilované nebo deionizované vody. Lze použít i denaturovaný etanol. K vypláchnutí barvícího prostoru HYDRASYSu po obarvení gelů. Skladování, stabilita a známky poškození Skladujte při pokojové teplotě v těsně uzavřené láhvi. Stabilní tři měsíce při lab. teplotě. Vyřaďte z používání při změně vzhledu, tj. při bakteriální kontaminací způsobeném zákalu. 3. FLUIDIL Příprava Fluidit (SEBIA, kat. č. 4587,1 lahv. 5 ml) připraveno k použití. K ředění viskózních nebo zakalených vzorků např. sér obsahujících kryoglobulin nebo kryogel. Skladování, stabilita a známky poškození Při teplotě místnosti. Stabilní do doby exspirace vyznačené na štítku. Nesmí obsahovat sraženiny. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. NUTNÉ VYBAVENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č nebo kat. č nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č Manuální nebo automatizovaný mikropipetor, SEBIA HYDRAPLUS, kat. č nebo SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č nebo SEBIA ASSIST, kat. č jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká Skladovací Komora kat. č. 1270, dodávaná s HYDRASYS systémem. 4. Accessory Kit HYDRASYS LIPOPROTEINS SEBIA, kat. č Pipety 10 µl a 200 µl a 1000 µl. 5. Držák gelů SEBIA, kat. č Densitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm nebo 82 x 102 mm : Software HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS pro plochý skener. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Doporučuje se odebírat vzorky od pacientů, kteří jsou nejméně 12 hodin nalačno. Odběr musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky uložte do chladničky (2 až 8 C) co nejdříve po odběru maximálně na 3 dny. Vzorky nezmrazujte. Nepoužívejte vzorky upravené heparinem. Skladování snižuje mobilitu pre-ß-lipoproteinu a dochází tak k podhodnocení odpovídající frakce. Mobilita rychlého pre-ß-lipoproteinu - nebo-li lipoproteinu Lp(a) - skladováním ovlivněna není. Příprava vzorků Používejte neředěná séra. Při skladování v ledničce nebo po zmrazení, se některá séra mohou stát viskózními nebo se vyvine zákal v takovém případě přidejte 25 µl Fluidilu k 75 µl séra a 15 vteřin promíchejte na Vortexu. Obvykle tato séra obsahují kryoglobulin způsobující problémy (špatná difúze skrze zuby aplikátoru) při nanášení vzorku. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVNÍ POSTUP HYDRASYS systém je poloautomatický, multiparametrický přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarózových gelů v následujícím pořadí : aplikace vzorků, elektro-foretické dělení, sušení, barvení, odbarvování a konečné osušení. Manuální kroky zahrnují různé manipulace se vzorky a gely a nastavení přístroje. DODRŽUJTE PEČLIVĚ POKYNY UVEDENÉ V MANUÁLU PŘÍSTROJE!

5 I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte aplikátory jeden aplikátor pro HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) (na 7 vzorků) a HYDRAGEL 15 LIPO + Lp(a) (15 vzorků) nebo 2 aplikátory při použití HYDRAGEL 15/30 LIPO + Lp(a) (30 vzorků) na rovnou plochu očíslováním jamek vzhůru (viz Obr. 1). - naneste 10 µl vzorku do každé jamky. Každý aplikátor musí být naaplikován nejdéle ve dvou minutách. - vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček), nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Komůrka se může vložit až na 8 hodin do chladničky a analýza může být tak po tuto dobu odložena. Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámrček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POzOR : Nikdy nezavírejte víko pokud je migrační rámeček nahoře! 4. Z menu na přístroji zvolte program migrace "7 LIPO + Lp(a)" pro HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) nebo "15/30 LIPO + Lp(a)" pro HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/ Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - Plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej po povrchu gelu narolujete, aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POzOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! - Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody při použití HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) nebo 200 µl pro HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše. - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do kontaktu s kapkou vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem bez vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU. 8. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Pro analýzu 7 a 15 vzorků umístěte aplikátor na nosič do pozice č V případě analýzy 30 vzorků umístěte 2 aplikátory na nosič do pozic č. 1 a 7. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Všechny části migračního rámečku jsou sníženy stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu probíhá aplikace vzorků do gelu. Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v kontaktu s povrchem gelu. Proběhne migrace při konstantních 7.5 W pro HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a), nebo při 15 W pro HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 při 20 C, řízených pomocí Peltierova efektu až do 100 Vh (po asi 30 minut). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Teplota migrační plochy stoupá až na 60 C na dobu 15-ti minut, po kterou se gel suší. Po vysušení gelu zazní zvukový signál informující o odblokování víka migračního modulu. Po otevření víka teplota dále klesá až na 20 C (za méně než 5 minut), kdy je možné začít další migraci. POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků. II. PROMYTÍ Č. 1 : MODUL PRO BARVENÍ 1. Umístěte prázdný držák gelů do modulu na zpracování a barvení gelů. DŮLEŽITÉ : Před zahájením mycího programu zkontrolujte : - kontejner na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 220 ml odbarvovacího roztoku ; - kontejner na odpad je vyprázdněn (není plný). Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody. 2. Zvolte mycí / barvící program "LIPO + Lp(a) & LIPO" z menu přístroje. Stisknutím tlačítka "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice) započnete cyklus. Během promývání zůstává tento oddíl uzamčen. Odemčení je signalizováno slyšitelným pípnutím. Z modulu na zpracování / barvení vyjměte držák gelů. III. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte aplikátor(y) a odstraňte jej(je). 3. Zvedněte migrační rámeček, vyjměte pufrované stripy uchopením za plastikové konce a odstraňte je. 4. Vyjměte usušený gel pro další zpracování. 5. Po každém použití otřete podélně elektrody i migrační plochu vlhkým hadříkem. 6. Otevřete držák gelu, umístěte usušenou gelovou plotnu (gelovou stranou nahoru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že plotna je umístěna správně uvnitř držáku (viz Obr. 5)

6 7. Vložte držák gelu do modulu na zpracování / barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před nastartováním programu pro zpracování a barvení zkontrolujte : - zda kontejner pro barvení je naplněn alespoň 220 ml barvícího roztoku ; - zda kontejner pro odbarvování obsahuje nejméně 220 ml odbarvovacího roztoku ; - zda kontejner na odpad je prázdný (není plný). Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody. 8. Stiskněte "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice). Během barvení, odbarvování, oplachování a sušení gelu, zůstává tento modul uzavřen. Po ochlazení se ozve pípnutí, signalizující odemknutí ventilace běží až do vyjmutí držáku gelu. IV. DOKONČENÍ ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Vyjměte držák s gelem, otevřete ho a vyjměte osušený gel Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny měkkým hadříkem nebo buničinou namočenou v 70 % roztoku etanolu. 2. Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání ; nastavte nulovou hodnotu pozadí na nejnižší bod. POZN. : Délka jednotlivých elektroforeogramů se může lehce lišit na gelech obsahujících vzorky ve 2 nebo 3 řadách, bez následku na provedení testu. V. PROMYTÍ Č. 2 : MODUL PRO BARVENÍ 1. Umístěte prázdný držák gelů do modulu na zpracování a barvení gelů. DŮLEŽITÉ : Před zahájením mycího programu zkontrolujte, že : - kontejner na promývací roztok č. 2 obsahuje nejméně 250 ml promývacího roztoku č. 2 ; - kontejner na odpad je vyprázdněn (není plný). Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody. 2. Po stisknutí tlačítka "START" začne promývání (zelená šipka na pravé straně klávesnice). Během promývání zůstává tento modul uzamčen. Po osušení, slyšitelné pípnutí signalizuje odemčení barvícího modulu. KONTROLA KVALITY Za každou sérii vzorků se doporučuje zařadit kontrolní sérum s hladinami triacylglycerolů a cholesterolu v mezích normy. VÝSLEDKY Hodnoty Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) relativních koncentrací každé frakce. Rozsahy Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) hlavních elektroforetických zón, byly stanoveny pro 200 zdravých mužů a žen metodou HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) nebo HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 : Beta lipoproteiny (LDL) : % Pre-beta lipoproteiny (VLDL) : % Alfa lipoproteiny (HDL) : % Rychlé pre-beta lipoproteiny Lp(a) lze vidět i na lipidogramech zdravých osob. Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. Pořadí migrace Dle složení vzorku lze pozorovat jeden ze dvou základních typů rozdělení : HDL VLDL LDL Od bodu aplikace směrem k anodě HDL Lp(a) VLDL LDL Od bodu aplikace směrem k anodě Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Vizuální hodnocení srovnáním vyšetřovaného vzorku s normální kontrolou. Denzitometrie relativní procenta jednotlivých lipoproteinových frakcí. Kvalitativní (přítomnost abnormálních frakcí nebo nepřítomnost normálních frakcí) i semikvantitatívní (relativní zvýšení či snížení frakcí) abnormality vyžadují další analýzu. Další pomocí při interpretaci lipidogramů je Fredricksonova klasifikace

7 Fredricksonova klasifikace TYP HYPERLIPEMIE TYP I TYP II a TYP II b TYP III TYP IV TYP V CELKOVÝ CHOLESTEROL g/l < mm < 7 13 TRIGLYCERIDY g/l < mm < VZHLED SÉRA mléčné čiré opal. opal. zákal mléčné CHYLOMIKRA LDL çiftli - -- VLDL N až --- N HDL --- N až - N až Lp(a) skríning Frakce mezi alfa a pre-beta zónami odpovídá Lp(a). Pohyblivost se může lišit v závislosti na fenotypu. Minimální hladina detekce je 0.03 g/dl. Pokud se frakce Lp(a) na lipidogramu prokáže, je vhodná její kvantifikace nefelometricky nebo elektroimunodifúzí. Zvláštní případy U typů IV a V dle Fredricksona, kde pre-beta frakce je vysoká a posunutá anodicky, může skrývat Lp(a). Doporučuje se nechat sérum stát hod. při pokojové teplotě (což sníží mobilitu VLDL) a opakovat elektroforézu, příp. vyšetřit Lp(a) kvantitativně. Lp X zůstává na katodické straně, chylomikra nejsou přítomna nachází se v ikterických sérech v případě cholestázy nebo biliárního onemocnění. Interference a omezení Nepoužívat mražené vzorky. Skladování snižuje mobilitu VLDL, může dojít k podhodnocení. Pohyblivost Lp(a) není skladováním ovlivněna. 8 mm před zónou alfa migruje albumin, který se barví Sudanem nesmí být zahrnut do vyhodnocení. Difúzní stopa před alfa-liproteinovou frakcí (HDL), vyskytující se u některých sér, se do vyhodnocení musí zahrnout (tato zóna odpovídá HDL částečně zbavených lipidů). Metoda je kvalitativní, zjištěné změny vyžadují další analýzu. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : HODNOTY Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení. Všechny elektroforeograby byly interpretovány taktéž vituálně. Reprodukovatelnost Ve všech studiích reprodukovatelnosti, byly nejdříve naskenované elektroforeogramy a poté zapsána procentuální hodnota relativní koncentrace každé lipoproteinové frakce. Průměry, SD a CV byly kalkulovány s ohledem na analyzované parametery. Po vizuální analýze elektroforeogramů nebyly pozorované žádné rozdíly mezi opakováními. Výsledky testů indikují velice dobrou reprodukovatelnost. V tabulkách níže jsou uvedeny reprezentativní příklady. Reprodukovatelnost na gelu Každý ze tři patologických vzorků s Lp(a) frakcí byl podroben analýze metodou HYDRAGEL 15 & 30 LIPO + Lp(a). Každý vzorek byl testován na všech 15-ti drahách gelu dvou různých šarží. Tabulka ukazuje výsledky na gelu (jeden gel / šarže) pro všechny tři vzorky : FRAKCE HDL (%) Lp(a) (%) VLDL (%) LDL (%) PRŮMĚR SD CV % Reprodukovatelnost mezi gely Patnáct (15) různých vzorků bylo podrobeno testům na gelech soupravy HYDRAGEL 15 & 30 LIPO + Lp(a) dvou šarží. Každý vzorek byl testován na jedné dráze každého z 10-ti gelů pro obě šarže. Tabulka ukazuje výsledky reprezentativních vzorků : FRAKCE HDL (%) Lp(a) (%) VLDL (%) LDL (%) PRŮMĚR SD CV %

8 Linearita a citlivost Relativní koncentrace lipoproteinových frakcí byly stanoveny následnými ředěními sérového vzorku. Denzitometricky stanovené koncentrace nebyly závislé na ředícím faktoru. Nejvyšší ředění (1 : 4) za předpokladu, že elektroforeogram bylo možné skenovat (obecně stejné jako s nativním vzorkem séra). Koncentrace Lp(a) byla stanovena v sérových vzorcích elektroimunodifuzí. Detekční limit byl okolo 30 mg/dl. Přesnost Denzitometricky stanovené relativní koncentrace jednotlivých lipoproteinových frakcí byly měřeny pomocí normálních a patologických vzorků séra (n = 56) ; 16 vzorků bylo s Lp(a). Všechny vzorky byly podrobeny analýze metodou HYDRAGEL 15 & 30 LIPO + Lp(a) a ekvivalentnímu elektroforetickému testu. Po vizuální analýze elektroforeogramů nebyly pozorované žádné rozdíly. Denzitometrické hodnoty byly analyzovány za použití lineární regrese : Frakce Korelační koef. y - úsek Sklon Rozsah % hodnot * HDL Lp(a) VLDL LDL * % hodnoty byly stanovené na SEBIA systému. Identifikace rychlé pre-beta frakce jako Lp(a) Imunofixační a imunosubstrakční techniky byly použité pro demonstraci toho, že Lp(a) migruje jako rychlá pre-beta frakce a jako jediná detekovatelná komponenta v tomto případě chybí v LDL, VLDL a HDL frakcích

9 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Berg K. A new serum type system in man : the Lp(a) system. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1963, 59, Buxtorf JC, Dachet C, Jacotot C. Dosage de la lipoprotéine Lp(a): une méthode immuno-turbidimétrique semi-automatique. Pathologie et Biologie, 1991, Vol 39, 4, Campos E., Fievet P., Caces E., Fruchart J-C and Fievet C.: A screening method for abnormally high lipoprotein (a) concentrations by agarose lipoprotein electrophoresis. Clin. Chim. Acta., 1994, 230, Carlson LA, Ericsson M. Quantitative and qualitative serum lipoprotein analysis. Part 1 : Studies in healthy men and women. Atherosclerosis, 1975, 21, Dahlen GH, Guyton JR, Arrar M, Farmer JA, Kautz JA, Gotto AM. Association of level of lipoprotein Lp(a), plasma lipids, and other lipoproteins with coronary artery disease documented by angiography. Circulation, 1986, 74, Fredrickson DS and Lees RS. A system for phenotyping hyperlipemias. Circulation, 1965, 31, Fruchart JC, Clavey V, Vanhoutte G. Méthodes d exploration biochimique des hyperlipoprotéinémies. Path. Biol., 1983, 31, 4, Fruchart JC, Puchois P. Méthodes d analyses des lipoprotéines. Ann. Biol. Clin., 1986, 44, Kostner GM, Avogaro P, Cazzolato G, Marth E, Bittolo-Bon G, Quinci GB. Lipoprotein Lp(a) and the risk for myocardial infarction. Atherosclerosis, 1981, 38, Morisett JD, Guyton JR, Gaubatz JW, Gotto AM Jr. Lipoprotein Lp(a) : Structure, metabolism and epidemiology. In: Gotto AM Jr, ed. Plasma lipoproteins. Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1987, Naito H. The association of serum lipids, lipoproteins, and apolipoproteins with coronary disease, assessed by coronary arteriography. Ann. Ny. Ac. Sc., 1984, 454, Papadopoulos NM. Detection of lipoprotein abnormalities by a sensitive electrophoretic test system for the prevention of cardiovascular disease. International Angiology, 1985, vol 4, 2, Schreiner PJ, Morrisett JD, Sharett AP, Patsh W, Tyroler HA, Wu K, Heiss G. Lipoprotein (a) as a risk factor for preclinical atherosclerosis. Arterioscler. Thromb., 1993, 13, Schreiver H, Assmann G, Sandkamp M, Schulte H. The relationship of lipoprotein (a) (Lp(a) ) to risk factors for coronary disease. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1984, 22, Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept :

10 HYDRAGEL 7, 15 & 30 LIPO + Lp(a) /12 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure Figure 3 Figure Figure 5 HYDRASYS HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)

11 HYDRAGEL 7, 15 & 30 LIPO + Lp(a) /12 SCHÉMAS / FIGURES HYDRASYS 2 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)

12 Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0) Fax : 32 (0) benelux@.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : Fax : GmbH Münsterfeldallee, Fulda Deutschland Tel. : 49 (0) Fax : 49 (0) Hispania S.A. C/Sicilia, n Barcelona España Tel. : Fax : Inc Corporate Drive Norcross, GA U.S.A. Tel. : Fax : info@-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : Fax : info@.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0) Fax : 44 (0) info@.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0) Shanghai Representative Office Cross Tower, Room Fuzhou Road Shanghai China Tel. : (21) Fax : (21)