MASARYKOVA UNIVERZITA

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE Kombinace separačních technik a hmotnostní spektrometrie pro proteomickou analýzu ječmene Brno 2010 Bc. Michal Synáček

2 Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatně, s použitím uvedené literatury. 2

3 Děkuji vedoucí své práce Ing. Markétě Laštovičkové, Ph.D. za vedení diplomové práce, trpělivost a ochotu poradit a pomoct. Dále děkuji Ing. Janette Bobáľové, CsC. za poskytnutou příležitost účastnit se zajímavého výzkumu a za cenné rady. Také bych rád poděkoval svým rodičům za podporu a trpělivost, kterých se mi dostávalo po celou dobu studia. Tato diplomová práce byla podporována projektem ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR: Výzkumné centrum pro studium obsahových látek ječmene a chmele (1M0570). 3

4 Obsah 1 Abstrakt Úvod Teoretická část Proteiny a jejich modifikace Proteiny Aminokyseliny Peptidová vazba, primární struktura proteinu Sekundární, terciární struktura proteinu Glykomika a glykoproteiny Typy glykosylací Glykace Separační metody Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného D Gelová elektroforéza (2D-GE) Afinitní chromatografie (AC) Hmotnostní spektrometrie (MS) Historie a uplatnění v proteomice Princip fungování MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) Průletový hmotnostní analyzátor (TOF) Tandemový hmotnostní analyzátor TOF/TOF Matrice Identifikace proteinů metodou peptidového mapování Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) Ječmen Systematika ječmene Historie a rozšíření Morfologický popis Pivo Historie Suroviny Voda Kvasnice Chmel Slad Úvod do proteomiky Definice proteomiky Cíle proteomiky Přístupy k proteomickému studiu Přehled proteinů obsažených v ječmeni Experimentální část Seznam chemikálií Materiál D gelová elektroforéza Extrakce proteinů rozpustných ve vodě Izoelektrická fokusace Příprava gelů pro 2D gelovou elektroforézu Gelová elektroforéza Afinitní chromatografie následovaná 1D gelovou elektroforézou Příprava proteinových extraktů pro afinitní chromatografii

5 4.4.2 Frakcionace proteinů afinitní chromatografií Dialýza vzorků D gelová elektroforéza Enzymatické štěpení proteinů Hmotnostní spektrometrie Identifikace proteinů Výsledky Vyhodnocení 2D gelové elektroforézy Popis gelů získaných 2D-GE Identifikace vybraných proteinů hmotnostní spektrometrií Podrobné informace o identifikovaných proteinech po 2D-GE Vyhodnocení afinitní chromatografie (AC) nasledované SDS-PAGE Gely získané pomocí AC následované SDS-PAGE Identifikace vybraných proteinů hmotnostní spektrometrií Podrobné informace o proteinech identifikovaných pomocí AC následované SDSPAGE Závěr Seznam použité literatury

6 1 Abstrakt Ječmen je důležitou zemědělskou plodinou používanou k přípravě sladu, jedné z výchozích surovin při výrobě piva. Chemické složení ječmene tak ovlivňuje výsledné vlastnosti tohoto hospodářsky významného nápoje. Jedním ze sledovaných parametrů ječmene je jeho proteinový obsah. Tato diplomová práce se zabývá charakterizací a porovnáním obsahu vodorozpustných proteinů obsažených v zrnu a sladu ječné sladovnické odrůdy Jersey. K tomu byla využita kombinace 2D gelové elektroforézy, enzymatického štěpení vybraných proteinů a jejich identifikace pomocí MALDI-TOF MS a MS/MS analýz a následného databázového vyhledávání. Jedním z cílů byla také detekce proteinů modifikovaných glykosylací, která významně ovlivňuje vlastnosti proteinů. K dosažení tohoto cíle bylo použito afinitní chromatografie následované SDS-PAGE, enzymovým štěpením a MALDI-TOF MS a MS/MS analýzou. Použitím metody zahrnující dvourozměrnou gelovou elektroforézu byly identifikovány jak proteiny přežívající sladování (např. glyceraldehyd3-fosfát dehydrogenasa) tak i proteinové spoty specifické pro zrno (B3-hordein) či slad (Barperm1, ječný hypotetický protein, atd. ). Lektinová afinitní chromatografie následovaná jednorozměrnou elektroforézou odhalila dva potenciální proteiny modifikované glykosylací, jeden v zrnu (protein disulfid-isomerasa) a jeden ve sladu (serin-karboxypeptidasa). Navíc byla identifikována i řada významných ječných proteinů, které nebyly lektinovou AC zadržovány (protein Z, beta-amylasa, endochitinasa, atd.) 6

7 Abstract Barley is an important agricultural crop mainly used for the production of malt, one of the key ingredients for brewing beer. Therefore, the chemical composition of barley affects the resulting properties of beer. Barley protein composition is one of widely studied aspects, which is also the focus of this master's thesis. The goals of this thesis were to characterize and compare water-soluble proteins found in grain and malt, and to detect and identify proteins modified by glycosylation, which gives proteins unique properties. To achieve these goals, the combination of two-dimensional gel electrophoresis, one-dimensional gel electrophoresis and affinity chromatography were employed as the separation methods. The identification and characterization of selected proteins was carried out by MALDI-TOF MS and MS/MS analyses followed by database searching. The use of two-dimensional gel electrophoresis led to the identification of both proteins surviving the malting process (e.g. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) and protein spots that were specific for grain (B3-hordein) or malt (Barperm1, barley hypothetical protein, etc.). Affinity chromatography followed by one-dimensional gel electrophoresis revealed two potential N-glycoproteins, one found in grain (protein disulfide-isomerase) and one found in malt (serine carboxypeptidase). Moreover, many important barley proteins were identified in lectin non-bound fractions (protein Z, beta amylase, endochitinase, etc.) 7

8 2 Úvod Ječmen je jednou z nejdéle pěstovaných plodin na světě. Většina dnes vypěstovaného ječmene je použita k výrobě sladu, jedné z hlavních složek piva. Z tohoto důvodu je ječmen důkladně studován. Jedním z předmětů studia ječmene je analýza jeho proteinového obsahu. Proteiny jsou základními stavebními kameny každého organismu, které zajišťují jeho správné fungování. Plní funkci podpůrnou, umožňují pohyb, přenášejí signály, slouží k obraně proti cizorodým látkám a také umožňují metabolismus buňky. Jedním z možných přístupů studování proteinů je využití proteomické analýzy. Proteomika se zabývá systematickou analýzou proteinů z hlediska jejich identity, množství a funkcí. Výhodou studia proteinů (na rozdíl od genomové analýzy) je možnost sledování změn, kterými studovaný organismus právě prochází. Množství proteinů v organismu se totiž neustále mění v závislosti na mnoha faktorech, jako je stáří organismu, adaptace na změny v prostředí či nemoc. Nemění se pouze koncentrace jednotlivých proteinů, proteiny jsou buňkou různě modifikovány, čímž může dojít ke změně jejich funkce. I tyto modifikace odrážejí aktuální stav buňky. Změnami v procesu výroby sladu prochází i proteinový obsah ječmene. V průběhu sladování je zrno ječmene nejprve máčeno vodou, čímž dojde ke klíčení ječmene. Poté, co ječmen začne klíčit, je předsušen při teplotách do 60 C a poté zahřát na teplotu až 105 C. Během celého procesu dochází k celé řadě změn v chemickém složení ječmene, včetně změn v proteinovém obsahu. Tvorba některých proteinů během sladování klesá nebo dokonce ustává, jiné proteiny jsou naopak nově syntetizovány a některé proteiny jsou přítomny ve všech fázích. Některé proteiny ze sladu tak mohou přejít do piva, kde ovlivňují jeho chuť a vzhled. Předmětem zkoumání této diplomové práce jsou právě změny v proteinovém složení ječmene. Prvním cílem je porovnání obsahu vodorozpustných proteinů zrna a sladu ječmene, druhým cílem byla snaha o nalezení a detekci proteinů modifikovaných glykosylací (připojením glykanu k proteinu). Takto modifikované proteiny vykazují řadu zajímavých vlastností; brání proteolýze, brání působení nízkých nebo vysokých ph a chrání proteiny před volnými radikály. K dosažení těchto cílů bylo použito kombinace separačních metod - jednorozměrné a dvourozměrné gelové elektroforézy a afinitní chromatografie. Charakterizace takto separovaných proteinů byla provedena hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF MS a MS/MS. 8

9 3 Teoretická část 3.1 Proteiny a jejich modifikace Proteiny Proteiny jsou vysokomolekulární látky podílející se téměř na všem, co organismus vykonává. Plní funkci podpůrné struktury, předávají signály uvnitř buňky, slouží k vykonávání pohybu a obraně proti cizorodým látkám. Proteiny zvané enzymy umožňují regulaci metabolismu selektivním zrychlováním chemických reakcí [1]. Zanořením proteinů do plazmatické membrány vznikají proteinové kanály a pumpy řídící průchod malých molekul do buňky i z buňky. Některé proteiny fungují jako hormony, protimrazové molekuly, jedy, protilátky nebo zdroje luminiscence [2]. Základními stavebními jednotkami proteinu jsou aminokyseliny. Proteiny vznikají spojením aminokyselin do různě dlouhých řetězců Aminokyseliny Jako aminokyseliny jsou označeny různé třídy molekul, mající jednu společnou vlastnost: všechny obsahují karboxylovou skupinu (-COOH) a aminoskupinu (-NH 2) uspořádané tak, že tyto skupiny jsou připojeny na jeden uhlíkový atom, zvaný alfa. Ve vodném roztoku o ph 7, tedy v prostředí nutném pro fungování organismu, karboxylová skupina proton ztrácí (COO -) a aminoskupina proton váže (NH3+) [3]. Aminokyseliny mají rozdílné postranní řetězce, které jsou také připojeny na uhlík alfa. COO- skupina se označuje jako C-konec, a NH 3+ skupina jako N-konec aminokyseliny. Na obrázku 1 je zobrazen obecný vzorec aminokyseliny. Obr. 1: Obecný vzorec aminokyseliny, R značí libovolný postranní řetězec. R je zkratka z anglického slova residue zbytek [3] Proteiny jsou běžně složeny z 21 druhů aminokyselin. To platí pro všechny živé organismy, od bakterií přes rostliny až k živočichům. Pět z 21 aminokyselin může díky svým postranním řetězcům v roztoku tvořit ionty; 2 mají zásadité postranní řetězce a 3 mají kyselé postranní řetězce. Postranní řetězce zbývajících aminokyselin zůstávají v roztoku nenabité. Některé z těchto nenabitých řetězců jsou polární a hydrofilní, jiné jsou nepolární a hydrofobní [2]. Zásadité: lysin (K), arginin (R), histidin (H). Kyselé: kyselina asparagová (D), kyselina glutamová (E). Polární: asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), threonin (T), tyrosin (Y). Nepolární: alanin (A), valin (V), leucin (L), isoleucin (I), prolin (P), fenylalanin (F), methionin (M), tryptofan (W), glycin (G) a cystein (C). Asymetričnost uhlíku alfa umožňuje existenci dvou zrcadlových forem aminokyseliny (vyjma glycinu). Tyto struktury se nazývají D- a L- isomery. Aminokyseliny v živých organismech se vyznačují tím, že se vyskytují pouze ve formě L. 9

10 3.1.3 Peptidová vazba, primární struktura proteinu Aminokyseliny mohou být kovalentně vázány jedna na druhou tak, že C-konec jedné aminokyseliny je kovalentně navázán na N-konec jiné aminokyseliny. Tato kovalentní vazba mezi dvěma aminokyselinami se označuje jako peptidová vazba. Ta je zobrazena na obrázku 2. Obr. 2: Peptidová vazba - vyznačena černě rámečkem [3] Jak bylo uvedeno výše, spojováním různých aminokyselin peptidovou vazbou do dlouhého řetězce vzniká protein. Pořadí aminokyselin proteinu se nazývá primární struktura. Protože je vzniklý protein velmi ohebný, množství tvarů, kterých může řetězec nabývat je velké. Tvar, který nakonec protein zaujme, je však vymezen nekovalentními vazbami. Tyto vazby jsou tvořeny atomy v polypeptidové kostře, velice důležité jsou však nekovalentní vazby vznikající mezi postranními řetězci jednotlivých aminokyselin v polypeptidovém řetězci. Mezi tyto vazby patří vodíkové můstky, iontové vazby a van der Waalsovy síly. Tyto vazby jsou ve srovnání s kovalentními vazbami slabé, takže stabilita výsledného tvaru je proto závislá na velkém počtu těchto vazeb. Dalším důležitým faktorem ovlivňující tvar proteinu je hydrofobnost a hydrofilnost postranních řetězců [2] Sekundární, terciární struktura proteinu I když celková konformace každého proteinu je jedinečná, lze přesto vysledovat dva základní modely skládání. První z nich je model α-šroubovice (α-helix), druhý typ je označován jako β-struktura neboli struktura skládaného listu. Oba dva typy jsou tvořeny vodíkovými můstky mezi skupinami N-H a C=O v kostře polypeptidu. Nezahrnují tedy postranní řetězce a proto mohou být tvořeny různými aminokyselinovými řetězci. α-helix vzniká tak, že se polypeptidový řetězec ovíjí kolem sebe sama a tvoří tuhý válec. Vodíkový můstek spojuje C=O skupinu jedné peptidové vazby s N-H skupinou jiné peptidové vazby, takto se k sobě váže každá čtvrtá peptidová vazba. Tento útvar je zobrazen na obrázku 3. Na obrázku 4 je symbol, kterým se α-helix označuje ve stužkových modelech. Obr. 3: α-helix [2] Obr. 4: Symbol označení α-helixu [2] 10

11 Druhý zmíněný typ konformace, který proteiny zaujímají, je β-struktura. Tyto struktury se často vyskytují v jádrech proteinů. Jsou tvořeny sousedícími polypeptidovými řetězci, které mají stejnou orientaci (jsou paralelní), nebo řetězci, které jsou složeny jako papír poskládaný do harmoniky tak, že každý úsek má vzhledem k sousedům opačnou orientaci (antiparalelní řetězce). Oba typy jsou rigidní útvary, drženy pohromadě vodíkovými můstky spojujícími peptidové vazby sousedních řetězců. Paralelní β-struktura je na obrázku 5, na obrázku 6 je symbol označující tuto strukturu. Obr. 5: Model paralelní β-struktury [3] Obr. 6: Symbol β-struktury [2] To, jak jsou tyto struktury k sobě orientovány v prostoru, tedy to, jakou konformaci protein zaujímá, se označuje jako terciární struktura Glykomika a glykoproteiny Již v roce 1938 bylo zjištěna vazba sacharidu na protein, ale až do 50. let se přítomnost sacharidů při zkoumání proteinů považovala za kontaminaci vzorku [4]. Dnes se ví, že vazba sacharidu na protein patří mezi jednu z mnoha posttranslačních modifikací proteinů. Tyto modifikace významnou měrou komplikují výzkum proteomů. Důvodem pro to je fakt, že stoupá počet variant proteinů. Tyto modifikace mají také zásadní význam pro funkci proteinů, ovlivňují jejich rozpustnost, stabilitu, transport do organel, enzymovou aktivitu, schopnost vázat ligandy či schopnost účastnit se předávání signálu [5]. Mezi nejsložitější a nejzásadnější modifikace patří glykosylace proteinů tedy vazba sacharidu (glykanu) na protein. Studiu glykosylace proteinů a lipidů se věnuje celý jeden vědní obor glykomika. Jeho cílem je získat znalosti o tom, jak tato modifikace ovlivňuje fungování proteinů a lipidů, a jak se glykosylace mění v závislosti na stavu buňky či organismu. Glykosylace plní zejména ochrannou funkci. Brání proteolýze, působení nízkých či vysokých ph a chrání proteiny před volnými radikály. Mezi další funkce patří zajištění dobré rozpustnosti a napomáhání proteinu zaujmout správné prostorové uspořádání. Glykosylace také ovlivňují aktivitu enzymů, určují směřování proteinu uvnitř buňky a stabilizuje proteiny uvolňované ven z buňky [6]. Navázané sacharidy roli také hrají při interakcích mezi různými buňkami, nebo mají podpůrnou funkci při interakci receptoru s ligandem [7]. 11

12 3.1.6 Typy glykosylací Rozlišovány jsou dva základní druhy glykosylací. Jedná se o N- typ a O- typ. Nejprve jsou uvedeny jednotlivé monosacharidy a jejich zkratky, z nichž se navázané glykany skládají. Jejich přehled je v tabulce 1. Monosacharid β-d-glukosa β-d-manosa β-d-galaktosa β-d-n-acetylglukosamin β-d-n-acetylgalaktosamin β-d-xylosa kyselina α-n-acetylneuramová kyselina β-d-glukoronová kyselina α-l-iduronová α-l-fukosa zkratka Glc Man Gal GlcNAc GalNAc Xyl NeuNac GlcA IdoA Fuc Tab. 1: Přehled monosacharidů z nichž se mohou tvořit glykany [8] N-glykosylace: Glykan se váže na volný amidový dusík aminokyseliny asparaginu. Aby k vazbě mohlo dojít, musí se asparagin vyskytovat v tomto aminokyselinovém tripletu: Asparagin libovolná aminokyselina (N+1) Serin/Threonin (N+2) V pozici N+1 se nesmí vyskytovat prolin a kyselina asparagová. Základním rysem N-glykanů je jádro tvořené ze dvou GlcNAc a tří Man. (Na obrázku 7). N-glykoproteiny mohou být dále děleny do několika podskupin podle toho, jaké monosacharidické jednotky tvoří glykan (např. typ s vysokým obsahem manosy). Příklady základních 3 typů N-glykanů jsou uvedeny na obrázcích 8 až 10. Typů glykanů, které se můžou na proteiny vázat je velké množství. K připojení sacharidu dochází v endoplasmatickém retikulu ještě před ukončením jeho syntézy [5]. Obr. 7 Jádro N-glykanů tvořené dvěma N-acetyl-D-glukosaminy a třemi manosami [8] Obr. 8 Příklad N-glykanu s vysokým obsahem manosy [8] 12

13 Obr. 9 Příklad hybridní struktury N-glykanu [8] Obr. 10 Příklad komplexní struktury N-glykanu [8] O-glykosylace: O-glykosylace byly pozorovány při vazbě na hydroxyskupinu serinu nebo threoninu, popsány jsou i O-glykosylace na tyrosinu, hydroxyprolinu a hydroxylysinu. O-glykosylace se nevyskytuje na proteinech osamoceně, častější je výskyt v určitých shlucích v oblastech bohatých na výskyt serinu a threoninu. Podobné pravidlo určující vazbu sacharidu na konkrétní aminokyseliny, jako je tomu v případě N-glykosylací, zatím nebylo určeno [5] Glykace Nízkomolekulární sacharidy, zejména glukosa, se mohou vázat na volné aminokyseliny biomolekul (nejen na proteiny) také bez katalytického působení enzymů. Tato vazba se nazývá glykace [9]. Po mnoho let byla tato reakce zajímavá pouze pro potravinové chemiky, ale v roce 1971 bylo zjištěno, že glykace probíhá v každém živém organismu [10]. Glykace v živých organismech může vést k tvorbě kyslíkových radikálů a toxických a antigenních produktů, které hrají roli v patogenezi různých onemocnění, jako například diabetu, Alzheimerovy choroby, arterosklerózy a ve fyziologickém stárnutí [11]. 13

14 3.2 Separační metody V diplomové práci byly použity elektromigrační metody a afinitní chromatografie. Z elektromigračních metod byla použita elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) a dvourozměrná gelová elektroforéza (2D GE) Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného Metoda SDS-PAGE využívá k separaci nabitých molekul jejich pohybu v elektrickém poli. Jedním z parametrů ovlivňujících průběh separace je prostředí, ve kterém se molekuly pohybují polyakrylamidový gel. Polyakrylamid je polymer vznikající polymerizací N,N'-methylenbisakrylamidu a akrylamidu. Reakci katalyzuje TEMED a peroxodisíran amonný [12]. Tato reakce je na obrázku 11. Obr. 11: Reakce akrylamidu a N,N'-methylenbisakrylamidu za vzniku polyakrylamidu [13] Monomery akrylamidu tvoří lineární řetězce, jež jsou příčně spojeny methylenbisakrylamidem, čímž jsou tvořeny v gelu póry. Gely s vyššími koncentracemi akrylamidu mají menší póry než gely s nižšími koncentracemi akrylamidu [14]. Dodecylsulfát sodný (SDS): SDS je látka, která se používá na přípravu proteinů pro běh elektroforézy. Je to aniontový detergent [15] způsobující disociaci proteinů. Dochází k denaturaci proteinů a ztrátě jejich nativní konformace [16]. Většina proteinů SDS váže v konstantním poměru 1,4 gramu SDS na gram polypeptidového řetězce [17]. Tím, jak získává protein po celé své délce záporný náboj, dochází ke vzájemnému odpuzování SDS molekul, čímž dochází k rozvinutí nativní struktury proteinu a ten získává podobu vlákna. Vazba SDS na protein má dva následky: 1) Ať už byl původní celkový náboj proteinu jakýkoliv, díky velkému množství navázaného SDS nově získaný záporný náboj vysoce převyšuje náboj původní, takže všechny proteiny získají téměř stejně velký náboj na jednotku své hmotnosti. 2) Díky rozvinutí proteinu do vlákna získávají všechny molekuly stejný tvar a způsob, jakým se budou pohybovat polyakrylamidovým gelem bude podobný. Pokud by tomu tak nebylo, proteiny se stejnou hmotností, ale jiným tvarem by se pohybovaly různě a docházelo by ke zhoršení separace. 14

15 Na obrázku 12 je schématicky znázorněn výsledek SDS-PAGE. Vzorek byl nanesen do první jamky (nejvíce vlevo). Výsledkem je gel, na kterém jsou po obarvení patrné proužky, což jsou místa v gelu, ve kterých jsou zachyceny proteiny o stejných hmotnostech (detail je na obrázku 13). Rozlišovací schopnost této metody je omezena v případě analýzy komplexní směsi proteinů, kdy dochází k překrývání pásů proteinů, které mají velice blízkou hmotnost a jsou příliš blízko u sebe [17]. Obrázky 12 a 13: Obr. 12: Řez aparaturou pro 1D-gelovou elektroforézu; vzorek je nanesen pouze do první jamky. Obr 13: Část gelu s pásy rozdělených proteinů. Obr. 12 Obr D Gelová elektroforéza (2D-GE) 2D-GE je separační metoda kombinující dva rozdílné separační postupy. V prvním kroku (první rozměr) je směs proteinů oddělena metodou izoelektrické fokusace (IEF), která využívá pohybu nabitých bílkovin v elektrickém poli na tzv. IPG proužku. V druhém kroku (druhý rozměr) je provedena SDS-PAGE s již separovanými proteiny. Poloha konkrétního proteinu na gelu tak závisí na dvou parametrech a výsledkem je gel, na kterém jsou rozmístěny proteiny po celé jeho ploše. První krok izoelektrická fokusace (IEF): Proteiny mohou, a také většinou mají nenulový celkový náboj, daný součtem všech svých kladných a záporných nábojů. Tento celkový náboj proteinu závisí na počtu jeho kyselých a bazických postranních řetězců aminokyselin, na posttranslačních modifikacích a dalších skupinách, které se na něj mohou vázat, z čehož je zřejmé, že velikost celkového náboje je specifická záležitost. Tento náboj je však také ovlivňován prostředím. Pokud je protein v prostředí s nízkým ph, získává náboj kladný, a naopak, je-li protein v prostředí s vysokým ph, získává náboj záporný. Protein však také může být v prostředí s takovým ph, že celkový náboj proteinu bude nulový, a takové ph je nazýváno izoelektrickým bodem (pi) daného proteinu. Je to právě tato vlastnost, která je využita k separaci proteinů v prvním kroku (prvním rozměru) 2D-GE, ve kterém jsou proteiny rozděleny na základě svých rozdílných pi. Jak IEF funguje: roztok se směsí proteinů je umístěn na proužek s vytvořeným nepohyblivým ph gradientem (IPG strip), a na proužek je přivedeno stejnosměrné napětí. Nabité proteiny poté konají pohyb k opačně nabité elektrodě. Proteiny jsou nabité kladně pokud jsou v prostředí s ph, které je nižší než pi proteinu. Tento protein se v elektrickém poli bude pohybovat k záporně nabité elektrodě (katodě). Obráceně, pokud protein bude v prostředí s vyšším ph než je pi proteinu, bude se pohybovat směrem ke kladně nabité elektrodě (anodě). V místě, kde ph prostředí je rovno pi proteinu, ztratí protein náboj a přestane se pohybovat [14]. Pohyb proteinu na IPG stripu je popsán na obrázku

16 Obr. 14: Fiktivní protein, který má při ph celkový náboj kladný se bude pohybovat směrem ke katodě až do oblasti ph, které je rovno jeho pi. Pokud je tento protein nanesen blízko katody, bude odpuzován do oblasti s nižším ph, neboť má více kyselých postranních řetězců než bazických, a proto má celkový náboj záporný [14]. Druhý krok: Spočívá v následném provedení gelové elektroforézy za použití SDS s již oddělenými proteiny na IPG proužku. Proteiny jsou v tomto kroku odděleny podle svých molekulových hmotností a výsledkem je gel, na kterém jsou rozmístěny proteiny po celé jeho ploše. Na takto vzniklém gelu lze každému proteinu přiřadit určité pi a určitou hmotnost. Na obrázku 15 je ilustrační obrázek 2D gelu membránových proteinů ječmene. Obr. 15: Ilustrační 2D gel membránových proteinů ječmene [18]. Takto vzniklé 2-D mapy proteinů lze využít k porovnání obsahu proteinů zkoumaného vzorku (organely, buňky, tkáně ) v různých časech jeho vývoje, nebo k porovnání obsahu proteinů vzorku za odlišných podmínek například před a po aplikaci léčiv či po vystavení vzorku různým fyzikálním či chemickým vlivům. V nejednodušším případě lze snímky získaných 2D gelů překrýt a zkoumat rozdíly, srovnávání se však téměř vždy provádí pomocí počítačových programů. Metoda 2-D GE patří mezi oblíbené separační metody, protože díky rozdělení polypeptidové směsi na základě dvou odlišných parametrů lze od sebe oddělit proteiny i z velice komplexních směsí. Na jediném gelu lze rozlišit až 2000 proteinů [17], což je množství dostačující k zahrnutí většiny proteinů například u bakterií. Mezi nevýhody patří časová náročnost a náročnost na manuální zručnost. 16

17 3.2.3 Afinitní chromatografie (AC) Další použitou separační metodou je afinitní chromatografie, což je typ kapalinové chromatografie. Metoda využívá schopnosti proteinů tvořit vysoce specifické komplexy s jinými molekulami. Tvorba těchto komplexů mezi proteinem a příslušnou molekulou ligandem je specifická, stabilní a reverzibilní [19]. Jako ligand může sloužit molekula nízko- či vysokomolekulární, anorganického či organického charakteru, která je uchycená (imobilizovaná) na nosiči - sorbentu. Ligand má dvě vazebná místa (tzv. heterobifunkční ligand), jedním se váže na nosič sorbent a na druhé místo se váže specificky protein. Důležitá je disociační konstanta reakce mezi ligandem a proteinem. Je-li její hodnota příliš vysoká, afinitní reakce nemusí proběhnout. Je-li hodnota disociační konstanty naopak příliš nízká, podmínky potřebné k disociaci komplexu na původní složky mohou denaturovat danou bílkovinu [20]. Jak afinitní chromatografie funguje: sorbent s navázaným ligandem je vložen do chromatografické kolony. Vzorek s proteiny je nanesen na kolonu. Při průchodu vzorku kolonou se protein s afinitou k použitému ligandu na tento ligand nekovalentně váže. Po promytí kolony promývacím pufrem jsou odstraněny nenavázané proteiny. Následně je kolona promyta tzv. elučním pufrem, který způsobí uvolnění navázaného proteinu z ligandu do elučního pufru. Tento eluát je zachycen a proteiny mohou být podrobeny další analýze. Předpokladem pro úspěšnou separaci je neuvolňování ligandu ze sorbentu při promývání kolony elučním pufrem. Princip fungování afinitní chromatografie je ukázán na obrázku 16. Obr. 16: Princip fungování afinitní chromatografie [20]. 17

18 V tabulce 2 jsou uvedeny některé častěji používané páry protein-ligand. Protein Polyklonální protilátka Monoklonální protilátka Avidin Lektin Vazebný protein Enzym Enzym Ligand antigen antigen biotin sacharid hormon, toxin substrát inhibitor Tabulka 2: Přehled často používaných párů protein-ligand [20] Účelem použití afinitní chromatografie v diplomové práci bylo separovat glykoproteiny. K tomu jsou využívány lektiny a některé významné lektiny jsou uvedeny v tabulce 3. Sacharidový zbytek D-N-acetyl galaktosamin α-d-galaktóza β-d-galaktóza α-d-glukóza α-d-manóza Interagující lektin Lektin 60 z Ricinus communis Lektin ze sojového bobu Fytohemagltinin E4 Fytohemagltinin L4 Jacalin Lektin z podzemnice olejné Lektin ze sojového bobu Lektin 60 a 120 z Ricinus communis Konkanavalin A Lektin z čočky Lektin z hrachu Konkanavalin A lektin z čočky lektin z hrachu Tabulka 3: Příklady lektinů vázajících sacharidové zbytky [21] Lektinem použitým v diplomové práci byl konkanavalin A. Jedná se o jeden z nejpoužívanějších lektinů vůbec. Konkanavalin A pochází z rostliny Canavalia ensiformis patřící do čeledi bobovitých. V oblasti glykoproteomiky je používán pro selektivní zachycení N-glykoproteinů manosového a komplexního typu [22], [23]. 18

19 3.3 Hmotnostní spektrometrie (MS) Historie a uplatnění v proteomice První plně funkční hmotnostní spektrometr byl sestrojen v roce 1919 Francisem W. Astonem, který v roce 1922 obdržel Nobelovu cenu za objev izotopů neradioaktivních prvků [24], a který navazoval na práci svého učitele Josepha J. Thomsona [25]. Na počátku druhé poloviny 50. let byl průletový hmotnostní analyzátor (TOF) použit jako detektor plynového chromatografu [26], což vedlo k výraznému urychlení detekce molekul. Přelomem pro biologické vědy byly objevy v 80. letech, které poprvé umožnily detekci biomolekul a velkých organických molekul. Prvním z nich byl objev ionizace laserovou desorpcí za účasti matrice (MALDI). Za vývojem této metody v roce 1987 stojí dva týmy vedené Fr. Hillenkampem a M. Karasem (používali organickou matrici na pevném povrchu) [27] a K. Tanakou (používal kovový prášek v kapalné matrici), který byl schopen ionizovat karboxypeptidázu-a, což je protein o velikosti zhruba 34,5 kda [28]. Neméně důležitou technikou pro ionizaci velkých makromolekul byl objev ionizace elektrosprejem (ESI) učiněný týmem vedeným Johnem B. Fennem [29]. Za tyto důležité objevy byla v roce 2002 K. Tanakovi a J. Fennovi udělena Nobelova cena v oboru chemie [30]. Jsou to právě tyto objevy díky kterým bylo možné pomýšlet na studium proteomů. Také dnes dochází v oblasti hmotnostní spektrometrie k neustálému zlepšování starých metod a vývoji nových technologií, čímž lze do budoucna počítat se zvyšováním citlivosti detekce, rozlišení a rychlosti měření Princip fungování Hmotnostní spektrometrie je založena na rozdělení iontů podle jejich efektivních hmotností - poměru m/z (m hmotnost iontu, z náboj iontu), čehož je dosaženo pohybem iontů, podle typu spektrometru, v magnetickém, elektrickém nebo kombinovaném poli. Tyto ionty dopadají na detektor hmotnostního spektrometru a je získáno hmotnostní spektrum daného vzorku [31]. Hmotnostní spektrometr se skládá ze tří základních částí: části ve které probíhá ionizace vzorku, analyzátoru, ve kterém jsou molekuly rozděleny na základě efektivních hmotností a detektoru. V diplomové práci bylo měření prováděno na přístroji, jež k ionizaci používá metody na principu MALDI, a k rozdělení ionizovaných molekul používá TOF (time-of-flight) analyzátor, neboli průletový hmotnostní analyzátor MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) MALDI je metoda ionizace molekul. Vzorek je rozpuštěn v roztoku obsahujícím tzv. matrici v poměru koncentrací [32] asi 1:104 a nanesen na speciální destičku. Jako matrice je obvykle použita slabá organická kyselina velice dobře pohlcující světlo o určité vlnové délce. Před analýzou je směs vysušena a dochází k tvorbě krystalků vzorku s matricí tak, že molekuly vzorku, například proteinu, jsou obklopeny molekulami matrice a tyto molekuly proteinu jsou tak navzájem izolovány [33]. (Samotné měření probíhá uvnitř přístroje ve vakuu, aby se zabránilo srážkám iontu s molekulami vzduchu a následným fragmentacím). Vzorek s matricí je ozářen krátkým pulsem laseru. Matrice toto záření silně absorbuje a dochází k jejímu vypařování. Při desorpci matrice dochází zároveň i k uvolňování molekul vzorku do plynné fáze. Matrice zároveň funguje i jako ionizační činidlo, je schopna protonovat či deprotonovat molekuly vzorku [33]. Výsledkem ionizace molekul vzorku je nejčastěji vznik protonovaného iontu, na který byl přenesen jeden proton. Tento ion se formálně označuje [MH]+, kde M značí molekulu vzorku, např. proteinu. Proces vzniku iontu je znázorněn na obrázku

20 Obr. 17: Molekuly matrice absorbují energii laseru a dochází k desorpci matrice z povrchu. Tím se uvolňují i molekuly vzorku, které jsou zároveň protonovány matricí [33] Na rozdíl od ostatních ionizačních metod využívajících laser, dochází u MALDI k významnému snížení tvorby klastrů ( slepenců ) molekul vzorku. To je dáno tím, že molekuly matrice jsou ve velkém přebytku vzhledem k molekulám vzorku a zabraňují tak kontaktu mezi molekulami vzorku a následné formaci klastrů. Oproti jiným způsobům ionizace také odpadá nutnost měnit vlnovou délku laseru pro rozdílné molekuly analytu, neboť energii laseru absorbuje matrice. Protože celý proces ionizace není závislý na velikosti a absorpčních vlastnostech analyzované látky, lze pomocí MALDI měřit i molekuly s hmotnostmi vyššími, než je 100 kda. Jelikož jsou získaná spektra jednoduchá, lze analyzovat i komplexní směsi [33] Průletový hmotnostní analyzátor (TOF) Návrh konstrukce TOF analyzátoru byl poprvé popsán v roce 1946, v roce 1955 byl zveřejněn návrh TOF hmotnostního spektrometru, který se stal později komerčně dostupným. Koncem 80. let 20. století došlo k rozvoji elektroniky umožňující nakládání s velkým objemem dat vzniklých při měření a jako klíčový se ukázal být objev MALDI v roce TOF analyzátor bývá často spojován právě se zdrojem ionizace MALDI, neboť pulzní laser používaný v MALDI je pro spojení s TOF analyzátorem ideální. Použití pulzního laseru totiž umožňuje přesně určit okamžik vzniku iontu. Princip fungování: Po vytvoření iontů vzorku pomocí MALDI se tyto ionty ocitnou v elektrostatickém poli, nacházejícím se mezi destičkou a uzemněnou mřížkou. V této oblasti dochází k urychlení iontů, a protože velká většina molekul má stejně velký náboj (MH+ - tedy jeden kladný náboj), i síla působící na tyto molekuly je stejně velká a molekuly získají stejnou kinetickou energii. Molekuly lišící se svými hmotnostmi získají ale rozdílnou rychlost a těžší molekuly budou mít rychlost nižší. Následně ionty vstupují do evakuované letové trubice, kde na ně nepůsobí žádné silové pole. Tam dochází k jejich rozdělení na základě jejich získaných rychlostí a na závěr dojde k detekci molekul na detektoru. Celkový náboj molekuly označme jako q, kde celkový náboj je daný počtem nábojů a velikosti elementárního náboje, tedy q = z.e; napětí mezi elektrodami v urychlovací oblasti označme jako U a délku letové trubice jako L. Dobu, za kterou urazí ion vzdálenost mezi počátkem letové trubice a detektorem označíme jako t a hmotnost molekuly jako m. Kinetickou energii iontu můžeme pak 1 2 vyjádřit takto: E k = mv ; pokud Ek vyjádříme jako Ek = Uq a rovnici upravíme, pro rychlost 2 20

21 2Uze. Čas, za který urazí ion vzdálenost L můžeme také vyjádřit m L m L2 pomocí rychlosti ze vztahu t =. Potom získáme výraz t 2=. Členy v závorce jsou v z 2Ue konstantní hodnoty, takže TOF analyzátor měří čas t, pomocí kterého je vypočtena efektivní hmotnost m/z [33]. molekuly získáme vztah v= Naměřené hmotnostní spektrum vypadá obecně takto: Na ose x jsou vyneseny efektivní hmotnosti m/z, osa y zachycuje množství detekovaných molekul viz. obrázek 18. Obr. 18: Na ose x jsou vyneseny hodnoty m/z. Výška píku je úměrná počtu detekovaných molekul. Nejvyššímu je přiřazena hodnota 100 %. Průletové hmotnostní analyzátory se vyznačují velkým rozsahem detekovatelných hmotností analytu, zhruba do cca 1 MDa. Existují dvě základní uspořádání TOF analyzátorů, lineární a reflektronové. Lineární uspořádání: Urychlené ionty jsou detekovány na konci přímého letu. Toto uspořádání se vyznačuje vysokou citlivostí, rozlišení je však omezeno nepříznivou šířkou signálu iontu. To je dáno rozptylem počáteční kinetické energie jednotlivých iontů způsobující zhoršení rozlišení u velkých molekulových iontů o hmotnostech vyšších než 10 4 Da. Pro zlepšení rozlišení se používá reflektronového uspořádání [32]. Reflektronové uspořádání: Reflektronové uspořádání využívá iontového zrcadla, které přilétající ionty selektivně zpomaluje (rychlejší ionty jsou zadrženy déle) a následně odráží a urychluje ke zpátečnímu letu k excentricky umístěnému detektoru. Tímto je výrazně korigován počáteční rozptyl iontů, čímž dojde ke zlepšení rozlišení hmotnostních spekter [32]. 21

22 Pulzní zpožděná extrakce iontů: Tato metoda se používá také ke zlepšení rozlišení výsledných spekter. Funguje tak, že elektrické urychlovací pole je zapnuto až po určité době po záblesku laseru a tím i desorpci analytu. Tato doba se pohybuje od stovek nanosekund do několika mikrosekund. Podobně jako u použití reflektronu touto metodou dochází k vyrovnání rychlostí iontů ze stejnými m/z ale jinou Ek, čímž se zmenšuje časová prodleva mezi jejich detekcí [33] Tandemový hmotnostní analyzátor TOF/TOF TOF/TOF analyzátor se sestává ze dvou TOF analyzátorů, mezi kterými je umístěna kolizní cela. Po desorpci analytu je do kolizní cely vpuštěna pouze molekula o žádaném poměru m/z. V kolizní cele dochází ke srážkám molekul vzorku s molekulami plynu, například N 2, čímž dochází k fragmentaci molekul vzorku. Po určité době jsou tyto fragmenty vypuštěny z kolizní cely do druhého TOF analyzátoru, ve kterém dochází k rozdělení fragmentů dle jejich m/z. Schéma TOF/TOF analyzátoru je na obrázku 19. Obr. 19: Schéma přístroje Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer [34] Matrice Výběr správné matrice patří mezi nejdůležitější kroky při MALDI-TOF MS analýzách, na kterém velmi závisí kvalita získaných výsledků. Matrice musí dobře absorbovat světlo laseru, musí mít dostatečně malou hmotnost, aby mohlo dojít k její sublimaci, musí být stabilní ve vakuu, musí dobře přenášet energii na analyt, ionizovat jej a její rozpustnost musí být kompatibilní s rozpustností analyzované látky. Hledání vhodné matrice je tedy složitý postup, a hledání optimálních podmínek je nutné provádět empiricky. V potaz je třeba brát vlnovou délku laseru přístroje, dále je při výběru matrice nutné věnovat pozornost možným interferencím, jako je například tvorba matricových klastrů a interakcím matrice s molekulami vzorku [33]. Níže je uveden přehled matricí nejčastěji používaných při analýze proteinů: 22

23 Kyselina 4-hydroxy-α-kyanoskořicová (CHCA): CHCA (obr. 20) je vhodná pro měření peptidů a proteinů o hmotnostech menších než Da. Pro měření proteinů je matrice rozpouštěna v roztoku kyseliny trifluoroctové (TFA) a acetonitrilu (ACN) [35], pro analýzu hydrofobních proteinů [36] je vhodné matrici smíchat s roztokem kyseliny mravenčí. Obr. 20: Kyselina 4-hydroxy-α-kyanoskořicová Kyselina 2,5-dihydroxybenzoová (DHB): DHB (obr. 21) je využívaná při analýze rozpustných proteinů, glykoproteinů, peptidů, fosfopeptidů a glykopeptidů. Při měření spekter fosfopeptidů je matrice rozpouštěna v roztoku ACN s kyselinou fosfatidovou, v ostatních případech je matrice smíchávána s roztokem TFA a ACN [35]. Tato matrice se vyznačuje tím, že i relativně vysoká množství organických i anorganických nečistot neovlivňují analýzu [37]. Obr. 21: Kyselina 2,5-dihydroxybenzoová Kyselina 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová (kyselina sinapová SA): SA (obr. 22) se používá pro analýzu proteinů a peptidů [38] a podobně jako DHB, ani při použití této matrice organické ani anorganické čistoty výrazně neovlivňují analýzu [37]. Obr. 22: Kyselina sinapová Identifikace proteinů metodou peptidového mapování Princip fungování metody peptidového mapování (neboli Peptide Mass Fingerprinting; PMF) je následující: zkoumaný protein je chemicky nebo enzymaticky štěpen na peptidy tak, aby štěpení nebylo náhodné, ale proběhlo na specifických místech. Poté jsou změřena hmotnostní spektra těchto peptidů. Hmotnosti peptidů získaných z naměřených spekter jsou porovnány s hmotnostmi virtuálních peptidů, získanými teoretickým štěpením aminokyselinových sekvencí proteinů uložených v počítačových databázích. Pomocí těchto údajů je vygenerován seznam proteinů, jejichž hmotnosti teoretických peptidů se shodují s hmotnostmi naměřenými. Každému proteinu je přiřazeno tzv. skóre, které závisí na počtu shodujících se peptidů. Zkoumanému proteinu je pak přiřazena identita proteinu s nejvyšším skóre. Metoda PMF byla první praktickou metodou použitou k identifikaci metodou pomocí MS [39]. Tato metoda je velice populární, neboť k identifikaci stačí relativně malý počet hmotností peptidů [40]. 23

24 3.3.8 Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) Důvodem pro selhání PMF je složitost peptidové směsi v enzymovém digestu, kdy k jednoznačné identifikaci proteinu malý počet specifických peptidů nemusí stačit. Mimo specifické peptidy mohou být ve směsi přítomny i peptidy nespecifické, vznikajících při autolýze štěpícího enzymu, peptidy keratinů a jiných příměsí. Proto od roku 2006 nejvýznamnější proteomické časopisy identifikace proteinů založených pouze na PMF až na výjimky nepublikují [41]. Metoda tandemové MS funguje následovně: Ze směsi naštěpených peptidů je vybrán jeden peptid takzvaný rodičovský ion, který je za použití TOF/TOF analyzátoru izolován v 1. TOF analyzátoru. Tomuto rodičovskému iontu je v kolizní cele dodána energie, která způsobí rozštěpení peptidu na kratší řetězce takzvané dceřinné ionty. Na obrázku 23 je zobrazeno schéma tohoto postupu: Obr. 23: Schéma rozdílu mezi MS a MS/MS hmotnostní spektrometrií [42]. MS: Na detektor dopadají původní ionty vzniklé při ozáření vzorku laserem. Horní obrázek. MS/MS: Do kolizní cely je prvním analyzátorem vpuštěn pouze vybraný rodičovský ion o požadované hmotnosti. Tento ion je v cele fragmentován a takto vzniklé dceřinné ionty jsou detekovány na detektoru. Způsob, jakým fragmenty vznikají, závisí na mnoha faktorech jako je primární struktura proteinu, způsob jakým energie byla předána, počet nábojů peptidového iontu či množství vnitřní energie peptidu [43]. Peptidy podléhají primárně fragmentacím podél peptidového řetězce a ve většině případů je štěpena peptidová vazba. Po rozštěpení peptidu vznikají dva fragmenty a podle toho, který fragment nese náboj, je tento fragment označován jako N- či C- koncový typ iontu. Nomenklaturou fragmentů a,b,c a x,y,z na obrázku 24 se popisuje, kde v (poly)peptidovém řetězci došlo k fragmentaci. Obr. 24: Názvy fragmentů vznikajících při štěpení peptidu [42] 24

25 3.4 Ječmen Systematika ječmene Ječmen patří svým botanickým zařazením [44] do: Říše: Rostliny (Plantae) Podříše: Cévnaté rostliny (Tracheobionta) Oddělení: Krytosemenné (Magnoliophyta) Třída: Jednoděložné (Liliopsida) Řád: Šáchorotvaré (Cyperales) Čeleď: Lipnicovité (Poaceae) Rod: Ječmen (Hordeum) Ječmeny se dělí na ječmeny plané a ječmeny seté. V České republice je nejrozšířenějším planým ječmenem ječmen myší. Ječmen setý Hordeum Sativum - se dělí ještě na ječmeny dvouřadé a ječmeny víceřadé. Dvouřadé ječmeny lze ještě dále rozdělit do tří skupin: ječmeny nící, ječmeny vzpřímené a ječmeny paví. Hlavní skupinu sladovnických ječmenů tvoří ječmeny nící Hordeum vulgare var. Nutans [45] Historie a rozšíření Ječmen patří mezi nejstarší zemědělské plodiny na světě. Archeologické nálezy z oblasti tzv. úrodného půlměsíce u Mrtvého moře potvrzují, že ječmen a oves byly v této oblasti zhruba před lety před naším letopočtem s velkou pravděpodobností vůbec prvními domestikovanými plodinami v této oblasti [46], [47]. Velké oblibě se ječmen těšil také ve starověkém Egyptě, kde byl používán jako surovina pro výrobu piva i při přípravě jídla [48]. Záznamy o využívání ječmene jako důležité zemědělské plodiny pochází také ze Sýrie, Mezopotámie, Palestiny, z oblasti malé Asie, Etiopie, Řecka, Říma a dokonce britských ostrovů a Skandinávie. Postupem času se ječmen obchodem dostal i do Číny, Japonska, Indie a Tibetu [49]. Ječmen byl však postupně vytlačován jinými plodinami, hlavně pšenicí, žitem a ovšem [50]. Dnes je ječmen podle sklizeného množství čtvrtou nejvíce pěstovanou obilninou na světě a v České republice mu po pšenici patří druhé místo [51] (údaje z roku 2007) Morfologický popis Stavba ječmene je popsána na obrázku 25: Obr. 25: Stavba ječmene [45] a) b) c) d) e) f) g) h) zárodečné kořínky adventivní kořínky odnožovací kolénko oddénkový článek koleoptile hlavní stéblo odnož klas 25

26 Kořenová soustava: Ječmen vytváří z našich obilovin nejvyšší počet zárodečných kořínků: 4 10, nejčastěji 5 6. Stéblo: Je složeno ze 4 8 článků (internodií) oddělených koleny a dorůstá cm délky. Listy: Jsou postaveny ve dvou řadách nad sebou. Na velikosti plochy listů a stébla je závislý výnos. Květ: Květenství, tzv. nevětvený klas se tvoří z vřetena klasu porostlého na hranách chloupky. Květenství: Květenstvím ječmene je složený klas. Květ je chráněn pluchou a pluškou. Obilka: Obilka (zrno) je složena ze tří částí: obalu, zárodku a endospermu. Obalovou vrstvou na hřbetní straně je plucha, na břišní straně pluška. Zárodek je latentní formou, ze které po hydrataci vyroste nová rostlina. Endosperm tvoří největší část obilky. Svrchní vrstva, tzv. aleuronová, je složena z hranolových buněk obsahujících bílkoviny, tuk a částečně i škrobová zrna. Při dosažení podmínek pro dosažení klíčení je aleuronová vrstva aktivována růstovými regulátory hormony. Vnitřní endosperm tvoří tenkostěnné buňky, ve kterých je uložen zásobní škrob. Poměr obsahu škrobu k obsahu dusíkatých látek určuje povahu endospermu tzv. moučnatost nebo sklovitost endospermu [45]. 26

27 3.5 Pivo Historie Pivo je oblíbeným a rozšířeným alkoholickým nápojem. První historické záznamy o výrobě piva pocházejí z Babylónské říše někdy před 8 tisíci lety [52]. Nesloužilo pouze jako nápoj, ale v mnoha kulturách bylo důležitým doplňkem stravy [53]. I když se díky moderním technologickým postupům a novým poznatkům z oblasti chemie dosahuje úspornějšího využití surovin a větší kontroly nad procesy při výrobě, principy výroby zůstávají stále stejné Suroviny Základní suroviny pro výrobu piva jsou: 1) 2) 3) 4) Voda Pivovarnické kvasnice Chmel Slad Voda Voda tvoří kolem 90 % obsahu piva, tudíž složení varní vody má vliv na konečný výsledek. Podle charakteru zdroje vody musí pivovary vodu vhodným způsobem upravovat, také musí zajistit mikrobiologickou nezávadnost použité vody. Důležitý je také obsah iontů, protože během rmutování a chmelovaru látky přecházející do mladiny interagují s ionty vody. Iontové složení ovlivňuje ph roztoku sladiny a mladiny. Ionty mohou mít vliv na přepěňování piva a ovlivňují funkci enzymů [45] Kvasnice V pivovarnictví jsou kvasnice tedy kvasinky (Saccharomyces cerevisiae) využívány pro svou schopnost přeměňovat zkvasitelné cukry na alkohol a oxid uhličitý za účasti řady enzymů a koenzymů. Metabolismus kvasinek souvisí s mnoha složkami mladiny a vzniká při tom široké spektrum vedlejších produktů ovlivňujících charakter hotového piva. Do vynálezu chlazení v polovině 19. století byla pivovarská výroba výhradně spjata s kvasinkami svrchního kvašení. Ty jsou dnes využívány k výrobě typu piva ale, porter a stout, druh pivovarských kvasinek spodního kvašení slouží pro výrobu piva plzeňského typu [45] Chmel Je představován usušenými chmelovými hlávkami samičích rostlin chmele evropského. Poskytuje pivu typickou hořkou chuť, přispívá k tvorbě charakteristického aroma a má další technologicky důležité vlastnosti. V České republice se pěstuje chmel na vysoké úrovni a velká část z celkové produkce se vyváží téměř do celého světa. Systematickým zařazením patří chmel do čeledě rostlin konopovitých. Má tři druhy, z nichž první, chmel otáčivý, zahrnuje poddruh chmel evropský, který se pěstuje v mnoha odrůdách pro pivovarské účely. Je rozšířen jako rostlina vytrvalá v mírném pásu obou polokoulí a v plné plodnosti vydrží až přes 25 let. Chmel je rostlina dvoudomá, tj. květy samčí i samičí jsou na různých rostlinách. K pivovarským účelům se pěstují pouze rostliny samičí. Chmelové hlávky, které se sklízejí pro pivovarské účely, se skládají ze stopky, vřeténka, pravých a krycích listenů a při oplození obsahují navíc semeno neboli pecku. Na vnitřní straně listenů se při zrání chmele vylučují pryskyřičná zrnka lupulinu, obsahující chmelové pryskyřice a silice, pivovarsky nejcennější složky chmele [45]. 27

28 Slad Slad je vyráběn procesem sladování. Cílem sladování je přeměnit ječmen na slad bohatý na enzymy a extrakt a to za minimálních nákladů a ztrát. Nejběžněji vyráběnými druhy sladů v České republice jsou světlý slad a bavorský slad. Ostatní druhy sladů jsou v našich zemích vyráběny pouze v malých množstvích pro speciální účely. Světlý slad slouží k výrobě světlého, lehkého a speciálního piva. Bavorský slad je charakteristický vysokou barvou a výraznějším aromatem, čehož se dosáhne výrazně hlubším rozluštěním při klíčení. Proces výroby sladu, prováděný ve sladovnách, lze z hlediska jednotlivých výrobních fází rozdělit na tři úseky: máčení, klíčení a hvozdění. Máčení: Cílem máčení je zvýšit řízeným způsobem obsah vody v zrnu pro zahájení enzymatických reakcí a pro klíčení zrna při únosné spotřebě vody, odstranit splavky a lehké nečistoty, umýt zrno a ze zrna vyloužit nežádoucí látky. Máčení je dnes považováno za nejdůležitější úsek výroby sladu, který rozhoduje o jeho budoucí kvalitě. V dobře uskladněném ječmeni je činnost enzymů, důležitých při sladování, výrazně utlumena, některé enzymy jsou syntetizovány později. Zvýšení obsahu vody v zrně vede k zahájení projevů života ke klíčení [45]. Klíčení ječmene: Rezervní látky, obsažené v zrně, jsou při skladování a před zahájením sladovacího procesu ve stabilní, vysokomolekulární formě. Následným transportem a činností enzymů pomocí vody dojde k jejich odbourání (rozluštění) na rozpustné nízkomolekulární produkty. Tato druhá hlavní fáze výroby sladu se nazývá klíčení. Výsledným produktem klíčení je tzv. zelený slad. Zelený slad má vysoký obsah vody a není na rozdíl od hotového sladu skladovatelný. Cílem sladařského klíčení je aktivace a syntéza enzymů, a docílení požadovaného rozluštění (vnitřní přeměny) zrna při minimálních nákladech a únosných sladovacích ztrátách. Při klíčení se snižuje obsah škrobu a zvyšuje se obsah nízkomolekulárních sacharidů [45]. Ze sladařského hlediska se za nejdůležitější dají označit enzymy třídy hydrolas, které lze rozdělit do čtyř skupin: cytolytické enzymy, proteolytické enzymy, fosfatasy, amylasy a třídy oxidoreduktas. V pivovarském procesu mají vedoucí úlohu hydrolasy, a to především ve varním procesu. Ostatní třídy enzymů se ve větší míře uplatňují při kvašení. Na hydrolýze škrobu, glykogenu a dalších polysacharidů se podílejí tzv. amylasy. Z amolytických enzymů jsou to α-amylasa a β-amylasa. Uvedené enzymy mají v technologii výroby piva základní význam především v procesu rmutování. Tyto enzymy štěpí škrob, a tím se podílejí na obsahu zkvasitelných sacharidů ve sladině. Obsah amylas je odrůdovou závislostí a je rovněž ovlivněn klimatickými podmínkami ročníku [45]. Hvozdění: Poslední fází výroby sladu je hvozdění. Zelený slad je na hvozdě nejprve předsušen při teplotách do 60 C, následně pak vyhřát a dotažen při teplotách od 80 do 105 C. Cílem hvozdění je převést zelený sklad s vysokým obsahem vody do skladovatelného a stabilního stavu, zastavit životní a luštící pochody v zrně a vytvořit aromatické a barevné látky, charakteristické pro daný druh sladu za minimálních nákladů a ztrát. Při hvozdění probíhají ve sladu hluboké fyzikální a chemické změny, které závisí na tom, při jakých teplotách, při jakém obsahu vody a jakou rychlostí dochází k odsoušení vody [45]. 28

29 3.6 Úvod do proteomiky Definice proteomiky Proteomika je obor systematicky se zabývající analýzou bílkovin z hlediska jejich identity, množství a funkcí. Název proteomika úzce souvisí s výrazem proteom. Slovo proteom je zkratka pro protein complement of the genome, tedy soubor proteinů, vzniklý exprimací souboru genů genomu [54]. Zkoumat lze samozřejmě nejen proteom celého organismu, ale i proteomy jednotlivých buňek a tkání. Na rozdíl od genomu, u kterého nedochází během života k výrazným změnám, se proteom každým okamžikem mění. Množství jednotlivých druhů proteinů v organismu není stálé, závisí na stáří, mění se při adaptacích na změny vnějšího prostředí či během nemoci. Tyto faktory ovlivňují syntézu i degradaci těchto bílkovin. Jelikož se bílkoviny účastní téměř všech buněčných funkcí, proteomika skrývá potenciál ozřejmit fungování a složení komplexních biologických systémů na molekulární úrovni. Tyto znalosti by pak mohly být využity k léčbě dosud nevyléčitelných chorob [55] Cíle proteomiky Studium proteomu skýtá obrovské množství příležitostí pro výzkum, proto i cíle výzkumu tohoto vědního oboru mohou být velice odlišné. Značné úsilí bylo zejména v minulosti věnováno snaze zjistit identitu všech proteinů exprimovaných konkrétním organismem. Tohoto cíle však nebylo pro žádný organismus dosaženo. Jedním z důvodů je velké množství různých proteinů, které daný genom kóduje. Tyto proteiny však mohou být dále různě upraveny, přičemž těmto úpravám podléhá většina proteinů a u některých proteinů bylo zjištěno až 1000 těchto modifikací [56]. Mezi ně patří mnoho druhů posttranslačních úprav jako jsou glykosylace, fosforylace a jiné. Jenom těchto posttranslačních úprav bylo objeveno kolem dvou set [57]. Další překážkou je široké rozmezí koncentrací proteinů obsažených v buňkách. Například u kvasinek [58] může být některý protein v nadbytku k jinému proteinu v 105 až 106 násobném množství, v lidském séru může být rozdíl v koncentracích až Proteiny zastoupené ve velkém množstvím maskují proteiny s nižší koncentrací. Problematické je také zkoumání membránových proteinů, které tvoří až 30 % všech proteinů v buňce, tyto proteiny se totiž špatně rozpouštějí [59]. Přes všechna tato úskalí však snahy o identifikaci kompletního souboru proteinů organismu nekončí. V roce 2001 byla založena organizace HUPO (The Human Proteome Organisation), která si za cíl klade zmapovat lidský proteom. Proteomika nalézá uplatnění v celé řadě oblastí výzkumu, například ve studování proteinových komplexů [60], při studiu signálních cest důležitých při vzniku nádorů nebo při studiu cystické fibrózy [60]. Proteomické postupy mohou být využity také v mikrobiologii, kdy je pomocí identifikace virulentních faktorů možno odhalit molekulární mechanismy patogenicity. Často jsou porovnávány proteiny příbuzných patogenních a nepatogenních bakterií, čehož bylo využito ke studiu původce tuberkulózy Mycobacterium tuberculosis [61]. Mnoho pozornosti je věnováno proteinovým biomarkerům, jejichž detekce by umožnila rychlejší odhalení různých chorob. Detekce biomarkerů se také používá k odhalení změn vyvolaných například toxicitou nových léčiv dříve, než se tyto změny projeví morfologicky [62]. Významné je i využití proteomiky v oblasti studia rostlin. Příkladem je analýza proteinového složení potravin [54], studium symbiózy mezi hospodářsky významnou luštěninou a mikroorganismem [63], detekce polypeptidů indukovaných v rýži ve slaném prostředí [64] či studium odezvy rostlin na přítomnost těžkých kovů v půdě způsobené znečišťováním životního prostředí [65]. Někteří vědci předpovídají, že s rostoucími znalostmi o funkčních a regulačních buněčných systémech bude možné modelovat velice komplexní biologické systémy. 29

30 3.6.3 Přístupy k proteomickému studiu Jak již bylo řečeno, svým rozsahem umožňuje proteomika studovat velké množství vlastností proteinů a jejich vzájemnou provázanost. Proto existuje také celá řada rozdílných přístupů k proteomickému studiu. Tyto přístupy se liší použitou metodologií, mají různé cíle a slouží k rozdílným účelům. Zde je přehled těch nejčastěji používaných [55]: Analytická proteomika: Je založena na separaci proteinů ze složitých biologických směsí, následné analýze těchto proteinů pomocí MS a nakonec bioinformatickém zpracování získaných údajů. Důraz je kladen na identifikaci proteinů, určení jejich molekulových hmotností, stanovení primární sekvence aminokyselin a určení posttranslačních modifikací. Strukturní proteomika: Jejím cílem je studium struktury bílkovin a pochopení tvorby a stability nativní konformace. Hojně využívanými technikami jsou krystalografie, NMR, MS a jiné. Tyto poznatky jsou dále využívány v proteinovém inženýrství modifikacemi průmyslových enzymů nebo za účelem vývoje nových léků. Funkční proteomika: Zabývá se kromě studia funkcí konkrétních bílkoviny zejména studiem komplexních životních procesů. To je důležité pro pochopení vývoje organismu a léčbu nemocí. Diferenční proteomika: Porovnává proteinová složení organismu při různých stavech například zdravý a patologický stav. Snahou je nalézt a posléze identifikovat bílkoviny, které jsou charakteristické pouze pro konkrétní stav. High-throughput proteomika: Jedná se o co nejrychlejší získání velkého množství údajů o proteinech. Používá se zejména při screeningových účelech ve zdravotnictví, zemědělství či při kontrole potravin. High-coverage proteomika: Zaměřuje se na stanovení co nejvyššího počtu aminokyselinových zbytků v bílkovině a určení posttranslačních modifikací. Těchto informací využívají ostatní obory proteomiky. Bottom-up proteomika: Tento přístup se dá označit za klasický postup identifikace bílkovin. Nejprve je daná bílkovina izolována ze směsi, poté je rozštěpena pomocí enzymu na směs peptidů a nakonec je určena její identita, molekulová hmotnost a případně sekvence pomocí MS. Ke štěpení se používají enzymy, specifické místem štěpení, často používaným je trypsin. Shotgun proteomika: Jedná se o obecný postup identifikace bílkovin, kdy je enzymově naštěpena neseparovaná směs bílkovin na směs peptidů. Tato směs peptidů je dále separována vhodnou metodou (například HPLC) a poté sekvenována tandemovou hmotnostní spektrometrií. Pro štěpení jsou využívány i nespecifické enzymy, například proteinasa K. Top-down proteomika: Používá postup, kdy je daná bílkovina nejprve izolována ze směsi, a poté je charakterizována. Snaha je fragmentovat bílkovinu až v hmotnostním spektrometru. Tímto postupem lze rychle získat informace o molekulové hmotnosti, sekvenci aminokyselin a posttranslačních modifikacích. 30

31 3.7 Přehled proteinů obsažených v ječmeni Proteiny tvoří 8-13,5 % obsahu zrna ječmene [66]. Dají se rozdělit na základě různých vlastností. Podle molekulární hmotnosti můžeme dělit proteiny na vysokomolekulární (HMW high molecular weight) a nízkomolekulární (LMW - low molecular weight). Jako vysokomolekulární jsou označovány proteiny mezi 35 a 50 kda, jako nízkomolekulární pak proteiny s molekulární hmotností mezi 5 až 15 kda. Dále mohou být děleny podle morfologického původu na proteiny aleuronové vrstvy, endospermu a embrya. Mezi velice používané patří dělení rostlinných proteinů podle jejich rozpustnosti v různých činidlech [67]. Podle tohoto systému lze proteiny rozdělit do čtyř skupin: 1) Albuminy: Rozpustné ve vodě. Patří mezi ně většina enzymatických proteinů. Představují 4 % všech bílkovin v ječmeni [45]. 2) Globuliny: Jsou rozpustné v roztocích solí. Tvoří asi 18 % celkového obsahu proteinů ječmene [45]. 3) Prolaminy (hordeiny): jsou rozpustné ve vodných roztocích ethanolu. Patří mezi ně mnoho zásobních proteinů. Lokalizovány jsou do aleuronové vrstvy [45]. 4) Gluteliny: jsou rozpustné v alkalických nebo kyselých roztocích a v detergentech. Patří mezi ně mnoho strukturních proteinů. Tvoří asi 32 % obsahu ječmene. Nacházejí se převážně v aleuronové vrstvě [45]. Některé z ječných proteinů přecházejí do piva, kde mohou ovlivňovat například pěnivost a stabilitu pěny piva [68] nebo hrát úlohu při tvorbě pivního zákalu [69], [66]. Nezbytné pro výrobu piva jsou enzymy štěpící zásobní látky ječmene na nízkomolekulární sacharidy, které pivní kvasnice využívají jako substrát pro tvorbu alkoholu [45]. Níže je uveden stručný přehled základních skupin ječných proteinů, které byly doposud identifikovány proteomickými studiemi: Enzymy podílející se na glykolýze: tyto proteiny umožňují základní metabolismus buňky. Byly identifikovány v zrnu ječmene [70], [71]. Amylasy: některé amylasy jsou v malé míře obsaženy již v zrnu, největší množství této skupiny enzymů vzniká během klíčení ječmene. Pomocí těchto enzymů mohou být škroby při rmutování ječmene odbourávány. Byly identifikovány v obilkách ječmene [72] sladu [71] a během máčení [73]. α-amylasa/trypsinové inhibitory: tato skupina proteinů tvoří velkou část identifikovaných proteinů. Byly identifikovány v zrnu, sladu a pivu [70], [71], [74]. Je zajímavé, že tyto proteiny neinhibují aktivitu endogenních amylas a má se za to, že fungují jako ochrana před predátory [75]. Některé z těchto proteinů ovlivňují tvorbu zákalu [69]. Peroxidasy: tyto proteiny oxidují množství organických a anorganických látek a lze je nalézt téměř ve všech organismech [76]. Podílí se na mnoha procesech; při biosyntéze a degradaci ligninu v buněčných stěnách, biosyntéze sekundárních metabolitů, při obranné reakci na zranění, na přítomnost patogenu a při reakci na útok hmyzu [76]. Tyto proteiny byly identifikovány v zrnu [77] i během klíčení [73]. 31

32 Nespecifické lipid-transferproteiny (ns-ltps; non-specific lipid transfer proteins): In-vitro mají tyto proteiny schopnost přemisťovat různé lipidy mezi membránami. Jedná se o všudypřítomné základní proteiny. Účastní se obrany rostlin proti mikrobiálním patogenům a ve formě hydrofobní vrstvy pokrývají rostlinné orgány [78], [79]. Protein ns-ltp1 je hojně zastoupen v pivu, a to zejména v pěně, kde přispívá k její tvorbě [68], ve větší míře však způsobuje nežádoucí pěnivost [80]. Proteiny byly identifikovány v zrnu, sladu a pivu (pivní pěně) [74], [80]. Thioredoxiny: Tyto enzymy reverzibilně redukují disulfidické vazby, což je důležité z hlediska regulace enzymů a proteinů. Mají velký vliv na klíčení ječmene [81]. Redukují například disulfidické vazby hordeinů, které se díky tomu stávají rozpustnější a náchylnější k proteolytické degradaci [82]. Byly zjištěny v zrnu a sladu [83], [84], [73]. Ječné serpiny: Mezi často identifikované proteiny této skupiny patří protein Z. Jedná se o albuminový protein, který byl identifikován ve sladu a pivu [74], [68], [71]. Protein Z pozitivně ovlivňuje pěnivost piva [68]. Protein Z je v procesu sladování glykován [85]. Hordeiny: Jedná o zásobní proteiny obilovin. Polypeptidové fragmenty, které si najdou cestu do piva přispívají k tvorbě zákalu [86]. Hordeiny byly identifikovány v zrnu [87], sladu a pivu [74]. Tvoří kolem 80 % všech proteinů obsažených v zrnu [73]. Proteiny katalyzující metabolismus uhlovodíků [70]. Protistresové a detoxikační proteiny [70]. Proteiny Saccharamyces cerevisiae: V vyprodukované kvasinkami [74]. 32 pivu byly také identifikovány proteiny

33 4 Experimentální část 4.1 Seznam chemikálií aceton, Lach-Ner, Neratovice, ČR acetonitril (ACN), Fluka, Buchs, Švýcarsko agarosa, BIO-RAD, Hercules, CA, USA akrylamid:bisakrylamid 37,5:1, Fluka, Buchs, Švýcarsko azid sodný (NaN3), Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo Bio-Lyte, BIO-RAD, Hercules, CA, USA, 40 % roztok (nosič amfolytů) bromfenolová modř, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo butanol, Lachema, Neratovice, ČR, čistota 99,5 % Coomassie Brilliant Blue G 250, Fermentas, Vilnius, Litva chlorid sodný (NaCl), Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo chlorid manganatý tetrahydrát (MnCl2), Lachema, Neratovice, ČR, čistota 99 % chlorid vápenatý (CaCl2), Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo, čistota 99 % 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonát (CHAPS), BIO-RAD, Hercules, USA chymotrypsin, bovine pancreas, Roche diagnostics, Mannheim, Německo D-(+)-glukosa, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo, čistota 99,5 % dithiothreitol (DTT), BIO-RAD, Hercules, CA, USA dodecylsulfát sodný (SDS), BIO-RAD, Hercules, CA, USA hydrochlorid tris(hydroxymethyl)aminomethanu (Tris-HCl), Sigma-Aldrich, SRN, čistota 99,9 % hydrogenuhličitan amonný (NH4HCO3), Fluka, Buchs, Švýcarsko glycerol, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo, čistota 99,9 % glycin, BIO-RAD, Hercules, CA, USA jodoacetamid, BIO-RAD, Hercules, CA, USA konkanavalin A izolovaný z Canavalia ensiformis, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo kyselina 4-hydroxy-α-kyanoskořicová, LaserBio Labs, Sopia-Antipolis Cedex, Francie kyselina chlorovodíková koncentrovaná (HCl), Lachema, Neratovice, ČR kyselina mravenčí (HCOOH), Lachema, Neratovice, ČR, % kyselina trichloroctová (TCA), Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo, 99 % kyselina trifluoroctvá (TFA), Fluka, Buchs, Švýcarsko, 99,5 % Lammli pufr, BIO-RAD, Hercules, CA, USA (připravený roztok pro SDS-PAGE) 2-merkaptoethanol, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo, čistota 98 % minerální olej, BIO-RAD, Hercules, CA, USA močovina, BIO-RAD, Hercules, CA, USA N,N'-methylenbisakrylamid, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo, čistota 98 % n-oktyl-β-d-glukopyranosid, Fluka, Buchs, Švýcarsko, čistota 99 % octan sodný (CH3COONa) peroxodisíran amonný, Lachema, Neratovice, ČR standard Broad Range SDS-PAGE ( kda), BIO-RAD, Hercules, CA, USA standard pro MS, Peptide Calibration Mix 1, LaserBio Labs, Sophia-Antipolis Cedex, Francie tetramethylendiamin (TEMED), Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Německo 33

34 4.2 Materiál Pro proteomickou analýzu byly použity pomleté obilky ječmene, konkrétně obilky zrna a sladu odrůdy ječmene Jersey. Pozornost této diplomové práce byla soustředěna na bílkoviny rozpustné ve vodě. Vzorky ječmene byly získány z Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského (Brno, ČR) procesem mikro-sladování [88] D gelová elektroforéza Extrakce proteinů rozpustných ve vodě Do zkumavek (Eppendorf, Hamburg, Německo) bylo naváženo 600 mg rozemletých obilek ječmene, ke kterému bylo přidány 3 ml deionizované vody (uvedené množství je pro jeden gel). Tato směs byla umístěna na 2 hodiny na třepačku (Vortex Genie 2, P-Lab, Praha, ČR), čímž byly z ječmene extrahovány proteiny rozpustné ve vodě. Po 2 hodinách byla směs odstřeďována po dobu 15 minut při 14,000 otáčkách/min. v centrifuze (minispin plus, Eppendorf) a vzniklý supernatan byl znovu odstřeďován po dobu 5 minut při 14,000 otáčkách/min. K supernatanu bylo přidáno 9 ml odsolovacího roztoku. Roztok byl poté umístěn nejméně na 4 hodiny do -20 C. Odsolovací roztok: 10 % TCA v acetonu s 0,12 % DTT. Po 4 hodinách byly vzorky odstřeďovány (5 minut při 10,000 otáčkách/min). Po odstředění byl odstraněn supernatan, ve zkumavce byla ponechána sraženina obsahující proteiny. Sraženina byla poté dvakrát promyta 500 µl acetonu (protřepání, následná centrifugace na 1 minutu při 10,000 otáčkách/min). Zbylý aceton byl odstraněn vysušením v koncentrátoru (Concentrator 5301, Eppendorf). Po vysušení bylo k extraktu přidáno 400 µl rehydratačního roztoku, následovalo rozpuštění směsi. Nerozpuštěný zbytek byl odstraněn odstředěním po dobu 3 minut při 14,000 otáčkách/min. Rehydratační roztok: 8 mol/l močovina 2% CHAPS 50 mmol/l DTT 0,2 % Bio-Lyte Bromfenolová modř Odstředěný čirý roztok byl nanesen do rehydratační vaničky. Na tento roztok byly umístěny IPG proužky (IPG ReadyStrip, 17 cm, lineární, rozsah 3 10 pi, BIO-RAD) které byly zality minerálním olejem. Rehydratace proužku byla provedena pasivně při pokojové teplotě po dobu 18 h. 34

35 4.3.2 Izoelektrická fokusace Isoelektrická fokusace byla prováděna na přístroji Protean IEF Cell (BIO-RAD). Nejprve byla připravena elektrofokusační vanička. Do drážek byly na kontaky umístěny papírky, které byly navhlčeny deionizovanou vodou. Potom byly rehydrované IPG proužky přemístěny do elektrofokusační vaničky. Proužky byly zality minerálním olejem. Isoelektrická fokusace probíhala dle předem optimalizovaných kroků: krok 100 V krok 250 V krok 600 V krok 5000 V krok V krok 10000V krok 500 V lin lin lin lin lin rapid rapid 10 minut 15 minut 15 minut 60 minut 75 minut V/h 24 h pro ukotvení proteinů na proužku Po ukončení fokusace byly proužky uchovány při -20 C do použití Příprava gelů pro 2D gelovou elektroforézu Nejdříve byl připraven stojan, do kterého byla vertikálně umístěna skla mezi která se nalévaly gely. Jeden gel se skládal ze dvou částí, ze zaostřovacího gelu a separačního gelu. Nejprve byl mezi skla nalit separační gel asi 3 cm od horního okraje skla. Gel byl přelit butanolem, aby nedocházelo k jeho vysychání. Po ztuhnutí gelu byl butanol odstraněn a na ztuhlý separační gel byl nalit gel zaostřovací. Následně byl na gel umístěn hřeben. Pro účely diplomové práce byl použit separační gel s 15 % obsahem polyakrylamidu. Uvedená množství jsou pro 1 gel. 15 % Separační gel: 22,5 ml roztoku A. Roztok A: 30 g akrylamidu + 0,8 g bisakrylamidu; doplnění do 100 ml destilovanou vodou 0,45 ml roztoku B. Roztok B: 10 g SDS; doplněno do 100 ml destilovanou vodou 22,5 ml roztoku C. Roztok C: 9,1g Tris-HCl rozpuštěných v 50 ml destilované vody; titrace koncentrovanou HCl na ph 8,8 a doplnění do 100 ml destilovanou vodou 30 µl TEMED 225 µl roztoku F. Roztok F: 100 mg peroxodisíranu amonného doplněno do 1 ml destilovanou vodou Zostřovací gel: 0,75 ml roztoku A 75 µl roztoku B 3,75 ml roztoku D. Roztok D: 3 g Tris-HCl rozpuštěných v 50 ml destilované vody; titrace koncentrovanou HCl na ph 6,8 a doplnění do 100 ml destilovanou vodou 2,85 ml destilované vody 3,75 µl TEMED 112,5 µl roztoku F 35

36 4.3.4 Gelová elektroforéza Příprava standardního roztoku: Nejdříve byl připraven standard. K 95 µl Laemliho pufru bylo přidáno 5 µl merkaptoetanolu. 12 µl tohoto roztoku bylo smícháno s 3 µl standardní proteinové směsi a vzniklý roztok byl povařen 2 min ve vodní lázni. IPG proužky byly ponechány při laboratorní teplotě na 20 až 30 minut, aby došlo k jejich rozmrazení. Poté byly postupně ekvilibrovány pomocí ekvilibračních roztoků I a II vždy po dobu 10 min. Ekvilibrace probíhala za třepání při laboratorní teplotě. Ekvilibrační roztok I: 6 mol/l močovina 2 % SDS 0,375 mol/l Tris-HCl ph 8,8 20 % glycerol 0,13 mol/l DTT Ekvilibrační roztok II: 6 mol/l močovina 2 % SDS 0,375 mol/l Tris-HCl ph 8,8 20 % glycerol 0,135 mol/l jodoacetamid Následně byly proužky omyty elektrodovým pufrem. Elektrodový pufr: 25 mm Tris-HCl ph 8,3 192 mm glycin 0,1 % SDS ph 8,3 IPG proužky byly umístěny na polyakrylamidový gel a zality agarosou. Na gel bylo naneseno 15 µl standardního roztoku. SDS-PAGE analýza byla provedena za těchto optimalizovaných podmínek: 1. krok 40 ma 2. krok 80 ma 3. krok 60 ma 35 minut 1 hodina 30 minut do ukončení elektroforézy Doba trvání elektroforézy se běžně pohybovala mezi 7 až 8 hodinami. Po SDS-PAGE analýze byly gely na 30 minut ponořeny do nádoby s fixačním roztokem. Fixační roztok: 12 g TCA bylo doplněno do 100 ml destilovanou vodou 36

37 Gely byly následně třikrát omývány destilovanou vodou vždy po dobu 5 minut. Po promytí následovalo barvení gelů barvou Coomassie G 250 při laboratorní teplotě přes noc. Po důkladném obarvení následovalo odbarvování gelů destilovanou vodou. Pro rychlejší promytí byla nádoba s gelem umisťována na třepačku. Hotové gely byly naskenovány pomocí přístroje EXQuest Spot Cutter (BIO-RAD) a analyzovány speciálním vyhodnocovacím programem PDQuest (BIO-RAD). Do dalšího použití byly gely uchovávány ve 2 % vodném roztoku kyseliny octové při teplotě 8 C. 4.4 Afinitní chromatografie následovaná 1D gelovou elektroforézou Příprava proteinových extraktů pro afinitní chromatografii Proteiny sladu či zrna byly extrahovány z 1,25 g ječné mouky 10 ml destilované vody při laboratorní teplotě. Směs vody a mouky byla umístěna na 2 hodiny na třepačku. Po 2 hodinách byly zkumavky odstředěny (14000 ot/min; 10 min). Supernatan byl ještě jednou odstředěn (14000 ot/min; 1 min). Následně byl supernatan přefiltrován přes mikrofiltr (velikost póru 0,45 µm, Millipore, MA, USA) a zlyofilizován Frakcionace proteinů afinitní chromatografií Lyofilizáty byly rozpuštěny ve 2 ml nanášecího pufru. Takto rozpuštěné proteiny byly poté separovány afinitní chromatografií. Nanášecí pufr: 0,1 mol/l Tris-HCl 0,5 mol/l NaCl 1 mmol/l MnCl2 1 mmol/l CaCl2 4 mmol/l n-octyl-β-d-glukopyranosid Pro účely afinitní chromatografie byla použita plastová kolonka o objemu 5 ml (MoBiTec, Goettingen, Německo), kde jako bifunčkní ligand byl použit konkanavalin A o objemu 2 ml. Postup při chromatografii byl následovný: 1) Promytí kolony 10 ml nanášecího pufru. 2) Napipetování 1 ml vzorku. 3) Promývání kolony 10 ml nanášecího pufru; v této fázi kolonou procházely nemodifikované proteiny, které byly vždy po 2 ml zachyceny do zkumavky. Výsledkem bylo 5 zkumavek, jejichž obsah byl spojen a označen jako 1. nezadržená frakce (NF 1). 4) Napipetování zbývajícího 1 ml vzorku. 5) Promývání kolony 20 ml nanášecího pufru; protékající roztok byl opět po 2 ml zachytáván do zkumavek. Z této fáze bylo získáno 10 zkumavek, jejichž obsah byl spojen a označen jako 2. nezadržená frakce (NF 2). 37

38 6) Promývání kolony 10 ml elučního pufru; tento pufr uvolnil navázané proteiny z ligandu. Roztok byl zachytáván, a výsledkem tohoto kroku byly 4 zkumavky, neboť první zkumavka do které byl roztok zachycen, obsahovala 1 ml nanášecího pufru z předešlých kroků a 1 ml elučního roztoku. Obsah zkumavek byl opět spojen a označen jako zadržená frakce (ZF). 7) Na závěr byla kolona promyta 10 ml nanášecího pufru a následně 10 ml uchovávajícího roztoku. Eluční pufr: 0,5 mol/l D-glukosy rozpuštěné v nanášecím pufru Uchovávací roztok: 0,1 mol/l octanu sodného (ph 6.8) 1 mol/l NaCl 1 mol/l CaCl2 0,5 % NaN Dialýza vzorků Frakce proteinů získané chromatografií byly dialyzovány oproti destilované vodě, aby došlo k odstranění solí. Pro dialýzu byla použita dialyzační membrána VISKING vyrobená z regenerované celulosy a nepropustné pro proteiny a bakterie (P-LAB, Praha, ČR). Voda byla po celý průběh dialyzace promíchávána magnetickou míchačkou. Doba trvaní dialyzace byla 18 hodin D gelová elektroforéza Po ukončení dialýzy byly jednotlivé frakce zakoncentrovány na objem 1 ml a následně zlyofilizovány. Po lyofilizaci byly proteiny ve zkumavkách postupně rozpouštěny v minimálním množství deionizované vody. Výsledkem rozpouštění byly tyto zkumavky: 1. zkumavka 200 µl NF 1 rozpuštěné v deionizované vodě 2. zkumavka 200 µl NF 2 rozpuštěné v deionizované vodě 3. zkumavka 50 µl ZF rozpuštěné v deionizované vodě Do každé zkumavky bylo přidán vzorkovací pufr v poměru 1:1 k objemu vzorku ve zkumavce. (Například do zkumavky s 200 µl nezadržené frakce 1 bylo přidáno 200 µl vzorkovacího pufru). Připraveny byly také extrakty zrna a sladu. K 250 mg mouky sladu nebo zrna byly přidány 2 ml destilované vody. Směs byla umístěna na 2 h na třepačku. Po 2 hodinách byly zkumavky odstředěny (14,000 ot/min; 10 min). Supernatan byl ještě jednou odstředěn (14,000 ot/min; 1 min). Výsledný supernatan byl zakoncentrován na 0,5 ml. Z tohoto 0,5 ml extraktu bylo odebráno 100 µl, ke kterým bylo přidáno 100 µl vzorkovacího pufru. Vzorkovací pufr: roztok Laemmliho pufru v merkaptoetanolu (1:19 v/v) Roztok proteinových standardů byl připraven dle postupu v kapitole

39 1D gelová gradientových elektroforéza byla prováděna na aparatuře Miniprotean Tetra cell (BIO-RAD) na zakoupených gelech Ready Gel (10 20 % Tris-HCl, 10 jamek o objemu 30 µl, (BIO-RAD). Elektroforéza byla vždy prováděna na dvou gelech zároveň. Elektrodový pufr byl shodný s pufrem používaným při 2D GE. gel 1 gel 2 1. jamka: standard 10 µl 2. jamka: zrno extrakt 10 µl 3. jamka: zrno NF1 10 µl 4. jamka: zrno NF2 10 µl 5. jamka: zrno ZF 10 µl 6. jamka: zrno ZF 15 µl 7. jamka: slad extrakt 10 µl 8. jamka: slad NF1 10 µl 9. jamka: slad NF2 10 µl 10. jamka: slad ZF 15 µl 1. jamka: 2. jamka: 3. jamka: 4. jamka: 5. jamka: 6. jamka: 7. jamka: 8. jamka: 9. jamka: 10. jamka: standard 10 µl zrno extrakt 15 µl zrno NF1 15 µl zrno NF2 15 µl zrno ZF 20 µl slad extrakt 15 µl slad NF1 15 µl slad NF2 15 µl slad ZF 15 µl slad ZF 20 µl Nastavení parametrů analýzy bylo následující: 160 V konstantní napětí na 2 gely. Typická doba trvání elektroforézy se pohybovala kolem 1,5 h. Po ukončení elektroforézy byly gely fixovány, vymývány, barveny a odbarvovány stejným postupem jako gely z 2D elektroforézy popsaným v sekci Enzymatické štěpení proteinů Vyříznutí proteinů: Po odbarvení byly gely (1D i 2D) omyty destilovanou vodou. Spoty s proteiny byly vyříznuty buď ručně pomocí skalpelu (u 1D gelů) nebo pomocí přístroje EXQuest Spotcutter (u 2D gelů). Kousky gely vyříznuté skalpelem byly nakrájeny na menší kostičky o velikosti zhruba 1 x 1 mm. Takto získané kousky gelů byly umístěny do zkumavek. Omývání proteinů: Kousky gelu byly ve zkumavkách dvakrát promyty deionizovanou vodou a směsí deionizované vody s ACN (1:1; v/v). Gely byly v tomto roztoku ponechány vždy po dobu 15 minut. Množství použitých objemů kapalin odpovídala dvojnásobku objemu gelů. Po tomto promytí byly roztoky ze zkumavek odpipetovány. Ke kouskům gelů byl přidán ACN tak, aby překrýval kousky gelu. Došlo k jejich sražení a zbělení. Poté byl ACN odpipetován a kousky gelu byly rehydratovány roztokem 50 mm NH4HCO3. Po 5 minutách byl do zkumavek opět přidán ACN ve stejném množství, jako NH4HCO3. Po 15 minutách byla ze zkumavek odstraněna veškerá kapalina a kousky gelu byly vysušeny v koncentrátoru. Redukce a alkylace: Proteiny ve zkumavkách byly redukovány přídavkem roztoku 10 mm DTT rozpuštěném v 50 mm NH4HCO3. Objem přidávaného roztoku byl opět zvolen tak, aby byly roztokem přikryty kousky gelu. Poté byly zkumavky umístěny do inkubátoru (Thermomixer comfort, Eppendorf) a inkubovány při teplotě 56 ºC po dobu 45 minut. Po inkubaci byly vzorky ochlazeny na laboratorní teplotu. Veškerý roztok byl ze zkumavek odpipetován a nahrazen přibližně stejným množstvím 55 mm jodoacetamidu rozpuštěném v 50 mm NH4HCO3. Zkumavky byly umístěny na 30 minut do tmy. Poté byl roztok odstraněn, kousky gelu byly promyty 50 mm NH 4HCO3 a po 5 minutách ACN, tak jak je popsáno v části Omývání proteinů. V této chvíli měly být kousky gelu průhledné. Pokud tomu tak nebylo a gely byly zbarvené, následovalo promývání NH 4HCO3 a ACN. Pokud kousky gelu byly bezbarvé, byl veškerý roztok ze zkumavek odstraněn. 39

40 Enzymatické štěpení: Kousky gelu byly vysušeny v koncentrátoru a rehydratovány roztokem obsahujícím 50 mm NH4HCO3 a 12,5 ng/µl chymotrypsinu v množství dostatečném po přikrytí kousků gelu. Pokud gel absorboval roztok, bylo ho přidáno více. Následovně byly kousky gely umístěny do 8 C na 45 minut. Po této době byl roztok ze zkumavek odpipetován a ke vzorkům bylo přidáno 5 až 20 µl stejného roztoku, který ale neobsahoval chymotrypsin. Zkumavky byly inkubovány při 37 ºC přes noc. Extrakce peptidů: Obsah zkumavek byl po štěpení přepipetován do čistých zkumavek, neboť již obsahoval peptidy. Pro extrakci maximálního množství peptidů byly gely inkubovány v dostatečném množství 25 mm NH4HCO3. Po 15 minutách bylo přidáno stejné množství ACN. Po dalších 15 min. byl supernatan přepipetován do zkumavek s peptidy získanými na počátku extrakce. Kousky gelů byly dále 15 minut extrahovány roztokem kyseliny mravenčí a ACN (1 % HCOOH/ACN 1:1 v/v), opět v množství nutném pro jejich přikrytí. Tento krok byl dvakrát až třikrát opakován. Jednotlivé supernatanty byly spojeny a vysušeny. Přečištění a nanesení peptidů na destičku: Před charakterizací vzorku na hmotnostním spektrometru byly peptidy přečištěny pomocí peptidových špiček Zip-Tip C18 (Millipore, MA, USA). Nejprve byly vysušené peptidy rozpuštěny ve 20 µl 0,1 % TFA v deionizované vodě. Následovalo přečišťování peptidů. Níže je uveden postup přečišťování: 1) 2) 3) 4) 5) Promytí Zip-Tip špiček roztokem 0,1 % TFA/ACN (1:1, v/v). Promytí těchto špiček v 0,1 % TFA. Sorpce peptidů ze vzorku. Promytí špiček v 0,1 % TFA. Eluce zachycených peptidů v 10 µl roztoku 0,1 % TFA/ACN (1:1, v/v). Takto přečištěné peptidy byly připraveny pro MS analýzu. Jako matrice byla použita kyselina 4-hydroxy-α-kyanoskořicová (CHCA). Příprava CHCA: 1 mg CHCA byl rozpuštěn v 100 µl roztoku 0,1 % TFA/ACN (1:1, v/v). Na destičku bylo nejprve naneseno 0,5 µl přečištěného vzorku, a na něj bylo naneseno 0,5 µl matrice. Pro kalibraci hmotnostního spektrometru byla použita komerční standardní směs peptidů Peptide Calibration Mix 1. Kalibrační roztok byl připraven následovně: Do zkumavky výrobce obsahující Peptide calibration Mix 1 bylo přidáno 100 µl 0,1 % TFA. Takto připravený kalibrační roztok byl poté smíchán s roztokem matrice uvedeným výše v poměru 1:9 (v/v). 40

41 4.6 Hmotnostní spektrometrie Měření hmotnostních spekter bylo prováděno na přístroji 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems, Framingham, USA). Všechna MS měření byla provedena v kladném reflektronovém módu MALDI-TOF hmotnostního spektrometru. Jako kolizní plyn byl pro MS/MS měření vždy použit dusík. 4.7 Identifikace proteinů Naměřená spektra byla zpracována počítačovým programem Data Explorer. Získané hmotnosti jednotlivých peptidů (MS) či jejich fragmentů (MS/MS) byly vyhodnoceny pomocí proteinových databází SwissProt a NCBInr. K vyhodnocení bylo použito vyhledávacího nástroje Mascot přístupného z internetových stránek 41

42 5 Výsledky V průběhu sladování dochází ke změnám proteinového obsahu ječmene. Tyto změny byly zkoumány pomocí 1D a 2D gelové elektroforézy [89]. Bylo ukázáno že proces sladování ovlivňuje posttranslační modifikace některých proteinů ječmene [90] a u některých proteinů byly tyto modifikace podrobně prozkoumány [85]. Cílem práce bylo zjistit další údaje o změnách proteinového složení během sladování a studovat možné modifikace proteinů obsažených v ječmeni. K tomuto účelu bylo k separaci proteinů použito 2D gelové elektroforézy a kombinace afinitní chromatografie s SDS PAGE, následované identifikací sledovaných proteinů pomocí MALDI TOF MS. Pro experimenty byla vybrána ječná odrůda Jersey. Tato odrůda byla vyšlechtěna firmou Cebeco Seeds BV a v České republice byla zaregistrována v roce Tato odrůda se řadí mezi výběrové sladovnické odrůdy vyznačující se krátkým obdobím posklizňového dozrávání a dobrou odnoživostí. Rostlina dorůstá 80 až 85 centimetrů, čímž se řadí mezi středně vysoké ječmeny. Odrůdu Jersey je možno pěstovat ve všech oblastech za účelem výroby kvalitních sladů; má vynikající úroveň extraktu v sušině sladu, optimální složení sladiny a optimální enzymatickou aktivitu [91].Díky svým vynikajícím parametrům kvality a výsledků pěstování je Jersey velice rozšířenou odrůdou v České republice [92]. 5.1 Vyhodnocení 2D gelové elektroforézy Popis gelů získaných 2D-GE Pro získání informace o celkovém proteinovém profilu zrna a sladu byla jako první provedena separace proteinů ječmene pomocí 2D gelové elektroforézy (viz. Kapitola 4.3). Ječné proteiny byly extrahovány z pomletých zrn deionizovanou vodou. Proteiny rozpouštějící se ve vodě byly pro výzkum vybrány z toho důvodu, že řada z nich přežívá proces sladování, a dostává se tak až do konečného produktu, tedy piva. Jelikož první krok 2D-GE, IEF, je velice citlivý na soli obsažené ve vzorku, bylo nutné extrakty nejprve přečistit. Jako optimální se ukázalo být srážení proteinů směsí aceton/tca. Teprve po tomto odsolení vzorku byla provedena samotná 2D-GE analýza. Proteiny byly separované na IPG stripech s lineárním rozsahem ph 3 10 a posléze na gelech s 15 % obsahem akrylamidu o rozměrech 20 x 22 cm, jednalo se tedy o velké PAGE gely. Po provedení elektroforézy byly gely obarveny pomocí Coomassie Brilliant Blue G 250. Protože jsou proteiny odděleny na základě dvou parametrů (molekulové hmotnosti a pi), lze touto metodou separovat i proteiny lišící se jenom velmi málo. Separací proteinů po celé ploše gelu získáváme tzv. 2D mapy, které mohou poskytnout informaci o proteinovém obsahu zkoumaného vzorku. Z 2D gelů lze také takto separované proteiny vyjmout a použít pro další analýzu. Nevýhodou této metody je náročnost přípravy gelů a zejména zisk malého množství proteinu, které nemusí být pro další analýzu hmotnostní spektrometrií dostatečné. Proto bylo zhotoveno celkem 24 gelů. Všech 24 gelů bylo postupně naskenováno a z těchto snímků byly vybrány dva, na kterých jsou spoty se separovanými proteiny nejlépe vidět. Snímek prvního gelu zachycuje separaci proteinů zrna (obr. 26), na snímku druhého gelu jsou separované proteiny sladu (obr. 27). Čísla podél pravé části obrázku popisují molekulové hmotnosti proteinů použitých jako standardy, podle kterých je určována hmotnost separovaných proteinů. Čísla v dolním pruhu potom zobrazují rozsah pi, ve kterém jsou proteiny rozděleny. 42

43 Zrno: Na obrázku 26 jsou patrné dvě oblasti obsahující velké množství spotů. První oblast obsahující nejvíce spotů leží v oblasti kda. Druhá část s menším počtem spotů leží v oblasti kda. Většina spotů v gelu leží v rozmezí pi mezi 5 až 8. Obr. 26: Snímek 2D gelu zrna s označením oblastí s viditelnými rozdíly oproti 2D gelu zrna. 43

44 Slad: Na obrázku 27 je snímek gelu sladu. Je zřejmé, že sladování vyvolalo změny v proteinovém složení. Ke změnám došlo v oblasti kda, kde některé spoty zmizely. Naopak nově přibyly spoty v oblasti kda a v oblasti kda. Jako nejvýraznější se jeví skupina spotů v oblasti kda, která je výrazná i v případě zrna. Další změnou je nový spot v oblasti kolem 20 kda. Podobně jako u snímku zrna, i zde leží téměř všechny proteiny v rozmezí ph mezi 5 a 8 s výjimkou spotů z oblasti kda, z nichž některé leží v oblasti s pi nižším než 5. Obr. 27: Snímek gelu sladu, vyznačeny jsou oblasti s největším množstvím proteinových spotů. 44

45 5.1.2 Identifikace vybraných proteinů hmotnostní spektrometrií Pro MS identifikaci jednotlivých proteinů bylo nutné, aby byly proteinové spoty nejprve vyříznuty z 2D gelů. K tomuto účelu bylo využito přístroje EXQuest Spotcutter umožňující velice přesné vyřezání spotů z gelu. Aby však mohl tento přístroj pracovat správně, bylo třeba snímky gelů zpracovat pomocí softwarového programu PDQuest. Snímky gelů zrna a sladu byly mezi sebou pomocí tohoto programu porovnány a spoty vybrané k identifikaci jsou vyznačeny na obrázcích 28 a 29. Zelenou barvou jsou vyznačeny spoty proteinů vyskytující se v zrnu i ve sladu. Červenou barvou jsou pak označeny spoty, které jsou charakteristické pro daný stav ječmene. Jednou z podmínek výběru spotů byl vysoký obsah proteinu ve spotu dostatečný pro analýzu hmotnostní spektrometrií, proto všechny označené spoty patří mezi nejvýraznější spoty. Zrno: Na obrázku 28 je snímek gelu zrna. Barevně označené spoty byly vyříznuty a dále analyzovány. Z gelu zrna bylo vybráno celkem 20 spotů. Spoty 1 až 12 jsou charakteristické pro zrno. Naopak spoty 13 až 20 byly vybrány jako příklady proteinů vyskytujících se jak v zrnu, tak ve sladu ve vysoké koncentraci. Obr. 28: Snímek gelu zrna s vyznačenými spoty pro další analýzu. 45

46 Slad: Na obrázku 29 je snímek gelu sladu. Barevně označené spoty byly vyříznuty a dále analyzovány. Pro další analýzu bylo vybráno celkem 25 spotů. Spoty charakteristické pro slad: 1' až 3', 10' až 23. Spoty sladu, jejichž proteiny by měly být identické s proteiny zrna jsou: 4' až 9' a spoty 24' a 25'. Obr. 29: Snímek gelu sladu s vyznačenými spoty pro další analýzu. Po vyřezání spotů z gelů byly spoty připraveny pro hmotnostní spektrometrii podle postupu popsaného v kapitole 4.5. Proteiny byly redukovány a alkylovány, aby došlo k přerušení disulfidických můstků. V další fázi byly proteiny enzymaticky naštípány pomocí chymotrypsinu. Získané směsi peptidů byly přečištěny pomocí Zip-Tip špiček naplněných reverzní fází C 18, a nakonec naneseny na destičku. Jako matrice byla použita kyselina 4-hydroxy-α-kyanoskořicová, která je běžně využívána při analýze peptidů. Po provedení všech těchto úkonů byly proteiny analyzovány pomocí MALDI TOF hmotnostní spektrometrie. 46

47 Nejprve byla získána MS spektra pomocí kladného reflektronového MALDI-TOF módu. Píky [M + H]+ odpovídají hmotnostem jednotlivých peptidů (M je hmotnost peptidu). Pro ilustraci jsou některá získaná MS spektra uvedena níže na obrázcích 30 až 33. Obr. 30: MALDI-TOF hmotnostní spektrum in-gel digestu ze spotu 11 (zrno).odpovídající identifikovaný protein: B3-hordein. Obr. 31: MALDI-TOF hmotnostní spektrum in-gel digestu ze spotu 14 (zrno). Odpovídající identifikovaný ječný protein: Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa. 47

48 Obr. 32: MALDI-TOF hmotnostní spektrum in-gel digestu ze spotu 15' (slad). Odpovídající identifikovaný ječný protein: Jasmonate-induced protein. Obr. 33: MALDI-TOF hmotnostní spektrum in-gel digestu ze spotu 20' (slad). Odpovídající identifikovaný protein: Protein z-type serpin. 48

49 Z naměřených MS spekter byly vybrány peptidy pro MS/MS analýzu. Pro CID fragmentaci bylo využito dusíku jako intertního plynu. Píky MS/MS spekter představují fragmenty daného peptidu. Příklady MS/MS spekter jsou uvedeny níže na obrázcích 34 až 37. Obr. 34: CID MALDI-TOF/TOF MS/MS spektrum ze spotu 11 (zrno). Odpovídající identifikovaný protein: B3-hordein. Rodičovský ion: 1133,52 Da. Obr. 35: CID MALDI-TOF/TOF MS/MS spektrum ze spotu 16 (zrno). Odpovídající identifikovaný protein: Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa. Rodičovský ion: 1030,55 Da. 49

50 Obr. 36: CID MALDI-TOF/TOF MS/MS spektrum ze spotu 5' (slad). Odpovídající identifikovaný protein: Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa. Rodičovský ion: 1138,66 Da. Obr. 37: CID MALDI-TOF/TOF MS/MS spektrum ze spotu 15' (slad). Odpovídající identifikovaný protein: Jasmonate-induced protein. Rodičovský ion: 1036,58 Da. 50

51 Po naměření všech MS a MS/MS spekter byly jednotlivé proteiny identifikovány dvěma způsoby: Pomocí dat získaných z MS spekter metodou Peptide Mass Fingerprinting (PMF). Pomocí údajů z MS/MS měření metodou MS/MS Ion Search. Oba způsoby využívají k vyhodnocení údajů počítačových databází. K identifikaci bylo použito databází NCBInr a SwissProt prostřednictvím programu MASCOT. Stručný přehled identifikovaných proteinů je uveden v tabulce 4 a 5. Většina ječných proteinů byla identifikována pomocí PMF i pomocí MS/MS analýz. Podrobné údaje získané při identifikaci proteinů jsou v tabulkách 6 (pro zrno) a 7 (pro slad), kde jsou uvedeny základní informace o proteinech: název, identifikační číslo proteinu pod kterým je veden v databázi, jeho teoretická i stanovená molekulová hmotnost. Dále jsou v tabulkách uvedeny základní charakteristiky MS i MS/MS identifikace: Skóre: Skóre je číslo, které vyjadřuje, jak velká je pravděpodobnost, že shoda mezi naměřenými hmotnostmi a hmotnostmi vypočítanými z databáze je náhoda. Čím menší je pravděpodobnost toho, že shoda je náhodná, tím větší je skóre. Program MASCOT využívá algoritmu MOWSE vyvinutého v roce 1993 [93]. Pokrytí (Coverage): Informuje o identifikovaném pokrytí primární struktury proteinu v případě MS a peptidu v případě MS/MS analýz. Počet zachycených peptidů: Počet peptidů naštěpeného proteinu, které se shodují s peptidy vypočtenými z databáze. (MS analýza). Výčet zachycených peptidů: Sekvence peptidů, které byly MS/MS analýzou označeny jako peptidy shodné pro naměřené údaje a údaje získané z databáze. Na obrázku 38 je obrázek ilustrující databázové vyhledávání pomocí programu MASCOT. Jedná se o grafické znázornění skóre, získané MS/MS analýzou spotu 20' (slad), kde byl s vysokou pravděpodobností zachycen ječný z-type serpin protein. Obr. 38: Grafické vyjádření skóre získané z MS/MS analýz spotu 20' programem MASCOT. 51

52 Tabulka 4: Přehled identifikovaných proteinů v zrnu ječmene. V tabulce je znázorněno, kterými metodami byl protein identifikován. Spot Zrno Protein B3-hordein glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa MS MS/MS MS MS/MS X X X Tabulka 5: Přehled identifikovaných proteinů ve sladu. Slad Spot 4' 5' 6' 7' 8' 12' 13' 14' 15' 19' 20' 21' 22' 23' Protein glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa Barperm1 hypotetický protein hypothetický protein jasmonate-induced protein protein z-type serpin protein z-type serpin protein z-type serpin protein z-type serpin protein z-type serpin 52

53 Tabulka 6: Podrobný přehled údajů o proteinech identifikovaných v zrnu. Označení v datab. MW teor/stanov způsob identifikace Skóre gi /42500 MS, MS/MS 62 MS Pokrytí Počet peptidů Skóre 38 % Spot 11 Název proteinu B3-hordein Pokrytí 12 % 13 Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa G3PX_HORVU 36605/4400 MS, MS/MS % % 14 Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa G3PX_HORVU 33443/42500 MS, MS/MS % % 15 Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa G3PX_HORVU 36605/44000 MS, MS/MS % % 16 Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa G3PX_HORVU 33443/42500 MS, MS/MS % % 17 Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa G3PX_HORVU 36605/44000 MS, MS/MS % % 18 Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa G3PX_HORVU 33443/42500 MS, MS/MS % % MS/MS Výčet zachycených peptidů QQLNPCKVF RHEAVRAIVY RTLPTMCSVNVPLY RTLPTMCSVNPLY KYDTVHGHW LFGEKPVTVF DAKAGIALNDHFVKL MFKYDTVHGQW KYDTVHGQW KHHEVKVKDSKTL LFGEKEVAVF GCRNPEEIPW KYDTVHGHW LFGEKPVTVF GVRNPEEIPWGEAGADYVVESTGVF RVPTVDVSVVDLTVRTEKAASY DAKAGIALNDHFVKL MFKYDTVHGQW KYDTVHGQW KHHEVKVKDSKTL LFGEKEVAVF GCRNPEEIPW RVPTVDVSVVDLTVRLAKPATY KYDTVHGHW LFGEKPVTVF GVRNPEEIPWGEAGADYVVESTGVF RVPTVDVSVVDLTVRTEKAASY DAKAGIALNDHFVKL MFKYDTVHGQW KYDTVHGQW KHHEVKVKDSKTL LFGEKEVAVF GCRNPEEIPW RVPTVDVSVVDLTVRLAKPATY

54 Tabulka 7: Podrobný přehled o proteinech identifikovaných ve sladu. Označení v datab. MW teor/stanov způsob identifikace G3PC_HORVU 36605/42000 MS, MS/MS Skóre 97 MS Pokrytí Počet peptidů Skóre 43 % Pokrytí 13 % MS/MS Výčet zachycených peptidů KYDTVHGHW GVRNPEEIPWGEAGADY VGDSRSSIF DAKAGIALNDHF KHHEVKVKDSKTL LFGEKEVAVF Spot 4' Název proteinu Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa 5' Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa G3PC_HORVU 33443/41000 MS, MS/MS % % 6' 7' Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa G3PX_HORVU G3PC_HORVU 36605/ /41000 MS MS, MS/MS % 35 % % KYDTVHGQW LFGEKEVAVF RVPTVDVSVVDLTVRLAKPATY 8' 12' 13' Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa Barperm 1 Hypotetický protein G3PX_HORVU gi gi / / /28000 MS MS MS, MS/MS % 42 % 54 % % 14' Hypotetický protein gi /28000 MS, MS/MS % % 15' Jasmonate-induced protein JI23_HORVU 22946/26500 MS, MS/MS % % 19' Protein z-type serpin gi /41000 MS, MS/MS % % 20' Protein z-type serpin gi /40500 MS, MS/MS % % 21' Protein z-type serpin gi /39500 MS, MS/MS % % 22' Protein z-type serpin gi /40500 MS, MS/MS % % 23' Protein z-type serpin gi /41000 MS, MS/MS % % VDNLKERY LHVHPSGAAVGSAGAVVY TEIREEGHYPNVGSW TEIREEGHYPNVGSWGY VDNLKERY NDWHGHIY LHVHPSGAAVGSAGAVVY TEIREEGHYPSVGSW VDNLKERY NDWHGHIY LHVHPSGAAAGSAGAVVY TEIREEGHYPSVGSW SIAHQTRF ALRLASAISSNPERAAGNVAF VLANESSTGGPRIAF ANESSTGGPRIAF HLLDGSSIQTQF ALRLASAISSNPERAAGNVAF VLANESSTGGPRIAF HLLDGSSIQTQF SIAHQTRF ALRLASAISSNPERAAGNVAF RLASAISSNPERAAGNVAF VLANESSTGGPRIAF ANESSTGGPRIAF HLLDGSSIQTQF AKGHDKRQF STEPEFIENHIPKQTVEVGRF RALGLQLPF SIAHQTRF ALRLASAISSNPERAAGNVAF RLASAISSNPERAAGNVAF VLANESSTGGPRIAF ANESSTGGPRIAF HLLDGSSIQTQF AKGHDKRQF RALGLQLPF IAHQTRF ALRLASAISSNPERAAGNVAF VLANESSTGGPRIAF ANESSTGGPRIAF HLLDGSSIQTQF AKGHDKRQF STEPEFIENHIPKQTVEVGRF RALGLQLPF

55 5.1.3 Podrobné informace o identifikovaných proteinech po 2D-GE Zrno: Ve spotu 11, který byl charakteristický pro zrno a během sladování zmizel byl nalezen fragment hordeinového proteinu B3 patřící do skupiny hordeinů. Jak bylo popsáno v kapitole 3.7, hordeiny slouží jako zásobní proteiny [94]. B3 hordein patří do skupiny hordeinů bohatých na síru [95]. Zjištěná aminokyselinová sekvence tohoto proteinu je pro ilustraci na obrázku 39. Červeně jsou vyznačeny části sekvence, které byly zachyceny hmotnostní spektrometrií. Obr. 39: Aminokyselinová sekvence fragmentu proteinu B3 hordein (gi ). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS. Ve spotech 13 až 18 byl nalezen enzym glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa. Tento enzym hraje roli při glykolýze (odbourávání cukrů), kde zajišťuje dehydrogenaci glyceraldehyd-3-fosfátu. Katalyzuje i reakci opačnou, u rostlin se v temné fázi fotosyntézy podílí na biosyntéze sacharidů [96]. Zjištěná aminokyselinová sekvence tohoto proteinu je pro ilustraci na obrázku 40. Obr. 40: Aminokyselinová sekvence proteinu glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa (G3PX_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS. Proteiny ze spotů 1 10 i 19 a 20, se identifikovat nezdařilo. Důvodem byla pravděpodobně jejich nedostatečná koncentrace na gelu, a to i přesto, že pro MS analýzy byly spojovány identické proteinové spoty z triplikátů 2D-gelů zrna resp. sladu. 55

56 Slad: Proteiny ze spotů 1' 3', 9' 11', 16' 18', 24' a 25' se nepodařilo identifikovat. Protein ze spotu 12' byl identifikován na základě MS dat jako protein Barperm1. Spoty 13' a 14' obsahují dva proteiny s téměř identickou hmotností - gi a gi rozdíl je pouhých 4 Da. Tyto proteiny jsou uvedeny jako hypotetické, což může znamenat, že ještě nebyly popsány. Protein ze spotu 15' byl identifikován jako jasmonate-induced protein. Exprese tohoto proteinu byla sledována po vystavení listů ječmene působení kyseliny jasmonátové, což je rostlinný růstový regulátor [97]. Předpokládá se, že tento protein má ochrannou úlohu v případě vystavení rostlině osmotickému stresu [98], předpokládá se i jeho role v regulaci tzv. house-keeping proteinů - tedy proteinů umožňujících základní fungování organismu [99]. Na obrázku 41 je uvedena zjištěná aminokyselinová sekvence tohoto proteinu. Obr. 41: Aminokyselinová sekvence proteinu jasmonate-induced protein (JI23_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS. Proteiny ze spotů 19' až 23' byly identifikovány pomocí PMF i MS/MS fragmentací. Podle získaných údajů se ve všech těchto spotech vyskytuje pouze jeden protein z-type serpin. Tento protein patří do velké skupiny albuminů. V pivu přispívá k tvorbě pivní pěny [100]. Jeho zjištěná aminokyselinová sekvence je uvedena na obrázku 42. Obr. 42: Aminokyselinová sekvence proteinu z-type serpin (gi ). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS. Spoty všech výše zmíněných proteinů byly objeveny až v gelech sladu. Další skupinou jsou proteiny ze spotů 4' až 9'. Protein obsažený v těchto spotech by měl být shodný s proteinem nalezeným v zrnu. Toto bylo potvrzeno, ve spotech 4' až 8', kde byl skutečně nalezen protein glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa shodující se s proteinem nalezeným v zrnu. Protein byl v případě spotu 6' a 8' potvrzen pouze MS měřeními. Výskyt některých proteinů ve více 2D spotech může znamenat, že dané proteiny se v ječmeni vyskytují ve více formách lišících se například v některých částech aminokyselinové sekvence, nebo jsou modifikovány (např. glykace proteinu Z [85]), čímž se mění jejich molekulová hmotnost a pi. 56

57 5.2 Vyhodnocení afinitní chromatografie (AC) nasledované SDS-PAGE Gely získané pomocí AC následované SDS-PAGE Dalším použitým postupem ke sledování změn během sladování byla výše zmíněná kombinace AC a SDS-PAGE. Důvodem pro použití této kombinace metod je monitoring s důrazem na glykosylované proteiny. Zatímco v případě použití 2D GE byly proteiny odděleny na základě svých molekulových hmotností a pi, kombinací AC a SDS-PAGE byly proteiny rozděleny na základě přítomnosti či absence glykosylace a svých hmotností. Proteinové extrakty pro AC byly extrahovány z pomletých zrn stejně jako v případě 2D GE deionizovanou vodou (kapitola 4.4). Poté byla provedena frakcionace proteinů afinitní chromatografií, kde byl jako bifunkční ligand použit Konkanavalin A, na který se glykosylované proteiny váží. Konkanavalin A je lektin s afinitou pro N-glykoproteiny vysoce mannosového a komplexního typu. Je považován za jeden z nejuniverzálnějších lektinů a proto je často využíván k prvotním studiím jako je tato. Výsledkem AC chromatografie byly dvě frakce: frakce obsahující proteiny nezadržené AC a frakce zachycená pomocí AC obsahující potenciální N-glykoproteiny. Obě frakce byly poté naneseny na gradientový gel (10 20 % Tris-HCl) a byla provedena SDS-PAGE. Takto byly zhotoveno 6 gelů, které byly stejně jako v případě 2D-GE barveny barvou Coomassie G 250. Byl použit také stejný standard, v rozsahu hmotností od 6,5 do 200 kda. Po odbarvení byly gely naskenovány a byl vybrán jeden gel, na kterém je separace nejlépe vidět. Tento gel je na obrázku 43. Obr. 43: 1D-SDS gel frakcí po afinitní chromatografii s uvedenými údaji o objemech vzorků nanesených do jamek. (Zkratky: NF nezadržená frakce; ZF zadržená frakce) 57

58 Popis obrázku 43: Na gel byly naneseny nezpracované původní extrakty zrna (jamka 2) a sladu (jamka 7), ve kterých jsou obsaženy všechny proteiny extrahovatelné vodou. Z obrázku je patrné, že rozsah jejich hmotností je kda. V nezadržených frakcích (NF) zrna (jamka 3; 4) a sladu (jamka 8; 9) lze vidět řadu proteinových spotů ve stejném hmotnostním rozsahu jako u původních extraktů. Gelová elektroforéza ukázala, že po AC zůstala většina proteinů v nezadržené frakci. V zadržených frakcích (ZF) bylo pozorováno u zrna 10 a u sladu 7 dobře oddělených proužků s molekulovými hmotnostmi v oblasti kda pro zrno (jamka 5; 6) a kda pro slad (jamka 10). K další analýze byly z původních extraktů a nezadržených frakcí vybrány proteinové proužky z oblasti molekulových hmotností asi kda. U nezadržených frakcí a extraktů byly vybrány proužky proteinů, u kterých se předpokládalo, že obsahují vyšší koncentrace proteinů, tedy ty, kde objem naneseného vzorku pro SDS-PAGE byl 20 μl na jamku. U zadržených frakcí byly pro identifikaci vyřezány všechny proužky. 58

59 5.2.2 Identifikace vybraných proteinů hmotnostní spektrometrií Podobně jako u 2D-GE analýzy byly bandy obsahující proteiny vyříznuty z gelu, tentokrát však ručně pomocí skalpelu. Na obrázku 44 je snímek gelu s vyznačenými místy, ze kterých byly proteiny vyříznuty. Zelenou barvou jsou označeny bandy proteinů sladu, červenou pak bandy proteinů zrna. Obr. 44: 1D-SDS gel původních extraktů frakcí po afinitní chromatografii s bandy označenými pro vyříznutí skalpelem. Přehled vyřezaných bandů: Zrno: Slad: Extrakt: ZE1 ZE6 Nezadržená frakce: ZNF1 ZNF5 Zadržená frakce: ZZF1 ZZF10 Extrakt: SE1 - SE7 Nezadržená frakce: SNF1- SNF7 Zadržená frakce: SZF1 SZF7 Po vyřezání proužků s proteiny následovala příprava proteinů pro MS postupem z kapitoly 4.5 a 4.6. Byla provedena redukce a alkylace proteinů, následovalo enzymatické štěpení chymotrypsinem, odsolení vzorků pomocí Zip-Tip špiček a nanesení proteinů na destičku. Stejně jako v případě 2D-GE byla jako matrice použita kyselina 4-hydroxy-α-kyanoskořicová. Poté byla provedena analýza MALDI-TOF MS. Pro názornost jsou některá naměřená MS spektra uvedena na obrázcích 45 až 48, kde píky [M + H] + (M je hmotnost peptidu) odpovídají hmotnostem jednotlivých peptidů. 59

60 Obr. 45: MALDI-TOF hmotnostní spektrum z bandu ZE3 (zrno). Odpovídající identifikovaný protein: protein-z-type serpin. Obr. 46: MALDI-TOF hmotnostní spektrum z bandu ZZF4 (zrno). Odpovídající identifikovaný protein: protein disulfid-isomerasa. 60

61 Obr. 47: MALDI-TOF hmotnostní spektrum z bandu SNF3 (slad). Odpovídající identifikovaný protein: protein-z-type serpin. Obr. 48: MALDI-TOF hmotnostní spektrum z bandu SZF4 (slad). Odpovídající identifikovaný protein: serin karboxypeptidasa. 61

62 Poté byla měřena MS/MS spektra. K fragmentaci peptidů v kolizní cele bylo opět využito dusíku jako inertního plynu. Píky MS/MS spekter představují fragmenty daného peptidu. Některá MS/MS spektra jsou uvedena níže na obrázcích 49 až 52. Obr. 49: CID MALDI-TOF/TOF MS/MS spektrum z bandu ZNF3 (zrno). Odpovídající identifikovaný protein: z-type serpin. Rodičovský ion: 1345,75 Da. Obr. 50: CID MALDI-TOF/TOF MS/MS spektrum z bandu ZE5 (zrno). Odpovídající identifikovaný protein: Aldosa-reduktasa. Rodičovský ion: 836,44 Da. 62

63 Obr. 51: CID MALDI-TOF/TOF MS/MS spektrum z bandu SNF6 (slad). Odpovídající identifikovaný protein: thaumatin-like protein TLP8. Rodičovský ion: 1444,80 Da. Obr. 52: CID MALDI-TOF/TOF MS/MS spektrum z bandu SE3 (slad). Odpovídající identifikovaný protein: protein z-type serpin. Rodičovský ion:1345,80 Da. 63

64 Stejně jako u 2D-GE byly proteiny po naměření hmotnostních spekter identifikovány dvěma způsoby. Díky datům získaných z MS spekter metodou PMF a díky údajům z MS/MS měření metodou MS/MS Ion Search. Stručný přehled identifikovaných proteinů je v tabulce 8 a 9. Podrobné údaje lze nalézt v tabulkách 10 (pro zrno) a 11 (pro slad). Tyto tabulky opět obsahují základní informace o proteinech název, identifikační číslo proteinu pod kterým je uvedeno v databázi, jeho teoretická i stanovená molekulová hmotnost a základní charakteristiky MS i MS/MS identifikací. Tabulka 8: Přehled identifikovaných proteinů zrna u ječmene. Zrno Frakce Nezadržená frakce Zadržená frakce Původní extrakt Spot ZNF1 ZNF2 ZNF3 ZNF5 ZZF4 ZZF8 ZE1 ZE3 ZE4 ZE5 Protein Beta-amylasa Protein z-type serpin Protein z-type serpin Alfa-amylasa/subtilisin inhibitor Protein disulfid-isomerasa Konkanavalin A Beta-glucosidasa Protein z-type serpin Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa Aldosa-reduktasa MS MS/MS X X X X X Tabulka 9: Přehled identifikovaných proteinů ve sladu. Slad Frakce Nezadržená frakce Zadržená frakce Původní extrakt Spot SNF1 SNF2 SNF3 SNF4 SNF5 SNF6 SNF7 SZF4 SZF5 SZF7 SE1 SE2 SE3 SE4 SE5 SE6 SE7 Protein Beta-amylasa Protein z-type serpin Protein z-type serpin Photosystem I reaction center sub. N 26 kda endochitinasa 2 Thaumatin-like protein TLP8 Alfa-amylasa/subtilisin inhibitor Serin-karboxypeptidasa Konkanavalin A Konkanavalin A Beta-amylasa Alfa-amylasa typ B isozym Protein z-type serpin Aldosa-reduktasa 26 kda endochitinasa 2 Thaumatin-like protein TLP6 Alfa-amylasa/subtilisin inhibitor 64 MS MS/MS X X X X X X X X

65 Tabulka 10: Podrobné údaje o proteinech identifikovaných v zrnu. Označení v datab. MW teor/stanov Způsob identifikace Skóre AMYB_HORVU 59894/64000 MS, MSMS 74 gi /44000 MS 76 gi /43000 MS, MSMS 78 MS Pokrytí Počet peptidů Skóre 40,00% ,00% 13 35,00% Spot NF1 NF2 NF3 Název proteinu Beta-amylasa Protein z-type serpin Protein z-type serpin Pokrytí 3,00% NF5 ZF4 ZF8 E1 E3 Alfa-amylasa/subtilisin inhibitor Protein disulfidická isomerasa Konkanavalin A Beta-glukosidasa Protein z-type serpin IAAS_HORVU PDI_HORVU gi gi SPZ4_HORVU 22378/ / / / /44000 MS, MSMS MS MS MS MS, MSMS ,00% 36,00% 49,00% 44,00% 35,00% ,00% 52 13,00% ,00% E4 E5 Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa Aldosa-reduktasa G3PX_HORVU ALDR_HORVU 36605/ /36000 MS MS, MSMS ,00% 75,00% ,00% 17,00% MS/MS Výčet zachycených peptidů KAAAAAVGHPEWEFPNDVGQY ALRLASAISSNPERAAGNVAF VLANESSTGGPRIAF HLLDGSSIQTQF STEPEFIENHIPKQTVEVGRF FVSQDPNGQHDGFPVRITPY NMQDGKVGTAHIIY ISNIDSSIPSGSTGRLL VLANESSTGGPRIAF HLLDGSSIQTQF STEPEFIENHIPKQTVEVGRF KVDLVDFVANHPF VANHPFLF LIREDIAGVVVF HIHWPF GWEIPEEDFKVL

66 Tabulka 11: Podrobné údaje o proteinech identifikovaných ve sladu. Označení v databázi MW teor/stanov Způsob identifikace Skóre AMYB_HORVU 58000/59609 MS 80 gi /43307 MS 78 gi /43307 MS, MSMS 113 MS Pokrytí Počet peptidů Skóre Pokrytí 43,00% 31 43,00% 19 60,00% ,00% MS/MS Výčet zachycených peptidů Spot NF1 NF2 NF3 Název proteinu Beta-amylasa Protein z-type serpin Protein z-type serpin NF4 NF5 Photosystem I reaction center sub. N 26 kda endochitinasa 2 PSAN_HORVU CHI2_HORVU 15718/ /31000 MS MS, MSMS ,00% 54,00% NF6 Thaumatin-like protein TLP8 gi /26000 MS, MSMS 78 44,00% NF7 Alfa-amylasa/subtilisin inhibitor IAAS_HORVU 22378/24000 MS, MSMS 67 54,00% ZF4 ZF5 Serin karboxypeptidasa Konkanavalin A CBP2_HORVU CONA_CANEN 52991/ /31000 MS MS, MSMS ,00% 48,00% ,00% TFLIKSPDSHPADGIAF FISNIDSSIPSGSTGRLL ISNIDSSIPSGSTGRLL ISNIDSSIPSGSTGRLL ZF7 E1 Konkanavalin A Beta-amylasa CONA_CANEN AMYB_HORVU 31461/ /56000 MS MS, MSMS ,00% 46,00% ,00% E2 Alfa-amylasa typ B isozym AMY2_HORVU 47497/47000 MS, MSMS ,00% ,00% E3 Protein z-type serpin gi /43000 MS, MSMS ,00% ,00% KAAAAAVGHPEWEFPNDVGQY NDTPERTQF RFDFAKGY SADVAKIY IDRSEPSFAVAEIW GGDGKPNLNQDQHRQEL KVAAHGNDYAVW ALRLASAISSNPERAAGNVAF VLANESSTGGPRIAF HLLDGSSIQTQF STEPEFIENHIPKQTVEVGRF E4 E5 E6 Aldosa-reduktasa 26 kda endochitinasa 2 Thaumatin-like protein TLP6 ALDR_HORVU CHI2_HORVU gi / / /26000 MS MS, MSMS MS ,00% 52,00% 56,00% ,00% VLANESSTGGPRIAF STEPEFIENHIPKQTVEVGRF 18,00% VAAAAAFPGFGTTGSADAQKREVAAF YGRGPIQL YGRGPIQLSHNY GRGPIQLSHNY KRYCDILGVGY 9,00% TVINKCQY SINVPAGTTSGRVW 7,00% RADANYY SGAEVHEY

67 5.2.3 Podrobné informace o proteinech identifikovaných pomocí AC následované SDS-PAGE Jak ukazují tabulky 4 a 5 (kap ) a 8 a 9 (kap ), některé proteiny byly nalezeny na 1D i 2D-gelech a u 1D-GE byla řada z nich identifikována v původním extraktu i jemu odpovídající nezadržené frakci. Pro přehlednost jsou proteiny identifikované po 1D-GE uvedeny v tabulce 12 dle svého výskytu v jednotlivých vzorcích. Tabulka 12: Přehled proteinů identifikovaných z 1D-gelů Zrno Původní extrakt Nezadržená frakce Protein Z ZE3 ZNF2 ZNF3 Glyceraldheyd-3-fosfát dehydrogenáza Beta-amylasa Alfa-amylasa/subtilisin inhibitor Aldosa-reduktasa Endochitinasa Thaumatin-like protein Beta-glukosidasa Protein photosystem I reaction center subunit N Isozym typu B alfa-amylasy Protein disulfidické izomerasy Serin karboxypeptidasa ZE4 Slad Zadržená frakce ZNF1 ZNF5 Původní extrakt Nezadržená frakce SE3 SNF2 SNF3 SE1 SE7 SE4 SE5 SE6 ZE5 Zadržená frakce SNF1 SNF7 SNF5 SNF6 ZE1 SNF4 SE2 ZZF4 SZF4 Popis identifikovaných proteinů: Protein z-type serpin a glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa: byly identifikovány v několika spotech u 2D gelů sladu (kap ). Popis jejich funkcí a zařazení bylo proto již v kapitole Beta-amylasa: patří mezi tzv. amylolytické enzymy. Podílí se na hydrolýze škrobu, glykogenu a dalších polysacharidů. Má základní význam v technologii výroby piva, neboť štěpením polysacharidů vznikají zkvasitelné nízkomolekulární cukry. Je obsažena již v zrnu ječmene, její obsah při sladování silně vzrůstá [45]. Na obrázku 53 je zjištěná aminokyselinová sekvence tohoto proteinu. Obr. 53: Aminokyselinová sekvence proteinu beta-amylasa (AMYB_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu ZNF1. 67

68 Protein alfa-amylasa/subtilisin inhibitor: je to hojně se vyskytující protein nacházející se v endospermu a aleuronové vrstvě. Specificky inhibuje isozym endogenní alfa-amylázy (AMY2), který je syntetizován během klíčení. Předpokládá se, že role enzymu spočívá v kontrole aktivity enzymu AMY 2, aby nedocházelo k předčasnému štěpení zásobního škrobu [101]. Druhá navrhovaná role spočívá v obraně buňky před proteázami patogenů a škůdců (například mikrobiálních). Protein totiž inhibuje funkci serinových proteáz subtilisinového typu [102]. Zjištěná sekvence tohoto proteinu je na obrázku 54. Obr. 54: Aminokyselinová sekvence proteinu α-amylasa/subtilisin inhibitor (IAAS_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu ZNF5. Protein aldosa-reduktasa: hraje roli v metabolizmu glukosy. Katalyzuje přeměnu glukosy na sorbitol. Sorbitol je dále přeměňován na fruktosu [103]. Zjištěná aminokyselinová sekvence je na obrázku 55. Obr. 55: Aminokyselinová sekvence proteinu aldose reduktasa (ALDR_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu ZE5. Protein 26 kda endochitinasa 2: tento enzym hydrolyticky degraduje chitin, který je součástí exoskeletonu hmyzu, je obsažen ve schránkách korýšů a vyskytuje se v buněčných stěnách plísní a hub. K expresi tohoto enzymu dochází při stresu nebo infekci plísní. Enzym omezuje růst plísní právě hydrolýzou chitinu obsaženého v jejich buněčné stěně [104]. Zjištěná aminokyselinová sekvence je na obrázku 56. Obr. 56: Aminokyselinová sekvence proteinu 26 kda endochitinasa 2 (CHI2_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu SNF5. 68

69 Thaumatin-like protein TLP8: tento protein patří do velké rodiny thaumatin-like proteinů (TLPs), které byly nalezeny v houbách, rostlinách a u živočichů. U rostlin je jejich exprese indukována přítomností patogenu, suchem, poškozením rostliny nebo nízkou teplotou. Předpokládá se, že se účastní protiplísňových aktivit, signalizují přítomnost patogenu, fungují jako protimrazové proteiny a u tabáku zvyšují toleranci ke zvýšenému obsahu soli a suchu [105]. Zjištěná aminokyselinová sekvence je na obrázku 57. Obr. 57: Aminokyselinová sekvence proteinu thaumatin like protein TLP8 (gi ). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu SNF6. Protein beta-glukosidasa: glukosidasy obecně katalyzují tyto biochemické reakce: Odbourávání polysacharidů, zpracování glykoproteinů a také syntézu oligosacharidových jednotek pro nově syntetizované glykoproteiny nebo glykolipidy [106]. Zjištěná sekvence tohoto proteinu je na obrázku 58. Obr. 58: Aminokyselinová sekvence proteinu beta-glukosidasa (gi ). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu ZE1. Protein photosystem I reaction center subunit N: tento protein je jednou z mnoha podjednotek fotosystému I [107]. Zjištěná sekvence je na obrázku 59. Obr. 59: Aminokyselinová sekvence proteinu photosystem I reaction center subunit N (PSAN_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu SNF4. 69

70 Protein isozym typu B alfa-amylasy: štěpí složky škrobu [45]. Je to právě tento isozym, jehož funkce je inhibována enzymem alfa-amylasa/subtilisin inhibitor. Zjištěná aminokyselinová sekvence je na obrázku 60. Obr. 60: Aminokyselinová sekvence proteinu isozymu B alfa-amylasa (AMY2_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu SE2. V zadržené frakci zrna byl pomocí MS analýzy identifiován N-glykoprotein disulfidická izomerasa: je to jeden z mnoha proteinů zajišťující správné složení nově syntetizovaných proteinů. Během jejich sbalování dochází často ke vzniku disulfidických můstků na špatných místech protein disulfidické izomerasy má na starosti přerušení těchto můstků a tvorbu můstků nových na místech správných [108]. Sekvence zjištěná hmotnostní spektrometrií je na obrázku 61. Potenciální místo Nglykosylace je na 282. aminokyselině. Obr. 61: Aminokyselinová sekvence proteinu disulfidické izomerasy (PDI_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu ZZF4. V zadržené frakci sladu byl pomocí MS analýzy identifikován N-glykoprotein serin- karboxypeptidáza: rozkládá zásobní proteiny obsažené v endospermu při klíčení rostliny hydrolýzou C-konce peptidové vazby. Syntéza karboxypeptidáz je řízena fytohormonem GA 3 (kyselina giberelová), který je sekretován embryem při klíčení [109]. Zjištěná sekvence je na obrázku 62. Místa N-glykosylací jsou dle databáze na aminokyselinách: 148, 159, 291, 341, 347, 352 a 472. Obr. 62: Aminokyselinová sekvence proteinu serin-karboxypeptidasa (CBP2_HORVU). Červeně označené peptidy byly zachyceny pomocí MALDI-TOF MS ve spotu SZF4. 70