Masarykova univerzita Lékařská fakulta Monitoring prostředí na pitevně ve FN u sv. Anny a FN Brno Bohunice

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta Monitoring prostředí na pitevně ve FN u sv. Anny a FN Brno Bohunice Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí práce: MUDr. Ondřej Zahradníček Vypracovala: Martina Kubíková Brno, duben 2016

2 Bibliografický záznam KUBÍKOVÁ, M. Monitoring prostředí na pitevně ve FN u sv. Anny a FN Brno Bohunice. Bakalářská práce. Brno: Masarykova univerzita, Lékařská fakulta, 2016, 78 s. Vedoucí bakalářské práce MUDr. Ondřej Zahradníček. Anotace Bakalářská práce se zaměřuje na monitoring prostředí na pitevnách ve FN Brno Bohunice a FN u sv. Anny. Práce je rozdělena do dvou částí. V teoretické části je vysvětlen termín mikroorganismy. Dále jsou přiblíženy typy bakterií. Hlavní pozornost je zaměřena na rod Staphylococcus, rod Bacillus a rod Micrococcus. Popsány jsou rovněž kultivační půdy, jejich dělení a podmínky pro kultivaci. Další kapitola obsahuje informace o dezinfekci a sterilizaci a poslední oddíl teoretické části se soustřeďuje na monitoring prostředí. V praktické části jsou přiblíženy výsledky z provedených otisků na zvolených pitevnách. Závěry ukazují, jaké typy mikroorganismů a v jakém množství se na pitevnách nachází. Abstrakt Bachelor thesis occupies with monitoring of environment in an autopsy room in The University Hospital Brno and St. Anne s University Hospital. The thesis is divided into two parts. The theoretical part explains the term microorganism. Next it describes types of bacteria. The main attention is paid to genus Staphylococcus, genus Bacillus and genus Micrococcus. Next culture media are described especially their division and conditions for cultivation. The next chapter consists facts about disinfectant and sterilization and the last chapter of a theoretical part is concentrated on monitoring of environment. The practical part is based on results of imprints in elected autopsy rooms. Conclusions show which types of microorganism with its amount can be find in autopsy rooms. Klíčová slova Mikroorganismy, pitevna, rod Staphylococcus, rod Bacillus, rod Micrococcus, kultivační půdy, dezinfekce, sterilizace, monitoring prostředí 1

3 Key words Microorganism, an autopsy room, genus Staphylococcus, genus Bacillus, genus Micrococcus, culture media, disinfectant, sterilization, monitoring of environment 2

4 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Ondřeje Zahradníčka a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne. 3

5 Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucímu bakalářské práce MUDr. Ondřeji Zahradníčkovi za cenné rady, pomoc, vstřícný přístup a čas, který mi věnoval. Dále děkuji pracovníkům piteven ve FN Brno Bohunice a FN u sv. Anny za umožnění získání dat k předložené práci. 4

6 OBSAH OBSAH... 5 SYMBOLY A ZKRATKY... 8 ÚVOD A CÍL PRÁCE... 9 I. TEORETICKÁ ČÁST MIKROBIOLOGIE A MIKROORGANISMY RŮZNÉ TYPY BAKTERIÍ VYSKYTUJÍCÍ SE V PROSTŘEDÍ Rod Staphylococcus Staphylococcus aureus Onemocnění způsobená druhem Staphylococcus aureus Koaguláza-negativní stafylokoky Meticilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) Rod Bacillus Bacillus anthracis Bacillus cereus Ostatní druhy rodu Bacillus Rod Micrococcus a příbuzné rody Micrococcus luteus a Micrococcus lylae KULTIVAČNÍ PŮDY Metabolismus bakterií Zdroje energie a živin Vztah ke kyslíku a oxidoredukční potenciál Voda a odolnost vůči vysychání Teplota, osmotický tlak, ph a záření Rozdělení kultivačních půd Rozdělení kultivačních půd podle složení

7 3.2.2 Rozdělení kultivačních půd dle konzistence Rozdělení kultivačních půd dle účelu STERILIZACE A DEZINFEKCE Sterilizace Fyzikální postupy sterilizace Chemické postupy sterilizace Dezinfekce Typy dezinfekcí Dezinfekce jednotlivých částí těla a prostor Typy dezinfekcí používaných na pitevnách MONITORING PROSTŘEDÍ II. PRAKTICKÁ ČÁST MATERIÁL, METODY A POSTUP PRÁCE VÝSLEDKY OTISKŮ Otisky I Otisky II Otisky III Otisky IV Otisky V Otisky VI Otisky VII Otisky VIII Otisky IX Otisky X SROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ OTISKŮ NA PITEVNÁCH DISKUZE ZÁVĚR

8 POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM TABULEK SEZNAM OBRÁZKŮ

9 SYMBOLY A ZKRATKY subsp. subspecies KNS - koaguláza-negativní stafylokoky MRSA meticilin-rezistentní Staphylococcus aureus CA-MRSA community-acquired MRSA HA-MRSA hospital-acquired MRSA HIV virus lidské imunodeficience SSCmec stafylokoková kazeta chromozomu mec PBP - normální penicilin vázající protein PBP2a získaný penicilin vázající protein PBPs peniciliny vázající protein HVR hypervariabilní oblast PCR polymerázová řetězová reakce CLSI Klinický a laboratorní institut pro normalizaci MIC minimální inhibiční koncentrace GIT gastrointestinální trakt camp cyklický adenosinmonofosfát cgmp cyklický guanosinmonofosfát HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie např. například aj. a jiné atd. a tak dále tzv. takzvaný HBV virus hepatitidy B HCV virus hepatitidy C FN fakultní nemocnice sv. svaté apod. a podobně CMV cytomegalovirus TBC tuberkulóza VRE vankomycin rezistentní enterokoky KA krevní agar 8

10 ÚVOD A CÍL PRÁCE Prostředí ve zdravotnických zařízeních se v poslední době stává velmi sledovaným tématem. Prostředí piteven je nicméně v rámci tohoto tématu poněkud opomíjeno, protože na pitevnách se nezdržují živí pacienti a pitevna tedy není místem přenosu nemocničních nákaz. Na druhé straně zde teoreticky může dojít k profesionální nákaze zde pracujících zdravotníků a případně i pracovníků pohřebnictví v případě, že by nějaké závažné mikroorganismy kontaminovaly samotný kadaver. Je tedy na místě se zabývat i tímto prostředím a sledovat, zda je kontaminováno pouze běžnými environmentálními druhy, nebo zda se v něm vyskytují i závažné, případně polyrezistentní kmeny. Bakalářská práce vznikla z toho důvodu, aby zmapovala prostředí na dvou vybraných pitevnách. Cílem, který jsem si vytyčila, bylo (1) zjistit, jaké typy mikrobů a v jakém množství se vyskytují v těchto prostředích, (2) zjistit, zda se v těchto prostředích vyskytují patogenní, případně polyrezistentní kmeny mikrobů a (3) porovnat nálezy z obou piteven a zjistit, do jaké míry mezi nimi existují rozdíly. Bakalářská práce je rozdělena do dvou hlavních částí teoretické a praktické. V teoretické části vycházím z názorů a ověřených faktů předních českých i zahraničních odborníků. V praktické části zpracovávám informace získané na pitevnách ve FN Brno Bohunice a FN u sv. Anny. Teoretická část se skládá z pěti kapitol. První kapitola stručně vysvětluje termín mikroorganismy. Druhá kapitola se zaměřuje na konkrétní rody bakterií, které běžně kontaminují prostředí ve zdravotnictví i mimo zdravotnictví, a to rod Staphylococcus, rod Bacillus, rod Micrococcus a příbuzné rody. U každého rodu popisuji jednotlivé druhy, jejich patogenitu a faktory virulence. Tyto rody byly zvoleny a detailněji popsány záměrně s ohledem na zaměření praktické části bakalářské práce. Třetí kapitola pojednává o kultivačních půdách. Obsahuje rozdělení půd do skupin a jejich kultivační podmínky. Hlavní pozornost je věnována těm typům kultivačních půd, které jsem využila v rámci výzkumu na pitevnách. Čtvrtá kapitola přináší informace o typech dezinfekce a sterilizace a jednotlivých dezinfekčních přípravcích používaných na pitevnách. Poslední kapitola je zaměřena na monitoring prostředí. Konkrétně na metody využívané pro sledování kontaminace prostředí a povrchů. Praktická část obsahuje informace o celkovém provedení otisků na pitevnách. Součástí je podrobný popis získávání vzorků a metody dalšího zpracování při nalezení kolonií (např. postup při zhotovení fixovaného nátěru, který byl následně obarven dle Grama). Dále je zde 9

11 popsáno složení kultivačních půd, které jsem používala pro provedení otisků. Tyto informace jsou obsaženy v první kapitole. Druhá kapitola této části zahrnuje dvě tabulky, ve které jsou zaznamenány výsledky všech vzorků (zda vyrostly kolonie, či nikoliv a o jaký druh bakterie se jedná). U každých otisků popisuji, který den jsem vzorky odebírala a konkrétně z kterých míst. Je zde popsáno i stručné shrnutí o výskytu bakterií. Třetí kapitola srovnává výsledky na obou pitevnách. Výsledky jsou zaznamenány v jedné tabulce, která zahrnuje nejčastější místa výskytu bakterií a jejich počet. Tato kapitola srovnává výskyt mikrobů zvlášť v prvních pěti odběrech a dalších pěti odběrech. Výsledky prvních pěti odběrů jsou odlišné z důvodu zaměření pouze na výskyt stafylokoků. Bakalářská práce by mohla být přínosná pro studenty lékařských a přírodovědeckých fakult i pracovníky piteven. Jedinečnost práce spočívá v monitoringu mikroorganismů v prostředí, ve kterém výzkumy podobného typu nebyly dosud realizovány. 10

12 I. TEORETICKÁ ČÁST 1 MIKROBIOLOGIE A MIKROORGANISMY Mikrobiologie je biologickou vědou zabývající se studiem mikroorganismů. Mikroorganismy jsou považovány za jedny z nejrozšířenějších organismů, které mají schopnost přežít v nepříznivých podmínkách. Vyskytují se všude kolem nás v půdě, ve vodě, ve vzduchu, v potravinách a jsou dokonce součástí jiných organismů (rostlin, živočichů a člověka). Některé mikroorganismy jsou škodlivé, jiné mohou být prospěšné, a to například v potravinářství či ve farmacii. Mikroorganismy, jinak také nazývané mikroby, jsou organismy, které jsou viditelné pouze pod mikroskopem. Na zemi se poprvé vyskytly před více než 3,5 miliardami let a jako první osídlovaly naši planetu. Díky nim došlo k rozvoji vyšších forem organismů. Nejenom, že se vyskytují na povrchu těla a v těle člověka, ale také u živočichů, rostlin a jiných organismů. Mikroorganismy vyvolávají různá onemocnění u lidí nebo zvířat, a proto se označují jako patogenní neboli choroboplodné (Juránková, 2011). Mezi mikroorganismy s možným patologickým působením na člověka patří z nebuněčných organismů zejména viry (a priony, u kterých lze ale o zařazení mezi organismy polemizovat), z prokaryotních organismů pak bakterie a sinice. Mezi mikroorganismy významné pro člověka patří i některé eukaryotní organismy, jako jsou houby (tj. kvasinky a plísně ), organismy dříve klasifikované jako prvoci (zejména někteří bičíkovci, améby a sporozoa) a do jisté míry lze mezi mikroorganismy řadit i některé vícebuněčné parazitické organismy (například škrkavky či tasemnice jsou sice makroskopické, ale jejich vajíčka dosahují pouze mikroskopických rozměrů). Na rozdíl od domén Eukarya a Prokarya se třetí doména Archaea na patogenitě pro člověka nepodílí. Mikroby se dále třídí do skupin a taxonů podle podobných vlastností a struktury a podle vzájemných vztahů (Votava a kol., 2010). Jádrem předložené bakalářské práce jsou bakterie. Velikost bakterií se vyjadřuje v mikrometrech (μm). Nejmenší bakterie mají velikost 0,2 μm, největší dosahují velikosti 60 μm. Bakterie mohou mít různý tvar kulovitý (koky), protáhlý (tyčinky), spirálovitý, nestálý a pravidelný. Koky mohou být uspořádány do dvojic, tetrád, řetízků nebo shluků, specifické typy uspořádání existují i pro tyčinky. Uvnitř bakteriální buňky se nachází cytoplasma obsahující nukleoid, ribosomy, vakuoly, granula nebo také endospory, ale ty 11

13 pouze u některých bakterií. Cytoplasma je ohraničena cytoplasmatickou membránou. Na povrch této membrány se váže bakteriální stěna, kterou může chránit pouzdro nebo vrstva slizu (biofilmu). Některé bakterie mohou mít na svém povrchu bičík, fimbrie nebo curli (Votava, 2005). Některé druhy bakterií jsou součástí normální flóry člověka. Mohou se vyskytovat na kůži, zubní sklovině, sliznici dutiny ústní, nosu, hrdle, žaludku, tenkém a tlustém střevě aj. (Schindler, 2014). Následně budou detailněji představeny zvolené typy mikrobů, které jsou hlavní součástí praktické části bakalářské práce. 12

14 2 RŮZNÉ TYPY BAKTERIÍ VYSKYTUJÍCÍ SE V PROSTŘEDÍ 2.1 Rod Staphylococcus Rod Staphylococcus patří mezi gram-pozitivní koky. Uspořádané jsou ve shlucích a jejich průměr se pohybuje kolem 1 μm. Jsou fakultativně aerobní a nevyskytují se u nich bičíky, spory a většinou ani pouzdra. Jsou to mikroby docela odolné, snáší vyschnutí a dovedou růst i v přítomnosti 10% NaCl. Katalázový test je u nich pozitivní a oxidázový test negativní. Stafylokoky mohou koagulovat plazmu, a proto je dělíme na koaguláza-pozitivní a koaguláza-negativní. Mezi stafylokoky nejdůležitější pro člověka se řadí (Votava a kol., 2010): - Staphylococcus aureus (koaguláza-pozitivní) - Staphylococcus epidermidis (koaguláza-negativní) V současné době rod Staphylococcus zahrnuje přes padesát druhů a poddruhů, přičemž tento počet se neustále mění s tím, jak se objevují nové taxony. Z tohoto počtu patří přes čtyřicet taxonů do kategorie koaguláza-negativních. U druhu S. schleiferi se vyskytuje jak koaguláza-pozitivní poddruh (S. schleiferi subspecies coagulans), tak koaguláza-negativní poddruh (S. schleiferi subsp. schleiferi). Celá rodina Staphylococcaceae nezahrnuje pouze rod Staphylococcus, ale také rody Jeotgolicoccus, Macrococcus, Nosocomiicoccus a Salinicoccus (Becker a kol., 2014) Staphylococcus aureus Poprvé jej vyizoloval v roce 1880 chirurg sir Alexander Ogston z hnisajících operačních ran. Běžně se podle kolonií označuje jako zlatý stafylokok, protože jsou nazlátle pigmentované (Julák, 2012). Kolonie jsou větší (1 3 mm) a plošší, jsou obklopeny β-hemolýzou. Rostou dobře na běžných půdách a bujóny se v jeho přítomnosti zakalují (Votava a kol., 2010) Faktory virulence Faktory virulence se dělí na: a) Povrchové peptidoglykan, protein A, vázaná koaguláza b) Extracelulární enzymy a toxiny 13

15 Peptidoglykan osidluje buněčnou stěnu a působí podobně jako endotoxin. Protein A zabraňuje imunoglobulinům opsonizaci stafylokoků tím, že je vychytává za Fc-fragmenty. Vázaná koaguláza (clumping faktor) navozuje shlukování buněk stafylokoků přeměnou fibrinogenu na fibrin (Votava a kol., 2010). Prvním extracelulárním enzymem je volná koaguláza, která dává vznik fibrinu. Proto infekce vyvolané stafylokoky probíhají jako ohraničená ložiska. Dalším enzymem je fibrinolyzin, který rozpouští fibrin. Hyaluronidáza rozkládá mezibuněčné tmely a s fibrinolyzinem dává stafylokokům možnost dostávat se do tkáně. Penicilinasa (beta-laktamasa) tlumí účinek beta-laktamových antibiotik (Votava a kol., 2010). Stafylokokovými toxiny jsou: - Toxin syndromu toxického šoku (TSST-1) - Enterotoxiny serotypu A až Q (SEA SEQ) - Cytolyziny - Exfoliatiny TSST-1 způsobuje poranění kapilárního endotelu (Votava a kol., 2010) a vyvolává syndrom toxického šoku (Julák, 2012). Enterotoxiny produkuje téměř polovina kmenů Staphylococcus aureus (Votava a kol., 2010), které jsou příčinou průjmů, bolestí břicha a zvracení. Tyto příznaky samovolně odezní do 24 hodin (Julák, 2012). Tyto dva toxiny se také podílejí na onemocnění, které je spojené s masivním uvolňováním cytokinů jak z makrofágů, tak z T-buněk (Yinduo Ji, 2007). Cytolyziny se dělí na 4 hemolyziny a leukocidin. Na krevním agaru jednotlivé kmeny druhu Staphylococcus aureus tvoří různě širokou a různě intenzivní hemolýzu, protože každý kmen tvoří různé množství hemolyzinů a také se některé hemolyziny vzájemně zesilují a jiné působí proti sobě. Z hemolyzinů je nejvýznamnější: - Alfa-hemolyzin u eukaryotických buněk poškozuje buněčnou membránu a je původcem nekróz - Pantonův-Valentinův leukocidin (PVL) tvoří drobné póry, které porušují leukocyty, a tím je ničí. Vyvolává závažné infekce, které mohou být i smrtelné (např. nekrotizující pneumonie, nekrotizující kožní infekce). Exfoliatiny jsou příčinou syndromu opařené kůže. Tento syndrom se vyznačuje tvorbou velkých puchýřů a odlupováním částí pokožky (Votava a kol., 2010). 14

16 Onemocnění způsobená druhem Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus vyvolává řadu onemocnění. Jedná se o hnisavé infekce, kdy k hnisání může dojít v jakémkoliv orgánu. Především bývá postižena kůže, na které vznikají: - Impetigo malé vředy, které nacházíme na povrchu kůže malých dětí a které jsou vyplněné žlutým hnisem - Vředy nazývané furunculus (nežit) a carbunculus jedná se o shluk furunklů - Absces ohraničené ložisko, které je zánětlivé. Tvoří se v něm dutina s hnisem, která se skládá z živých i rozpadajících se bakterií a leukocytů. Okolo abscesu se nachází fibrinová stěna a tkáň kolem bývá zanícená - Folliculitis infekce vlasového folikulu, která se vyznačuje tvorbou hnisu - Hordeolum (ječné zrno) na okraji očního víčka dochází k zánětu mazové žlázy - Blepharitis zánět víčka - Paronychium zánět nehtu - Panaritium zánět prsu - Mastitis vzniká především u kojících žen a jedná se o zánět mléčné žlázy - Syndrom opařené kůže (SSSS) vzácné, ale velmi závažné onemocnění způsobené pouze výjimečnými kmeny zlatých stafylokoků, vybavených určitými mimořádnými faktory virulence; vzniká převážně u dětí (Votava a kol., 2010; Vinš, 2014) Staphylococcus aureus také způsobuje hnisání ran a to jak popálenin, tak operačních ran. Z rány se stafylokoky dostávají do mízních uzlin, kde vyvolávají lymphadenitis (zánět mízních uzlin). Z mízních uzlin mohou putovat do krve a zde může dojít k rozvoji sepse (Votava a kol., 2010). Dále může tento stafylokok vyvolat onemocnění ohrožující život, ke kterým se řadí pneumonie, endokarditida, meningitida a řada dalších (Julák, 2012). Dalším typem onemocnění jsou infekce toxického typu, ke kterým patří syndrom toxického šoku, syndrom opařené kůže a enterocolitis (zánět střeva). Otravy z potravin vznikají při pomnožení stafylokoka v nějaké potravině a produkci enterotoxinů (Votava a kol., 2010). Všechny typy infekcí snadněji vznikají při poškození kůže nebo sliznic, ale tvoří se i ve tkáni, která je neporušená, prostřednictvím hyaluronidasy, kterou produkuje stafylokok (Julák, 2012). 15

17 2.1.2 Koaguláza-negativní stafylokoky Koaguláza-negativní stafylokoky (KNS) jsou gram-pozitivní kulovité bakterie uspořádané ve shlucích. Od kmenů S. aureus se pomocí mikroskopu nedají rozlišit, ale stejně jako tyto kmeny rostou na běžných půdách, odolávají vysychání a jsou schopné růst v přítomnosti 10% NaCl (Votava a kol., 2010). Nejsou producenty koagulázy a shlukovacího faktoru a pouze některé druhy produkují hemolyziny. Nejběžněji je izolován Staphylococcus epidermidis, jehož kolonie mají porcelánově bílou pigmentaci. Dále můžeme izolovat Staphylococcus hominis subs. hominis, S. hominis subsp. novobiosepticus, S. haemolyticus, S. warneri a několik dalších druhů. Kolonie S. haemolyticus jsou žlutě pigmentované, ale jejich odstín je lomený a působí jako špinavý. Kolonie u druhů tvořících sliz ulpívají na povrchu agaru, protože mají vazkou konzistenci (Votava a kol., 2010). Mezi nedávno objevené koaguláza-negativní stafylokoky v lidských vzorcích patří S. jettensis, S. massiliensis, S. pettenkoferi, S. pseudolugdunensis a S. petrasii (včetně S. petrasii subsp. petrasii a S. petrasii subsp. croceilyticus). Zároveň dva druhy stafylokoků řazených mezi koaguláza-negativní byly z této skupiny odebrány. Jedná se o S. pulvereri, který je identický jako dříve popsaný S. vitulinus a dále se jedná o S. caseolyticus, který byl zařazen do rodu Macrococcus. Tento rod zahrnuje gram-pozitivní a kataláza-pozitivní koky. Jsou to větší buňky než stafylokoky, v DNA mají vyšší množství cytosinu a guaninu a v jejich buněčné stěně se nevyskytuje kyselina teichoová (Becker a kol., 2014). Koaguláza-negativní stafylokoky jsou složkou normální mikrobiální flóry kůže a sliznic. Spíše se vyskytují na místech s vyšší vlhkostí, na těle se tudíž jedná o podpaží, hýždě, třísla, loketní a podkolenní jamku. Také se vyskytují v oblasti předních nosních dírek (stejně jako S. aureus), na povrchu oka a spojivky. S. epidermidis vylučuje serinovou proteázu Esp, která rozkládá biofilm, který vytváří S. aureus a zabraňuje mu v kolonizaci nosní sliznice (Becker a kol., 2014). Tabulka č. 1: Přehled místa výskytu jednotlivých stafylokoků (Becker a kol., 2014) Stafylokok Místo výskytu S. epidermidis Podpaží, inguinální a perineální oblast, spojivka, přední nosní dírky S. haemolyticus, S. hominis Podpaží, stydká oblast s vysokým množstvím apokrinních žláz S. capitis Okolí mazových žláz na čele a vlasové pokožce 16

18 S. lugdunensis Pánevní a perineální oblast, třísla, dolní končetiny, podpaží S. auricularis Vnější ucho S. pettenkoferi Lidská kůže S. saprophyticus subsp. saprophyticus Konečník, urogenitální trakt S. saprophyticus také kontaminuje syrové hovězí a vepřové maso, protože je součástí gastrointestinálního traktu skotu a prasat. Ve velkém procentu (65,7%) byl ve vzorcích pitné vody z distribuční sítě, která zásobuje spotřebitele, nalezen S. pasteuri (Becker a kol., 2014) Faktory virulence a patogenita U koaguláza-negativních stafylokoků se za faktory virulence považují jejich delta-hemolyziny a látky, které využívají ke vzniku biofilmu (slizové hmoty). Jako patogeny působí pouze tehdy, pokud jsou pro ně splněny určité podmínky (proto se označují jako oportunní patogeny). Napadají nezralé novorozence, pacienty s nízkým počtem neutrofilních granulocytů a především pacienty s implantovanými a zavedenými pomůckami. Jedná se o umělé srdeční chlopně, kardiostimulátory, různé katetry (močové, intravenózní, dialyzační), kloubní protézy, likvorové shunty atd. K rozvoji infekce dochází tak, že po zavedení těchto pomůcek do těla se jejich povrch začne obalovat vrstvou krevních bílkovin. Na bílkoviny nasedají mikroby, které pocházejí z kůže (hlavně S. epidermidis), a to buď přímo, nebo pomocí krevního oběhu. Na površích se mikroby množí a vyvolávají tvorbu biofilmu, který obsahuje sliz působící především na polymorfonukleáry (granulocyty). Zabraňuje jim fagocytovat a zabíjet stafylokoky, které jsou poté odolné i vůči antibiotikům (Votava a kol., 2010). Tato skupina stafylokoků způsobuje infekce krevního řečiště po zavedení výše uvedených pomůcek. Infekce krevního oběhu se projevují jako bakteriémie a mohou přecházet až v sepsi. Také mohou být za spoluúčasti jiných mikrobů původcem mozkových abscesů a mohou infikovat operační rány. Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus vyvolává u mladých žen infekce močového traktu, u starších osob s trvalým katetrem odpovídají za tyto infekce jiné druhy (např. S. epidermidis, S. haemolyticus) (Votava a kol., 2010). Nejčastějším původcem infekcí je S. epidermidis, dále S. hominis, S. haemolyticus a S. capitis. Druhým nejběžnějším původcem endokarditidy je S. lugdunensis (Becker a kol., 2014). 17

19 KNS jsou také přenášeny ve zdravotnickém zařízení, podobně jako MRSA (původci nozokomiálních nákaz). Nadužíváním antibiotik a vpravením cizích těles do těla u nich vzniká (multi)rezistence na antibiotika a antiseptika, tudíž se z nich stávají virulentnější kmeny, které přispívají k vyšší morbiditě a mortalitě. Například se na jednotkách intenzivní péče prokázalo, že s kolonizací a onemocněním předčasně narozených novorozenců jsou spojeny kmeny multirezistentních S. epidermidis a S. haemolyticus. K šíření KNS v nemocničním prostředí dochází v důsledku nedostatečné dezinfekce a/nebo sterilizace lékařských nástrojů a povrchů a nedostatečnou hygienou rukou (Becker a kol., 2014). S. epidermidis patří mezi středně patogenní stafylokoky. Vždy, když se prokáže v závažném klinickém vzorku (například v hemokultuře), by mělo být zjištěno, zda vyvolává příslušnou infekci, nebo se do vzorku dostal z kůže. Využívá se pro studium výskytu infekcí spojených se zdravotní péčí. Vyvolává spíše subakutní nebo chronické infekce s nespecifickým a nepatrným klinickým obrazem. Původcem život ohrožujících nebo smrtelných infekcí je pouze výjimečně (Becker a kol., 2014) Meticilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) V dřívější době se stal Staphylococcus aureus významným patogenem vyvolávající převážně infekce získané v nemocnicích, ale v současné době je izolován i z infekcí získaných ve společenství lidí. Jedná se o invazivní infekce, které byly před vynalezením antibiotik velmi často smrtelné. Objevení penicilinu vedlo ke zlepšení prognózy u pacientů s těžkými infekcemi. Po několika letech se S. aureus stal na toto antibiotikum rezistentní kvůli produkci β-laktamázy, která jej hydrolyzuje. Proto byl vyvinut meticilin (a také v našich podmínkách mnohem běžnější oxacilin), který odolává působení penicilinázy (druh β-laktamázy) a využívá se pro léčbu infekcí vyvolaných stafylokoky produkující tento enzym. Po určité době používání se staly některé kmeny S. aureus na meticilin rezistentní a tyto kmeny, nazvané MRSA, se rozšířily v nemocnicích po celém světě. To vedlo k výskytu mnoha případů bakteriémie, pneumonie, infekcí v chirurgických ranách a dalších nozokomiálních infekcí. Nozokomiální MRSA infekce jsou velmi závažné, protože ohrožují pacienta vysokou morbiditou a mortalitou a také jsou zátěží pro zdravotní péči, protože tito pacienti vyžadují delší pobyt v nemocnicích. Staphylococcus aureus je také druhým nejčastějším původcem infekcí krevního řečiště a v roce 2001 bylo prokázáno, že kmeny MRSA se podílejí na těchto infekcích z 57 % (Yinduo Ji, 2007). V komunitním prostředí se kmeny MRSA vyskytly v roce 1990 (označují se jako community-acquired MRSA nebo CA-MRSA). Vyvolávají především kožní abscesy, 18

20 nekrotizující pneumonii, furunkulózu a šok s následkem smrti. V tomto roce také začaly vznikat infekce u pacientů bez rizikových faktorů, které jsou spojené s nemocničním prostředím (označují se hospital-acquired MRSA nebo HA-MRSA). Jedná se například o chronické onemocnění, dialýzu, nedávný nemocniční pobyt, intravenózní užívání drog a infekce způsobené virem lidské imunodeficience (HIV). CA-MRSA jsou náchylné k antimikrobiálním látkám, ale jsou většinou rezistentní proti β-laktamáze. Za rezistenci na meticilin odpovídá mec gen typu IV., který je součástí stafylokokové kazety chromozomu mec (SCCmec). Faktory virulence u nich tvoří unikání kombinace a jsou geneticky jiné než u HA-MRSA (Yinduo Ji, 2007) Mechanismus antibiotické rezistence Existují modifikace normálního penicilinu vázající protein (PBP) a získaného penicilinu vázající protein (PBP2a). Na cytoplasmatické membráně S. aureus se vyskytují čtyři PBP, které se v buněčné stěně bakterií podílí na zesíťování peptidoglykanu. Tyto PBPs mají vysokou afinitu k β-laktamovým antibiotikům a jejich aktivita je podobná jako u serinových proteáz. Pokud dojde k navázání proteinu na penicilin, tak PBPs nefungují v buněčné stěně a způsobují smrt bakterií. PBP2a je unikátní a obsahuje protein, jehož molekulová hmotnost je přibližně 76 kda a produkují ho pouze meticilin-rezistentní stafylokoky. Na rozdíl od PBP má nízkou afinitu k β-laktamovým antibiotikům a také dokáže i za účasti β-laktamů nahradit biosyntetickou funkci PBPs, a tím znemožní buňkám lyzovat. Mechanismy antibiotické rezistence jsou klinicky rezistentní ke všem β-laktamům, včetně penicilinů, cefalosporinů, karbapenemů, monobaktamů a kombinacím β-laktamových/β-laktamázových inhibitorů (Yinduo Ji, 2007). Gen meca, který se nevyskytuje u kmenů citlivých na meticilin, kóduje PBP2a. Zatím není znám přesný původ tohoto genu, ale předpokládá se, že byl získán ze vzdáleně příbuzných druhů. Tento gen je přenášen na stafylokokovou kazetu chromozomu mec (SCCmec), která slouží jako mobilní genetický element. Na SCC se také nachází regulační geny, rekombináza a geny crr zodpovídající za integraci a odstranění SCCmec. Komplex genů mec je rozdělen do 4 tříd (třída A-D). Modelovým komplexem je třída A (třída A mec). Tato třída obsahuje meca, kompletní mecr1, regulační geny mecl namířené proti meca, hypervariabilní oblast (HVR) a pro meca se vkládá sekvence IS431. Třída B obsahuje meca, zkrácený mecr1vyplývající z vložení sekvence IS1272 proti meca, HVR a IS431 pro meca. Třída C se skládá z meca, zkráceného mecr1 pomocí vložení sekvence IS431 proti meca a HVR a IS431 pro meca. Rozlišují se dvě třídy C komplexu genů mec (C1 a C2 komplex). 19

21 Sekvence IS431 proti meca má ve třídě C1 stejnou orientaci jako IS431 pro meca. Ve třídě C2 má IS431 proti meca opačnou orientaci. Tyto dvě třídy pravděpodobně vznikly nezávisle na sobě, a proto se jedná o různé komplexy genů mec. Třída D se skládá z meca, mecr1, který ale nenese vkládací sekvenci pro mecr1 (Teruyo Ito, 2009). Komplex genů crr je rozdělen do tří alotypů. Skládá se z crr genů a z okolních otevřených čtecích rámců (ORFs), u některých zatím není zjištěna jejich funkce. Geny ccr rozdělujeme do tří fylogeneticky odlišných skupin (ccra, ccrb, ccrc). Všechny tři skupiny byly objeveny v sekvenci DNA u S. aureus v podobnosti pod 50%. Geny skupiny ccra a ccrb jsou dále rozděleny do čtyř alotypů. V současné době je nově navržená nomenklatura, podle které by měly být nové ccr geny formulovány na základě DNA sekvence v podobnosti pod 50 % a nově objevené alotypy ccr genů podle toho, zda jsou jejich sekvence podobné z 50 % až 85 %. Série alotypů byla definována na základě alelické variace v ccr. U S. aureus byl identifikován komplex genů crr, který zahrnuje typ 1 (nese ccra1b1), typ 2 (nese ccra2b2), typ 3 (ccra3b3), typ 4 (ccra4b4), typ 5 (ccrc). Všechny typy mohou být detekovány pomocí PCR metody s páry specifických primerů (Teruyo Ito, 2009) Detekce rezistence oxacilinu (meticilinu), klindamycinu, vankomycinu Většina buněk je citlivá na nízké koncentrace oxacilinu, ale při jeho koncentraci 50 μg/ml roste pouze malá část buněk. Proto bylo pro detekci rezistentních kmenů upraveno in vitro testování zvýšením exprese rezistence oxacilinu. Existuje několik metod k detekci rezistence oxacilinu u S. aureus, které doporučuje CLSI (Klinický a laboratorní institut pro normalizaci USA). Využívá se diskový difúzní test, bujóny a agary a plotna se očkuje vyšetřovaným mikrobem. U těchto metod musí být dodržena 24 hodinová inkubace při teplotě 37 C. Pokud se použijí diluční testy (E-testy, stanovení minimální inhibiční koncentrace a minimální baktericidní koncentrace), tak by se měly doplnit o Mueller-Hintonův bujón nebo agar s 2 % NaCl. Očkování na plotnu je velmi účinné pro detekci kmenů S. aureus obsahujících gen meca, který zajišťuje rezistenci na oxacilin. Ale pokud se na plotně vyskytují i kmeny s heterogenní rezistencí, tak je účinnost mnohem menší. Kontrolní laboratoře tento test využívají pro screening pacientů kolonizovaných infekcí. Také je to doporučená metoda, která by se měla provádět při použití dilučních metod pro potvrzení rezistence meticilinu u S. aureus. U diskového difúzního testu bylo prokázáno, že účinnost difúzního disku cefoxitinu je ekvivalentní jako u difúzního disku oxacilinu a je snadnější odečítat difúzní disk oxacilinu. Poté se difúzní disk cefoxitinu začal používat pro určení rezistence k oxacilinu u stafylokoků, u kterých je rezistence zajištěna genem meca a je 20

22 preferován pro detekci rezistence oxacilinu u kmenů S. aureus meca pozitivních a koaguláza negativních stafylokoků, před difúzním diskem oxacilinu. Výsledky by neměly být vyjádřeny pro cefoxitin, ale pro oxacilin (Yinduo Ji, 2007). U stafylokoků je mechanismem rezistence makrolidů ribosomální metyláza, která je kódována erm geny (MLS B fenotyp). Dalším mechanismem rezistence jsou efluxní pumpy kódované msr geny (M fenotyp). Stafylokoky jsou rezistentní vůči erytromycinu a klindamycinu, pokud je rezistence MLS B konstitutivní. Ale pokud je rezistence indukovaná, tak jsou kmeny rezistentní na erytromycin a je vyvolána i rezistence vůči klindamycinu. U kmenů, které jsou rezistentní na erytromycin a citlivé ke klindamycinu, je mechanismem rezistence efluxní pumpa. Indukce se prokazuje buď na krevním agaru, nebo Mueller- Hintonově plotně. Na obě půdy se klade disk klindamycinu a erytromycinu. Kmeny, u kterých nedošlo ke zploštění klindamycinové zóny, jsou označovány jako citlivé na klindamycin. Kmeny, u kterých došlo ke zploštění zóny citlivost ke klindamycinu ze strany, kde je vedle ní umístěn disk erytromycinu, jsou považovány za rezistentní na klindamycin. Indukovanou rezistenci ke klindamycinu je velmi důležité detekovat u CA-MRSA, protože se jedná o doporučené antibiotikum k léčbě infekcí, vyvolaných těmito kmeny (Yinduo Ji, 2007). Vankomycin byl dříve účinný proti všem stafylokokům, a proto se také využíval paušálně k léčbě infekcí vyvolaných MRSA. Ale od roku 1997 se začaly objevovat kmeny S. aureus se střední citlivostí na vankomycin (minimální inhibiční koncentrace = MIC byla 8 16 μg/ml), a proto se dnes vankomycin sice i nadále považuje za lék volby u závažných infekcí způsobených MRSA, avšak doporučuje se ověřit citlivost kmene k tomuto antibiotiku. Kvantitativní test určení minimální inhibiční koncentrace se přitom volí např. u kmenů izolovaných z materiálů, které bývají normálně sterilní jako například likvor nebo hemokultura. Tato metoda se provádí v mikrotitračních destičkách a pro reakci se využívá růstové médium a různé koncentrace antibiotik (kultivace 24 hodin při 37 C).,,Za MIC se považuje nejnižší koncentrace antibiotika, která je ještě schopna potlačit (inhibovat) růst testovaných mikrobů. (Votava a kol., 2010) Výsledná hodnota se poté porovnává s hraniční hodnotou určitého antibiotika. Mikrob je na antibiotikum citlivý, pokud je hodnota MIC nižší nebo stejná jako hraniční hodnota (Yinduo Ji, 2007). Vankomycin působí na syntézu buněčné stěny, protože se váže na C-terminál komplexu pentapeptidu buněčné stěny a zabraňuje tak její syntéze (Yinduo Ji, 2007). CLSI uvádí, že při testování citlivosti na vankomycin u S. aureus jsou jako citlivé izoláty označovány ty, které mají MIC vankomycinu 4μg/ml. Jako středně citlivé pak izoláty s MIC 8 16 μg/ml. Rezistentní izoláty mají MIC 32 μg/ml. Bohužel tato klasifikace 21

23 nemusí být dostačující, jak ukázal případ pacientů s MRSA infekcí, u kterých nezapůsobila léčba pomocí vankomycinu. U těchto izolátů byla prokázána MIC 4 μg/ml, avšak vyskytla se subpopulace buněk se střední citlivostí vůči vankomycinu. V současné době jsou tyto izoláty označovány jako heterogenní izoláty S. aureus (hvisa). VRSA kmeny (vankomycinrezistentní S. aureus) s MIC 32 μg/ml jsou detekovány pomocí Mueller-Hintonova bujónu (inkubace 24 h při 37 C). Pokud se nalezne MIC 4 μg/ml u jakéhokoliv stafylokoka, tak by tyto vzorky měly být poslány do referenční laboratoře pro ověření (Melicherčík a kol., 2010; Yinduo Ji, 2007). 2.2 Rod Bacillus Rod Bacillus se zařazuje do čeledi Bacillaceae, která je velkou skupinou zahrnující různorodé rody a druhy. Typickým znakem tohoto rodu je tvorba endospor, které mohou být kulaté, oválné nebo válcového tvaru. Endospory se tvoří uvnitř bakteriální buňky (Slepecky, Hemphill, 2006). V buňce vždy vzniká pouze jedna spora a její uložení může být různé - centrální (uprostřed buňky), subterminální neboli paracentrální (nedaleko konce buňky) nebo terminální (na konci těla bakterie) (Sedláček, 2007). Spora bakterie rodu Bacillus nebubří, tudíž nedochází ke zduření buňky v místě spory a nepřesahuje šířku bakteriálních buněk. Endospory jsou velmi odolné (odolávají vysychání, teplu, chladu, dezinfekčním prostředkům a záření) a díky nim mohou bakterie přežívat dlouhou dobu v nepříznivých podmínkách (Baron a kol., 1996). Nepřijímají Gramovo barvivo a pod mikroskopem se jeví jako světlolomné tvary. K barvení používáme metody jako u acidorezistentních tyčinek (například barvení za horka), ale spory se těžko odbarvují i při užití silných odbarvovacích tekutin (Votava, 2005). Bakterie rodu Bacillus jsou gram-pozitivní tyčinky aerobní nebo fakultativně anaerobní. Mohou být různě dlouhé, většinou rovného tvaru a jejich konce jsou buď zakulacené, nebo čtvercovité. Pohybují se pomocí peritrichálních bičíků a mnohdy vytváří dvojice nebo se spojují do řetízků. Rostou při teplotě mezi C, některé druhy jsou producenty pouzder a pigmentů a většinou bývají kataláza-pozitivní. Mohou i nemusí na krevním agaru vytvářet hemolýzu. Pokud ji tvoří (jako např. Bacillus cereus), tak se jedná o β-hemolýzu (Sedláček, 2007). Z pohledu významu pro klinickou mikrobiologii jde o bakterie vesměs minimálně patogenní, jejich nálezy na Petriho miskách s kultivací klinických vzorků se zpravidla hodnotí jako pravděpodobná kontaminace laboratorního prostředí a pouze v případě opakovaného 22

24 nálezu uvažujeme o jejich případném klinickém významu. Výjimku tvoří dva výrazněji patogenní druhy, B. anthracis a B. cereus. I když ty nebyly přímo předmětem mé práce, stručně je zde také uvedu Bacillus anthracis Bacillus anthracis jsou gram-pozitivní aerobní tyčinky poměrně dlouhé i široké. Uspořádávají se do řetízků, které mají podobu bambusové tyče. Spory dokáže tvořit pouze v přítomnosti kyslíku a také vytváří polypeptidové pouzdro. Bacillus anthracis je charakteristický svými šedobílými táhnoucími se koloniemi na krevním agaru. Kolonie mohou dosahovat velikosti až kolem 1 cm a typický je také jejich rozcuchaný provázkovitý povrch (označují se jako caput Medusae ). Na krevním agaru roste pouze v přítomnosti zvýšeného množství CO 2 a netvoří β-hemolýzu (Schindler, 2014; Votava a kol., 2010). Faktory virulence B. anthracis produkuje komplexní (anthraxový) toxin, který je hlavním faktorem virulence. Dalším faktorem virulence je pouzdro. Anthraxový toxin se skládá ze tří částí. První součástí je edemogenní faktor (faktor I). Jedná se o adenylátcyklasu, která způsobuje otoky při onemocnění anthraxem. Dochází ke ztrátám vody a iontů tím, že v buňce vyvolává nárůst camp. Druhou složkou je protektivní antigen (faktor II), který zajišťuje faktoru I a III dostávat se do buněk prostřednictvím vazby na jejich membrány. Poslední částí je letální faktor (faktor III), což je komplex proteáz. Díky své aktivitě ničí buňky a dávají vznik zánětu (Julák, 2012). Bakterie jsou před působením imunitního systému a fagocytózou ochraňovány pomocí bakteriálního pouzdra. Faktory virulence jsou kódovány geny, které se nachází na plazmidech. Pokud dojde k jejich úbytku, kmeny ztrácí virulenci (Votava a kol., 2010). Patogeneze Bacillus anthracis je původcem smrtelného onemocnění anthraxu (neboli sněť slezinná). Jedná se o závažné onemocnění hospodářských zvířat i lidí (Julák, 2012). Lidé se mohou nakazit přímo při styku s infikovaným zvířetem nebo nepřímo prostřednictvím zvířecích produktů (Baron a kol., 1996). Jakmile se spory B. anthracis dostanou do organismu, začínají růst a vytvářet toxin. Toxin způsobuje nekrózu a otoky. Bakterie se poté 23

25 dostávají do krevního systému přes lymfatické cévy a zde jsou zdrojem sepse (Votava a kol., 2010). Existuje několik forem anthraxu. Z více než 95 % vzniká kožní forma, při které se objevují příškvary na kůži (pustula maligna). K průniku bakterií do organismu dochází prostřednictvím poraněné kůže. Jakmile není tato forma léčená, může se rozvinout sepse a tento stav až z 20 % končí smrtí. Dalším typem anthraxu je střevní forma. K jejímu rozvoji dochází při požití infikovaného masa býložravce. Při střevní formě vzniká nekróza ve sliznici GIT z důvodu proniknutí spor B. anthracis do těchto míst. Nekróza může opět vést k rozvinutí sepse a smrti. A poslední formou je plicní anthrax, který je nejzávažnější. Při nezahájení včasné léčby končí ze 100 % smrtí. K rozvoji plicní formy anthraxu dochází při vdechnutí prachových částic obsahujících spory B. anthracis. Spory se v plicích roznáší do mezihrudí, kde jsou původci nekrotizujícího zánětu, který přechází v sepsi (Baron a kol., 1996; Votava a kol., 2010). Bacillus anthracis byl také využit jako biologická zbraň a prostředek bioterorismu. Důvodem jsou jeho vysoce odolné spory a možnost vyvolávat smrtelnou nákazu, především se jedná o plicní anthrax (Votava a kol., 2010). V dnešní době se s tímto onemocněním setkáváme spíše v méně rozvinutých oblastech (Afrika, Jižní Amerika a Asie), protože byla zavedena protiepidemická opatření. V endemických oblastech se očkují hospodářská zvířata. Očkování by se mělo provádět pravidelně jednou za rok. Lidé se očkují pouze při výkonu rizikových profesí (např. pracovníci na veterinách, vojáci některých armád). U zvířat se k vakcinaci využívají živé spory, které ale nejsou schopny vyvolat onemocnění. Lidé se očkují inaktivovanými toxiny (toxoidy). Oba typy vakcín indukují humorální a buněčnou imunitu, a tím zajišťují ochranu antigenních složek anthraxového toxinu. Při styku člověka se spory B. anthracis se mohou začít profylakticky podávat antibiotika. Ohrožený jedinec užívá amoxycilin, ciprofloxacin a deoxymykoin během následujících 60 dní (Baron a kol., 1996; Votava a kol., 2010) Bacillus cereus Bacillus cereus je fakultativně anaerobní gram-pozitivní tyčinka. Na krevním agaru roste ve velkých plstnatých koloniích a také tvoří spory, které nebubří tyčinku. Na rozdíl od Bacillus anthracis nemá schopnost tvořit pouzdro a vykazuje β-hemolýzu. Jedná se o bakterie, které běžně nacházíme v prostředí, vodě, půdě a které kontaminují potraviny. Také jsou součástí běžné lidské střevní mikroflóry (Votava a kol., 2010; Julák, 2012). 24

26 Faktory virulence a patogeneze Hlavními faktory virulence jsou toxiny a enzymy. Z enzymů B. cereus produkuje oxygenlabilní cereolysin a oxygenstabilní hemolyzin II (jedná se o hemolyziny) a fosfolipasu C. Z toxinu se jedná o enterotoxiny, které vyvolávají enterotoxikózy. Mezi enterotoxiny se řadí průjmový a emetický toxin, které zvyšují syntézu camp a cgmp ve střevních buňkách. Tato syntéza vede k úniku vody a průjmům. Také dochází ke zvracení vlivem dráždění nervus vagus v žaludku (Votava a kol., 2003). Emetický toxin je polypeptid nazývající se cereulid, který je termostabilní, což znamená, že odolává teplotě 126 C po dobu 90 minut. Také je vysoce odolný vůči nízkému ph (odolává žaludeční šťávě) a proteolytickým enzymům. Tento toxin je původcem emetické enterotoxikózy, která se projevuje zvracením, nevolností a křečemi v břiše. Příznaky se objevují do 1 5 hodin po pozření potraviny obsahující tento toxin, který se vyskytuje nejčastěji v potravinách, jejichž složkou je škrob (např. rýže, těstoviny). Spory B. cereus při vaření velkého množství rýže a následného zchlazení vyklíčí a buňky zahájí produkci toxinu (Votava a kol., 2003; Brooks a kol., 2010). Cereulid se vyskytuje pouze u kmenů vyvolávajících emetickou formu onemocnění. Tvoří se prostřednictvím neobvyklé syntézy, která se označuje jako neribosomální peptidová syntéza (NRPS). Tato syntéza je zakódována buď na plasmidu pcere01, nebo pbce4810 (Julák, 2012). Průjmový toxin se od emetického toxinu liší tím, že je termolabilní a neodolává proteolytickým enzymům (pepsin a trypsin). Velice se podobá toxinu Vibrio cholerae. Množí se především v omáčkách a mase a po požití potravin obsahujících tento toxin dochází ke vzniku vodnatých průjmů, křečím v břiše a méně často k horečce a zvracení. Tyto příznaky se objeví do 6 16 hodin. Průjmový toxin může také nekrotizovat tkáň a zvyšovat propustnost cév (Votava a kol., 2003, Brooks a kol., 2010). Enzymy produkované B. cereus mohou vzácně u oslabených osob způsobit infekce. Hovoříme o něm jako o oportunním patogenu. Vyvolává infekce ran, GIT, zánět membrán mozku a míchy (meningitida), zánět endokardu (endokarditida), zápal plic, sepsi, infekce nedonošených dětí atd. Také je původcem endoftalmitidy, která vzniká po poranění oka. Prostřednictvím proteolytických enzymů může dojít ke ztrátě celého oka, protože enzymy zničí obsah oční koule. Při intravenózním užívání drog se zvyšuje riziko vzniku těchto infekcí (Votava a kol., 2003; Brooks a kol., 2010). Některé kmeny B. cereus jsou důležité u zvířat. Působí u nich jako probiotika. Ve střevě hospodářských zvířat snižuje množství některých bakterií (např. Salmonella, Campylobacter). Probíhá to prostřednictvím probiotik ve formě potravy. Probiotika obsahují 25

27 neškodné kmeny B. cereus. Zvířata se lépe vyvíjí a rostou a jejich maso je poté bezpečnější jako zdroj lidské potravy (Julák, 2012) Ostatní druhy rodu Bacillus Existuje velká řada dalších druhů rodu Bacillus. V této kapitole si stručněji popíšeme pouze některé z nich. Některé druhy mohou být patogenní pro člověka i zvířata, ale většinou se jedná o bezpečné druhy saprofytů (Baron a kol., 1996). Druhy Bacillus brevis, B. subtilis, B. licheniformis aj. u osob mohou působit jako oportunní patogeny (Votava a kol., 2010). Bacillus brevis je aerobní tyčinka tvořící spory. Barví se gram-pozitivně až gramvariabilně a má schopnost pohybu. Tohoto mikroba nacházíme ve vodě, půdě, vzduchu a hnijícím materiálu. Z kmenů B. brevis byla poprvé získána antibiotika tyrocidin a gramicidin (Julák, 2012). Bacillus subtilis (senný bacil, trávní bacil) je tyčinka barvící se gram-pozitivně a tvořící endospory. Endospory se tvoří, pokud se mikrob nachází na místě se špatnými podmínkami pro život, a tím mu zajišťují ochranu. Endospory jsou velmi odolné, snáší kyseliny, soli a var. Spory B. subtilis vyvolávají kontaminaci potravin a přežívají i při jejich vaření. Většinou nezpůsobují otravy, ale při skladování uvařených potravin mohou zahájit tvorbu bakteriálních polysacharidů, které jsou lepkavé. Na potravině se tento jev projevuje lepkavými provázky. Také je producentem enzymu subtilisinu (Julák, 2012). Bacillus licheniformis je gram-pozitivní tyčinka, termofilní, za vhodných podmínek netvoří spory, ale vyskytuje se ve vegetativní formě. Spory tvoří pouze za nepříznivých podmínek. Nachází se v půdě a peří ptáků, na jejich ocasu a hrudi. B. licheniformis produkuje proteasy, které se přidávají do pracích prášků. Proteasy snáší vysoké ph, protože tento mikrob je schopný růst v zásaditém prostředí. Při praní při nižších teplotách je vhodné používat tyto prací prostředky s proteasami, protože mají schopnost ničit nečistoty proteinové povahy (Julák, 2012). Dalšími druhy rodu Bacillus jsou patogeny hmyzu. Jedná se o pět druhů B. thuringiensis, B. sphaericus, B. lentimorbus, B. larvae a B. popilliae. Některé jsou využívány jako insekticidy. Zároveň vznikly pochybnosti o geneticky upravených rostlinách a potravinářských produktech. Problémem byly geny B. thuringiensis, které kódují insekticidní sloučeniny a které byly vpraveny do genetického materiálu těchto rostlin (Brooks a kol., 2010). 26

28 Některé další druhy jsou používány ve farmaceutickém, lékařském a zemědělském průmyslu. Uplatňuje se zde jejich schopnost produkce antibiotik, enzymů a jiných metabolitů a velké škály fyziologických vlastností. Příkladem jsou antibiotika polymyxin a bacitracin a využití ve farmaceutických a lékařských testech jako standardů. Dále se některé druhy rodu Bacillus podílejí na rozkladu odpadních produktů. Další možností využití těchto druhů je pro testování sterilizačních a fumigačních postupů, k čemuž se využívá B. subtilis subsp. globigii. Pro testování tepelné sterilizace se uplatňují spory Geobacillus stearothermophilus (Brooks a kol., 2010); rod Geobacillus byl před nedávnem vyčleněn z rodu Bacillus. 2.3 Rod Micrococcus a příbuzné rody Mikrokoky a jim příbuzné bakterie jsou gram-pozitivní koky vyskytující se ve dvojicích, tetrádách a nepravidelných shlucích. Jejich průměrná velikost je kolem 1 1,8 μm. Nejsou schopny tvořit spory, nepohybují se a většina druhů má schopnost produkovat karotenoidní pigment, který je žlutý nebo světle oranžový. Převládá u nich přísně aerobní respirační metabolismus a jsou kataláza i oxidáza pozitivní. Mohou růst i v přítomnosti 5% NaCl a jejich optimální teplota pro růst je C. Běžně se vyskytují ve vodě, půdě, vzduchu a potravinách (maso), ale především je nacházíme na kůži člověka i zvířat. Objevují se v menší míře než Staphylococci a také méně často působí jako oportunní patogeny. Řadí se mezi saprofyty (Sedláček, 2007; Kocur a kol., 2006; Murray a kol., 2003). Tento rod se od rodu Staphylococcus liší v množství guaninu a cytosinu v DNA. Množství G + C u rodu Micrococcus je %. U rodu Staphylococcus je obsah těchto dvou složek přibližně o polovinu nižší. Micrococci ve své membráně neobsahují teichoovou kyselinu a glycin, který je zabudovaný v peptidoglykanu. Další rozdíly jsou ve složení cytochromu v respiračním řetězci. Rod Micrococcus obsahuje všechny 4 typy cytochromu (a, b, c, d typ), zatímco rod Staphylococcus obsahuje pouze typ a a b. V praxi tyto dva rody od sebe snadno rozeznáme pomocí resistence na bacitracin a citlivosti k furazolidonu u rodu Staphylococcus (Murray a kol., 2003). Dřívější rod Micrococcus byl později na základě dalších analýz rozdělen do šesti různých rodů. Prvním je nově definovaný rod Micrococcus, který obsahuje pouze druhy M. luteus a M. lylae. Druhým rodem je Kocuria (pojmenovaná po dlouholetém pracovníkovi České sbírky mikroorganismů v Brně, dr. Kocurovi), zahrnující dříve označované druhy Micrococcus varians, M. roseus a M. kristinae. Třetím rodem je rod Dermacoccus, řadí se 27

29 sem s původním označením M. nishinomiyaensis, čtvrtým je rod Nesterenkonia zahrnující M. halobius, označení obou druhů je opět původní. Pátý rod Kytococcus s druhem M. sedentarius a šestý rod Arthrobacter obsahující M. agilis (Murray a kol, 2003) Micrococcus luteus a Micrococcus lylae Micrococcus luteus je saprofytická gram-pozitivní bakterie. Na běžných půdách roste ve žlutých až oranžových koloniích kulovitého tvaru. Toto zabarvení způsobuje karotenoidní pigment označovaný jako sarcina xantin. Může být získán z vhodných rozpouštědel a využívá se v různých analytických metodách (např. gelová permeační chromatografie, nukleární magnetická rezonance, HPLC). Dříve byl označován jako Micrococcus lysodeikticus, ale tento název již neplatí. Probíhá u něj striktně aerobní metabolismus a je koaguláza-negativní. Velmi se podobá Staphylococcus aureus. Pro jejich odlišení se využívá bacitracinový test, na který je M. luteus značně citlivý. Tvoří složku běžné mikroflóry kůže savců, u lidí se vyskytuje v horních cestách dýchacích, na sliznicích, v ústech a orofaryngu. Také můžeme M. luteus nacházet v prachu, půdě, vzduchu a vodě. Jeho velkou schopností je, že dokáže přežívat velmi dlouhou dobu v prostředí, které je chudé na živiny. Byla provedena studie, která předpověděla, že životaschopný vydrží až 170 tisíc let (Julák, 2012; Pawar a kol, 2016). M. luteus je nepatogenní bakterie, ale může působit jako nosokomiální původce u oslabených osob. Může být původcem pneumonie, meningitidy, septické artritidy a abscesů. Pokud se v nějakém vzorku prokáže, většinou se jedná o kontaminaci (Julák, 2012; Murray a kol, 2003). Micrococcus lylae tvoří nepigmentované, krémově bílé kolonie. Od M. luteus se odlišuje neschopností vyrůstat na agaru s přídavkem dusíku a také je odolný vůči lysozymu. K léčbě onemocnění způsobených rodem Micrococcus se využívá penicilin, vankomycin, gentamycin, klindamycin nebo jejich kombinace (Murray a kol., 2003). 28

30 3 KULTIVAČNÍ PŮDY Kultivační půdy se využívají k přímému průkazu infekčního agens. Je to důležitá metoda především pro identifikaci vyrostlých mikrobů a ke zjištění jejich citlivosti k antimikrobiálním látkám, ale jsou velice zdlouhavé. Proto jsou nahrazovány molekulárně biologickými metodami, jako je průkaz nukleových kyselin a antigenů, ale tyto metody nedokážou zcela zastoupit klasickou kultivaci (Votava, 1999). Další nevýhodou kultivace je, že mohou vznikat falešně negativní výsledky při kultivaci náročných bakterií nebo bakterií, které se nedají kultivovat. Aby byla kultivace úspěšná a aby nám bakterie vyrostly v čisté kultuře, je potřeba dodržovat řadu podmínek, které si blíže vysvětlíme v následujících kapitolách (Juránková, 2011). 3.1 Metabolismus bakterií Metabolismus bakterií je zajištěn souborem chemických reakcí, které probíhají v buňkách bakterií a díky kterým se bakterie množí a rostou. Reakce, při kterých dochází ke štěpení sloučenin, se označují jako katabolismus. Opačné reakce jsou označovány jako anabolismus (biosyntéza). Většina těchto reakcí je katalyzována enzymy. Aby enzymy mohly působit, musí být v reakci přítomny další molekuly, tzv. kofaktory. Jedná se buď o ionty kovů (např. vápníku), nebo vitamíny (označují se koenzymy) (Votava, 1999) Zdroje energie a živin Zdrojem energie pro většinu bakterií je oxidace redukovaných látek. U patogenních bakterií dochází k oxidaci organických látek, a proto se označují jako chemoorganotrofy. Tato oxidace bývá nazývána také jako dehydrogenace, protože z molekuly redukovaných látek se odštěpuje proton i elektron a vytváří atom vodíku. Elektrony se v bakteriích přemísťují na některé molekuly, které se nachází v cytoplazmatické membráně a během tohoto přemístění dochází k uvolnění energie, která se ukládá v molekule ATP (adenosintrifosfát) ve formě makroergických vazeb (Votava a kol., 2010). Zdroje uhlíku. Bakterie mohou uhlík získávat z oxidu uhličitého, jedná se o autotrofy. Patogenní bakterie získávají uhlík stejně jako energii, tudíž prostřednictvím oxidace organických látek. Dalšími zdroji mohou být lipidy, proteiny, nukleové kyseliny a sacharidy. Jednoduché sacharidy (např. glukóza) do buňky pronikají přímo, zatímco enzymaticky rozštěpeny musí být složité sacharidy (např. škrob). 29

31 Zdroje dusíku, síry a fosforu. Dusík bakterie získávají z amoniaku, síru a fosfor ve formě síranů a fosfátů (Votava a kol., 2010) Vztah ke kyslíku a oxidoredukční potenciál Podle toho, jaký mají mikroby vztah ke kyslíku, je dělíme do čtyř až šesti skupin. První skupinou jsou striktní aeroby, které rostou pouze za přítomnosti kyslíku (např. Pseudomonas). Fakultativní anaeroby rostou lépe v přítomnosti kyslíku, ale mohou růst i bez kyslíku. Do této skupiny lze zařadit většinu klinicky významných bakterií (např. stafylokoky). Další skupinou jsou obligátní (striktní) anaeroby, pro které je kyslík toxický, tudíž rostou bez jeho přítomnosti. Některé druhy bakterií v jeho přítomnosti zahynou již během několika minut (např. Clostridium difficile). Do této skupiny se někdy přiřazují i aerotolerantní anaeroby, které v přítomnosti kyslíku přežívají, ale nemohou se množit (např. Clostridium perfringens). Mikroaerofily potřebují k růstu kyslík, ale v množství desetkrát menším než se vyskytuje v atmosféře (20 %). Příkladem je například rod Lactobacillus. S mikroaerofily bývají často zaměňovány kapnofilní mikroby, které vyžadují vyšší koncentraci CO 2. Do této skupiny patří například meningokoky a gonokoky (Votava a kol., 2010).,,Oxidoredukční potenciál (redox potenciál) odráží poměr mezi oxidovanými a redukovanými látkami v prostředí. (Votava a kol., 2010) Redox potenciál je u kultivačních půd, které jsou běžně používané a na které působí kyslík z atmosféry, v kladných hodnotách (kolem 200 mv). Kladnou hodnotu mají kvůli tomu, že jsou oxidovány. Tyto podmínky jsou vhodné pro aeroby, kteří ale při množení tento potenciál snižují do záporných hodnot. Pokud je redox potenciál negativní, prostředí je redukované a je vhodné pro anaeroby (hodnoty kolem 0 mv nebo i nižší). Takové podmínky můžeme získat odstraněním kyslíku nebo přidáním redukovaných látek (Votava a kol., 2010) Voda a odolnost vůči vysychání Voda je velice důležitá, protože převážná část bakterií ji potřebuje ve svém prostředí. Na nedostatek vody jsou nejvíce citlivé gonokoky a meningokoky a také jsou citlivější gramnegativní bakterie (např. treponemata). Vysychání lépe odolávají bakterie než viry. Z virů jsou odolné poxviry, virus hepatitidy B a papilomaviry. Z bakterií jsou odolnější gram-pozitivní bakterie (např. 30

32 stafylokoky) a acidorezistentní bakterie (např. Mycobacterium tuberculosis). Dále vysychání nepodléhají spory bakterií, vajíčka helmintů a cysty prvoků (Votava a kol., 2010) Teplota, osmotický tlak, ph a záření Patogenní bakterie pro svůj růst vyžadují optimální růstovou teplotu, která se nachází mezi 35 až 37 C. Tato teplota je ideální pro většinu bakterií, ale některé druhy potřebují i jiné teplotní rozmezí. Například salmonely rostou při teplotě 8 až 42 C. Mikroby, podle ideální teploty k růstu, rozdělujeme na (Votava a kol., 2010): a) Mesofily jejich teplotní rozmezí je C. Do této skupiny se řadí většina mikrobů, především patogenní mikroby, ale řada z nich má široké teplotní rozmezí. Některé mohou růst při teplotě kolem 0 C (např. listerie), jiné od 8 C (např. zlaté stafylokoky, salmonely) nebo také kolem 45 C jako například kampylobaktery. Při pokojové teplotě nebo při teplotě 28 C rostou plísně, kvasinky a prvoci (Votava, 1999) b) Psychrofily množí se při teplotě pod 20 C, patří sem nepatogenní bakterie jezer, oceánů a bahna c) Termofily jejich teplotní optimum je nad 40 C, jedná se o mikroby, které nejsou pro člověka patogenní Co se týče osmotického tlaku, tak mikroorganismy díky své pevné buněčné stěně nepraskají v hypotonickém prostředí, tudíž je pro ně toto prostředí vhodnější než hypertonické. V hypertonickém prostředí dochází ke smrštění cytoplasmy, ztrátě vody a nedochází k jejich dělení. Existují mikroby, které vyžadují ve svém růstovém prostředí vyšší množství soli. Označují se jako halofily (Votava a kol., 2010). Rozdělují se na halotolerantní halofily, které ke svému růstu nevyžadují zvýšenou koncentraci solí, ale zároveň jim nevadí a vyrostou i v její přítomnosti (např. enterokoky a stafylokoky) a dále obligátní halofily, které vždy potřebují zvýšenou koncentraci solí. Nachází se především v mořské vodě a lékařsky významné jsou halofilní vibria, například Vibrio parahaemolyticus (Votava, 1999). Hodnota ph většině mikrobů vyhovuje v oblasti neutrální, jedná se o ph mezi 6 a 8. V zásaditém prostředí se vyskytují alkofily, mezi které se řadí Vibrio cholerae. Roste při ph mezi 7,4 9,6, ale v kyselém prostředí nepřežívá. Alkalickému prostředí také odolávají enterokoky a mikroby, které štěpí proteiny a močovinu (např. rod Proteus). V kyselém prostředí nacházíme acidofily. Především se jedná o fakultativní acidofily, které rostou v kyselém i neutrálním ph. Příkladem je rod Lactobacillus, který snáší ph 6 i ph 3. Dále se 31

33 mezi acidofily řadí enterokoky a ústní streptokoky skupiny mutans (např. Streptococcus mutans). Kyselé i zásadité prostředí nesnáší gonokoky (Votava a kol., 2010). Záření je pro mikroorganismy škodlivé. Ionizační záření je nebezpečné při styku s kyslíkem, protože dochází ke vzniku radikálů (hydroxylu a superoxidu) poškozující molekuly DNA aj. UV-záření poškozuje zvláště báze nukleových kyselin, cystein a aromatické aminokyseliny obsahující benzenový kruh. (Votava a kol., 2010) 3.2 Rozdělení kultivačních půd Existuje mnoho druhů kultivačních půd, které se rozlišují podle jejich složení, konzistence a účelu, ke kterému se používají (Votava, 1999) Rozdělení kultivačních půd podle složení Podle složení se půdy rozdělují na přirozené (komplexní) a syntetické (jejich složení je přesně chemicky definované). Součástí přirozených půd jsou složky, které nelze chemicky definovat (masový vývar, kvasniční extrakt, bílkovinný hydrolyzát apod.). Základem těchto půd je zpravidla živný bujón, jsou docela levné a mají vynikající výživové vlastnosti. Přirozené půdy jsou nejvíce využívané v lékařské mikrobiologii. Syntetické půdy obsahují chemicky definované sloučeniny. Příkladem je minerálně modifikované glutamátové médium, které se využívá k znovuobnovení poškozených buněk Escherichia coli (Votava, 1999). Jedná se o půdy využívající se k určení potřeby aminokyselin, vitamínů a dalších růstových faktorů a které neobsahují tu složku, jejíž potřebu chceme ověřit (Votava a kol., 2010) Rozdělení kultivačních půd dle konzistence Do této skupiny se řadí půdy tekuté a pevné (agarové). Tekutými půdami jsou různé druhy bujonů, Šulova půda pro záchyt mykobakterií, některé cukrové půdy (určené pro biochemickou identifikaci) atd. Cukrové půdy se plní do úzkých zkumavek, které se nazývají cukrovky. Pro bujony se využívají bakteriologické zkumavky. Jedná se o silnostěnné zkumavky, které mají rovné okraje a jejich průměr je 16 mm. Naplňují se přibližně 10 ml bujonu. Všechny typy zkumavek se utěsňují vatovou nebo kovovou zátkou, někdy se také používá pryžová zátka (Votava a kol., 2010). V tekutých půdách je pro mikroorganismy snadno dostupná voda a živiny, proto zde vyrostou i z malé nebo staré kultury (pro tento účel 32

34 se tyto půdy označují jako resuscitační půdy) (Votava, 1999). Růst mikrobů v tekutých půdách se projevuje pouze zákalem, někdy blankou nebo sedimentem, což je jejich nevýhodou, protože ze zákalu nelze rozeznat, zda se jedná o směs mikrobů nebo o čistou kulturu (Votava a kol., 2010). Pevné půdy obsahují 1 2 % agaru a připravují se ztužením, především bujonového, základu. Agar se získává z mořských řas (agarofytů) a skládá se ze směsi polysacharidů agarosy a agaropektinu. Důležité je od sebe rozlišovat agary evropských a amerických výrobců. Americké agary se do pevných půd přidávají v koncentraci 1,5 2,0 %, protože hůře tvoří dostatečně tuhý gel. Evropské agary snadněji tvoří tuhý gel, a proto se do půd přidávají v koncentraci 1,2 1,5 %. Nejkvalitnější agarové půdy tuhnou až při 38 C a díky tomu můžeme k těmto půdám přidávat krev, prané erytrocyty, můžeme přenášet bakterie do tekutých půd, aniž by došlo ke ztrátě jejich životnosti atd. Pro uchování pevných půd se používají Petriho misky o průměru 9 cm (vyrábí se i misky jiných rozměrů). V současné době se vyrábí z polystyrenu a jsou opatřeny víčky. Půdy se do nich nalévají v množství 25 ml a pokud se nalijí do šikmé polohy, tak vznikají tzv. šikmé agary (Votava a kol., 2010) Rozdělení kultivačních půd dle účelu Podle účelu, ke kterému se půdy využívají, je rozdělujeme na základní, obohacené, diagnostické, selektivní a selektivně diagnostické. Dále existují půdy používané k určení citlivosti na antibiotika, ke stanovení účinných látek (např. vitaminů) aj. (Votava a kol., 2010). Zvláštním případem jsou transportní půdy a půdy, které slouží k uchovávání kultur. Zde nedochází k pomnožení mikrobů, a tudíž striktně vzato nejde o půdy kultivační. Ale to, že mikroby v těchto půdách přežívají, lze na druhou stranu považovat za zvláštní případ pěstování neboli kultivaci (Votava, 1999) Základní půdy Na základních půdách rostou takové mikroby, které k růstu nevyžadují žádné speciální nároky. Základní tekutou půdou je bujon a peptonová voda. Bujon je masový extrakt s peptonem. Slouží jako základ pro přípravu ostatních půd a rostou zde především nenáročné bakterie vyskytující se ve vodě. Peptonová voda je roztok, který neobsahuje masový extrakt, ale je v něm rozpuštěno 1 % peptonu a 0,5 % NaCl. Využívá se nejčastěji jako základ diagnostických půd a ke zjištění, zda jsou mikroby schopné kvasit sacharidy. Základní pevnou 33

35 půdou je živný (masopeptonový) agar, který se získává rozvařením přibližně 1,5 % agaru v bujonu (Votava a kol., 2010) Obohacené půdy Obohacené půdy slouží k pomnožení náročných bakterií (např. streptokoků, patogenních neisserií a hemofilů). Jejich základ se připravuje z kvalitnějších extraktů a přidávají se k němu další složky (např. vitaminy, hydrolyzáty, speciální peptony a bílkovinné koncentráty). Kromě těchto složek se do půd mohou přidávat další složky. Nejčastěji se přidává krev, dále séra (koňská a bovinní), hydrolyzovaný albumin atd. (Votava a kol., 2010). Mezi půdy obohacené krví patří zejména krevní agar, o kterém se více zmíním, protože patří mezi půdy, které jsem používala ke svému praktickému úkolu. Dále je krví obohacen čokoládový agar, který se připravuje z krevního agaru, zahřátím na 80 C. Používá se pro odhalení kapavky. Pokud horký čokoládový agar zfiltrujeme, tak získáme Levinthalův agar, který slouží k záchytu hemofilů. Další půdou obsahující krev je Bordetova-Gengouova půda, na které roste Bordetella pertussis a Bordetella parapertussis (původci dávivého kašle) (Votava a kol., 2010). Půdami obohacenými sérem je půda Šulova, která je tekutá a obsahuje bovinní sérum. Slouží k průkazu mykobakterií. Koňské sérum je obsaženo v půdách pro záchyt mykoplazmat a v Löfflerově séru. Toto sérum neobsahuje agar a roste na něm původce záškrtu (Votava a kol., 2010). Vaječnými půdami jsou McCoyova půda k izolaci francisel a Dorsetova půda, která slouží k uchování mikrobiálních kultur. Další vaječnou půdou je Löwensteinova-Jensenova půda, na které roste Mycobacterium tuberculosis (Votava a kol., 2010). Půdy, obsahující glukosu, se používají k pěstování laktobacilů, streptokoků, anaerobů a enterokoků. Také slouží k izolaci kvasinek a plísní. K tomuto účelu se využívá Sabouraudův agar. Sacharosa je přidávána do bujonu pro růst krevních mikrobů (Votava a kol., 2010). Krevní agar V klinické mikrobiologii je nejčastěji používanou půdou, protože zde roste převážná část důležitých mikrobů. Připravuje se z agarového základu, který se ochladí na teplotu C a přidá se 5 10 % sterilní defibrinované ovčí krve. Existují i varianty obsahující krev jiných zvířat, ty se však používají jen výjimečně, například při studiu jednotlivých 34

36 bakteriálních hemolyzinů. Některé mikroby na krevním agaru vytváří hemolýzu, a díky tomu je můžeme přímo určit (proto se také řadí mezi půdy diagnostické). Pokud mikrob tvoří hemolýzu, tak je schopen poškozovat erytrocyty v okolí kolonie nebo pod kolonií. Hemolyziny porušují cytoplazmatickou membránu erytrocytů štěpením některé její složky. Často jde o fosfolipidovou část membrány, řada hemolyzinů funguje na principu enzymu fosfolipázy. Může vzniknout buď úplná, nebo neúplná hemolýza. Při úplné hemolýze dochází k celkovému rozpadu erytrocytů i hemoglobinu a kolem kolonie se agar odbarví a projasní (často je zcela průhledný). U streptokoků se úplná hemolýza označuje jako β-hemolýza. Výrazná je hlavně u Streptococcus pyogenes a u dalších β-hemolytických streptokoků. (Votava a kol., 2010) Při neúplné hemolýze se erytrocyty zcela nerozpadají, půda není průhledná, ale je průsvitná a místo červené barvy je spíše žlutá. Tento typ hemolýzy způsobují kmeny S. epidermidis nebo některé kmeny S. aureus, konkrétně ty, které ze všech hemolyzinů produkují pouze δ-lyzin. Může vznikat i α-hemolýza, která se také označuje jako viridace a jedná se o přeměnu krevního barviva na zelený verdoglobin. Schopnost viridace mají především ústní streptokoky (např. Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius), ale také patogenní streptokoky (např. Streptococcus pneumoniae) (Votava a kol., 2010). V některých případech může docházet k vzájemnému ovlivnění hemolyzinů, které produkují různé mikroby nacházející se ve své blízkosti. V místě střetnutí hemolyzinů dochází buď ke vzniku úplné hemolýzy, nebo se hemolýza pouze zesílí, ale pokud by se mikroby nacházely samostatně, tak by hemolýzu nevyvolaly. Pro diagnostiku se využívá CAMP-test, kde dojde k reakci β-lyzinu S. aureus s lytickou látkou, kterou produkuje Streptococcus agalactiae produkující CAMP faktor. Vzniká motýlovité rozšíření hemolýzy (Votava a kol., 2010). Hemolýza může být také způsobena jedním mikrobem, ale látky z jiného mikroba ji potlačují. Příkladem je tzv. převrácený CAMP-test, při kterém reaguje β-hemolyzin S. aureus s hemolyzinem Arcanobacterium haemolyticum, který potlačuje hemolýzu vyvolanou stafylokokem (Votava a kol., 2010) Selektivní půdy Složkou selektivních půd je inhibitor (nejčastěji antibiotika), který zabraňuje růstu nežádoucích bakterií. Tudíž na těchto půdách rostou pouze některé mikroby a růst jiných mikrobů inhibitor zabraňuje. Mezi selektivní půdy se řadí agar s 10 % NaCl, na kterém vyrostou pouze stafylokoky. Tekutými selektivními půdami je půda pro růst salmonel, která 35

37 se označuje jako selenitová půda a alkalická peptonová voda sloužící k pomnožení Vibrio cholerae. Tyto půdy se také označují jako půdy selektivně pomnožovací (Votava a kol., 2010). Krevní agar s 10 % NaCl Krevní agar s 10 % NaCl je složením i přípravou stejný jako klasický krevní agar, pouze obsahuje zvýšené množství soli. Je to vysoce selektivní půda díky velkému množství NaCl, která zabraňuje růstu některým bakteriím, a tudíž zde vyrostou pouze stafylokoky (Svobodová, 2015) Diagnostické půdy Na diagnostických půdách určujeme, o kterého mikroba se jedná podle jejich vlastností. Jejich složkou je substrát, na který mikrob působí a způsobuje jeho změnu. Pokud změna není viditelná, tak se použije indikátor, který ji objasní. Mikrob může u substrátu vyvolat jeho štěpení. Pro průkaz štěpení se využívají cukrové půdy, na kterých mikrob štěpí nějaký sacharid (glukosu nebo laktosu), což se projeví změnou ph půdy. Jako indikátor se používá fenolová červeň nebo bromthymolová modř. V pozitivním případě půdy mění svoji barvu, například u Hajnovy půdy je to změna z červené na žlutou (Votava s kol., 2010). Substrát může být mikrobem využíván k růstu v přítomnosti určité látky. Mikrob tuto látku potřebuje pro svůj růst. Příkladem je Haemophilus influenzae rostoucí pouze kolem disku, který je nasycený růstovými faktory X a V. Nebo může látka vadit ostatním mikrobům, ale našemu zkoumanému mikrobu nikoliv. Příkladem je Streptococcus pneumoniae, který neroste kolem disku s optochinem, ale ostatní α-hemolytické streptokoky ano (Votava a kol., 2010). Mikrob může také substrát přeměňovat na jinou látku. Prokazuje se tvorba H 2 S, kdy jako substrát slouží sirné kyseliny a jako indikátor soli železa. Při pozitivní reakci půda zčerná díky tvorbě sulfidu železitého. Mikroby mohou tvořit indol (např. rod Escherichia), který vzniká z tryptofanu. Proto se pro průkaz tvorby indolu využívají speciální peptony obsahující vysoké množství tryptofanu. Při pozitivní reakci změní půda svoje zbarvení na červené, případně vzniká červený prstenec na povrchu půdy. Dále se prokazuje tvorba pigmentů a pohyblivost mikrobů. Tvorbu pigmentů je důležité prokazovat u stafylokoků, streptokoků skupiny B a pseudomonád. Pohyblivost mikrobů se dokazuje na polotuhých agarových 36

38 půdách, které se naočkují příslušným mikrobem pomocí vpichu. V případě pohyblivého mikroba dojde k jeho rozrůstání z místa vpichu, zatímco nepohyblivé mikrobi vyrostou pouze v místě vpichu (Votava a kol., 2010). Zvláštním případem diagnostických půd jsou tzv. chromogenní půdy, které obsahují dva nebo i více chromogenů. Na chromogeny reagují mikroby svými enzymy. Mikrob považuje chromogen za substrát, a proto ho pohltí a enzymy ho rozštěpí na chromofor a substrát. Chromofor se hromadí v buňce mikroba, je barevný, a tudíž způsobuje zbarvení kolonií mikroba. Toho se využívá ke snadnějšímu určení jednotlivých druhů mikrobů než na klasických půdách, ale naopak jejich nevýhodou je finanční náročnost. Příkladem chromogenní půdy je SM ID medium sloužící k záchytu salmonel, které zde rostou v červených koloniích, ve kterých zde mohou růst i Escherichia coli, shigelly, yersinie a morganelly. E. coli na této půdě většinou vytváří fialové kolonie. Rod Citrobacter roste v modrých koloniích a rod Proteus v bezbarvých koloniích. Existují i další chromogenní půdy CHROMagar Orientation, Sorbitol MacConkey Agar, Rapid E. coli půda (Votava, 1999). Existují také kombinované diagnostické půdy, které slouží k určování několika biochemických znaků současně. Využívají se především jako biochemický screening při vyšetřování vzorků stolice na střevní patogeny a vzorků potravin. Kombinovanou diagnostickou půdou je půda dle Hajny, biochemický klín, CLED půda a půda MIU (Votava a kol., 2010). Půda dle Hajny se používá k rozlišení shigel a salmonel od ostatních enterobakterií. Rozliší se podle tvorby sirovodíku a chování k laktose. Jedná se o šikmou půdu ve zkumavkách. Substrátem je glukosa, sacharosa, laktosa a thiosulfát sodný pro sirovodík. Podle různých biochemických reakcí dochází ke změnám zbarvení půdy, tvorbě bublinek nebo protrhání půdy (Votava a kol., 2010). Biochemický klín se nalévá do 1/3 Petriho misky v podobě klínu, ke kterému se přidává Endova půda. Na této půdě můžeme pozorovat tvorbu H 2 S, CO 2 a štěpení laktosy, glukosy, urey, sacharosy, mannitolu. Půda CLED se využívá pro diagnostiku mikrobů z moči. Můžeme zde mikroby izolovat, určit jejich množství a také je identifikovat, protože vytváří na této půdě charakteristický vzhled (Votava a kol., 2010). MIU půda (motility-indol-urea) je polotuhá půda nalitá ve zkumavce a využívána k průkazu štěpení urey. Obsahuje pouze 0,15 % agaru a enzymatický kaseinový hydrolyzát, který se používá místo tryptofanu. Po naočkování mikroba vpichem do středu půdy můžeme pozorovat pohyb, štěpení urey a tvorbu indolu. Pohyb se prokáže tvorbou zákalu mimo místo, 37

39 kde došlo k vpichu. Při štěpení urey se půda zabarví do růžova až červena. Pokud prokazujeme tvorbu indolu, musí se k půdě přidat Kovácsovo reagens a pokud dojde k jeho tvorbě, tak v místě, kde se půda stýká s reagens, vzniká červený prstenec (Votava, 1999) Selektivně diagnostické půdy Selektivně diagnostické půdy vykonávají úlohu selektivních i diagnostických půd. Využívají se pro diagnostiku mikrobů, u kterých se předpokládá, že se ve vzorku vyskytují spolu s ostatní mikrobiální flórou (jedná se například o vzorky stolice, potravin atd.). Půdy se skládají ze živného základu, substrátu, indikátoru, který reaguje na změny substrátu a inhibitoru zabraňující růst nežádoucích mikrobů. Při naočkování vzorku půda umožní růst pouze některých bakterií, zatímco jiné jsou potlačeny (selektivita), zároveň se nepotlačené bakterie vzájemně liší některým výrazným znakem, díky kterému mohou být dobře určeny (diagnostická vlastnost). Některé bakterie mají například schopnost způsobovat změnu substrátu, a proto mají jejich kolonie či agar v jejich okolí charakteristickou barvu (Votava a kol., 2010). Mezi selektivně diagnostické půdy patří Endova půda, na které rostou gram-negativní tyčinky (např. enterobakterie) a laktosa štěpící mikroby vytváří kolonie s tmavým okolím, zatímco laktosa neštěpící mikroby kolonie s vybledlým okolím. MacConkeyho půda slouží k izolaci gram-negativních bakterií, které mohou opět štěpit nebo neštěpit laktosu. Dalšími půdami této skupiny je XLD, MAL a CIN půda. XLD půda slouží k záchytu salmonel, shigel a ostatních enterobakterií. Na MAL půdě rostou především salmonely a na CIN půdě yersinie (Votava a kol., 2010) Příklady dalších půd Transportní půdy Transportní půdy neslouží pro diagnostiku mikrobů, ale pouze pro transport. Obsahují látky (např. aktivní uhlí), které zpomalují metabolismus a pohlcují toxické produkty. Funkcí transportních půd je dopravit do laboratoře živé a stejně početně zastoupené mikroby, tak jako se nacházely v místě odběru. Takovou půdou je Amiesovo transportní médium, které zajistí přežití i těch nejchoulostivějších mikrobů (Votava a kol., 2010). 38

40 Půdy k určení citlivosti na antibiotika Půdou sloužící ke zjištění citlivosti na antibiotika je MH-agar (agar dle Muellera a Hintonové). Je to třetí nejpoužívanější půda, která musí od všech výrobců obsahovat stejné složky, aby antibiotika pronikala stejným způsobem, a aby se mohly mezi sebou porovnávat výsledky (Votava a kol., 2010). 39

41 4 STERILIZACE A DEZINFEKCE Sterilizace a dezinfekce jsou velmi důležité úkony zabraňující přežívání mikroorganismů na pokožce, plochách a materiálech. Správné provedení těchto postupů (dezinfekce rukou, sterilizace zdravotnických nástrojů atd.) vede ke zmírnění šíření infekčních chorob. Řadí se do protiepidemického režimu zdravotnických zařízení a oblastí, ve kterých probíhají závažné protiepidemické činnosti (Melicherčíková, 2015). Své dezinfekční řady mají také pitevny a na jejich uplatňování a dodržování záleží, zda se daří předcházet šíření nežádoucích bakteriálních kmenů v prostředí. 4.1 Sterilizace Před samotným postupem sterilizace se musí provést předsterilizační příprava u všech materiálů určených ke sterilizaci. Předsterilizační příprava se provádí buď ručně, nebo v mycích a dezinfekčních zařízeních. Jedná se o dezinfekci, sušení, sanitaci, rozdělení do setů, balení a označení. Všechny tyto postupy nesmí veškerý materiál určený ke sterilizaci poškodit. Předsterilizační postupy zničí mikroorganismy, odstraní organické a anorganické sloučeniny, potlačí aktivitu virů, radionuklidů a cytostatik. Výsledkem je čistý a suchý zdravotnický materiál, který je zabalený nachystán ke sterilizaci (Melicherčíková, 2015). Vlastní sterilizace se provádí ve sterilizačních přístrojích (sterilizátorech), které využívají fyzikální, chemické postupy nebo jejich kombinace. Sterilizační postup je několikakrokový. Prvním krokem je nahřívání sterilizovaného materiálu a někdy také odsátí vzduchu. Ve druhém kroku dochází k vyrovnání teplot ve sterilizačním přístroji a materiálu. Třetí krok slouží k odstranění mikroorganismů a ve čtvrtém kroku se sterilizátor ochlazuje, materiál se osuší a vyrovnává se tlak (Melicherčíková, 2015) Fyzikální postupy sterilizace 1) Sterilizace vlhkým teplem (sytou vodní párou) Sterilizace vlhkým teplem se uskutečňuje v parních přístrojích za teplot 121 až 134 C a tlaku právě nasycené páry. Je to velice účinný sterilizační postup, který je vhodný ke sterilizaci různých druhů materiálu (např. textilu, keramiky, porcelánu, gumy, kovu). Existuje u nich jedna nevýhoda - vždy musí být zcela odvzdušněný pracovní prostor, aby nedocházelo k tvorbě vzduchové kapsy. Mohou se využívat stolní parní sterilizátory, jejichž objem je do 40

42 54 litrů. Pokud není u těchto sterilizátorů zajištěno odsávání vzduchu, nesmí se zde sterilizovat textil a porézní materiál. Dále se používají sterilizátory s větším objemem (nad 54 litrů), které ke své činnosti vyžadují další zařízení (např. zařízení zapisující tlak během celé sterilizace, program k provedení Bowieho-Dickova testu). Během procesu sterilizace dochází ke kondenzaci páry, prostřednictvím které se přenáší teplo na sterilizovaný materiál. Také se přenáší voda do spor a dochází k denaturaci bílkovin a nukleových kyselin mikroorganismů. Tyto typy sterilizátorů musí obsahovat antibakteriální filtr, který musí být pravidelně vyměňován (Melicherčíková, 2015). 2) Sterilizace proudícím horkým vzduchem Tento typ sterilizace je vhodný pro zdravotnické přístroje z materiálu, jako je kov, keramika, sklo, porcelán a kamenina. Samotný postup probíhá v přístrojích, ve kterých dochází k cirkulaci vzduchu. Vzduch přenáší teplo na sterilizovaný materiál buď přímo, nebo nepřímo prostřednictvím vodivosti a sálání. Suché teplo vyvolá denaturaci strukturních bílkovin. Vzhledem k tomu, že horký vzduch přináší menší množství tepelné energie než horká pára pod tlakem, je nutno použít vyšší teploty i delší časy ( C po minut) (Melicherčíková, 2015). 3) Sterilizace plazmatem Plazma se používá ke sterilizaci přístrojů z kovu, pryže a plastů. Neslouží ke sterilizaci vlhkých materiálů, molitanu, dlouhých dutých materiálů a výrobků získaných z celulózy. Sterilizaci způsobuje plazma vytvořená v elektromagnetickém poli. Nízkoteplotní plazma pocházející z peroxidu vodíku je rozložena na reaktivní částice. Tyto částice reagují s molekulami živé hmoty. Poté dojde ke spojení nezreagovaných částic a vznikne voda a některé další netoxické sloučeniny. Povrch sterilizovaného materiálu se nijak nemění a nevzniká koroze ani toxické zbytky (Melicherčíková, 2015). 4) Radiační sterilizace Sterilizace je zajištěna γ zářením. Jedná se o elektromagnetické záření, které má schopnost pronikat materiálem. Tudíž je vhodné k ozařování materiálů uložených v kartonech a vždy je zajištěno, že získají sterilizační dávku 25 Gy. Ale nastává problém u některých virů (např. HBV, HIV), které jsou schopny toto množství radiace přežít. Proto se především využívá pro sterilizaci jednorázového materiálu a nově vyrobených materiálů. 41

43 K radiační sterilizaci se využívá radioizotop 60 Co a je uskutečňována v ozařovacích centrech. Dalšími nevýhodami je možná změna vlastností a barvy ozařovaných materiálů. Výhodná je především pro plast, buničinu, textil, pryž a materiál používaný k šití. Dále je žádoucí pro ozařování léčiv, radiovakcín, radioantigenů a transplantátů a také slouží ke konzervaci potravin (např. koření) (Melicherčíková, 2015). Tento typ sterilizace se používá především při průmyslové sterilizaci jednorázových pomůcek pro zdravotnictví. Přímo ve zdravotnictví jej využívají spíše jen centrální sterilizace velkých nemocnic. Důvodem je náročnost splnění všech podmínek, které legislativa předepisuje pro práci s radioizotopy (Melicherčíková, 2015) Chemické postupy sterilizace K chemické sterilizaci se používají přístroje, ve kterých plyn při teplotě do 80 C vytváří přetlak nebo podtlak. Pokud sterilizátor ke své práci využívá podtlak, k zavzdušnění komory dochází přes antibakteriální filtr. Tento druh sterilizace je vhodný pro zdravotnické zařízení, které nesnese fyzikální postupy sterilizace (Melicherčíková, 2015). 1) Sterilizace formaldehydem Formaldehyd se užívá ke sterilizaci kovových a optických nástrojů, termolabilních látek. Není vhodný pro sterilizaci materiálů z papíru a textilu. Využívá se zde plynné směsi formaldehydu s vodní párou. Přístroj pracuje s podtlakem při teplotě mezi 60 až 80 C. Formaldehyd se v mikroorganismech váže na OH a NH 2 skupiny bílkovin a nukleových kyselin. Dochází k potlačení aktivity enzymů. Účinek sterilizace je zajištěn právě touto neutralizací enzymů a také alkylací karboxyskupin, triolových skupin a bílkovin. Výhodou formaldehydu oproti jiným chemickým látkám (např. ethylenoxidu) je, že vznikající zbytky jsou minimálně toxické až netoxické. Formaldehyd není výbušný a může se velmi dlouhou dobu skladovat. A také materiály, které byly sterilizovány formaldehydem, se mohou ihned po procesu použít a nemusí se odvětrávat (Melicherčíková, 2015). 2) Sterilizace etylenoxidem Ethylenoxid je bezbarvá, těkavá, žíravá kapalina. Při kontaktu se vzduchem je výbušný a jeho páry jsou hořlavé. Působí karcinogenně a mutagenně. Při sterilizaci se v komoře udržuje teplota C. Ethylenoxid způsobuje alkylaci bílkovin, virů, jader buněk a dochází k jejich nevratnému poškození. Slouží ke sterilizaci termolabilních látek (např. gumy, papíru) a porézních materiálů (např. molitanu). Při sterilizaci tyto materiály 42

44 pohlcují ethylenoxid, a proto se musí před použitím odvětrávat. K odvětrávání se používají speciální skříně, které se nazývají aerátory. Udržuje se v nich teplota 55 C a odvětrání trvá 24 hodin. Nebo se může využívat uzavřený prostor. Při teplotě 15 C musí být doba odvětrávání alespoň 72 hodin (u gumových a plastových materiálů je doba delší, až 7 dnů). Při teplotách nižších než 15 C nedochází k odstranění ethylenoxidu (Melicherčíková, 2015). 4.2 Dezinfekce Podle epidemiologické situace rozlišujeme běžnou a speciální dezinfekci. Běžná dezinfekce slouží k zabránění vzniku infekčních chorob. Provádí se ještě před rozvojem infekce v rámci hygienických opatření. Hygienická opatření jsou důležitá ve zdravotnických zařízeních, hotelech, lázních a v dalších zařízeních, ve kterých dochází ke společnému výskytu více lidí. Dále se jedná o místa, kde dochází ke zpracování, skladování a prodeji potravin atd. Dezinfekce může být také prvkem technologie výroby, jedná se například o pasterizaci mléka (Melicherčíková, 2015). Speciální dezinfekce zajišťuje usmrcení zdroje infekce v ohnisku nákazy a zabraňuje jejímu dalšímu šíření. Rozlišuje se, zda je pouze jednorázová nebo má zabezpečit dlouhodobější efekt. Dlouhodobější efekt je obstarán průběžnou ohniskovou dezinfekcí, která ničí zdroj infekce vylučovaný nakaženým člověkem nebo zvířetem. Zahájí se již od okamžiku, kdy nemocný začne vylučovat infekční agens a provádí se v jeho okolí. Trvá do doby, dokud není infekční agens zneškodněn. Tento typ dezinfekce je zaměřen i na osoby žijící v blízkosti nemocného. Při domácí izolaci dezinfekci provádí rodina chorého, zatímco v nemocničním prostředí dezinfekci obstarává zdravotnický personál. Jednorázová dezinfekce, která usmrcuje mikroorganismy v prostředí, ve kterém se nemocný vyskytoval, se označuje jako konečná (závěrečná) ohnisková dezinfekce. Musí být provedena pečlivěji než průběžná dezinfekce a zahájí se po odvozu pacienta do nemocnice nebo po jeho smrti (Melicherčíková, 2015) Typy dezinfekcí Existuje fyzikální, chemická, fyzikálně-chemická a biologická dezinfekce. 1) Fyzikální dezinfekce Fyzikální dezinfekce používá suché nebo vlhké teplo a záření. Do fyzikálního způsobu se řadí dezinfekce varem buď za atmosférického tlaku, nebo v přetlakových nádobách. Dále 43

45 se využívá horký proudící vzduch (teplota 110 C) a teplota vyšší než 90 C v pracích, mycích a parních přístrojích. Účinek ultrafialového záření má vliv pouze na ty povrchy, které ozařuje a ve vodě působí maximálně do hloubky 1 mm pod hladinou. Při působení UV záření vzniká oxid dusíku, peroxid vodíku a ozonu. Tyto látky způsobují reverzibilní i ireverzibilní poškození nukleových kyselin mikrobů. Odolnými jsou mikroby dávající vznik pigmentu a sporám, z virů se jedná o virus HIV, HBV, HCV. Naopak velmi citlivé jsou mikroby z rodu Staphylococcus a Streptococcus, z virů je to virus chřipky a poliovirus. Pasterizace, filtrace, žíhání a spalování jsou dalšími druhy fyzikální dezinfekce. Při filtraci se využívají filtry z různých materiálů a s rozdílnou velikostí pórů, přes které prochází mikroorganismy a nečistoty (Melicherčíková, 2015). 2) Chemická dezinfekce Chemická dezinfekce je zprostředkována chemickými dezinfekčními přípravky (např. alkoholy, aldehydy, kyselinami, hydroxidy). Všechny chemické přípravky nemusejí vždy působit na všechny druhy mikroorganismů, na některé například nereagují vůbec. Účinek chemických látek může být ovlivněn příměsí různých dalších látek (např. léčivy, organickými a anorganickými látkami). Při dezinfekci je velice důležité, aby pracovníci, provádějící tuto službu, byli svědomití a dodržovali správnou techniku (Melicherčíková, 2015). 3) Fyzikálně-chemická dezinfekce Fyzikálně-chemická dezinfekce kombinuje fyzikální a chemické postupy, kterými usmrcuje mikroorganismy. Zahrnuje dezinfekci v paroformaldehydové dezinfekční komoře a v čistících, pracích a mycích přístrojích. Paroformaldehydová komora využívá páry formaldehydu a vodní páry. V komoře se udržuje teplota C. Ostatní přístroje používají k dezinfekci chemické látky a teplotu do 60 C (Melicherčíková, 2015). 4) Biologická dezinfekce Biologická dezinfekce slouží k odstranění plísní z nehtů, kůže, sliznic, ale také zdí a omítek. Principem je mezidruhový parazitismus vláknitých hub, které se získávají z přírodních látek a zabraňují růstu plísním. Použité vláknité houby nemají žádný negativní vliv na člověka, rostliny a zvířata (Melicherčíková, 2015). 44

46 4.2.2 Dezinfekce jednotlivých částí těla a prostor Dezinfekce rukou a pokožky Na hygienu rukou jsou kladeny velké požadavky z toho důvodu, že se na nich nachází přenosná a vnitřní mikroflóra. Vnitřní mikroflóra je tvořena nemalým množstvím mikroorganismů, které jsou součástí běžné mikrobiální flóry. Přenosnou mikroflórou jsou mikroby z vnějšího prostředí, a tudíž může docházet k přenosu infekcí nebo kontaminaci různých výrobků. A proto je mytí rukou základním prvkem hygieny, který je ve zdravotnictví nejdůležitější ochranou proti přenosu infekcí. Nejlepší je umývat ruce pomocí tekutého mýdla s teplou vodou. Při používání dávkovačů se musí tyto nádoby po vypotřebování určitého přípravku celé ponořit do dezinfekčního roztoku. Ruce kontaminované biologickým materiálem jsou dezinfikovány virucidními přípravky. Dále se mohou používat alkoholové dezinfekční přípravky, které se nanáší na osušené ruce jednorázovými ubrousky a nechají se samovolně zaschnout. K dezinfekci rukou se mohou používat i vodné roztoky, do kterých se ruce ponoří na určitý čas. Dalším typem ochrany jsou ochranné rukavice. Po jejich použití se musí ruce opět umýt mýdlem, osušit a použít dezinfekční přípravek (Melicherčíková, 2015). Dezinfekční přípravky musí kvalitně a v co nejkratším čase zničit mikroorganismy, ale zároveň nesmí dráždit pokožku. Alkoholové přípravky mají své výhody i nevýhody. Výhodou je, že rychle zasychají a rychle vyvolají dezinfekční účinek. Při poškození struktury pokožky jsou ji schopny podráždit. Po jejich nanesení a následném použití elektrických přístrojů se musí počkat, dokud zcela nezaschnou, protože mají nízký bod vzplanutí. Také se nesmí uchovávat v blízkosti otevřeného ohně (Melicherčíková, 2015). Patogenní i nepatogenní mikroorganismy nacházíme i na kůži a sliznicích. Podílí se na udržování mastných kyselin, lysozymu a nízkého ph pokožky. Pokud dojde k poškození pokožky, tak se mikroorganismy mohou dostat do podkoží a zde vyvolat zánět. K dezinfekci pokožky se používají barevné nebo bezbarvé přípravky. Používají se vždy, když hrozí poškození pokožky (např. při tetování, piercingu, zavádění injekcí, operacích) (Melicherčíková, 2015). Dezinfekce podlah a stěn Čistění a dezinfekce podlah zabraňuje přenosu infekčních agens vzduchem a kontaktem, protože zašpiněné podlahy a prach ve vzduchu jsou místem, kterým se infekce přenáší. Ve zdravotnictví, ale i jiných zařízeních (např. ve výrobnách potravin), je důležité dodržovat zásady dezinfekce, protože mikroorganismy na různých površích přežívají velmi 45

47 dlouhou dobu. V tabulce č. 2 je uveden přehled některých mikrobů a jejich doba přežití (Melicherčíková, 2015). Tabulka č. 2: Přehled mikrobů a jejich doba přežití (Melicherčíková, 2015) Druh mikroba Doba přežití Gram-pozitivní bakterie (např. Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes) Několik měsíců Gram-negativní bakterie (např. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) Několik měsíců Bordetella pertussis, Proteus vulgaris, Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae Několik dnů Sporulující bakterie, mycobacteria Několik měsíců Candida albicans 4 měsíce Candida glabrata 5 měsíců Candida parapsilosis 14 dnů Respirační viry (např. rinovirus, coronavirus) Několik dnů Viry trávicího ústrojí (např. astrovirus, rotavirus) 2 měsíce Viry v krvi a tělních tekutinách (např. HIV, HBV, HCV) Více než 1 týden Herpetické viry (např. CMV, virus herpes simplex) Několik hodin 1 týden K dezinfekci povrchů se používají čistící a enzymatické přípravky, které nepůsobí na mikroorganismy, ale pouze odstraňují nečistoty. Snadno se dezinfikují hladké povrchy a naopak špatně se dezinfikují porézní a poškozené povrchy. Enzymatické a alkalické přípravky jsou vhodné k likvidaci bílkovinných nečistot. Kombinace kyselých a alkalických látek slouží k odstranění povlaků a minerálních nečistot. Tenzidy ničí mastnotu a oxidace se využívá na uhlohydráty (Melicherčíková, 2015). Při dezinfekci podlah se musí dodržovat určitý postup. Z nejvíce využívaných postupů jsou následující. První metodou je použití dvou kbelíků. V jednom kbelíku je čistá voda a ve druhém je směs čistícího a dezinfekčního přípravku. Další pracovní postupy jsou zajištěny mopy. Existuje ruční mop s dávkovacím zařízením. Dochází zde k nasátí čistícího i dezinfekčního přípravku přímo do mopu. Na každý úklid se používá nový mop. Ruční mop se nemusí používat pouze jednorázově, ale může se vyprat, osušit a znovu použít. Také se může využívat dvoustranný mop (systém Twixter). 46

48 Očištění míst potřísněných biologickým materiálem se provede pokrytím papírovou vatou nebo tkaninou, které jsou napuštěny dezinfekčním virucidním přípravkem. Poté se místo klasickým způsobem dezinfikuje (Melicherčíková, 2015). Dezinfekce ovzduší K dezinfekci ovzduší se využívají chemické nebo fyzikální postupy a dále se rozlišuje, zda jsou v otevřených nebo uzavřených systémech. Příkladem dezinfekce otevřeným způsobem je výměna vzduchu větráním. Provádí se při podezření na vznik infekčního aerosolu. Vzduch se může také vyměnit pomocí filtroventilačního přístroje nebo přístroje, ve kterém laminárně proudí vzduch. Otevřeným systémem je i klimatizační zařízení, ve kterém vzniká přetlak nebo podtlak. Zařízení obsahuje filtr (např. olejový, papírový). Uzavřenými systémy jsou UV zářiče a zařízení zajišťující filtraci vzduchu (Melicherčíková, 2015) Typy dezinfekcí používaných na pitevnách Dezinfekční schéma ve FN u sv. Anny zahrnuje dezinfekci rukou, ploch a nástrojů. Probíhá následovně: a) Hygienická dezinfekce rukou den v měsíci Promanum N den v měsíci Softa- Man b) Rychlá dezinfekce plochy den v měsíci Meliseptol NF den v měsíci Meliseptol Rapid c) Mytí a dezinfekce nástrojů den v měsíci Helipur den v měsíci Stabimed Dezinfekční schéma ve FN Brno Bohunice zahrnuje dezinfekci rukou, povrchů, nástrojů a potřísněných ploch. K dezinfekci rukou využívají dezinfekční přípravky Desderman a Manusept basic, které by se měly nechat na rukou působit alespoň 30 sekund v množství 3 ml. Používají se vždy po skončení práce s kontaminovanými materiály, sundání rukavic atd. 47

49 Povrchy dezinfikují po skončení pracovní směny a malé plochy v průběhu dne podle potřeby. Při úklidu velkých povrchů se plocha přetře dezinfekčním přípravkem Desam ox. K dezinfekci zásobníků jak na jednorázové utěrky, tak na jednotlivé roztoky používají Kohrsolin FF. Dezinfekce a bělení pitevních stolů a přikrajovacích desek je prováděna pomocí Savo prim. Malé plochy se buď dezinfekčním roztokem postříkají a nechají se zaschnout nebo se přetřou dezinfekčními ubrousky obsahující dezinfekční roztok. K postřiku využívají Desprej a k setření Destix MK75. Nástroje se čistí vložením do dezinfekčního roztoku Helipur H plus N, kde se nechají po určitou dobu a po vytáhnutí se opláchnou vodou a nechají zaschnout. Povrchy znečištěné biologickým materiálem se posypou přípravkem Klorsept (ve formě granulátu). Granula do sebe nasají biologický materiál a po 3 minutách působení se zlikvidují a povrch se zdezinfikuje klasickým způsobem. Popis jednotlivých dezinfekčních přípravků 1) Promanum N Promanum N je alkoholový dezinfekční přípravek, který je velmi vhodný pro dezinfekci rukou. Obsahuje 96 % etanol a isopropylalkohol. Kromě baktericidního účinku (působí i na bakterie TBC a MRSA) má virucidní účinek (je účinný na rotaviry, virus HIV atd.) a také je schopný usmrcovat houby (Lékárna.cz). 2) Softa-man Dezinfekční přípravek Softa-man je na bázi alkoholu, ale zároveň má kosmetické vlastnosti, které jsou zajištěny pěstícími látkami. Tyto látky zabraňují vysušení pokožky. Používá se k dezinfekci rukou ve zdravotnictví, ale také je výborný k sanitaci rukou, pokud nemáme k dispozici vodu. Působí proti bakteriím (i MRSA), virům (např. rotavirům, HIV, HBV, HCV), kvasinkám a plísním. Obsahuje etanol, propanol, isopropylmyristát, glycerin, Bisabolol a další pomocné látky (Zelená hvězda). 3) Meliseptol NF Meliseptol NF je také alkoholový dezinfekční přípravek používaný k dezinfekci ploch. Skládá se z etanolu a dalších látek. Zajišťuje usmrcení bakterií (i MRSA), virů (HIV, HBV, HCV, rotavirů atd.) a plísní (Pluradent). 48

50 4) Meliseptol Rapid Meliseptol Rapid je dezinfekční alkoholový přípravek, který je vhodný k dezinfekci povrchů a zdravotnických pomůcek (např. židlí, postelí). Obsahuje propanol a didecyl(dimethyl)amoniumchlorid. Velmi rychle účinkuje proti bakteriím (včetně bakterií tvořící spory), virům a houbám (Zelená hvězda). 5) Helipur Helipur je kapalný koncentrát na bázi fenolů. Slouží k dezinfekci a čištění zdravotnických nástrojů, což je zajištěno přítomností dalších látek. Obsahuje p-chlor-mkresol, p-chlor-o-benzylfenol a o-fenylfenol. Dobře odstraňuje a dezinfikuje předměty se zaschlou krví a sekrety. Působí baktericidně (včetně mykobakterií), virucidně (i proti lipofilním virům např. HIV) a fungicidně (Zelená hvězda). 6) Stabimed Stabimed slouží k dezinfekci zdravotnických nástrojů a přístrojů a termolabilních pomůcek. Jeho účinek je kvalitní i při nízké koncentraci. Účinnou látkou je kokospropylendiamin. Také velmi dobře působí na materiály potřísněné krví a sekrety. Ničí viry, bakterie (včetně MRSA, mykobakterií) a houby (Zelená hvězda). 7) Desderman Desderman je čirý, světle zelený roztok nebo gel, který se používá k dezinfekci rukou. Účinnou látkou je 96 % etanol a dále obsahuje isopropyl myristát, 2-propanol, 2-bifenylol polyvidon 30, barviva E 131 a E 104, aromatické látky, čištěnou vodu a ceteraryl octaonát sorbitol. Nevysušuje pokožku díky látkám, které zadržují vlhkost, vláčnost a které zajišťují omaštění kůže. Desderman působí baktericidně (včetně TBC, MRSA, VRE atd.), virucidně (včetně HBV, HCV, polioviry, rotaviry atd.), fungicidně (včetně kvasinek a mikroskopických hub) (Schülke). 8) Manusept basic Účinnou látkou Manusept basic je 99 % etanol a dalšími pomocnými látkami jsou tetradecan-1-ol, sodná sůl, butan-2-on, heptamethylnonan, aqua purificata, (2-ethylhexyl)(2- ethylhexanoat), kyselina (RS)-5-oxo-pyrrolidin-2-carboxylic. Neobsahuje žádná barviva a je neparfémovaný. Tento dezinfekční přípravek je účinný proti bakteriím (i MRSA), virům (včetně rotavirům, HIV atd.), houbám (kvasinkám) (Hartmann). 49

51 9) Desam ox Desam ox je kapalný přípravek na bázi aktivního kyslíku, který slouží k dezinfekci povrchů. Obsahuje peroxid vodíku a kvartérní amoniové soli, které zajišťují účinnost tohoto přípravku. Působí na viry, bakterie (mykobakterie, MRSA) a houby (Medist). 10) Kohrsolin FF Kohrsolin FF je dezinfekční přípravek na bázi aldehydů a kvartérních amoniových sloučenin. Látkami zajišťující účinnost jsou benzyl-c12-18-alkyldimethyl-ammonium chlorid, glutaral a didecyldimethylammonium chlorid. Opět působí na bakterie (TBC), houby (kvasinky), viry (obalené viry) a také na spory Clostridium difficile (Hartmann). 11) Savo prim Savo prim je kapalný roztok využívaný k jednofázové dezinfekci povrchů na bázi aktivního chloru. Slouží také k odstranění nepříjemných zápachů a je parfémovaný. Obsahuje tenzidy, chlornan sodný a také parfém pro zajištění voňavého efektu. Jeho účinnost spočívá v usmrcování hub, bakterií (včetně mykobakterií a MRSA), virů (včetně adenovirů, poliovirů) a spor (Medist). 12) Desprej Desprej je tekutý roztok na bázi kvartérních amoniových solí a alkoholů. Velmi často se využívá pro dezinfekci míst se špatnou přístupností. Účinnými látkami je etanol, kvartérní amoniové soli a isopropanol, které zajišťují baktericidní, virucidní a fungicidní účinek (Medist). 13) Destix MK75 Destix MK75 se vyskytuje ve formě navlhčených dezinfekčních ubrousků, které jsou uchovávány v plastových nádobách s uzávěrem. Kromě skladování v nádobách jsou navíc ubrousky zabaleny v plastovém obalu, který zabraňuje jejich vysychání. Slouží k likvidaci bakterií (i MRSA), plísní a virů (i HIV, HBV) (Xertec). 14) Klorsept Klorsept je přípravek ve formě granulí, který se využívá především k likvidaci rozlitého biologického materiálu. Granula snadno nasají kontaminovaný materiál a zároveň 50

52 dojde k dezinfekci potřísněné plochy. Troklosen natrium je v tomto přípravku účinnou látkou, který působí proti bakteriím (včetně MRSA, TBC), houbám a virům (Anti-germ). 51

53 5 MONITORING PROSTŘEDÍ K získání vzorků za účelem monitoringu prostředí ve zdravotnickém zařízení se využívají různé metody. Jedná se především o stěry, spadové metody, otisky a aeroskopické vyšetření (Míčková, 2012). Pravidelné monitorování slouží ke zjištění velikosti kontaminace zdravotnických prostorů. Poskytuje nám informace o výskytu mikrobů v prostředí, a tudíž i o správném či nesprávném provedení úklidu a dezinfekce. Metoda stěrů Stěry se provádí pomocí stěrové soupravy, která obsahuje vlhký tampon. Slouží ke kvantitativnímu zjištění mikrobiální kontaminace na různých površích (např. okně, nástrojích). Pravidelné provádění stěrů dává možnost zdravotnickému zařízení mít kontrolu nad správným postupem dezinfekce, deratizace (likvidace hlodavců) a dezinsekce (usmrcení škůdců). Samotný stěr se provádí tak, že na místo, ze kterého chceme získat vzorek, přiložíme šablonu (součástí setu) a tampon namočíme do zkumavky s roztokem. Podle šablony vedeme tampon a setřeme plochu. Poté tampon vrátíme zpět do zkumavky s roztokem a zároveň musíme dávat pozor na vznik sekundární kontaminace. Zkumavka s tamponem a roztokem se popíše a v co nejkratším časem odešle do laboratoře. Nejlépe by se měl vzorek přepravovat v chladu a měl by být zpracován tentýž den. Při zpracování se musí tampon důkladně vytřepat do roztoku. Pipetou se nabere 0,5 ml roztoku a přenese na kultivační půdu nalitou v Petriho misce. Roztok se rozvrství přes celou půdu a nechá zaschnout a poté se vloží do termostatu, ve kterém se nechá podle potřeby určitou dobu inkubovat (Lebeda, 2013; ITEST plus, s.r.o., 2015). Obrázek č. 1: Šablona (ITEST plus, s.r.o., 2015) 52

54 Obrázek č. 2: Stěrová souprava (ITEST plus, s.r.o., 2015) Spadové metody Spadové metody se provádí pomocí Petriho misek, které jsou umístěny na místech určených k monitoringu. Nechávají se na těchto místech otevřené a po určitou dobu. A poté se misky kultivují a následně se počítá množství vyrostlých kolonií. Tyto metody slouží ke kvalitativnímu určení, protože menší částice nebo kapičky vyskytující se ve vzduchu se nemusí vůbec dostat na půdu. Nejčastěji se jako půda používá neselektivní médium. Jejich výhodou je levné a snadné provedení, ke kterému nevyžadují speciální vybavení. Podávají informace o výskytu mikrobů v prostředí a díky tomu se můžeme zavčas vyvarovat problémům. Tyto metody mají ale také své nevýhody. Jednou z nich je vysychání kultivační půdy při dlouhodobém otevření Petriho misky při získávání vzdušných spadů (Rapidmicrobiology, nedatováno). Otiskové metody Otiskové metody jsou výborné pro sledování účinnosti dezinfekčních prostředků používaných na různých površích a plochách a také ke kontrole zdravotnického personálu a jejich oděvů. Povrchy a plochy mohou být kontaminované buď z důvodu usazování aerosolových částic, nebo se mikroby mohou na povrchy přenášet z rukavic zdravotnického personálu a zdravotnických předmětů. Otisky je vhodné provádět především na rovných plochách. Tuto metodu jsem také pro monitoring prostředí na pitevně využívala. Kultivační půdy (v mém případě KA a KA s 10 % NaCl) byly nalité ve speciálních miskách o průměru 6 cm. Okraj půd lehce přečníval přes okraj misky a na spodní straně misky se nachází mřížka, která slouží ke snadnějšímu počítání kolonií (Běhal, 2011; O.K. SERVIS BioPro s.r.o.). 53