+D?E>F>?CGH*4&#E*!+*IJKK*

Transkript

1

2 !"#$%&'#()*+,-%"./01,*$*2&)(#.3)$%* 4&5&,6,$%6%7/8*9)/:3()* +D?E>F>?CGH*4&#E*!+*IJKK* LM,&"5/*&%7%"',$)"N71*O&5.O%$/,$* * IPQ*)O&53*IJKK* 2&)(#.3)$)R*@3,$%"./8*&%O:M3#/)* G@2?S*TPUVUJVIIWVWJKWVU* 2

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

4 Problematika kultivace mikroskopických vláknitých řas rodu Klebsormidium a jejich ontogeneze Kateřina Perútková, Bohuslav Uher Masarykova univerzita, Ústav botaniky a zoologie, Terezy Novákové 62, , Brno- Řečkovice, Česká republika, @mail.muni.cz Abstrakt Vláknitá řasa rodu Klebsormidium patří mezi kosmopolitně rozšířené druhy. Její zástupci představují jednu z hlavních složek aerofytických synuzií městských biotopů. Obývá rozmanité substráty jako je půda, kámen, beton i sladká voda. Klasifikace rodu Klebsormidium je založela plně na morfologii, velmi málo je objasněná fylogeneze jednotlivých druhů. Cílem bylo zefektivnit kultivaci vláknitých řas rodu Klebsormidium a zjistit jejich jednotlivé ontogenetické stádia v laboratorních podmínkách, t.j. navození a pozorování rozmnožovacího procesu a výsledná rekonstrukce životního cyklu. Výsledky jsou součástí bakalářské práce. Klíčová slova: Kultivace řas; vláknité řasy; Klebsormidium; ontogeneze; městské biotop. Úvod a formulace cíle Řasy spolu se sinicemi jsou nejjednodušší autotrofní organismy, které se řadí na začátek rostlinného systému a zároveň se považují za centrum vývoje vyšších rostlin a snad i části živočichů. Předmětem jejich studia je objasnění zákonitostí nejen evoluce rostlinných organismů a pochopení rostlinné říše jako celku. S bakteriemi a houbami patří mezi nejvíce rozšířené organismy v přírodě a významně zasahují do biochemických cyklů v prostředí, kde se vyskytují [1,2]. Významné postavení mají i v potravním řetězci. Jsou nedílnou součástí vodních společenstev, jako je plankton, fytobentos a litorál. Stejně tak je nalezneme i v terestrickém prostředí, jak na přirodních, tak na umělých substrátech. Kromě kůry stromů, půdy a kamene tvoří nárosty na budovách, kašnách a betonových zídkách. Tyto organismy osidlují i extrémní biotopy s nedostatkem kyslíku, světla, velkým obsahem síry nebo s mimořádně vysokými a nízkými teplotami. Řasy jsou často prvními kolonizátory těchto nehostinných míst a vytvářejí zde první ekosystémy. Budují příznivé prostředí a zpřístupňují dané lokality jiným organismům, jako jsou ostatní mikroorganismy nebo vyšší rostliny [3]. Nemůžeme v tomto případě mluvit pouze o pozitivním vlivu řas, co se týče staveb a budov, které osidlují, označují se jako biodeteriogeny [4]. Neexistuje žádná přesná definice pro to, co biodeteriogen je. Takto označené organismy obvykle obývají umělé povrchy staveb a svou vedlejší aktivitou přispívají ke koloběhu částic. Tím způsobují výraznou destrukci 584

5 a degradaci stavebního materiálu [5]. Studium biodeteriorace a procesů s ní spojených je velmi důležité pro zachování a ochranu kulturních památek. Řasy a sinice tvoří na jejich povrchu biofilm, který může mít rozmanité zabarvení (zelené, modré, černé, oranžové a červené). Tyto kolonie svou aktivitou mění vlastnosti substrátu, na kterém se vyskytují. Jejich činnost je velmi významná při zvětrávání povrchů a následky se dají srovnat s působením mechanických nebo chemických vlivů [6]. Rod Klebsormidium je jedním z nejvíce zastoupených v městských biopotech [7], [8], [9], [10]. Jako ostatní vláknité řasy má složitou nomenklaturu a taxonomii [11]. Jméno Klebsormidium bylo zavedeno autory Silva et al. (1972) pro vyřešení taxonomických nejasností vláknitých řas z rodu Hormidium [12]. V současné době rod zahrnuje asi 22 druhů, je to pouze předběžný odhad, protože není jasné zda se jedná o druhy nebo o poddruhy. Otázkou je, zda by mělo být více taxonů považováno za samostatné druhy nebo formy jiných druhů [13], [14]. Cílem práce je zefektivnit kultivaci vláknitých řas rodu Klebsormidium a rekonstrukce životního cyklu jeho zástupců rodu z přírodního materiálu a jednodruhových izolátů z městkých biotopů. Materiál a metody Vzorky byli odebírány na území města Brna a Prostějova v období od srpna 2010 do ledna Brno je centrem Jihomoravského kraje a rozkládá se na soutoku řek Svratky a Svitavy. Jižní část Brna zasahuje do nížin Dyjskosvrateckého úvalu. Z ostatních stran je Brno obklopeno kopci, kde se nachází i nejvyšší bod Kopeček. Město je položeno v nadmořské výšce v rozmezí m. Průměrná roční teplota je 8,4 C a roční úhrn srážek 509 mm. Město Prostějov se nachází na západním okraji roviny Hané, na severu navazuje na Hornomoravský úval a na východ je položena Drahanská vrchovina. Okraj města lemují říčky Hloučela a Romže. Prostějov se rozkládá v nadmořské výšce 225 m. Průměrná roční teplota činí 6,9 C, úhrn srážek 606 mm. Kameny s nárosty byli sbírány na šesti lokalitách vždy z betonových zídek. První tři se nachází v Brně, konkrétně v městské části Žabovřesky a v centru. Vzorky v Prostějově pocházeli z Partyzánské a Havlíčkovi ulice, které jsou nedaleko centra města. Odběr byl prováděn vizuální detekcí na budovách vyhledaním trávově zelených nárostů, které značí výskyt řas, potenciálně s vláknitými řasami rodu Klebsormidium. Vzorky byli odebírány vždy 585

6 10 až 15 cm nad zemí. Ze všech lokalit byly použité pro kultivaci úlomky substrátu s nárostem řas, popřípadě nárosty seškrábané pomocí sterilní laboratorní jehly do plastikových sáčků. Každý vzorek byl označen lokalitou odběru, datumem, základními mikroklimatickými podmínkami (expozice, zastínění, vlhkost substrátu) a číslem vzorku. Pro kultivace bylo použito médium BBM, určené pro terestrické sinice a řasy. Po smíchání média s agarem se tekutina nechala provařit v mikrovlnné troubě, je to účinný způsob sterilizace, ale musí se opakovat nejlépe třikrát. Výhodou oproti jiným způsobům sterilizace je to, že je velmi efektivní a přitom není toxická. Uvádí se, že v 1 až 1,5 litru mořské vody vymřou během 5 minut veškeré řasy, během 8 minut bakterie a za 10 minut houby [15]. První kultivaci se prováděla tak, že se celý kámen ponořil do agaru v Petriho miskách nebo se na agar nasypal vzorek seškrábané omítky s nárostem řas. Řasy se postupně z přírodního substrátu rozrůstaly na médium. Očkovalo se kovovou nebo plastikovou kličkou. Nástroje můsí být sterilní. Následnými kultivacemi a přeočkováním byli získané čisté kultury. Všechny úkony s kulturami se prováděly ve sterilním prostředí ve flowboxu. Řasy byly kultivovány v pokojové teplotě v rozmezí C. Kultury byly udržovány na fluorescentním světle střední intenzity s dodržováním denního cyklu (12 hodin světlo, 12 hodin tma). K determinaci druhů byla použita literatura [6] a [12]. Při analýze vzorků byl použit mikroskop Olympus BX 50 s Nomarského kontrastem a obrazová analýza NIS Elements AR 2.30 CZ. Výsledky a diskuse Pro rod Klebsormidium jsou charakteristická dlouhá vlákna s jedním nástěnným chloroplastem v každé buňce. Chloroplast byl okrouhlý s jedním pyrenoidem. Častým jevem byla fragmentace vláken, která je jedním ze dvou způsobů nepohlavního rozmnožování. Po fragmentaci byly zřetelně viditelné zbytky buněčných stěn na konci vláken, ve tvaru H. Druhým způsobem nepohlavního rozmnožování je tvorba zoospor. Ve všech případech nedošlo k jejich uvolnění samovolně, ale bylo potřeba jejich tvorbu navodit zalitím agaru destilovanou vodou. Po uvolnění zoospor byly pozorované na buňkách typická okénka, tedy otvor, kterým zoospora unikla ven z buňky. Jediným odlišným znakem kultur byl rozměr šířky buněk. Naměřené hodnoty z brněnských lokalit byly v rozmezí 5-9 µm, Klebsormidium nitens. Vzorky z Prostějova měly rozměry 7-10 µm, Klebsormidium flaccidum. 586

7 Při kultivaci byl zaznamenaný rozdíl v růstu jednotlivých kultur. Nejednalo se však o rozdíly mezi vzorky z různých lokalit. Limitujícím faktorem byla hustota agaru. Pokud byl agar moc pevný a hustý, řasy na něm hůře rostly, ačkoliv pro manipulaci a práci je to praktičtější. Nejlepších výsledků se dosáhlo na polotekutém médiu (0,5% agar). To vysvětluje zjištění, že pokud je médium moc tuhé, vytvoří se na povrchu neprostupná vrstva a řasy na něm kultivované nejsou schopny z média čerpat živiny, to má za následek sníženou schopnost růstu těchto organismů. Řešením je řidší médium nebo odlišný způsob očkování. Očkování se provádí plastikovou nebo kovovou kličkou a provádí se tak, že se klička vede po povrchu média. Když se ale klička s řasami dostane při očkování hlouběji do agaru pod jeho povrch, tak se usnadní rozrůstání mikroorganismů a umožní jim to plně využívat živiny média. Autoři [16] zmiňují, že pro očkování vláknitých řas je vhodnější penetrovat agar očkovací jehlou. Vlákna jsou vitálnější a jejich růst je rychlejší, protože mohou plně čerpat živiny. V kulturách byli zdokumentovány všechna známá ontogenetická stádia, t.j. dvoubičíkaté zoospory, jednobuněčná přisedlá stádia, dvoubuněčná stádia, mladá vlákna, dospělá vlákna, odumírající vlákna a pohlavní stádium, které doposud nebylo u rodu Klebsormidium známé. Dvoubuněčná stádia byly charakteristická tím, že dané dvě buňky mezi sebou svíraly určitý úhel, většinou 90. Znakem mladých vláken je to, že se ještě nedokážou dále dělit, mají sytě trávovitě zelený chloroplast a v buňce je málo metabolitů. Dospělá vlákna mají již schopnost rozmnožovat se, na nich byli prázdné buňky s okénky po zoosporách. Odumírající vlákna obsahovali světle zelené až průhledné chloroplasty, které byly na povrchu laločnaté, a měli vysoký obsah metabolitů v buňce. Zajímavostí bylo zjištění pohlavního rozmnožování u vzorku z Brna-Žabovřesek, kde se pravděpodobně jednalo o autogamii (resp. klestoizogamii ) dvou protoplastů sousedních buňek způsobem lýze přepážky a migrace jedné gamety ke druhé a jejich následné splynutí a vytvoření zygoty, vzniklé zygosporangium bylo kulovitého tvaru (viz Obr. 1 a, b, c, d). Tento proces je ještě potřeba ověřit experimentálně, protože byl pozorován jenom jednou a v jednom vzorku. Jedná se tedy o nový typ doposud nepoznaného způsobu rozmnožování u rodu Klebsormidium. 587

8 Obr. 1 Pohlavní rozmnožování rodu Klebsormidium (orig. K. Perútková) (a, b) migrace gamet do středu zoosporangia, (c, d) splývání gamet v jeden protoplast. Závěr Z přírodních vzorků byli úspešně izolované vláknité řasy druhů Klebsormidium flaccidum a K. nitens. V průběhu kultivace byli zdokumentovány pomocí obrazové analýzy jednotlivá stádia životního cyklu a výsledně se mohla rekonstruovat ontogeneze jednotlivých zástupců rodu Klebsormidium. Zjištěny byli zoospory, přisedlá jednobuněčná stádia, dvoubuněčná stádia, mladá, dospělá a odumírající vlákna. Byli pozorovány oba způsoby nepohlavního rozmnožování, jak fragmentaci vláken, tak tvorbu zoospor. Zajímavostí byla přítomnost pohlavního rozmnožování. Jde o zatím doposud neznámý proces rozmnožování a je ho potřeba experimentálně ověřit. Poděkování Náklady spojené s výzkumem této bakalářské práce byly hrazeny z výzkumného záměru č. MSM , se kterým tento výzkum souvisel. 588

9 Seznam použité literatury [1] Fott B. (1956) Sinice a řasy. Nakladatelství ČSAV, Praha, p. 373 [2] Poulíčková A., Jurčák J. (2001) Malý obrazový atlas našich sinic a řas. Univerzita Palackého, Olomouc, p. 17 [3] Ettl H. (1978) Xanthophyceae. In: Ettl h., Gerloff J. a Heynig H. (Eds.) Süsswasserflora von Mitteleuropa. Vol. 3., Gustav Fischer Verlag, Jena, p. 1 [4] Krumbein W. E., Urzi C. (1992) Biologically induced decay phenomena of antique marbles some genetal considerations. In: Decrouez D., Chamay J., Zezza F. (Eds), The conservervation of monuments in the Mediterranean Basin, 2nd International Symposium, Genéve, November , Genéve, p. 219 [5] Winkler E. M. (1994) Stone in Architecture, Properties, Durability. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p. 1 [6] Uher B. (2010) Cyanobacteria and algae as significant actors of biodeterioration. Lambert academic publishing, Saarbrücken, p. 1 [7] Büdel B. (1999) Ecology and diversity of rock-inhabiting cyanobacteria in tropical regions. European J. of Phycol 34; p.361 [8] John D. M. (2002) Orders Chaetophorales, Klebsormidiales, Microsporales, Ulotrichales. In: John D. M., Whitton B. A. and Brook A. J. (Eds), The freshwater algal flora of the British Isles. Cambridge University Press, Cambridge, p. 433 [9] Darienko T., Hoffmann L. (2003) Algal growth on cultural monuments in Ukraine. Biologia, Bratislava 58; p. 575 [10] Uher B. (2004) Cyanobacteria and algae as significant actors of biodeterioration on stone monuments in Bratislava and Murcia-flora, ecology and taxonomy. Dizertační práce, Univerzita Komenského, Bratislava, p. 1 [11] Rindi F., Guiry M. D., Lopez-Bautista J. M. (2008) Distribution, morfology and fylogeny of Klebsormidium (Klebsormidiales, Charophyceae) in urban environments in Europe. J. of Phycol. 44; p [12] Lokhorst G. M. (1996) Comparative taxonomic studies on the genus Klebsormidium (Charophyceae) in Europe. In Jülich, W. [Ed.] Cryptogamic Studies, Vol. 5, Gustav Fischer, Stuttgart, p. 1 [13] Ettl H., Gärtner G. (1995) Syllabus der Boden-, Luft- und Flechtenalgen. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, New York, p

10 [14] Škaloud P. (2006) Variation and taxonomic significance of some morphological features in European strains of Klebsormidium. Nova Hedwigia 83; p. 533 [15] Keller M. D., Bellows W. K. and Guillard R. R. L. (1988) Microwave treatment for sterilization of phytoplankton culture media. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 117; p. 279 [16] Preisig H. R., Andersen R. A. (2005) Historical review of algal culturing techniques. Academic Press, Burlington, San Diego, London, p.1 590