KLINICKÁ BIOCHEMIE - praktikárna PRO

Transkript

1 KLINICKÁ BIOCHEMIE - praktikárna PRO 1. Bílkoviny krevní plazmy Stanovení celkové bílkoviny v séru biuretovou reakcí Stanovení albuminu v séru Stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) Elektroforéza plazmatických bílkovin na agarosovém gelu, hodnocení dysproteinemií 2. Glukóza, lipidy v krvi Stanovení glukózy v séru Stanovení glukózy v kapilární krvi glukometrem Stanovení celkového cholesterolu v séru Stanovení HDL cholesterolu v séru Stanovení triacylglycerolů v séru 3. Nebílkovinné dusíkaté látky, metabolismus žlučových barviv Stanovení močoviny v séru Stanovení kyseliny močové v séru Stanovení přímého a celkového bilirubinu v séru 4. Vyšetření moči I Vznik moči a funkce ledvin Fyzikální vyšetření moči Základní chemické vyšetření moči (glukóza, bílkoviny, ketolátky, krevní barvivo, bilirubin, urobilinogen) 5. Vyšetření moči II Mikroskopické vyšetření močového sedimentu Funkční zkoušky ledvin - stanovení glomerulární filtrace jako clearance kreatininu Aminokyseliny a jejich metabolity v moči (fenylketonurie, cystinurie, tyrosinóza) 6. Ionty v séru, vyšetření mozkomíšního moku Stanovení vápníku v séru fotometricky Stanovení Cl - v séru iontově selektivní elektrodou Stanovení Na + a K + v séru plamenovou fotometrií Vyšetření mozkomíšního moku (glukóza, proteiny, laktát)

2 Stanovení celkové bílkoviny v séru biuretovou reakcí Princip: Peptidy (nejmén tílenné) poskytují podobn jako biuret a karbamylderiváty s ionty Cu 2+ v alkalickém prostedí modrý komplex vhodný k fotometrickému stanovení. Provedení: Pipravte si ti zkumavky a oznate je vz, st a pv. Do zkumavek odpipetujte podle tabulky sérum, standard, fyziologický roztok a biuretové inidlo. vz st pv vzorek séra (ml) 0,1 - - standard (ml) - 0,1 - fyziol. roztok (ml) - - 0,1 biuretové inidlo 5,0 5,0 5,0 Nechte stát 30 minut pi laboratorní teplot. Zmte absorbanci vzorku a standardu proti porovnávacímu roztoku pi vlnové délce 546 nm. Vypoítejte koncentraci vzorku podle následujícího vztahu: Koncentrace celkové bílkoviny c vzorku (g/l) = x c standardu (70 g/l) Výsledek porovnejte s normální hodnotou celkové bílkoviny v séru. Použité roztoky a inidla: 1. biuretové reagens: 1,5 g CuSO 4. H 2 O a 6 g vinanu sodnodraselného se smísí s 500 ml destilované vody, 300 ml 2,5 M NaOH a za stálého tepání se ve smsi rozpustí 1 g KI, doplní se vodou na 1 l, ph má být 11,4 2. Fyziologický roztok (0,9 g NaCl/100 ml) 3. Standardní sérum se známým obsahem bílkovin (nap. Versatol)

3 Stanovení albuminu v séru (set Lachema Alb-BCP 30) Princip: Bromkrezolový purpur (5,5 - dibrom-o- kresolsulfonftalein) tvoí s albuminem ve slab kyselém prostedí za pítomnosti povrchov aktivních látek zelenomodrý komplex vhodný k fotometrickému stanovení. Provedení: Pipravte si ti zkumavky a oznate je vz, st a pv. Do zkumavek odpipetujte podle tabulky sérum, standard, destilovanou vodu a inidlo. vz st pv vzorek séra (ml) 0, standard (ml) - 0,02 - dest.voda (ml) - - 0,02 inidlo 2,0 2,0 2,0 Roztoky zamíchejte a nechte stát 10 minut pi laboratorní teplot. Zmte absorbanci vzorku a standardu proti porovnávacímu roztoku pi vlnové délce 600 nm. Vypoítejte koncentraci vzorku podle vztahu: Koncentrace albuminu c vzorku (g/l) = x c standardu (40 g/l) Výsledek porovnejte s normální hodnotou albuminu v séru. Vypoítejte albuminoglobulinový koeficient. A/G = (orientaní rozmezí je 1,3 2,0)

4

5 Elektroforetické dlení plasmatických bílkovin na agarosovém gelu Bílkoviny jsou biopolymery vzniklé polykondenzací asi dvaceti základních aminokyselin. Funkní skupiny nkterých aminokyselin (Asp, Glu, Lys, Arg, His) nacházející se v postranním etzci proteinu mohou pi vhodném ph disociovat a bílkovina tím získá uritý iontový náboj. Za fyziologických podmínek pi ph krve 7,40 je v plasm 15 až 17 mmol/l záporných proteinátových náboj. Plasmatické bílkoviny tvoí podstatnou a zcela specifickou souást krve. Normální hladina je 62 až 82 g/l. Mají dležitou roli transportní (nap. bilirubinu, lipid, nkterých hormon aj.), podílejí se na udržování osmotických pomr, na iontové i acidobazické rovnováze, na imunitních djích a v krizových stavech mohou mít i význam nutriní. Jejich spektrum je širší než poet jejich elektroforetických frakcí, nebo nelze mezi sebou rozlišit látky se stejnou elektroforetickou pohyblivostí. Pi dlení v alkalickém prostedí (ph = 8,6) lze získat tyto elektroforetické frakce: (+) 1. albuminy 53-65% 2. α 1 -globuliny 2-4% 3. α 2 -globuliny 8-13% 4. β-globuliny 9-16% 5. γ-globuliny 11-19% (-) start Hodnotí se rovnž pomr albuminové a globulinové frakce (tzv. albumino-globulinový koeficient A/G, normální hodnota - vyšší než 1,2). Vyhodnocení se provádí na densitometrech, které zaznamenají rozložení frakcí, odetou na elektroforeogramu jejich plochu a vyjádí ji ve vzájemném pomru. Pi rzných závažných patologických stavech (akutní a chronické zánty, onemocnní ledvin a jater, imunitní problémy, poruchy v oblasti lipoprotein, nádorová onemocnní aj.) je provedení elektroforetického dlení nezbytnou souástí posouzení stavu vyšetované osoby. Provedení: Sklennou desku s agarosovým gelem osušte filtraním papírem. Na spodní tetinu gelu (asi 2 cm od okraje) piložte nanášecí šablonu. Otvory šablony naplte vzorkem séra zedného pufrem v pomru 1 : 3 a nechte 5 minut vsakovat. Pak odsajte pebytek séra proužkem filtraního papíru a sejmte šablonu. Desku vložte do pipravené elektroforetické komory naplnné pufrem agarosovou vrstvou dol na mstky ze složeného chromatického papíru a lehce pitisknte. Laborantka pikryje komoru víkem a pipojí zdroj naptí. Dlení nechte probíhat 30 minut pi naptí 100 V. Poté laborantka odpojí zdroj naptí, sejme víko a vyjme gel. Následuje fixace a barvení: 5 minut fixace v kyselém alkoholu 10 minut barvení v barvicí lázni amidoern Dalším krokem je odbarvení: 15 minut v 5% kyselin octové Gel peneste ze skla na filtraní papír, zvolna usušte a piložte k protokolu.

6 Použité roztoky a inidla 1. Pufr: 2,76 g kyseliny diethylbarbiturové a 15,40 g diethylbarbiturátu sodného rozpustit na 1500 ml roztoku 2. Agarosový gel: 1,0 g agarosy a 0,6 g arabské gumy rozvait ve 100 ml pufru (roztok 1) na vodní lázni 3. Fixaní roztok: 600 ml ethanolu a 100 ml konc. kyseliny octové doplnit vodou na objem 1000 ml 4. Barvící roztok: 1,0 g amidoern, 30 ml konc. kyseliny octové a 6,8 g octanu sodného doplnit vodou na objem 1000 ml 5. Odbarvovací roztok: kyselina octová (5% roztok) 6. Krevní sérum 7. Sklenné desky s agarosovým gelem Mezi dv sklenné desky (10 x10 cm) se vloží gumový rámeek, skla se stisknou svorkami a mezi n se pipetou pomalu nalije asi 8 ml horké agarosy (roztok 2) tak, aby byl prostor mezi skly zcela vyplnn. Nesmí vzniknout vzduchové bubliny. Nechá se pi laboratorní teplot ztuhnout (asi 30 minut), pak se uvolní svorky a opatrn se stáhne horní sklo. Deska se vloží do vlhké komrky a uloží do chladniky. Takto se mže uchovávat 5 dn.

7 !" " #$%# &'()*+ &, - %% + (#.,%/ ))0 " " " ))0 " " " ))0 0) 0) 0) 0# 1 2 # 3,2 244#!

8 !"#" $%& '()*+, $%&!"# $ %% &'()*+,- % & #"./ /# 0/- *$ 1 "0 2 3)3*( 3)3*( 3)3*( *)( *)( *)( $ 4 5 $ 6"5% %% # 5 %$ -. /

9 ! " #$%" & '( $ %$ ') &% ' ( $%! $ * +,,# ' -+,%* &! %$' " & -!"$ " -%%'. % $*%! % " -%%" %! " " /-%0%,% # &/ %#'1 ##!234$ 5 &' , %%* $ 9 : 7;7 < = < -% < = < -% 7 %7 < = > % /%$! %?@A 4AB '.&0 % % %? 9 ##C#" &." %%D & )"! &2%'

10 E' 04 %?#."D")"%!% > % #&F GH '&@ '%%@ ' &@ 0%E' I"3 I"3 I"3 I"IE %% I"IE % I"IE <' %?/% ##!4AB %#2 4'? %!/ % 234 :' #0%#$0 %? ## #! $ $#%!& 2' /%&%/?!%J' J'! ##,H C#) E C#D E C#. E A'! &*0! %,% %? "!%%/%I"40%<'# K' /% #2!4AB 3' #0%#$ %?# #! $ $#%& EI'! ##,H C#) < C#D < C#. < EE'0%? ## %&! H 9)@) < ) E 9D@D < D E 9.@. <. E $*'

11 !"# $%" & '( $ " % $ )*! &# & % %% # &+ ',, -. / 0 121**,, 3 121** 121**4% %+%4 **,, /. -. /. -. /. 4% -. /,, + % 5%$! %"*-67".%0.,,2789':& % % ##+:%%+;"# + %%+' <' 2 %*#:";"="%!%+ % #&>?+@

12 '&6 '%%6 ' &6 % <"AA <"AA <"AA A"A< 1 1 %% 1 A"A< 1 % 1 1 A"A<.' %*5%+ #+!2789%#<A 2' * %!5 +% BCD C' # %#$ %*# #! $ $+#+%! &+ B' 5%&+%5 *!%D' D'! =## +: %%+;@ #= #: #; $E %% 6.".DF

13 Výpoet LDL cholesterolu Výpoet koncentrace LDL cholesterolu se provádí podle Friedewalda na základ látkové koncentrace cholesterolu celkového, HDL cholesterolu a triacylglycerol. Výpoet je založen na pedpokladu, že cholesterol je obsažen v ásticích VLDL, LDL a HDL. Koncentrace VLDL je v rovnici odhadována z hladiny triacylglycerol. LDL cholesterol (LDL-C) = celkový cholesterol HDL cholesterol

14 Vyhodnocení rizika aterosklerózy Z namených hodnot týkajících se lipidového metabolismu lze poítat rzné ukazatele. Doruovány jsou indexy, které berou v úvahu vliv koncentrace nejen celkového cholesterolu, ale i HDL cholesterolu. Aterogenní index (AI) = Riziko aterosklerózy se zvyšuje se stoupající hodnotou aterogenního indexu. Tento výpoet zohleduje, že zvýšená hladina celkového cholesterolu mže být zapíinna zvýšenou hladinou HDL cholesterolu, který není rizikový. Existují i ukazatele poítající s hladinou triacylglycerol jako je nap. aterogenní index plazmy. Aterogenní index plazmy (AIP) = log Rizikových faktor aterosklerózy je ale více (vk, pohlaví, hypertenze, kouení). V klinické praxi se pro vyhodnocení celkového kardiovaskulárního rizika používá tabulka vycházející z projektu SCORE (Systematic COronary Risk Evaluation), pomocí které se provádí odhad rizika fatálních kardiovaskulárních píhod v následujících 10 letech. Tabulka rizika podle projektu SCORE

15 ! " # % $ %&'()! "! * +* %'()! *,-. /)" ( 0( *755+*1(0(%&'()5! * 800,91(:( ;<=. >?</.< $@ AB.0(0BC!D@ "@ * 3 <<. ),E! "!#@?/<</))0<)(0F <=B,B 0 <<@ 8 < < (G 0 3@ 7 0 )?? 15 0(=?? *3<<H!!#@ 7/)5<(G03@70?? I@ 8HFGH.B.,@5(,(@,@ %&' ;<),B??, 1,5 00 ),E ;<)<E

16 !" # $ % & '! ( ( ) * +, * ) *, * ) * -, * ) ( ( '. #% / 0 $ (1234 5! 1 #678$'. 9 %:';! <!<! < 5== 5== 5== ==* > > > ==* > > > ==* *! #0' '$1234* 1! * # $ '' $ '?! $ &'6'7 ; % <1?2AB

17 ! " # $ %% " # & # $! %" & $ ' " %()$ %" & $ " * &+,($ #!" #$ -. % & % /0 /0 / 0 /0 * 0 1!! %! 2 3 '' #

18 '()*+!" -. % & % /0 /0 / / * /0 /0 * 0 1!. / / 2 1! %! 4 3 '' # 0

19 ! " # $ % $& ' (! ) (* " ( $! &+, $$ ' "-!." $ $ ) ( /!!! ( (0'%1234$567 2%'%12! "- & )-" ) )

20 !!"#$ % # % %! " #"$%"$ &$" ' ( %) $%*+,- )-.' /! %0 0&1 ( 2$ :8& 2 & %0 0! 0 &$" 0 ( %) $%-) '2 1;<& %/0! &=# % =#+!"=# 999 (, % =# %!0 30 %$ 0 0 # 0&/ ( %)/$%;+* 0 %$ 0 2 #> =# & &: ( %) $%,0 % % 0 &? :'? $!!!' 0 0&?# %! 2 )&

21 ( * %* % *,-.: "0 $% % 0 02 &# % 0 1 +/ 1 +/&' 3 A$ '! 02''& &: % *2 & $% ' ' (%' 2!& &$! 20& 0&1 ( & %) %000 0 &C ( 2$ :8& 2 & %00! &5 ( %, 3 %0! %00 0! "#$ % D ( %) $% D $!" 0 0 % #! " 0! 'A!! $ E"!!0 # F 0 G$18:H2!0I?& : %1 $18:0 E% 1 %0#E 0#00#0

22 !"# $"$$#% &' (#$$% # ) $ * +# ),---. $ / /%$$' 0/-%) 1 2$$ ' /# +) 2 #" 0 ($,-$3--#$/"#$# '/ ' $ ( /#$ 4 5# /# '" % 6%$ +# /% 7 829)-:## %29)-(;<= ($># /2>2 ($$ / #%# *## $

23 Stanovení glomerulární filtrace jako clearance endogenního kreatininu 1) Do isté nádobky (najdete na tácu u dveí do praktikárny) odeberte vlastní mo. 2) Vzorek moi 100x zedíme. Do odmrné baky (o objemu 100 ml) napipetujte sklennou pipetou 1 ml moi. Destilovanou vodou doplte odmrnou baku po rysku (tj. na objem 100 ml). Odmrnou baku uzavete zátkou a obsah dkladn promíchejte. Pro moedíme? Látky, které se v glomerulu voln filtrují a následn nepodléhají ani tubulární resorpci ani tubulární sekreci (o kreatininu pedpokládáme, že se práv tak chová), mají v definitivní moi zhruba 100x vtší koncentraci než v glomerulárním filtrátu (koncentrace v glomerulárním filtrátu je blízká koncentraci v krevní plazm). Pi fotometrickém stanovení, kdy paraleln zpracováváme vzorek a standard, je nutné, aby koncentrace vzorku nebyla píliš vzdálená od koncentrace standardu. V praxi se postupuje tak, že se používá standard o koncentraci srovnatelné s oekávanou koncentrací vzorku. Další možností je ední vzorku tak, abychom se dostali po naední ádov ke koncentraci standardu. Ze zmené koncentrace naedného vzorku a známého ední mžeme snadno spoítat koncentraci pvodního (needného) vzorku, která nás zajímá. V našem pípad jako standard použijeme krevní sérum o známé koncentraci kreatininu (177 µmol/l), pro zjištní clearance kreatininu musíme zmit jeho koncentraci jednak ve vzorku krevní plazmy (séra) vyšetovaného pacienta, jednak v prmrném vzorku po dobu 24 hodin sbírané moi. Oekávaná koncentrace kreatininu v séru je ádov srovnatelná s koncentrací standardu, ale pro mo tohle neplatí, oekávaná koncentrace v moi je ádov 100x vyšší, proto musíme ped mením vzorek moi edit. 3) Podle následujícího schématu napipetujte: vzorek séra a standardu do centrifuganích zkumavek vzorek moi a slepý vzorek (porovnávací roztok) do tenkostnných zkumavek Krevní sérum a mo jsou úpln jiné biologické matrice, zkumavky 1 (sérum) a 2 (standard) budou zpracovávány odlišným zpsobem je nutné odstranit proteiny, které by rušily stanovení, precipitací kyselinou trichloroctovou. Objemy jsou centrifuganí zkumavky tenkostnné zkumavky uvedeny v ml Sérum Standard Zedná mo Porovnávací roztok sérum 0,50 standard 0,50 zedná mo 0,50 destilovaná voda 1,00 1,00 0,25 0,75 kys. trichloroctová 0,50 0,50 0,25 0,25 Lihovým fixem zkumavky oíslujte a centrifuganí zkumavky oznate tak, abyste si je poznali. 4) Obsah zkumavek promíchejte a nechte 5 minut stát. 5) Centrifuganí zkumavky (1 a 2) odevzdejte laborantce k provedení centrifugace (10 min, 3000 ot/min). Tenkostnné zkumavky (3 a 4) ponechte stát ve stojánku na stole, už jsou pipravené pro krok 7 návodu, se kterým ale zanete až po probhnutí centrifugace a odbru supernatantu. ekání mžete využít k prohlížení preparát moového sedimentu, pípadn si vyzkoušet webové kalkulátory GF. 6) Po dokonení centrifugace peneste opatrn do paralelních tenkostnných zkumavek (1 a 2) po 1,00 ml supernatantu. 7) V tomto kroku máte pipravené 4 zkumavky, každá obsahuje 1 ml roztoku (zkumavka 1 a 2 supernatant odebraný po centrigugaci, zkumavky 3 a 4 máte už pipravené z kroku 3 návodu. Vlastní stanovení kreatininu (Jaffého reakce) Ke stanovení kreatininu se používá reakce s kyselinou pikrovou v alkalickém prostedí. Reakce není specifická, podobn reaguje ada dalších látek (tzv. Jaffé-pozitivní chromogeny).

24 Do všech zkumavek napipetujte roztok kyseliny pikrové a NaOH (viz tabulka): kys. pikrová 0,50 0,50 0,50 0,50 hydroxid sodný 0,50 0,50 0,50 0,50 8) Obsah zkumavek promíchejte nechte 20 minut stát. ekání mžete využít k prohlížení preparát moového sedimentu, pípadn si vyzkoušet webové kalkulátory GF. 9) Zmte absorbanci všech tí vzork (A sérum = zkumavka.1 sérum, A st = zkumavka. 2 standard, A z. mo = zkumavka. 3 zedná mo) proti porovnávacímu roztoku (zkumavka. 4) pi vlnové délce 505 nm. 10) Provete výpoet koncentrace kreatininu v séru (S kr ): S = c kr st A sérum A st pozn. Referenní rozmezí fyziologických hodnot je závislé na vku a pohlaví, zhruba µmol/l. 11) Provete výpoet koncentrace kreatininu ve zedné moi (U z. mo ): U z. mo = cst A z. mo A st 12) Provete výpoet koncentrace kreatininu v pvodní needné moi (U kr ): pozn. U kr = 50 U z. mo Mo jste ped stanovením kreatininu edili 100x, ale zkumavky 1 a 2 (kde je bylo matricí sérum), byly zpracovávány odlišným zpsobem.než zkumavka se zednou moí, po centrifugaci byla dále zpracovávána jen polovina výchozího množství...). 13) Provete výpoet odhadu glomerulární filtrace jako clearance kreatininu: GF C U kr kr = kde V je diuréza/24 hodin, poítejte s údajem S kr V V = 1,78 l/den pozn. Referenní rozmezí fyziologických hodnot je závislé na vku a pohlaví, zhruba platí: C kreat = 1,3 3,3 ml/s Provedení v praktických cvieních neodpovídá vyšetení jednoho daného pacienta, i když pracujete s vlastní moí, spoítaná glomerulární filtrace nic neíká o funkci vašich ledvin!!! Zamyslete se, jak jste postupovali: U kr S kr V vlastní mo jednorázový odbr fetální bovinní sérum 24-hodinový sbr moe nebyl provádn, diuréza/24 hodin je už pro výpoet dopedu udána Pro zajímavost, jak se vyšetení skuten provádí: Pokyny k provedení vyšetení (citováno dle: Ústav klinické biochemie a hematologie FN Plze) Clearance endogenního kreatininu (C kr ) 3 dny ped a bhem testu vynechat maso, výrobky z masa, léky pokud je to z klinického hlediska možné. Vyhnout se fyzické námaze. V den testu pijímat prmrné množství tekutin; pacient nesmí pít píliš, ale též nesmí žíznit. Nepodávat látky s moopudným úinkem (diuretika, káva, aj). Dodržovat tlesný klid; vyšetovaný leží nebo mírn pechází. Provádíme 24-hodinový sbr moe. Mo není teba konzervovat, pípadná konzervace nevadí. Do laboratoe zaslat 5 ml prmrného vzorku moe na stanovení hladiny kreatininu (U kr ). Na žádance vyznait diurézu/24 h s pesností na 10 ml. Souasn ráno nalano, staí na konci sbrného období, odebrat srážlivou krev na stanovení hladiny sérového kreatininu (S kr ). Výpoet se vztahuje na ideální tlesný povrch 1,73 m 2 ; k výpotu skuteného tlesného povrchu je teba udat hmotnost a výšku pacienta.

25 STANOVENÍ AMINOKYSELIN A JEJICH METABOLIT V MOI Akoliv jsou aminokyseliny z primární moi v tubulech aktivn resorbovány, v malém množství (do 14 mmol/ 24h) jsou vyluovány moí. Jejich zvýšená koncentrace je obvykle patologická, hovoíme o aminoacidurii. Podle píiny mžeme rozdlit aminoacidurie na tzv. renální, kdy zvýšené vyluování aminokyselin pi jejich normální hladin v krvi je dsledkem postižení tubul nebo tzv. overflow aminoacidurii, kde produkce jedné nebo více aminokyselin pevyšuje resorpní kapacitu ledvinných tubul. Velmi asto je aminoacidurie dsledkem ddiného defektu, tzv. ddiné metabolické poruchy, která mže být lokalizována ve specifickém reabsorpním systému nebo v metabolické dráze aminokyseliny. Ddiné metabolické poruchy jsou obecn zpsobeny mutací v jednom genu, což má za následek tvorbu nefunkního produktu, nejastji enzymu. Dsledkem takovéto enzymové poruchy je hromadní substrát píslušné metabolické dráhy a souasný nedostatek jejích produkt. Hromadící se substrát bývá asto pemován alternativní cestou za vzniku abnormálních, asto toxických vedlejších produkt. Výsledkem jsou rzn závažné klinické projevy. Diagnózu ddiné choroby lze provést na tech úrovních: 1. Detekce mutace v DNA 2. Detekce defektního proteinu 3. Detekce zvýšené hladiny substrátu / nedostatku produktu / alternativního produktu Nejjednodušší a nejdéle užívané jsou detekce zvýšené hladiny aminokyselin nebo jejich metabolit v moi pomocí jednoduchých test. Pro stanovení aminokyselin v moi použijte modelový vzorek moi. Obsahuje danou aminokyselinu, proto bude výsledek pozitivní. Jako negativní kontrolu použijte vlastní mo. 1. Stanovení cystinu Na filtraní papír dejte malé množství práškového inidla (nitroprusid sodný + (NH 4 ) 2 SO 4 +Na 2 CO 3 +NaCN) a zvlhete kapkou moi. V pozitivním pípad vznikne ihned ervenofialové zabarvení. (Na rozdíl od acetonu, kdy se zabarvení vyvíjí pomalu a je trvalejší.)

26 2. Prkaz fenylpyruvátu K nkolika ml moi ve zkumavce pidejte 2 kapky 10% HCl a 3 kapky FeCl 3. V pozitivním pípad vznikne tmavozelené zabarvení. 3. Prkaz tyrosinu Ve zkumavce smíchejte stejný díl moi (max. 0,5 ml) a Millonova inidla (Hg + HNO 3 ). V pozitivním pípad se do 10 minut vyvine ervené zbarvení.

27 ! "#$ % & ' (%$"%") * " +"%)! %* #%%,, % %) & &!" # -%.,./.,./ -.,./ + &.,./ 0 /,. /,. /,. /,. 1")!$* 2% $"! ##"3 % %" %42.& 1) * %#%"$&'%5* %*" $6 7 % 8 /8! "#$#%!! "#$#%!

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

29 !" #$ % && ' ( ) * * *$ + &,# - (.#% / ' ( 0"1$ 2 ) / " 1( ) ) /1 (! $ 3 ( ( /) 1$ 4 & ( $ % 5(6 5(6 5(6 /1 5(6 5(6 0 4$ / (6 ) /7& ) * $1!" " ) 8(6 9 ) :) (5 9 ) ) ;(5 9 ) % )! /1 ) <5= $. )! )!"!( &) * & )$

30 >) 0 )@) ( 0: 0:! & $ A & B!) ) $ 2 ) $ 3 ( ( /1 /) 1$ 4 & ( ( $!$ " #! $%& /1 5(5 5(5 0 0, /1 # # 5(5 # 4$ /1 0 0 # 5(5 + /1 (5 (5 (5 (5!! )! 8C D ;5 $ &! : ) 6-< $ ) & $ 3 ) E. ) " /91 $ % " /8(88 91 &'"()*" "' &'"()*" "'