Zavedení monitorování antiagregační léčby. na analyzátoru Multiplate

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd Zavedení monitorování antiagregační léčby na analyzátoru Multiplate Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Mgr. Ilona Fátorová Hradec Králové, 2012 Šárka Trenčanská

2 Prohlašuji, ţe tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichţ jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla vyuţita k získání jiného nebo stejného titulu.. V Hradci Králové dne Podpis:

3 Poděkování Tímto bych ráda poděkovala paní Mgr. Iloně Fátorové, své školitelce, za její vstřícnost, trpělivost, cenné rady a připomínky, díky kterým mohla být tato práce napsána a dokončena.

4 Abstrakt Tato práce popisuje zavedení sledování antiagregační léčby na přístroji Multiplate, který pracuje na principu impedanční agregometrie. Ke sledování jsme pouţili 4 testy ASPItest, který slouţí pro monitorování léčby kyselinou acetylsalicylovou (ASA), ADPtest a ADPtestHS slouţící pro sledování léčby thienopyridiny a TRAPtest pro monitorování léčby inhibitory GPIIb/IIIa. Cílem této práce bylo ověřit přesnost metody pro jednotlivé testy, stanovit vlastní referenční meze a porovnat je s literárními údaji a na souboru kardiologických pacientů uţívajících duální antiagregační léčbu (ASA 100 mg/den a clopidogrel 75 mg/den) vyhodnotit případnou rezistenci na tyto léky. Přesnost metody jsme ověřili na souboru 10 dárců krve zcela bez léčby. Kaţdý vzorek byl opakovaně 5x změřen a z naměřených hodnot jsme vypočítali variační koeficienty. Naše hodnoty variačních koeficientů se od hodnot udaných výrobcem (CV 6 10 %) výrazně nelišili (ASPItest: CV 8,7 %, ADPtest: CV 8,8 %, ADPtestHS: CV 13,3 % a TRAPtest: CV 12,1 %). Dále jsme ověřili na souboru 32 dárců krve zcela bez léčby referenční rozmezí AUC pro jednotlivé testy, která jsme porovnali s literárními údaji. Mezi hodnotami AUC našeho kontrolního souboru a literárními údaji nebyly výrazné rozdíly (ASPItest: p = 0,6136; ADPtest: p = 0,0745; TRAPtest: p = 0,3518). Pouze u ADPtestuHS byla pozorována signifikantní odlišnost oproti literárním údajům (p = 0,0004). U souboru 83 kardiologických pacientů na duální léčbě jsme hodnotili přítomnost rezistence na některý z léků ve dvou odběrech. 1. odběr byl proveden den po medikaci a 2. odběr za 3 6 měsíců po prvním. Rezistence v obou odběrech na danou denní dávku medikamentů byla prokázána u 2 pacientů (2,4 %) na duální léčbu a u 2 pacientů (2,4 %) na léčbu pouze ASA, u 1 pacienta (1,2 %) na léčbu pouze clopidogrelem. Počty pacientů s rezistencí na léčbu u sledovaného souboru jsou niţší neţ udává literatura.

5 Abstract This study describes the implementation of antiplatelet therapy monitoring on the analyzer Multiplate that works on the principle of impedance aggregometry. We used to determine four tests - ASPItest used for monitoring acetyl salicylic acid (ASA) therapy, ADPtest and ADPtestHS used to monitoring thienopyridines treatment and TRAPtest, which is used to monitoring treatment with GPIIb/IIIa inhibitors. The aim of this study was to verify the accuracy of this method for individual tests, to determine its own reference limits and compare them with literature data and on a group of cardiac patients receiving dual antiplatelet therapy (aspirin 100 mg per day and clopidogrel 75 mg per day) to assess any resistance to these drugs. Accuracy of the method we verified the group of 10 blood donors without any treatment. Each sample was repeatedly measured 5 times and from the measured values we calculated coefficients of variation. Our values of coefficients of variation from the values given by the manufacturer (CV 6-10 %) did not differ significantly (ASPItest: CV 8.7 %, ADPtest: CV 8.8 %, ADPtestHS: CV 13.3 % and TRAPtest: CV 12.1 %). We also verified on a group of 32 blood donors without any treatment reference ranges AUC for single tests, which were compared with reference limits from the literature. Between the AUC values of our control group and the literature data were not significant differences (ASPItest: p = 0,6136; ADPtest: p = 0,0745; TRAPtest: p = 0,3518). Only when using ADPtestHS significant difference was observed (p = ). The group of 83 cardiac patients on dual therapy, we evaluated the presence of resistance to any of the drugs in two consecutive sampling. 1st blood collection was performed 2 to 5 days after medication and 2nd blood collection for 3 to 6 months after the first. Resistance in both sampling subscriptions to the daily dose has been demonstrated in two patiens (2,4 %) on dual therapy and in two patiens (2,4 %) with ASA therapy only, in one patient (1,2 %) with clopidogrel therapy only. Numbers of patients with resistance to treatment in the studied cohort are lower than in the literature.

6 Obsah 1. Úvod a zadání práce cíl práce Teoretická část Trombóza Vrozené trombofilní faktory Koagulační faktory a inhibitory koagulace Metabolizmus homocysteinu Hyperagregabilita trombocytů Získané faktory Ţilní trombóza Arteriální trombóza Ateroskleróza Poškození endotelu a endoteliální dysfunkce Tukové prouţky Ateromové pláty Komplikované léze Rizikové faktory aterosklerózy a arteriální trombózy Neovlivnitelné rizikové faktory Ovlivnitelné rizikové faktory Patogeneze vzniku arteriální trombózy Úloha trombocytů při vzniku arteriální trombózy Adheze a aktivace trombocytů Aktivátory destiček Aktivační cesty destiček Receptory spřaţené s G-proteiny Tyrozinkinázová cesta aktivace Agregace... 26

7 2.5. Profylaktická léčba arteriální trombózy Inhibitory adheze Inhibitory aktivace Blokátory tromboxanové cesty Metabolismus kyseliny arachidonové Inhibitory cyklooxygenázy Blokátory tromboxanových receptorů Blokátory ADP receptorů Blokátory trombinových receptorů, serotoninových receptorů a receptorů pro PAF Stabilizace trombocytů Inhibitory agregace Inhibitory receptorů IIb/IIIa na bázi monoklonálních protilátek Inhibitory receptorů IIb/IIIa s malou molekulou Blokátory trombinu Rezistence na protidestičkovou léčbu Monitorování protidestičkové léčby Agregometrie Optická agregometrie Optická agregometrie v plazmě Optická agregometrie v plné krvi Impedanční agregometrie Průtoková cytometrie Další metodiky PFA Koncentrace tromboxanu B 2 v séru a 11-dehydrotromboxanu B 2 v moči Praktická část... 37

8 3.1. Materiál a metodika Přístroj Princip měření Induktory Postup stanovení Vyjadřování výsledků Referenční rozmezí a interpretace výsledků Reagencie Odběr vzorků Charakteristika vyšetřovaného souboru Statistické zpracování Výsledky a vyhodnocení Opakovatelnost Stanovení vlastních referenčních rozmezí a jejich porovnání s literárními údaji Sledování účinku léčby na souboru kardiologických pacientů Diskuse a závěr Seznam pouţité literatury Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam grafů Přílohy Kontrolní soubor pro ověření přesnosti metody Kontrolní soubor pro porovnání referenčních rozmezí Souboru kardiologických pacientů... 66

9 Seznam zkratek ADP - adenosindifosfát APC - R - rezistence na aktivovaný protein C APS - antifosfolipidový syndrom ASA - kyselina acetylsalicylová Arg arginin AUC plocha pod křivkou AU agregační jednotky camp - cyklický adenosinmonofosfát COL - kolagen COX - cyklooxygenáza CT - closure time, čas uzávěru CV variační koeficient DAG - diacylglycerol DIK - diseminovaná intravaskulární koagulace DNA kyselina deoxyribonukleotidová ELISA - anglická zkratka enzyme-linked immuno sorbent assay EPCR - endotelový receptor proteinu C EPI epinefrin F - faktor FcR - Fc receptor FcRγ γ řetězec Fc receptoru Gln glutamin

10 Gly - glycin GDP - guanosin difosfát GTP - guanosin trifosfát GP - glykoprotein Hcy - homocystein HDL - lipoproteiny s vysokou denzitou IP3-1,4,5-inositoltrifosfát ITAM - anglická zkratka immunoreceptor tyrosine-based activation motif K S test Kolmogorov Smirnov test LDL - lipoproteiny s nízkou denzitou LMWH - nízkomolekulární heparin Lp(a) - lipoprotein (a) MTHFR - 5,10-metylentetrahydrofolát reduktáza PAF - faktor aktivující destičky PAI inhibitor aktivátorů plazminogenu PAR - proteázou aktivovaný receptor PDGF - růstový faktor z destiček PGG 2 prostaglandin G 2 PGH 2 prostaglandin H 2 PGE 1 prostaglandin E 1 PGI 2 - prostacyklin PIP 2 - fosfatidylinositol 4,5-bisfosfát PLC fosfolipáza

11 P2Y 1 a P2Y 12 - receptory pro adenosindifosfát RGD - aminokyseliny arginin, glycin, aspartát ROC anglická zkratka Receiver Operating Characteristic curve SD směrodatná odchylka SPS - syndrom lepivých destiček TF - tkáňový faktor TFPI - inhibitor tkáňového faktoru Thr - threonin t- PA - tkáňový aktivátor plazminogenu TPα a Tpβ - trombinové receptory TRAP - peptid aktivující trombinový receptor TXA 2 - tromboxan A 2 u-pa - urokináza VASP - anglická zkratka Vasodilatator-Stimulated Phosphoprotein VASP P fosforylovaná forma VASP VTE - ţilní trombembolizmus vwf - von Willebrandův faktor

12 1. Úvod a zadání práce cíl práce Trombocyty hrají v organizmu významnou úlohu při zástavě krvácení. Účastní se tvorby primární zátky a aktivace plazmatického koagulačního systému. Za patologických stavů však mohou výrazně přispívat k tvorbě krevních sraţenin, které mohou cévy postupně uzavírat a následně je i zcela ucpat. Nejčastější příčinou bývá ateroskleróza, na jejímţ podkladě arteriální trombózy vznikají. Následkem postupného uzavírání cév či jejich úplného uzávěru vzniká řada kardiovaskulárních onemocnění postihujících srdce a cévy, mezi něţ patří například ischemická choroba srdeční, srdeční infarkt a mozková mrtvice. Vzhledem k tomu ţe tato onemocnění patří mezi nejčastější příčiny úmrtí, je jejich prevenci a léčbě věnována velká pozornost. K profylaxi vzniku a rekurenci arteriálních trombóz slouţí protidestičkové léky. Určitá dávka léku můţe být pro jednoho pacienta dostatečně účinná, nicméně u jiného můţe vést k předávkování a následným krvácivým komplikacím, nebo naopak nedostatečná a můţe vést k riziku trombotických komplikací. Proto by měla být léčba těmito preparáty, vzhledem k rozdílnému účinku u jednotlivých pacientů, monitorována a dávkování případně upraveno. K monitorování účinku protidestičkových léčiv je vyuţívána celá řada přístrojů zaloţených na různých principech. Tato práce je zaměřena na vyuţití přístroje Multiplate, který pracuje na principu impedanční agregometrie v plné krvi. Cílem této práce je: rešerše problematiky trombóz - příčiny vzniku, léčba a její monitorování ověření přesnosti měření na přístroji Multiplate stanovení vlastních referenčních mezí sledování účinku léčby u souboru kardiologických pacientů 12

13 2. Teoretická část 2.1. Trombóza Integrita cévního systému je zajišťována součinností cévní stěny, krevních destiček a plazmatických bílkovin, mezi něţ patří koagulační faktory, jejich inhibitory, fibrinolytický systém a inhibitory fibrinolýzy. V případě poranění cévní stěny dojde k aktivaci krevního sráţení nezbytného k zabránění ztráty krve. Tvorba krevní sraţeniny je regulována systémem inhibitorů koagulace, který zamezuje vzniku cévní okluze. Vytvořený trombus je postupně rozpouštěn za účasti fybrinolytického systému důleţitého pro obnovení normálního průtoku krve cévou. Pokud začnou převaţovat aktivační koagulační děje nad kapacitou inhibitorů koagulace a fibrinolytického systému, můţe dojít ke vzniku trombózy. (Kessler, 2006) Trombóza je stav, při kterém v cévách - ţilách nebo arteriích, vzniká krevní sraţenina (trombus), která můţe vést k částečnému nebo úplnému omezení průtoku krve postiţenou oblastí. Zvýšené dispozice ke vzniku trombů se označují jako trombofilní stavy. Při pátrání po příčině trombofílie je třeba vycházet z rozdílného způsobu trombotizace v ţilním a arteriálním systému. Jejich včasným rozpoznáním lze zabránit vzniku nebo rekurenci trombózy vhodně zvolenou profylaxí. Trombotické komplikace jsou multifaktoriální povahy. Jiţ více neţ před 100 lety popsal Virchow 3 faktory, které mohou vést k jejich vzniku: Postiţení cévní stěny Stagnace krevního proudu Změny ve sloţení a funkci krve porucha funkce destiček změny v plazmatickém koagulačním systému včetně inhibitorů narušení fibrinolytických mechanizmů Jakékoli faktory, jak vrozené či získané, postihující jeden nebo více z těchto faktorů, vychylují rovnováhu hemostatických mechanizmů směrem k trombóze. 13

14 Mezi klinická kritéria pro určení trombofilního stavu patří: ţilní trombózy před 45. rokem věku (včetně trombóz u novorozence) opakované ţilní trombózy tepenné trombózy před 35. rokem věku trombóza v neobvyklé lokalizaci opakovaně předčasně ukončená gravidita (bez morfologických změn plodu) pozitivní rodinná anamnéza trombóza vzniklá při účinné antikoagulační terapii (Kessler, 2006) Faktory vedoucí k hyperkoagulačním stavům lze dělit na vrozené a získané Vrozené trombofilní faktory Koagulační faktory a inhibitory koagulace Rezistence na aktivovaný protein C (APC-R) - Aktivovaný protein C štěpí a inaktivuje faktory Va a VIIIa důleţité pro vznik koagulačně aktivních komplexů tenázy a protrombinázy, čímţ vede k inhibici krevního sráţení. Při APC-R je inaktivace těchto faktorů nedostatečná a inhibiční vliv na koagulační proces je sníţený. Nejčastější příčinou APC-R je jednobodová mutace faktoru V, která vede k záměně aminokyseliny ve vysoce konzervovaném štěpném místě pro protein C. Ve více neţ 90 % se jedná o mutaci faktoru V-Leiden (Arg 506 Gln). Mezi další mutace patří: mutace faktoru V-Cambridge (Arg 306 Thr), Hong Kong (Arg 306 Gly) a faktor V haplotyp HR2. Poslední tři uvedené mutace vedou jen k mírné APC-R. (Raušová & al, 2005; Khan, Dickerman, 2006) Mutace protrombinu (FII) Glykoprotein protrombin je protrombinázou štěpen na serinovou proteázu trombin, která aktivuje koagulační faktory V, VII, IX, XIII, krevní destičky a štěpí fibrinogen na fibrinové monomery, jeţ 14

15 spontánně polymerují a za pomoci aktivovaného faktoru XIII tvoří nerozpustný fibrin. Mutace genu pro protrombin (G20210A) je příčinou jeho vysoké koncentrace v krvi a tím zvýšeného rizika ţilní trombózy. (Khan, Dickerman, 2006) Deficit proteinu C - Protein C je vitamin K-dependentní serinová proteáza aktivovaná komplexem trombin-trombomodulin na povrchu endotelu a vazbou na endotelový receptor proteinu C (EPCR). Jeho sníţená hladina nebo funkční aktivita vede k nedostatečnému štěpení faktorů Va a VIIIa a tím k nedostatečné inhibici koagulace. Deficit proteinu S - Protein S je vitamin K-dependentní glykoprotein. Jeho volná forma slouţí jako kofaktor aktivovaného proteinu C při štěpení faktorů Va a VIIIa a inhibici koagulace. Sníţená hladina nebo funkční aktivita proteinu S, stejně jako proteinu C, vede ke zvýšení rizika vzniku ţilních trombóz. Deficit antitrombinu - Antitrombin je přirozený inhibitor koagulace, který přímou vazbou inaktivuje koagulační faktory XII, XI, IX, X a trombin. Tuto reakci zesiluje zhruba 1000x heparin. Deficit antitrombinu patří mezi významné trombofilní stavy. Deficity přirozených antikoagulačních proteinů C, S a antitrombinu jsou po genetické stránce vysoce heterogenní a je známa celá řada jejich mutací. (Raušová & al, 2005) Zvýšená hladina PAI-1 - PAI-1 je inhibitor aktivátorů plazminogenu t-pa (tkáňový aktivátor plazminogenu) a u-pa (urokináza) a tím i fibrinolýzy. PAI-1 4G/5G inzerční/deleční polymorfismus zvyšuje trombotické riziko ovlivněním exprese genu pro PAI-1. (Raušová & al, 2005) Dysfibrinogenémie Dysfibrinogenémie jsou charakterizovány strukturálními změnami v molekule fibrinogenu, které vedou ke změnám funkčních vlastností proteinu. Nejčastěji jsou důsledkem dědičných vrozených vad (jednobodové mutace se záměnou aminokyselin, zkrácení molekuly předčasným zařazením stop kodonu, malé delece či adice bazí), ale mohou být i získány při jaterních onemocněních. Klinicky jsou pacienti s dysfibrinogenémií často bez příznaků (jsou objeveni náhodně díky prodlouţeným koagulačním testům), u některých 15

16 však můţe dojít ke krvácivým, trombotickým, případně k oběma komplikacím současně. Příčinou trombóz můţe být buď neschopnost abnormální molekuly vázat se k trombinu, která vede ke zvýšení hladiny trombinu v krvi, nebo tvorba fibrinového koagula rezistentního k degradaci plazminem. Většinu pacientů tvoří heterozygoti, kteří mají 50 % molekul fibrinogenu normálních, coţ je pro udrţení normální sráţlivosti dostačující. (Roberts, 2001) Vysoká hladina fibrinogenu - vede ke zvýšení viskozity krve, podporuje aktivaci a agregaci destiček a proliferaci buněk hladké svaloviny v intimě cévní stěny. Ke zvýšení hladiny fibrinogenu vede například polymorfismus genu pro β řetězec. Zvýšená hladina FVIII - Faktor VIII slouţí jako kofaktor při tvorbě komplexu tenázy, aktivaci faktoru X a protrombinu. Vysoká hladina faktoru VIII je rizikovým faktorem venózního tromboembolizmu (VTE). Toto riziko stoupá se zvyšující se hladinou faktoru VIII. (Khan, Dickerman, 2006) Deficit FXII a prekalikreinu Faktor XII, prekalikrein a vysokomolekulární kininogen se účastní vnitřní cesty aktivace protrombinu na trombin (k aktivaci dochází kontaktem s negativně nabitým povrchem, například subendoteliálními strukturami) a rovněţ patří mezi vnitřní aktivátory plazminogenu při fibrinolýze. Výrazný deficit těchto faktorů můţe vést ke zvýšenému trombofilnímu riziku (defekt fibrinolýzy). (Khan, Dickerman, 2006) Metabolizmus homocysteinu Hyperhomocysteinémie - Homocystein (Hcy) vzniká jako meziprodukt metabolické přeměny methioninu na cystein. Metabolizmus Hcy probíhá dvěma drahami. V remetylační dráze je Hcy přeměněn za účasti vitaminu B 12 a kyseliny listové na methionin pomocí enzymů methionin-syntázy a 5,10- metylentetrahydrofolát reduktázy (MTHFR) na methionin. Zbytek Hcy, který není remetylován, je za účasti enzymu cystathionin-β-syntázy a jejího kofaktoru vitaminu B 6 transsulfurován na cystein v transsulfurační dráze. (Vlachová, 2004) Vysoká hladina homocysteinu byla prokázána jako nezávislý rizikový faktor pro hlubokou ţilní trombózu. Mírná hyperhomocysteinémie je vyvolána polymorfismy v genu pro MTHFR C677T a A1298C. U zdravého jedince s normálním příjmem vitaminů skupiny B je její efekt na celkové trombofilní 16

17 riziko malý. Mutace v genu kódujícím enzym cystathionin-β-syntázu (např. T833C) vede v homozygotním stavu k homocystinurii, metabolické vadě spojené s extrémním zvýšením hladiny homocysteinu s vlivem na předčasné trombotické komplikace. (Raušová & al, 2005) Hyperagregabilita trombocytů Syndrom lepivých destiček (SPS) - je autozomálně dominantní porucha trombocytů spojená se vznikem ţilních a arteriálních tromboembolických událostí. Existují 3 typy: I. typ je charakterizovaný zvýšenou agregabilitou trombocytů v plazmě bohaté na destičky s induktory ADP a epinefrinem, II. typ pouze s epinefrinem a III.typ pouze s ADP. Klinicky se u pacientů projevuje například jako angina pectoris, infarkt myokardu, cévní mozková příhoda, periferní arteriální trombóza či ţilní trombóza, často se opakující i přes antikoagulační terapii. (Mammen, 1999) Získané faktory Antifosfolipidový syndrom Antifosfolipidový syndrom (APS) je charakterizován přítomností antifosfolipidových protilátek a současně klinických projevů venózní a/nebo arteriální trombózy, či mikrotrombotizace v cirkulaci a/nebo reprodukčních ztrát. Cílovými antigeny antifosfolipidových protilátek jsou makromolekulární struktury vázané na negativně nabité, zejména fosfolipidové povrchy (např. 2 - glykoprotein, protrombin/trombin, proteiny C a S, fosfolipáza A 2, trombomodulin TFPI a anexin V). Nejčastější klinickou manifestací APS je ţilní trombóza dolních končetin. (Bulíková, Penka, 2005; Bártková, 2010) Další faktory: anamnéza prodělané VTE, věk, obezita, hormonální antikoncepce, hormonální substituce, těhotenství, nefrotický syndrom, sepse, DIK, úrazy, velké chirurgické zákroky, imobilizace, nádorová onemocnění, získaná rezistence na aktivovaný protein C, získaná zvýšená hladina FVIII, fibrinogenu a získaná hyperhomocysteinémie 17

18 2.2. Ţilní trombóza Ţilní trombózy jsou v rozvinutých zemích, po ischemické chorobě srdeční a cévní mozkové příhodě, třetím nejčastějším kardiovaskulárním onemocněním. Představují tak jednu z hlavních příčin morbidity a mortality, která kaţdoročně postihuje 1/1000 populace. Klinickou manifestací ţilní trombózy je venózní tromboembolizmus, zahrnující hlubokou ţilní trombózu a/nebo plicní embolii. Jedná se o komplexní onemocnění, které je výsledkem interakce mnoha rizikových faktorů různého původu: genetických, environmentálních a vlivu ţivotního stylu. Na vzniku trombóz v ţilním řečišti se významně podílí krevní stáza a hyperkoagulace v plazmatickém systému. K ţilní stáze dochází např. při imobilizaci z různých příčin, jako jsou velké operace a úrazy, při dlouhém cestování vsedě, u chronické ţilní nedostatečnosti či v těhotenství. Na vzniku trombóz se ţilní stáza podílí hromaděním koagulačních faktorů v postiţené lokalitě a aktivací koagulace v důsledku poškození cévního endotelu. K léčbě a prevenci ţilních trombóz se podávají antikoagulační preparáty. (Dulíček, 2005) 2.3. Arteriální trombóza Trombóza v tepenném řečišti je ve většině případů podmíněna aterosklerotickým postiţením cévní stěny a aktivací krevních destiček. Nejčastější manifestací arteriální trombózy je akutní koronární syndrom - nestabilní angina pectoris a infarkt myokardu, cévní mozková příhoda a ischemický syndrom periferních tepen Ateroskleróza Ateroskleróza je chronický zánětlivý proces, vyvíjející se po desetiletí, charakterizovaný specifickými buněčnými reakcemi na ukládání lipidů v cévní stěně. Patogeneze aterosklerózy není zcela objasněna. Prvním impulzem by mohlo být poškození endotelu a endoteliální dysfunkce, následované dalšími fázemi aterogeneze, kterými jsou tukové prouţky, ateromové pláty a komplikované léze. (Češka, 2005) 18

19 normální céva mírná ateroskleróza těţká ateroskleróza Obrázek 1 Céva postiţená aterosklerózou (převzato a upraveno z Poškození endotelu a endoteliální dysfunkce Porucha funkce endotelu je prvním a významným stadiem rozvoje aterosklerózy. K poškození endotelu můţe dojít v důsledku působení řady faktorů: např. mechanických, chemických, imunitních, metabolických, infekčních a degenerativních. Nejvýznamnějším projevem endoteliální dysfunkce je sníţená produkce oxidu dusnatého, který kontroluje prostupnost leukocytů a lipidů do cévní stěny, relaxuje hladkou svalovinu cévní stěny, brání adhezi krevních destiček a stabilizuje je, dále brzdí migraci a proliferaci buněk hladké svaloviny do subendoteliálního prostoru. Funkční postiţení endotelu proto vede ke zvýšené propustnosti cévní stěny se vznikem nerovnováhy mezi vazoaktivními mechanizmy a hemokoagulačními působky, jehoţ výsledkem je proaterogenní účinek a převaha vazokonstrikčních a protrombotických pochodů. (Badimón & al, 2009; Karetová, Staněk, 2001) Tukové prouţky Tukové prouţky lze běţně nalézt v intimně velkých cév jiţ u malých dětí. Základní buněčnou sloţkou tukových prouţků jsou pěnové buňky a T-lymfocyty. Pěnové buňky vznikají dvojím způsobem. 19

20 1. Monocyty chemotakticky pronikají do intimy a přeměňují se na makrofágy. Makrofágy uvolňují reaktivní kyslíkové radikály (superoxidový aniont), které poškozují endotel, blokují účinek oxidu dusnatého a modifikují-oxidují LDL. Modifikované LDL rovněţ poškozují endotel, vyvolávají proliferaci cévní svaloviny a mají vysokou afinitu ke scavengerovým receptorům na makrofázích. Makrofágy následně fagocytují velká mnoţství modifikovaných LDL a mění se v pěnové buňky. (Karetová, Staněk, 2001; Silbernagl, Lang, 2001) 2. Chemotaktické faktory monocytů a trombocytů spouštějí migraci hladkých svalových buněk z médie do intimy, kde jsou prostřednictvím PDGF (růstový faktor z destiček) a jiných růstových faktorů stimulovány k proliferaci. Vychytáváním modifikovaných LDL se z nich rovněţ stávají pěnové buňky. (Silbernagl, Lang, 2001) Ateromové pláty Vzhledem k toxicitě modifikovaného LDL dochází k zániku pěnové buňky a uvolněný obsah se stává substrátem pro další fagocyty nebo zůstává jako nekrotická debris obsahem plátu. Přibývání pěnových buněk, jejich rozpad s vypadáváním krystalů cholesterolu, proliferace buněk hladké svaloviny a vazivových vláken vede k rozvoji ateromových plátů. Důsledkem je zúţení cévního průsvitu, které můţe vést k ischemii a vzniku okluzivního trombu. V hlubších vrstvách plátu mohou vznikat nekrotická loţiska, která mohou podléhat kalcifikaci. (Češka, 2005) Komplikované léze Komplikované léze vznikají z ateromových plátů masivní kalcifikací a zejména těţkými degenerativními změnami jako jsou ulcerace a ruptury, které se stávají místem krvácení do plátu, adherence a agregace trombocytů s organizací trombu. O prognóze nemocných rozhoduje nejen rozsah aterosklerotického postiţení, ale zejména vulnerabilita (nestabilita) jednotlivých plátů. Vulnerabilita je dána jak velikostí plátu, tak především jeho sloţením - poměrem lipidové a fibrózní sloţky. Povrch plátu je sklerotický, tvořený hladkou svalovinou, kolagenními a elastickými vlákny. Polotekuté jádro je ateromové povahy, sloţené z nekrotické debris převáţně lipidové povahy, pěnových buněk, makrofágů a T-lymfocytů. Makrofágy produkují metaloproteinázy (elastázu a kolagenázu), které rozrušují fibrózní povrchovou vrstvu plátu a zvyšují riziko jeho ruptury. (Karetová, Staněk, 2001) Stabilní pláty jsou tvrdé s nízkým obsahem lipidů a bez tendence ke vzniku trombóz. Nemocného ohroţují pouze 20

21 tehdy, zuţují-li kriticky lumen cévní stěny. Nestabilní pláty, bohaté na lipidy (měkké pláty), často při okraji praskají a dávají tak vznik trombóze. Změnu nestabilního plátu na stabilní lze docílit intenzivní hypolipidemickou léčbou. (Češka, 2005) Rizikové faktory aterosklerózy a arteriální trombózy Neovlivnitelné rizikové faktory Věk - pravděpodobnost manifestace aterosklerózy roste s věkem Pohlaví - muţi mají výrazně vyšší riziko aterosklerózy Pozitivní rodinná anamnéza - výskyt infarktu myokardu nebo náhlé smrti u otce nebo prvostupňového muţského příbuzného ve věku pod 55 let a u matky nebo prvostupňového ţenského příbuzného pod 65 let Ovlivnitelné rizikové faktory Hyperlipoproteinemie - zvýšený celkový a LDL-cholesterol (transportuje cholesterol z jater do tkání), hypertriacylglycerolemie, zvýšený Lp(a) a sníţený HDL-cholesterol (transportuje cholesterol z tkání do jater) Kouření - poškození endotelu hypoxií indukovanou oxidem dusnatým, toxicita nikotinu, tvorba volných radikálů Arteriální hypertenze - > 140/90 mm Hg, podporuje dysfunkci endotelu Diabetes mellitus, inzulinová rezistence a hyperinzulinemie Obezita asociovaná s diabetes mellitus II.typu, hyperlipoproteinemií a hypertenzí Nízká fyzická aktivita Zvýšená hladina homocysteinu - podílí se na oxidaci LDL, poškození endotelu, podporuje proliferaci buněk hladkého svalstva arteriální stěny, zvyšuje adhezivitu a agregabilitu trombocytů a způsobuje poruchy koagulační kaskády a fibrinolýzy (Vlachová, 2004) Nízká hladina estrogenu - estrogeny podporují syntézu LDL-receptorů, čímţ sniţují hladinu LDL v krvi a podporují tvorbu HDL cholesterolu 21

22 Infekce - chlamydia pneumoniae, helicobacter pylori, virus herpes simplex, cytomegalovirus Renální insuficience - asociovaná s hypertenzí a hyperlipoproteinemií Trombogenní faktory vysoká hladina fibrinogenu antifosfolipidový syndrom (Karetová, Staněk, 2001; Češka, 2005) Patogeneze vzniku arteriální trombózy Na poškozené místo cévy, kde je obnaţen vysoce trombogenní obsah prasklého aterosklerotického plátu a subendotelové matrix, začínají adherovat krevní destičky. Adheze je zprostředkována vazbou mezi von Willebrandovým faktorem (vwf) na kolagenu subendotelové matrix cévní stěny a receptorem GPIb/V/IX na trombocytu. Adherované destičky se dostávají do kontaktu s tkáňovým faktorem (TF), který je ve velkém mnoţství přítomen v ateromatózní hmotě plátu. Tkáňový faktor váţe faktor VIIa cirkulující v krvi. Vytvořením komplexu TF-VIIa (vnější tenáza) dochází k iniciaci koagulační kaskády a aktivaci faktorů IX (FIX, FVIII, fosfolipidy a Ca 2+ tvoří vnitřní tenázu) a X (FX, FV, fosfolipidy a Ca 2+ tvoří protrombinázu). Protrombináza štěpí protrombin za vzniku malého mnoţství trombinu, který přispívá k aktivaci destiček. Aktivované destičky uvolňují z α-granul a denzních granul adhezivní proteiny, koagulační faktory (např. faktor V) a látky podporující vazokonstrikci a indukující agregaci destiček, jako jsou tromboxan A 2, serotonin, adenosindifosfát a destičky aktivující faktor. Agregace destiček je zprostředkována vazbou fibrinogenu na destičkové receptory GPIIb/IIIa. Uvolnění obsahu granul a velkého mnoţství trombinu výrazně urychluje další tvorbu a narůstání trombu inkorporací nových trombocytů. Při aktivaci se na vnější povrch membrány dostávají negativně nabité fosfolipidy, fosfatidylserin a fosfatidyletanolamin, důleţité pro tvorbu tenázového a protrombinázového komplexu a tvorbu jiţ velkého mnoţství trombinu. Trombin katalyzuje přeměnu fibrinogenu na fibrin, který po stabilizaci faktorem XIII, tvoří fibrinovou síť zpevňující trombus. Další osud trombu závisí na výsledném poměru protrombotických a trombolytických procesů. (Mackman, 2006; Pecka, 2010; Andrews, Berndt, 2004) 22

23 2.4. Úloha trombocytů při vzniku arteriální trombózy Adheze a aktivace trombocytů Trombocyty za normálních okolností s intaktní cévní stěnou nereagují. Pokud však přijdou v průběhu cirkulace do styku se subendotelovou vrstvou cévní stěny, která obsahuje vysoce trombogenní kolagen, dojde v tomto místě k jejich adhezi. Vazba trombocytů na kolagen probíhá ve dvou fázích: iniciační adheze a pevná adheze. Iniciační adheze je zprostředkována vazbou A1 domény von Willebrandova faktoru s destičkovým receptorem GPIb (komplex GPIb/V/IX) a pevná adheze je zajištěna vazbou GPIa/IIa (integrin α2β1) a GPVI ke kolagenu. (Pecka, Malý, 2009) vwf je nezbytný pro formaci trombu při vysokých smykových rychlostech (> 650/s) typických pro středně velké arterie či aterosklerózou zúţené cévy. vwf se váţe A3 doménou k cévnímu kolagenu (typ I, III a VI) a A1 doménou k destičkovému receptoru GPIb/V/IX, tato vazba mezi destičkami a subendotelovou matrix však není stabilní. Stabilní vazby je dosaţeno přímým navázáním destičkového receptoru GPVI k cévnímu kolagenu. Při nízkých smykových rychlostech je adheze zajištěna vazbou destičkového receptoru GPIa/IIa k cévnímu kolagenu. V menší míře k adhezi přispívá i fibronektin, laminin, vitronektin a trombospodin. (Badimón, Vilahur, 2008) Trombocyty se v průběhu adheze aktivují, dochází k centralizaci organel do středu buňky, změně tvaru z diskoidního na sférický s četnými výběţky, přesunu vápníku z nitrobuněčných kompartment (denzního tubulárního systému a mitochondrií) do cytoplazmy a k aktivaci membránových receptorů GPIIb/III. Výsledkem je uvolnění obsahu granul (α-granul a denzních granul), jenţ vede k amplifikaci aktivace destiček a indukci agregace. (Pecka, 2010) 23

24 Obrázek 2 Děje probíhající v trombocytu během primární hemostázy (převzato z Aktivátory destiček Trombin - vzniká na povrchu destiček účinkem protrombinázového komplexu na protrombin Kolagen - sloţka pojivové tkáně cévní stěny Tromboxan A 2 (TXA 2 ) - produkt metabolismu kyseliny arachidonové Adenosindifosfát (ADP) - obsaţený v denzních granulích trombocytů Serotonin - obsaţený v denzních granulích trombocytů Adrenalin - uvolňovaný poškozenou cévní stěnou Faktor aktivující destičky (PAF) - produkt neutrofilů, monocytů, makrofágů a trombocytů Prostacyklin a oxid dusnatý - produkty endotelu, aktivaci destiček naopak inhibují Aktivační cesty destiček Aktivace krevních destiček vazbou kolagenu s vwf a GPIb/V/IX, stejně jako vazba kolagenu s GPVI, je zprostředkována tyrozinkinázovou cestou. Trombin, TXA 2, PAF, ADP, serotonin a adrenalin aktivují destičky přenosem signálu přes receptory spřaţené s G-proteinem (např. proteázou aktivované receptory PAR-1 a PAR-4 pro trombin, receptory P2Y pro ADP, tromboxanové receptory TPα a TPβ pro TXA 2, α 2 - adrenergní receptory pro adrenalin). (Broos & al, 2011) 24

25 Receptory spřaţené s G-proteiny Heterotrimerní G-proteiny (guanosintrifosfát vázající proteiny) se skládají ze tří podjednotek, α, β a γ. α podjednotka má vysokou afinitu ke guaninovým nukleotidům GTP a GDP. Vazbou ligandu na receptor dojde k navázání GTP na podjednotku α a oddělení komplexu podjednotek βγ, vzniká tak aktivovaná forma α podjednotky Giα, Gsα, Gqα a G12/13α. α podjednotka je inaktivována defosforylací GTP na GDP pomocí endogenní GTP-ázy a opětovným připojením komplexu βγ. Interakce ligandu s receptorem vede prostřednictvím G-proteinu k uvolnění druhého (intracelulárního) posla např. cyklického adenosinmonofosfátu (camp), 1,4,5-inositoltrifosfátu (IP 3 ) a diacylglycerolu (DAG). Úlohou druhých poslů je zesílení přijatého signálu a jeho rozšíření dále do nitra buňky k cílovým proteinům, kterým je informace určena. (Silbernagl, Despopoulos, 2009) TXA2 a receptory TPα a TPβ Receptory TPα a TPβ jsou asociovány s proteiny Gq a G12/13. Přes protein Gq je aktivována fosfolipáza C, která degraduje membránový fosfatidylinositol 4,5- bisfosfát (PIP 2 ) a uvolňuje druhé posly IP 3 a DAG. DAG aktivuje za účasti Ca 2+ intracelulární proteinkinázu C, která vede k fosforylaci dalších proteinů. Z membránových DAG můţe být odštěpena fosfolipázou A 2 kyselina arachidonová, ze které vznikají prostaglandiny a tromboxan. IP 3 zvyšuje hladinu cytoplazmatického Ca 2+, uvolněného z endoplazmatického retikula. (Broos & al, 2011) ADP a receptory P2Y1 a P2Y12 Receptor P2Y 1 je asociován s proteinem Gq a jeho aktivace vede ke zvýšení hladiny intracelulárního Ca 2+. Receptor P2Y 12 je asociován s proteinem Gi a jeho aktivace vede k inhibici adenylátcyklázy a sníţení hladiny camp. P2Y 12 je hlavní receptor schopný amplifikace a udrţení aktivace destiček. (Broos & al, 2011) Trombin a receptory PAR-1 Receptor PAR-1 je asociován s proteiny G12/13, Gq a Gi. Protein G13 působí Rho-kinázou zprostředkovanou cestou fosforylaci lehkých řetězců myosinu a podílí se tak na změně tvaru destiček. Proteiny Gq (zvýšení hladiny intracelulárního Ca 2+ ) a Gi (sníţení hladiny camp) zprostředkují signalizační dráhu vedoucí k aktivaci destiček, 25

26 receptorů IIb/IIIa a agregaci destiček, stejně jako ADP a TXA 2. (Angiolillo & al, 2010; Broos & al, 2011) Tyrozinkinázová cesta aktivace Příkladem je aktivace krevních destiček vazbou GPVI ke kolagenu. GPVI se skládá ze dvou extracelulárních, imunoglobulinu podobných domén, transmembránové části a krátkého, vysoce glykosylovaného, cytoplazmatického konce. GPVI je spojen s γ řetězcem Fc receptoru (FcRγ) prostřednictvím vazby argininového zbytku v pozici 3 transmembránové domény GPVI a zbytku kyseliny asparagové v transmembránové doméně γ podjednotky Fc receptoru. Na cytoplazmatický konec GPVI jsou přes SH3 doménu vázány Src kinázy Fyn a Lyn, které jsou aktivovány vazbou kolagenu na GPVI. Tyto kinázy se účastní fosforylace tyrozinu v části FcRγ označované ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif), která vede k aktivaci další destičkové kinázy enzymu Syk a následně k aktivaci fosfolipázy Cγ2 (PLCγ2) fosforylací tyrozinu její SH2 domény. PLCγ2 hydrolyzuje fosfatidylinositol 4,5 - bisfosfát za vzniku 1, 4, 5 inositoltrifosfátu a diacylglycerolu, které se podílejí na aktivaci trombocytů. K aktivaci destiček je zapotřebí i destičkový receptor GPIa/IIa, který slouţí jako kotva pro adhezi destiček k vláknům kolagenu. (Andrews, Berndt, 2004; Nieswandt, Watson, 2003) Při aktivaci trombocytů dochází k přetočení membrány (flip-flop mechanizmus) a odhalení fosfolipidů vnitřních struktur membrány (fosfatidylserinu a fosfatidyletanolaminu) tvořících podklad pro koagulačně aktivní komplexy. (Pecka, 2010) Agregace Při agregaci se trombocyty vzájemně shlukují prostřednictvím vazby fibrinogenu a receptorů GPIIb/IIIa (integrin α IIb β 3 ), které byly aktivovány konformačními změnami v předchozích reakcích. Na receptory GPIIb/IIIa se fibrinogen váţe doménou obsahující sekvenci arginin-glycin-asparagin (RGD) a dodekapeptid karboxylové části γ-řetězce. Kromě fibrinogenu tuto sekvenci obsahují i další molekuly (vwf, vitronektin, trombospodin a fibronektin), které se mohou na receptory GPIIb/IIIa rovněţ vázat. Nejprve dochází k primární, vratné agregaci, při které se destičky spojují přes malé mnoţství receptorů GPIIb/IIIa na jejich výběţcích a pokud není vyvolávající impuls dostatečně silný, můţe docházet k jejich oddělení. Při silnějším impulsu k sobě destičky přilnou těsněji pomocí většího počtu receptorů GPIIb/IIIa. Trombospodin, uvolněný z 26

27 α-granulí, vazbu destiček stabilizuje a vede tak k sekundární, nevratné agregaci. Agregované destičky se rozprostírají, rozpadají a postupně navzájem splývají v procesu viskózní metamorfózy. (Pecka, 2010) 2.5. Profylaktická léčba arteriální trombózy Cílem protidestičkové léčby je omezení shlukovací schopnosti trombocytů a sníţení rizika vzniku arteriálních okluzí. Během formace destičkového trombu prochází trombocyt čtyřmi kroky: adhezí, aktivací, degranulací a agregací. Mechanizmem účinku protidestičkových léků je inhibice primární hemostázy ve všech těchto krocích. Zatímco stávající protidestičkové léky, jako kyselina acetylsalicylová, ticlopidin, clopidogrel či inhibitory receptorů GPIIb/IIIa, přicházely s mnohaletými pauzami, v posledních letech nastupuje celá řada nových léků. Důvodem je jednak vysoký výskyt aterotrombotických komplikací a také skutečnost, ţe aktivace trombocytů je pod kontrolou řady receptorů, ze kterých lze zatím ovlivnit jen některé. Hlavní pozornost ve vývoji dalších antiagregačních léčiv je zaměřena na zlepšení jejich účinnosti, sníţení trombotických příhod u léčených nemocných a sníţení výskytu krvácení. (Bultas, Karetová, 2010) Inhibitory adheze Ve fázi adheze lze inhibovat vazbu destiček na obnaţená vlákna kolagenu buď na úrovni destičkových receptorů, nebo blokádou vwf, který vlastní vazbu zprostředkovává. Ve fázi testování jsou blokátory adheze trombocytů na bázi specifických fragmentů protilátek směrovaných zejména proti destičkovému komplexu glykoproteinových receptorů Ib/V/IX, jejichţ příkladem je nanoprotilátka ALX Jedná se o ultramalý fragment řetězce imunoglobulinu s afinitou k vaznému místu GPIb (komplex GPIb/V/IX) s doménou A1 vwf. Obsazením této vazby nedojde k adhezi, ani k aktivaci trombocytu (Bultas, Karetová, 2010). Další moţností jsou monoklonální protilátky namířené proti vwf, rekombinantní fragmenty vwf, které se váţí na GPIb/V/IX trombocytů a blokují tak jeho interakci s intaktním vwf a kyselina aurintrikarboxylová, interagující s A1 doménou vwf a bránící tak jeho vazbě na GPIb/V/IX na povrchu trombocytů. K výraznému pokroku v této oblasti však zatím nedošlo. (Vanhoorelbeke, Ulrichts, Schoolmeester, Deckmyn, 2003) 27

28 Inhibitory aktivace Aktivace trombocytů je klíčovým krokem vedoucím ke změně jejich tvaru, který umoţňuje optimální adhezi ke kolagenu a jiným povrchům a aktivaci enzymů, zejména fosfolipázy C, fosfolipázy A 2 a adenylátcyklázy. Tyto děje vedou k degranulaci a uvolnění řady protrombotických a vazokonstrikčních látek, k aktivaci povrchových receptorů (převáţně GPIIb/IIIa) a ke změně orientace membránových fosfolipidů umoţňující vazbu s protrombinovým komplexem a akceleraci sekundární hemostázy. Do této skupiny patří: blokátory tromboxanové cesty inhibitory cyklooxygenázy, blokátory tromboxanových receptorů, ADP-receptorů, látky ovlivňující serotoninové receptory, trombinové receptory typu PAR-1 a receptory pro faktor aktivující destičky. (Bultas, Karetová, 2010) Blokátory tromboxanové cesty Metabolismus kyseliny arachidonové Kyselina arachidonová vzniká z membránových fosfolipidů působením fosfolipázy A 2. Je metabolizována enzymem cyklooxygenázou (prostaglandin H- syntetázou) na prostaglandin G 2 a H 2. Prostaglandin H 2 je modifikován působením enzymů izomeráz a reduktáz na prostaglandiny E 2, D 2, F 2α, dále prostacyklin syntetázou na prostacyklin (PGI 2 ) a tromboxan syntetázou na TXA 2. Prostacyklin produkovaný endotelovými buňkami brání aktivaci trombocytů a podporuje vazodilataci, zatímco TXA 2 tvořený trombocyty podporuje aktivaci destiček a vazokonstrikci. Cyklooxygenáza (COX) je membránově vázaný enzym tvořící úzký a dlouhý hydrofobní kanál, do kterého vstupuje kyselina arachidonová. Existuje ve dvou izoformách: COX-1 a COX-2. COX-1 je přítomna v endoplazmatickém retikulu většiny buněk a odpovídá za syntézu prostaglandinů nutných pro normální funkci buňky. COX- 2 se za normálních okolností nevyskytuje a je syntetizována aţ při zánětlivých stimulech. (Vojáček, Malý, 2004; Patrono, Coller, 2004) Inhibitory cyklooxygenázy K léčbě inhibitory cyklooxygenázy je nejčastěji vyuţívána kyselina acetylsalicylová. Kyselina acetylsalicylová (ASA) v trombocytech a buňkách endotelu ireverzibilně inhibuje cyklooxygenázu (COX-1 170x více neţ COX-2) tím, ţe ji acetyluje. V důsledku acetylace hydroxylové skupiny serinového rezidua v místě Ser 529 dochází k zablokování hydrofobního kanálu a zamezení přístupu kyseliny arachidonové 28

29 ke katalytickému místu enzymu cyklooxygenázy. V endotelu se COX tvoří rychle znovu a schopnost produkovat prostacyklin je tím omezena jen přechodně, oproti trombocytům, které jako bezjaderné buněčné fragmenty nejsou schopny enzymy opět syntetizovat a tvorba TXA 2 je omezena po celou dobu jejich ţivota (10-12 dní). (Pecka, Malý, 2009;Vojáček, Malý, 2004) Po perorálním podání kyseliny acetylsalicylové je koncentrace nezměněné účinné látky ve vena porte vyšší neţ v systémovém řečišti (kyselina acetylsalicylová je deacetylována v játrech). Trombocyty jsou proto při průchodu mezenteriálním řečištěm vystaveny vyšší koncentraci ASA neţ endotelie v systémové cirkulaci. Při vhodném dávkování ( mg denně) můţe dojít k poţadovanému efektu, a to k výraznější inhibici vzniku TXA 2 neţ neţádoucího účinku v podobě sníţení syntézy prostacyklinu. Toto dávkování je dostačující pro sníţení trombotizace v arteriích, nicméně vzniku trombů ve venózním řečišti nezabrání. Plazmatický poločas ASA je zhruba 20 minut, nicméně dostačuje pro inhibici prakticky všech trombocytů. Mezi hlavní neţádoucí účinky ASA patří gastrointestinální krvácení způsobené ztrátou protektivního účinku prostaglandinu E 2 na buňky ţaludeční sliznice. Funkce trombocytů se vrací do normálu 5-6 dnů po poslední dávce. (Lüllmann, 2004) Ireverzibilně blokuje syntézu TXA 2 rovněţ triflusal. Jeho inhibiční schopnost je sice menší neţ u kyseliny acetylsalicylové, nicméně je kompenzována tím, ţe triflusal inhibuje trombocytární COX-1 a syntézu TXA 2, zatímco v endoteliích tlumí COX-1 o řád méně a blokáda syntézy prostacyklinu je tedy nevýznamná. (Bultas, Karetová, 2009) Blokovat syntézu TXA 2 lze i pomocí reverzibilních inhibitorů cyklooxygenázy sulfinpyrazonu, flurbiprofenu, indobufenu aj. (Vojáček, Malý, 2004) Blokátory tromboxanových receptorů Nadějným antagonistou tromboxanových receptorů - receptorů pro vazokonstrikční a proagregační prostanoidy TXA 2, PGG 2 či PGH 2 je terutroban, který má experimentálně antitrombotické, vazodilatační a antiaterosklerotické vlastnosti. Potvrdí-li se závěry preklinických studií dokumentující výraznou regresi aterosklerózy, mohlo by jít o přínosný lék. Inhibitory tromboxanových receptorů (ridogrel a nidrogrel) stejně jako inhibitory tromboxansyntázy (dazoxiben a ozagrel) se neosvědčily, léčba byla zatíţena větším rizikem krvácení při srovnatelném efektu v porovnání s kyselinou acetylsalicylovou. (Bultas, Karetová, 2010) 29

30 Blokátory ADP receptorů Adenosindifosfát (ADP) je aktivátor trombocytů uvolňovaný z erytrocytů, aktivovaných destiček a poškozených endotelových buněk, který navozuje adhezi a agregaci. Reakce trombocytů na ADP je zprostředkována membránovými receptory P2. Patří mezi ně rychle a krátce působící receptory P2Y 1, které mobilizují ionizované kalcium ze zásobních vezikul a stimulují časné fáze agregace (zatím je ovlivnit nelze) a receptory P2Y 12 aktivující trombocyty inhibicí adenylátcyklázy a umocňující pozdní fáze agregace. Tyto receptory jsou aktivované pomaleji, ale působí déle (Malý, 2003). Inhibitory receptorů P2Y 12 jsou dvojího typu, nepřímo působící (vyţadující bioaktivaci), kam patří ticlopidin, clopidogrel a prasugrel a přímo působící - ticagrelor, cangrelor nebo elinogrel. (Bultas, Karetová, 2010) Ticlopidin a jeho analog clopidogrel patří mezi thienopyridiny, které ireverzibilně blokují aktivaci trombocytů přes receptory pro ADP. Na aktivní metabolity jsou biotransformovány systémem cytochromu P-450 v játrech. Během 3-5 dnů inhibují agregaci o %. Ticlopidin se na rozdíl od clopidogrelu vyznačuje vyšším rizikem vzniku neutropenie, trombocytopenie, aplastické anémie a trombocytopenické purpury. (Malý, 2003) Prasugrel je představitelem další generace tienopyridinů. Je rovněţ proléčivem s nutností konverze, ale na rozdíl od clopidogrelu, který je z většiny degradován a jen z % oxidován na aktivní metabolit, nepodléhá štěpení esterázami a nedochází k jeho degradaci na neúčinné metabolity. Jeho předností je proto spolehlivější protidestičkový účinek, u kterého zatím nebyla prokázána rezistence k léčbě, a rychlejší nástup účinku. (Bultas, Karetová, 2009) Ticagrelor, cangrelor a elinogrel reverzibilně blokují P2Y 12 receptory a na rozdíl od thienopyridinů nevyţadují bioaktivaci a působí přímo. Cangrelor a elinogrel mohou být podány parenterálně s nástupem účinku za několik minut s inhibicí agregace téměř 100 % Blokátory trombinových receptorů, serotoninových receptorů a receptorů pro PAF Blokáda serotoninových receptorů kataserinem či naftidrofurylem ovlivňuje aktivaci trombocytů jen okrajově a jejich protidestičkový efekt je minimální. Obdobně se neosvědčila ani blokáda PAF např. rupatadinem či lexipafantem, které mají rovněţ zanedbatelný protidestičkový účinek. (Bultas, Karetová, 2010) 30

31 Ve fázi klinického hodnocení jsou dva preparáty inhibující trombinový receptor PAR-1, SCH vorapaxar a E5555-atopaxar, jejichţ místo bude pravděpodobně jen v kombinaci s kyselinou acetylsalicylovou nebo s inhibitory ADP-receptorů. Do této skupiny léčiv patří rovněţ trombostatin, degradační oligopeptidový produkt bradykininu o pěti aminokyselinách, který se přímo váţe na aktivní místo receptoru. (Angiolillo & al, 2010; Bultas, Karetová, 2010) Stabilizace trombocytů Aktivace trombocytů je závislá na hladině cyklického adenosinmonofosfátu (camp). Vazbou prostacyklinu na jeho destičkový receptor (spřaţený s G-proteinem) dochází k aktivaci adenylátcyklázy, zvýšení camp a sníţení hladiny cytoplazmatického vápníku, které vedou k potlačení aktivace trombocytu. Fosfodiesterázy patří mezi enzymy katalyzující hydrolýzu camp. Léčiva dypiridamol a cilostazol tyto esterázy inhibují. Zvyšují tak hladinu camp a přispívají ke stabilizaci destiček. Dypiridamol je spolu s kyselinou acetylsalicylovou součástí přípravku Aggrenox, který kombinuje účinek obou léčiv. (Patrono, Coller, 2004; Špác, Hlinomaz, 2006) Inhibitory agregace Při agregaci trombocytů dochází k vzájemnému spojení trombocytů prostřednictvím vazby fibrinogenu na glykoproteinové receptory IIb/IIIa destiček. Přípravky inhibující tuto vazbu patří v současné době k nejúčinnějším protidestičkovým lékům Inhibitory receptorů IIb/IIIa na bázi monoklonálních protilátek Monoklonální protilátka 7E3 inhibující receptor IIb/IIIa byla objevena americkým hematologem B. Collerem. Při dalším výzkumu došlo k odstranění její Fc části a začal být pouţíván jen Fab fragment. Tím došlo ke sníţení aktivace komplementu a výskytu trombocytopenie, ke které vedlo vychytávání trombocytů značených intaktní protilátkou retikuloendotelovým systémem. Nahrazením DNA sekvencí konstantní domény odpovídajícími lidskými sekvencemi s ponecháním myších variabilních sekvencí vznikla chimérická myší/lidská protilátka pojmenovaná abciximab. Abciximab nespecificky a ireverzibilně blokuje sterickou zábranou glykoproteinový receptor IIb/IIIa trombocytů a inhibuje jejich agregaci. (Fontana, Reny, 2007; Vojáček, Malý, 2004) 31

32 Inhibitory receptorů IIb/IIIa s malou molekulou K vazbě fibrinogenu a dalších ligandů na receptor IIb/IIIa dochází prostřednictvím domény se sekvencí aminokyselin arginin-glycin-aspartát (RGD), kterou tento receptor rozeznává. Inhibitory s malou molekulou napodobují sekvenci RGD a tím selektivně a reverzibilně blokují receptor krevních destiček IIb/IIIa. Mezi peptidové inhibitory receptoru IIb/IIIa patří eptifibatib. Jedná se o syntetický cyklický heptapeptid odvozený z hadího jedu pygmejového chřestýše, u kterého je oproti RGD sekvenci nahrazen arginin lysinem, coţ vede ke zvýšení specificity a afinity vazby k receptoru IIb/IIIa. Tato látka docílí blokace více neţ 80 % trombocytů, brání vzniku trombů a rozpouští jiţ vzniklé tromby. (Vojáček, 2003) Mezi nepeptidové inhibitory receptoru IIb/IIIa patří tirofiban (derivát tyrozinu) a lamifiban. Všechna výše uvedená léčiva se podávají parenterálně. Syntetizována a zkoušena byla i perorální léčiva např. xemilofiban, orbofiban, lotrafiban, sibrafiban, roxifiban, lefradafiban, nicméně neúspěšně vzhledem k riziku krvácivých komplikací a vyšší mortalitě. (Fontana, Reny, 2007) Blokátory trombinu Trombin slouţí jako aktivátor agregace krevních destiček. Ke sníţení jeho produkce a tím aktivace agregace trombocytů vede podávání nízkomolekulárních heparinů (LMWH). LMWH potencují v přítomnosti antitrombinu jeho účinek na aktivovaný faktor Xa a nepřímo tak sniţují produkci trombinu. Mezi látky přímo inhibující trombin bez přítomnosti antitrombinu patří hirudin a další rekombinantní syntetické formy (lepirudin, bivalirudin, argatroban) podávané parenterálně a ximelagatran (vývoj v roce 2006 zastaven pro hepatotoxicitu) a dabigatran, které se podávají perorálně. (Špác, Hlinomaz, 2006; Krčová, 2011) Rezistence na protidestičkovou léčbu Byla zaznamenána rezistence na kyselinu acetylsalicylovou (s prevalencí 5 45 % v závislosti na pouţité metodice sledování) a clopidogrel (s prevalencí 5 10 %). Rezistenci na tyto dva léky lze definovat klinicky, kdy i přes probíhající uţívání léčiva dochází k manifestaci trombotických příhod nebo laboratorně, kdy nedochází k vyvolání odpovídající laboratorní odpovědi - inhibici agregace destiček. (Ševčíková, Vojáček, Pudil, 2006) 32

33 2.6. Monitorování protidestičkové léčby Podávání protidestičkových léků sniţuje riziko vzniku arteriálních trombóz. Jejich předávkování však můţe vést ke zvýšení rizika krvácení. Proto je důleţité sledovat účinnost protidestičkové léčby a zajistit tak pacientovi optimální a bezpečnou dávku léčiva. Mezi nejčastěji monitorované léky patří kyselina acetylsalicylová, lze však sledovat i účinek inhibitorů receptorů P2Y 12 a inhibitorů GPIIb/IIIa Agregometrie Optická agregometrie Optická agregometrie v plazmě Optický agregometr je v podstatě spektrofotometr, jehoţ podstatou je zachycování rozdílu transmise světla mezi plazmou bohatou na destičky (0% agregace) a plazmou chudou na destičky (100% agregace). (Osmančík, Paulů, Toušek, 2010) Plazma se získává centrifugací citrátové krve při nízkých a vysokých otáčkách. Temperovaná kyveta (37 C) s plazmou je umístěna mezi zdroj světla a detektor. Jak destičky agregují, plazma se vyčeřuje a umoţňuje tak větší průchodnost světla. (Harrison, 2005) K indukci agregace lze pouţít jak endogenní faktory (např. kyselina arachidonová, adrenalin, kolagen, ADP), tak faktory exogenní (kationický propylgalát sodný). Výsledkem měření je agregační křivka, na které se hodnotí maximální amplituda (%), doba do nástupu agregace (lag time) a sklon křivky (slope). Metoda je vhodná pro sledování účinku kyseliny acetylsalicylové, thienopyridinů a inhibitorů GPIIb/IIIa. Její nevýhodou je nutnost pouţití velkého mnoţství citrátové plazmy a časová náročnost. (Osmančík, Paulů, Toušek, 2010) Pro sledování léčby kyselinou acetylsalicylovou lze vyuţít metodu, při které je agregační odpověď vyvolána pomocí kationického propylgalátu sodného, který je citlivý na nízké koncentrace ASA v plazmě. Stanovení se provádí na optickém agregometru v destičkami bohaté plazmě. Měří se velikost maximální amplitudy a především rychlost náběhu agregační křivky (slope). (Pecka, 2006) Pro sledování léčby antagonisty P2Y 12 optickou agregometrií se vyuţívá jako induktor ADP. Odečítá se maximální amplituda agregační křivky během léčby a porovnává se s hodnotou před léčbou. (Pecka, 2010) 33

34 Optická agregometrie v plné krvi Na principu optické agregometrie v plné krvi pracuje např. systém VerifyNow, který měří změny absorbce světla způsobené indukovanou agregací trombocytů v nesráţlivé plné krvi. Přístroj převádí vzorek krve z odběrové zkumavky do jednorázového testovacího zařízení, které obsahuje drobné mikročástice s navázaným lidským fibrinogenem. Po smísení se vzorkem dochází k vazbě tohoto fibrinogenu na GP IIb/IIIa aktivovaných destiček. Tvorba agregátů se projeví zvýšenou transmisí světla. Monitorovat lze terapii kyselinou acetylsalicylovou, thienopyridiny a inhibitory GPIIb/IIIa. ( Při měření účinku kyseliny acetylsalicylové se jako induktor vyuţívá kyselina arachidonová. Výsledek je vyjádřen jako Aspirin Reaction Unit (ARU) a je vypočítán jako funkce rychlosti agregace. ( Při monitorování účinku antagonistů P2Y 12 se jako induktor vyuţívá ADP/PGE 1. Výsledek je vyjádřen v P2Y 12 Reaction Unit (PRU). Ve druhém kanálu se přidávají další induktory - iso-trap (Thrombin Receptor Activating Peptid, který blokuje účinek thienopyridinů) společně s PAR-4 AP (PAR-4 aktivující peptid). Výsledek se vyjadřuje jako základní destičková funkce (BASE) vzorku. Z obou hodnot se vypočte procento inhibice destiček ve vzorku. ( Při měření účinku blokátorů GPIIb/IIIa se jako induktor vyuţívá iso-trap. Výsledek se vydává v Platelet Aggregation Unit (PAU), které představují rychlost náběhu a intenzitu agregační odpovědi. ( Impedanční agregometrie Impedanční agregometr pracuje na principu záchytu změn elektrického odporu mezi dvěma platinovými elektrodami, ke kterým dochází narůstáním destičkových agregátů v plné nesráţlivé krvi. Destičky jsou aktivovány pomocí induktorů. Výhodou impedanční agregometrie v plné krvi je moţnost bezprostřední analýzy vzorku bez zbytečné manipulace, ztrát času, ztrát části subpopulace nebo aktivace destiček během centrifugace a pouţití menšího mnoţství vzorku. (Pakala, Waksman, 2011) 34

35 Na principu impedanční agregometrie pracuje např. přístroj MULTIPLATE, který bude popsán v experimentální části Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie je metoda, která umoţňuje simultánní měření a analýzu fyzikálně-chemických vlastností buněk během jejich průchodu laserovým paprskem. Ve chvíli, kdy buňka paprsek kříţí, dochází k lomu a rozptylu světla. Přímý rozptyl světla (forward scatter) je charakterizován lomem světla o malém úhlu a odpovídá velikosti buňky. Úhel bočního rozptylu (side scatter) - 90 charakterizuje vnitřní strukturu buňky. Kromě těchto parametrů lze detekovat i fluorescenci procházejících buněk. Suspenze buněk je inkubována s monoklonálními protilátkami namířenými proti měřenému antigenu, jeţ jsou značeny příslušným fluorochromem. Po inkubaci procházejí buňky přes komoru, kde je kaţdá z nich ozářena laserovým paprskem. Podle mnoţství fluorochromem emitovaného záření se určí mnoţství navázaných monoklonálních protilátek a tím i denzita sledovaného antigenu. Pomocí průtokové cytometrie lze měřit denzitu aktivovaných receptorů GPIIb/IIIa přímo na membráně destiček. Vyšetření se však nepouţívá k monitorování protidestičkové terapie, ale ke stanovení aktivity destiček u vybraných onemocnění a stavů. Vyšetření se provádí z plné krve. (Osmančík, Paulů, Toušek, 2010, Brown, Wittner, 2000) Průtoková cytometrie je vyuţívána k měření intracelulárního trombocytárního proteinu VASP (Vasodilatator-Stimulated Phosphoprotein) pro sledování účinku léčby inhibitory receptorů P2Y 12. VASP je ve svém inaktivním stavu nefosforylovaný. Jeho přeměna na fosforylovanou formu VASP-P je aktivována PGE 1 a inaktivována ADP přes receptory P2Y 12. (Osmančík, Paulů, Toušek, 2010) PGE 1 se váţe na inositol fosfátové receptory na povrchu trombocytů a přes G stimulační protein a adenylátcyklázu signalizuje přeměnu ATP na camp, a poté přes proteinkinázu A přeměnu VASP na VASP-P. ADP, které působí přes receptory P2Y 12 naopak jeho fosforylaci inhibuje. ADP se váţe na receptory P2Y 12 na povrchu destiček a přes G inhibiční protein vede k inhibici PGE 1 -indukované signalizace přes adenylátcyklázu. Thienopyridiny fosforylaci VASP nepřímo podporují a inhibují tak efekt ADP. V přítomnosti PGE 1 a ADP je mnoţství VASP-P, měřené pomocí monoklonálních protilátek, přímo úměrné stupni inhibice P2Y 12. (Marinov, 2008; Pakala, Waksman, 2011) 35

36 Průtokovou cytometrií lze monitorovat i terapii antagonisty GPIIb/IIIa (abciximab). Monoklonální protilátka 7E3 se váţe na receptory GPIIb/IIIa. Detekcí volných vazebných míst GPIIb/IIIa komplexu za pouţití fluorochromem značené monoklonální protilátky 7E3 (sníţená nebo chybějící fluorescence) lze monitorovat efekt léčby antagonisty receptorů GPIIb/IIIa. (Marinov, 2008) Další metodiky PFA 100 Přístrojem PFA 100 se měří schopnost aktivovaných destiček tvořit destičkovou zátku. Do přístroje se vkládá jednorázový měřicí modul, který je tvořen zásobníkem na vzorek, kapilárou a biologicky aktivní membránou s otvorem uprostřed. Ze zásobníku je citrátová krev transportována kapilárou k membráně, která je potaţena induktory aktivace trombocytů - kolagenem a epinefrinem (COL/EPI) nebo kolagenem a ADP (COL/ADP). Během adheze a agregace se vytvoří trombus, kterým se otvor v membráně uzavře a průtok krve se zastaví. Výsledkem je čas, který uběhne od prvního kontaktu krve s membránou po okamţik, kdy došlo k uzavření otvoru v membráně - closure time (CT). (Harrison, 2005; Pecka, 2010) Pro monitorování léčby kyselinou acetylsalicylovou je membrána potaţena induktory COL/EPI. Za terapeutickou hodnotu se povaţuje CT delší neţ 145 s. V modulu COL/ADP je CT v normálních mezích. (Pecka, 2010) Pro monitorování léčby antagonisty receptorů P2Y 12 je membrána potaţena induktory COL/ADP a navíc je pokryta ionty vápníku a PGE 1. Terapeutickou hodnotou je CT nad 106 s. (Pecka, 2010) Koncentrace tromboxanu B 2 v séru a 11-dehydrotromboxanu B 2 v moči Tromboxan B 2 je metabolitem tromboxanu A 2, produkovaného při metabolizmu kyseliny arachidonové. Stanovení se provádí metodou ELISA nebo hmotnostní spektrometrií a ukazuje na účinnost léčby kyselinou acetylsalicylovou. (Osmančík, Paulů, Toušek, 2010) 36

37 3. Praktická část 3.1. Materiál a metodika Přístroj Multiplate (Verum Diagnostica) Multiplate je zařízení, které pracuje na principu impedanční agregometrie v plné krvi. Slouţí k analýze funkce krevních destiček a monitorování antiagregační léčby. Pomocí několika testů (ASPItest, ADPtest, ADPtestHS, TRAPtest) lze monitorovat účinek kyseliny acetylsalicylové, thienopyridinů a antagonistů Gp IIb/IIIa. Měření se provádí v jednorázových testovacích kyvetách, které obsahují dva na sobě nezávislé senzory. Ty slouţí rovněţ jako vnitřní kontrola kvality. Kaţdý senzor tvoří dvě elektrody z vysoce vodivé mědí potaţené stříbrem. V kyvetách je přítomno teflonem potaţené míchadlo slouţící k míchání rekční směsi. Přístroj má 5 kanálů pro paralelní testování (aţ 30 testů za hodinu), 4 pozice vyhřívané na 37 C, panel pro reagencie, zabudovaný počítač s interaktivním softwarem a elektronickou automatickou pipetu. Zadávání dat a výběr testů se provádí pomocí klávesnice a myší. ( interaktivní software 5 kanálů pro paralelní měření elektronická pipeta panel pro reagencie 4 vyhřívané pozice Obrázek 3 Analyzátor Multiplate (převzato a upraveno z 37

38 Princip měření Vlivem induktorů se aktivované trombocyty přichytávají na elektrody senzorů v testovací kyvetě. Přilnutí trombocytů způsobí zvýšení odporu (impedance) mezi elektrodami. Změny impedance jsou kontinuálně detekovány zvlášť pro kaţdý senzor. Data jsou přístrojem převedena na arbitrární agregační jednotky (AU) a vynesena jako dvě agregační křivky proti času. ( port pro konektor 2 senzory, kaţdý s 2 elektrodami testovací kyveta vstup pro pipetování teflonem potaţené míchadlo trombocyty v klidovém stavu aktivace trombocytů po přidání induktorů přilnutí aktivovaných trombocytů na senzory Obrázek 4 Testovací kyveta (převzato a upraveno z Induktory Trombocyty v klidovém stavu nemají na svém povrchu vystaveny receptory pomocí kterých se mohou vázat na elektrody. Tuto schopnost získávají aţ po jejich aktivaci prostřednictvím induktorů. ASPItest: aktivace trombocytů pomocí kyseliny arachidonové, která je enzymem cyklooxygenázou přeměněna na tromboxan A 2 ADPtest: aktivace trombocytů pomocí ADP, které se váţe na ADP receptory na povrchu destiček 38

39 ADPtestHS: aktivace trombocytů pomocí ADP s přídavkem prostaglandinu E 1, který zvyšuje senzitivitu testu k thienopyridinům TRAPtest: aktivace trombocytů pomocí TRAP 6 (peptid aktivující trombinový receptor), který se stejně jako trombin váţe na trombinové receptory na povrchu destiček ( Tabulka 1 Přehled pouţitých induktorů a jejich senzitivita k léčivům senzitivita induktorů test induktor ASA ADP antagonisté GPIIb/IIIa antagonisté ASPItest kyselina arachidonová ADPtest adenosindifosfát ADPtestHS TRAPtest adenosindifosfát zcitlivělý prostaglandinem E1 peptid aktivující trombinový receptor ţádná senzitivita + niţší senzitivita ++ vysoká senzitivita Postup stanovení Testovací kyveta se vloţí do měřicí pozice a k senzorům se pomocí konektoru připojí kabel. Elektronickou pipetou se za kontroly softwaru přístroje do kyvety napipetuje na 37 C vytemperovaný fyziologicky roztok (0.9 % NaCl), plná krev a směs se za stálého míchání 3 minuty inkubuje. Po inkubaci se přidá příslušný induktor a kontinuálně se měří změny impedance. Výsledek v podobě dvou agregačních křivek je k dispozici za 6 minut. 39

40 Agregace (AU) Tabulka 2 Pipetovací postup Pipetovací postup fyziologický roztok 300 µl plná krev 300 µl inkubace 3 minuty induktor 20 µl Vyjadřování výsledků Výsledkem stanovení jsou dvě agregační křivky. Přístrojem jsou vypočteny tři parametry. Nejdůleţitějším z nich je plocha pod křivkou (daná celkovou výškou agregační křivky a jejím sklonem), která nejlépe vyjadřuje celkovou aktivitu destiček. Další dva parametry slouţí pro výzkumné účely. Patří k nim maximální amplituda (výška agregační křivky) a maximální sklon amplitudy (velocity). Všechny parametry vypočtené pomocí softwaru jsou průměrem hodnot obou křivek. Během měření je hodnocen Pearsonův korelační koeficient a počítán rozdíl mezi oběmi plochami pod křivkou. Výsledek je akceptován, pokud je korelační koeficient alespoň 0,98 a rozdíl mezi křivkami je menší neţ 20%. ( AUC plocha pod křivkou test 1 test 2 Čas (min) Obrázek 5 Agregační křivka (převzato a upraveno z 40

41 Tabulka 3 Výstupní veličiny a jednotky Výstupní veličiny Jednotky plocha pod agregační křivkou (AUC) AU*min / U * maximální agregační amplituda (aggregation) AU maximální sklon amplitudy (velocity) AU/min * 10 AU*min = 1 U Referenční rozmezí a interpretace výsledků Tabulka 4 Referenční rozmezí a cut off hodnoty jednotlivých testů Test AUC (U) Cut-off (U) ASPItest ADPtest ADPtestHS TRAPtest Neléčení a zdraví jedinci: hodnoty AUC v referenčním rozmezí Léčení pacienti: hodnoty AUC < cut-off úspěšná antiagregační léčba hodnoty AUC > cut-off nedostatečná antiagregační léčba vyšší riziko arteriálního tromboembolismu moţný výskyt rezistence na příslušnou léčbu 41

42 TRAPtest ASPItes ADPtest bez inhibice trombocytů 100 mg ASA 75 mg Clopidogrelu 100 mg ASA + 75 mg Clopidogrelu Tirofiban Obrázek 6 Příklady agregačních křivek (převzato a upraveno z Reagencie Tabulka 5 Přehled reagencií a jejich obsah reagencie ASPItest ADPtest TRAPtest obsah 1ml 15mM kyseliny arachidonové 1ml 0,2 mm adenosindifosfátu 1ml 1mM TRAP-6* Prostaglandin E 1 1ml 300 nm prostaglandinu E 1 * TRAP-6 peptid aktivující trombinový receptor 42

43 Odběr vzorků Vyšetření se provádí z plné krve, která se odebírá do 3,0 ml zkumavek obsahujících 25 µg/ml hirudinu, přímého inhibitoru trombinu, jako protisráţlivého činidla. Výhodou hirudinu je, ţe v krvi nesniţuje hladinu Ca 2+. Krev je nutné 4 5 x promíchat a vyšetřit do 3 hodin po odběru. Výhody pouţití plné krve: nedochází ke ztrátě trombocytů při centrifugaci, destičky jsou ve svém fyziologickém prostředí (Tóth, 2006) Charakteristika vyšetřovaného souboru Během jednoho roku byl vyšetřen soubor osob tvořený zdravými dobrovolníky dárci krve, neuţívajícími ţádné léky a dále soubor kardiologických pacientů s akutním koronárním syndromem (například infarkt myokardu, cévní mozková příhoda, angina pectoris) s antiagregační duální léčbou (kyselina acetylsalicylová 100mg/den a clopidogrel 75 mg/den). Bliţší charakteristika vyšetřovaných souborů je uvedena u jednotlivých výsledků Statistické zpracování Data byla vyhodnocena pomocí Microsoft Office Excel 2007 a programem MedCalc. K ověření normality dat byl pouţit Kolmogorov Smirnov test. V případě normality dat byl pro porovnání dat ze dvou závislých souborů pouţit párový t-test a v případě nenormálního rozloţení dat Wilcoxonův párový test. Pro porovnání dat vzájemně nezávislých souborů byl v případě normality dat pouţit t-test pro nezávislé vzorky a v případě nenormálního rozloţení dat Mann-Whitneyův test pro nezávislé vzorky. K porovnání hodnot kontrolního souboru s průměrnými hodnotami referenčních rozmezí získaných z literatury byl pouţit jednovýběrový t-test. Za statisticky signifikantní byla povaţována hodnota p < 0, Výsledky a vyhodnocení Opakovatelnost Přesnost metody je definována jako míra shody mezi výsledky získanými opakovanou analýzou téhoţ vzorku za předem stanovených podmínek. Je statistickým vyhodnocením náhodných chyb, které nelze zcela eliminovat. Výsledky opakovaných analýz jsou rovnoměrně rozptýleny kolem průměrné hodnoty, přičemţ četnost 43

44 jednotlivých výsledků vykazuje normální rozloţení. Mírou rozptylu výsledků (nepřesnosti) je směrodatná odchylka - SD. Niţší hodnota směrodatné odchylky ukazuje na vyšší přesnost metody, a naopak. Směrodatná odchylka je vyjadřována ve stejných jednotkách jako měřená veličina. Závisí na měřené hodnotě, proto se obvykle počítá relativní směrodatná odchylka variační koeficient (CV), vyjadřovaná v %. (Racek, 2006) Testovaný soubor byl tvořen 10 osobami zdravými dobrovolníky (5 muţů a 5 ţen; průměrný věk byl 33 let; rozmezí let; medián 33 let) zcela bez léčby. Z kaţdého vzorku bylo provedeno 5 měření a vypočítán variační koeficient podle vzorce: kde CV je variační koeficient, SD je směrodatná odchylka, je aritmetický průměr. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 6. Tabulka 6 Přesnost jednotlivých testů ASPItest ADPtest ADPtestHS TRAPtest CV (%) CV (%) CV (%) CV (%) č.1 10,0 5,1 20,5 16,5 č.2 3,6 3,3 5,4 7,5 č.3 4,9 12,6 29,1 9,9 č.4 8,4 4,4 8,4 8,0 č.5 6,7 22,7 16,4 21,1 č.6 24,2 7,0 14,9 36,7 č.7 6,4 8,2 10,8 5,9 č.8 3,1 13,4 18,5 3,7 č,9 7,4 3,8 3,6 7,2 č.10 12,6 7,3 4,9 4,3 průměr 8,7 8,8 13,3 12,1 44

45 Stanovení vlastních referenčních rozmezí a jejich porovnání s literárními údaji Referenčním rozmezím jsou takové hodnoty laboratorního testu, mezi nimiţ leţí většina hodnot (obvykle 95 %) získaná měřením referenční populace (soubor jedinců, splňující určité předpoklady). Jelikoţ nelze vyšetřit celou referenční populaci, provádí se náhodný výběr a získá se výběrová referenční skupina, u které se měří výběrové referenční hodnoty a určí výběrové referenční meze. Pokud je referenční skupina dostatečně veliká a byl správně proveden náhodný výběr, odpovídá odhad referenčních mezí u výběrové skupiny skutečným referenčním mezím u celé referenční populace s co nejmenší nejistotou. Výpočet referenčních mezí je v případě normálního rozloţení dat výpočtem aritmetického průměru a směrodatné odchylky s podle vzorce: ± 2SD (Racek, 2006) Testovaný soubor byl tvořen 32 dárci krve, kteří byli zcela bez léčby (muţi n = 17, ţeny = 15), průměrný věk testované skupiny byl 52 let (rozmezí let; medián 53 let). U naměřených hodnot jednotlivých testů jsem ověřovala normalitu dat pomocí Kolmogorova Smirnova testu, který potvrdil, ţe data mají normální rozloţení. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 7. Z naměřených hodnot jsem vypočítala směrodatné odchylky a následně podle vzorce: ± 2SD referenční rozmezí pro jednotlivé testy. Hodnoty kontrolního souboru jsem porovnala pomocí jednovýběrového t-testu s průměrnými hodnotami referenčních rozmezí získaných z literatury. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 8 a znázorněny graficky (viz graf 1). Tabulka 7 Ověření dat pomocí Kolmogorova Smirnovova testu medián průměr rozmezí p - hodnota TRAPtest 128,4 129, ,7 0,2019 ASPItest 104, ,5-210,6 0,7386 ADPtest 80,8 78,8 32,7-148,5 0,9534 ADPtestHS 50,4 51,2 13,5-142,9 0,

46 AUC (U) Tabulka 8 Porovnání referenčního rozmezí kontrolního souboru a literárních údajů kontrolní soubor AUC (U) literární údaje AUC (U) p - hodnota TRAPtest 103,3-155, ,3518 ASPItest 74,7-141, ,6136 ADPtest , ,0745 ADPtestHS 25,7-76, , Kontrolní skupina x literární údaje kontrolní soubor literární údaje TRAPtest ASPItest ADPtest ADPtestHS Graf 1 Porovnání hodnot referenčních rozmezí kontrolního souboru s literárními údaji 46

47 Sledování účinku léčby na souboru kardiologických pacientů Testovaný soubor tvořilo 83 kardiologických pacientů uţívajících duální antiagregační léčbu (100 mg ASA denně a 75 mg clopidogrelu denně), 59 muţů a 24 ţen s průměrným věkem 71 let (rozmezí let; medián 72 let). První odběr byl proveden den po medikaci a druhý odběr za 3 6 měsíců. Porovnání naměřených hodnot při 1. a 2. odběru U naměřených hodnot jsem ověřovala normalitu dat pomocí Kolmogorova Smirnova testu. Data z 1. a 2. odběru stanovená pomocí TRAPtestu měla normální rozloţení, zatímco u dat z 1. a 2. odběru stanovených pomocí ASPItestu, ADPtestu a ADPtestuHS byla normalita zamítnuta. V případě normálního rozloţení dat jsem oba odběry porovnala párovým t-testem a v případně nenormálně rozloţených dat párovým Wilcoxonovým testem. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 9. Tabulka 9 Shrnutí naměřených dat, porovnání rozdílů naměřených hodnot při 1. a 2. Odběru u léčených pacientů TRAPtest 1.odběr TRAPtest 2.odběr ASPItest 1.odběr ASPItest 2. odběr ADPtest 1.odběr ADPtest 2.odběr ADPtestHS 1.odběr ADPtestHS 2.odběr medián průměr rozmezí K-S test normality 87,7 89,2 8,9 169,0 p = 0, ,2 66, ,7 p = 0, ,9 22, ,8 p = 0,0007 5,8 17, ,7 p < 0, ,7 25, ,1 p = 0, ,3 21,0 0 87,9 p = 0,0141 9,9 14,5 0 99,7 p = 0,0028 7,6 13,0 0 79,8 p = 0,0004 p - hodnota p < 0,0001 p = 0,1283 p = 0,3305 p = 0,

48 AUC (U) Zjištění rozdílu naměřených hodnot u jednotlivých testů mezi kontrolním souborem a léčenými pacienty Pro zjištění rozdílu naměřených hodnot u jednotlivých testů mezi kontrolním souborem a léčenými pacienty (1. i 2. odběr) jsem v případě normálně rozloţených dat pouţila t-test nezávislých vzorků a v případě nenormálně rozloţených dat Mann Whitney test pro nezávislé vzorky. Tyto testy prokázaly, ţe mezi hodnotami kontrolního souboru a léčených pacientů jsou signifikantní rozdíly. Ve všech případech byla p hodnota < 0,0001. Výsledky jsou shrnuty graficky (viz graf 2). 140,0 120,0 100,0 kontrolní skupina 1.odběr 2.odběr 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 TRAPtest ASPItest ADPtest ADPtestHS Graf 2 Graf porovnání průměrných hodnot AUC u kontrolní skupiny a léčených pacientů z 1. a 2. odběru 48

49 Procentuální vyhodnocení rezistence na antiagregační léčbu Účinnost léčby ASA jsme sledovali pomocí ASPItestu a účinnost léčby clopidogrelem pomocí ADPtestu a ADPtestuHS. Úspěšnost léčby jsme hodnotili podle cut-off hodnot AUC pro jednotlivé testy. Cut-off hodnota AUC pro ASPItest = 30 U, pro ADPtest = 50 U a pro ADPtestHS = 25 U. Hodnoty < cut-off svědčí o úspěšnosti antiagregační léčby. Pacienty jsme tímto způsobem procentuálně vyhodnotili ze 4 pohledů reagující na ASA i clopidogrel (duální léčba), reagující pouze na ASA (nereagující na clopidogrel) nebo reagující pouze na clopidogrel (nereagující na ASA) a nereagující na oba léky. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 10 a znázorněny graficky v grafech 3, 4, 5, 6, 7 a 8. Tabulka 10 Účinnost léčby na pacienty v čase pouze 1. odběr pouze 2. odběr 1. i 2. odběr n = 83 počet % počet % počet % rezistence na clopidogrel 6 7,2 9 10,9 1 1,2 rezistence na ASA 9 10,9 6 7,2 2 2,4 reagující na ASA i clopidogrel , ,8 rezistence na ASA i clopidogrel 9 10,9 4 4,8 2 2,4 nereagující v některém z odběrů 35 42,2 49

50 10,9% 71% rezistence na ASA i clopidogrel rezistence na clopidogrel 7,2% 10,9% rezistence na ASA reagující na ASA i clopidogrel Graf 3 Graf znázorňující účinek léčby na pacienty při 1. odběru 7,2% 77,1% rezistence na ASA i clopidogrel rezistence na clopidogrel rezistence na ASA 10,9% 4,8% reagující na ASA i clopidogrel Graf 4 Graf znázorňující účinek léčby na pacienty při 2. odběru 50

51 51,8% 42,2% rezistence na ASA i clopidogrel rezistence na clopidogrel rezistence na ASA 2,4% 1,2% 2,4% reagující na ASA i clopidogrel nereag.v některém z odběrů Graf 5 Graf znázorňující účinek léčby na pacienty při 1. i 2. odběru 51