Šlechtění révy vinné na odolnost proti plísni révové Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl. & de Toni

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici na Moravě Šlechtění révy vinné na odolnost proti plísni révové Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl. & de Toni DISERTAČNÍ PRÁCE Ing. Radek Sotolář LEDNICE

2 Na tomto místě bych rád poděkoval svému školiteli Doc. RNDr. Miroslavu Pidrovi CSc., jakož i dalším pracovníkům Mendelea, za cenné rady a pomoc při zpracování disertační práce. 2

3 OBSAH Literární část 1. ÚVOD HISTORIE VINOHRADNICTVÍ ČR 8 2. BOTANICKÉ ZAŘAZENÍ, VZNIK A ROZDĚLENÍ KULTURNÍCH ODRŮD RÉVY VINNÉ BOTANICKÉ ČLĚNĚNÍ RODU VITIS SPP DĚLENÍ KULTURNÍCH ODRŮD RÉVY VINNÉ DĚLENÍ NATIVNÍCH DRUHŮ RÉVY VINNÉ ŠLECHTĚNÍ RÉVY VINNÉ HISTORIE ŠLECHTĚNÍ RÉVY VINNÉ ŠLECHTĚNÍ NA ODOLNOST PROTI BIOTICKÝM VLIVŮM Rezistentní šlechtění Proces rezistentního šlechtění a charakteristika základních pojmů Šlechtění na odolnost proti houbovým chorobám interspecifické odrůdy Vzdálená hybridizace a genetické manipulace Vzdálená hybridizace Transgenní rostliny GENOVÉ ZDROJE RODU VITIS SPP., ZPŮSOBY JEJICH UCHOVÁVÁNÍ, IDENTIFIKACE A VYUŽITÍ GENOVÉ ZDROJE RODU VITIS SPP IDENTIFIKACE GENOVÝCH ZDROJŮ GENETICKÉ ZDROJE REZISTENCE A JEJICH ŠLECHTITELSKÉ ZHODNOCENÍ Šlechtitelské zhodnocení některých vybraných druhů rév PRINCIPY ODOLNOSTI K HOUBOVÝM CHOROBÁM DESKRIPTORY K VYHODNOCOVÁNÍ ÚROVNĚ ODOLNOSTI PROTI PLÍSNI RÉVOVÉ Deskriptory OIV, IPGRI a UPOV Deskriptor EPPO Deskriptory podle Reuvena (1998) a Cohena (1999)

4 4.5.4 Deskriptor míry napadení interspecifických hybridů podle Kozmy a Duly (2003) PLÍSEŇ RÉVOVÁ INTRODUKCE PLÍSNĚ RÉVOVÉ DO EVROPY HOSTITELSKÉ ROSTLINY TAXONOMIE PLÍSNĚ RÉVOVÉ PŘÍZNAKY ONEMOCNĚNÍ BIOLOGIE HOUBY A PODMÍNKY INFEKCE Vývojový cyklus plísně révové Oospory Sporangiofory Sporangia a zoospory Podmínky pro vznik infekce Klíčení oospor a uvolňování zoospor Inkubační doba Sporulace Přežívání sporáangií Infekční perioda OCHRANA, PROGNÓZA A SIGNALIZACE OCHRANA PROTI PLÍSNI RÉVOVÉ Ochrana nepřímá Ochrana přímá Chemické přípravky PROGNÓZA A SIGNALIZACE Role prognózy, signalizace a práh škodlivosti Princip prognózy a signalizace Stručná historie vzniku předpovědi a signalizace Krátkodobé předpovědi a signalizace Dlouhodobé předpovědi intenzity výskytu chorob

5 Experimentální část 7. CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODIKY NAKŘÍŽENÍ POŽADOVANÉHO VÝCHOZÍHO MATERIÁLU Výběr výchozího materiálu Stručné popisy rodičovských odrůd Bianca Hibernal Hibia Kunleany Merzling Kastrace a opylení Sklizeň a stratifikace semen Výsev semen MOŽNOSTI KULTIVACE PLÍSNĚ RÉVOVÉ Tzv. ze sušiny Kontinuální přemnožování METODY TESTOVÁNÍ ODOLNOSTI PROTI PLÍSNI RÉVOVÉ Laboratorní test tzv. terčíková metoda Klasické provokační metody - umělá infekce v pařeništi či skleníku DESKRIPTOR K VYHODNOCOVÁNÍ PROVOKAČNÍCH METOD VYHODNOCENÍ A VÝSLEDKY KŘÍŽENÍ DANÝCH ODRŮD Kastrace a opylení v roce Kastrace a opylení v roce Sklizeň a stratifikace semen Výsev semen Klíčivost semen v jednotlivých kombinacích Ošetřování semenáčů ÚCHOVA A KULTIVACE PLÍSNĚ RÉVOVÉ Úchova sporangií plísně révové na infekčních zchlazených listech

6 9.2.2 Úchova sporangií plísně na přirozeně seschlých a zamrazených infekčních listech Úchova a kultivace plísně v in vitro podmínkách Kultivace sporangií plísně révové na agarovém kultivačním médiu MURASHIGE-SKOOG Kultivace sporangií plísně révové na kultuře ve zkumavkách Kontinuální přemnožování plísně z infekčních terčů TESTOVÁNÍ ODOLNOSTI PROTI PLÍSNI RÉVOVÉ Laboratorní test pomocí listových disků (terčíková metoda) Otestování odolnosti rodičovských odrůd Testování jednotlivých kombinací v roce Testování jednotlivých kombinací v roce Provokační metoda ve studeném pařeništi Testování jednotlivých kombinací v roce Testování jednotlivých kombinací v roce Polní pozorování (screening) Charakteristika pozemku Charakteristika klimatu Průběh počasí a tlak plísně révové v roce Výsledky polního screeningu v roce ANALÝZA ZÍSKANÝCH SEMENÁČŮ STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ Srovnání mezi testovanými roky Srovnání mezi použitými metodami Průkaznosti rozdílů mezi variantami (analýza rozptylu) Srovnání variability jednotlivých kombinací křížení při testování různými metodami z pohledu matečné odrůdy Srovnání variability jednotlivých kombinací křížení při testování různými metodami z pohledu otcovské odrůdy DISKUSE ZÁVĚR 144 6

7 12. SOUHRN SUMMARY POUŽITÁ LITERATURA PŘÍLOHY SEZNAM PŘÍLOH 168 7

8 Literární část 1. Úvod Historie vinohradnictví ČR Réva vinná patří mezi staré kulturní rostliny, jejíž pěstování je známo od nejstarších dob. Už v pravěku sbírali lidé hrozny z divoce rostoucí révy, kterou si později začali vysazovat u svého obydlí. První odrůdy ušlechtilé révy vznikaly pravděpodobně ve Střední Asii v oblastech kolem Černého a Kaspického moře. První větší výsadby byly zakládány už před 5-7 tis. lety v Egyptě, Mezopotánii, Sýrii a Babyloně. K největšímu rozšíření révy došlo v období římských výbojů. Prokazatelné počátky moravského vinohradnictví se datují do 2-3. n.l. století při postupném pronikání římských legií caesara Marca Aurelia Antonia ( po Kristu) do Uher, Rakous, Slovenska a na Moravu - tehdy Pannonie a Germanie (tvz. Markomanské války n.l.), a pak zejména Marca Aurelia Proba Augusta ( po Kristu). Introdukovány byly zejména odrůdy Malvasia a Chrupky. Nasvědčují tomu vykopávky na tzv.,,římském vrhu u někdejšího Mušova pod Pálavou, kde byly nalezeny zbytky římské stanice X. legie Legio Decima Geminia Pia Fidelis z Vindobony (dnešní Vídeň), které kromě jiného ukrývaly i zachovalý vinařský nůž. Kolem Dunaje (hraniční řeka) působilo 12 různých legií a jen přímo na Dunaji v největším zdejším castru Carnuntu (naproti Děvínu) byla posádkou Legie XIV. Martia Victrix, pak ona Legie X. Gemina z Vindobony (Vídeň), Legie I. Adiutrix v Brigetiu (Komárno) a Legie II. Adiutrix v Aquincu (Budapešť) a setrvaly zde (byť s občasnou výměnou garnizon) až do konce římského období. Doložený rozvoj nastal také v období Velké Moravy, kdy kníže Svatopluk ( 9. stol.; vládl n.l.) nechal dovést révu vinnou z Rakous a Uher a začal cílevědomě zakládat vinice. Rozvoji vinařství pomohlo i šíření křesťanství. Víno bylo součástí liturgických obřadů a proto církev, konkrétně některé klášterní komunity, začaly zakládat další nové vinice. Byli to především premonstráti, kteří založili v roce 1195 klášter v Louce u Znojma, dále cisterciáci, kteří se usadili v roce 1202 na Velehradě, později dominikáni ve Znojmě a Brně a asi v polovině 13. stol. také benediktini z Rajhradu. Nesporně největší historický význam mělo vinohradnictví městské. Povzneslo městský stav a stalo se základem bohatství města. Dle šacunku (odhadu) měli měšťané asi třetinu majetku uloženou právě ve vinicích a vínu. Na Moravě to byli hlavně měšťané z Brna a Znojma. Brněnští měšťané zakládali vinice v blízkosti Brna, ale později poznali 8

9 lepší podmínky pro pěstování révy na jižní Moravě, zejména v Hustopečích. Zde založili velké množství vinic a kolem roku 1368 se staly Hustopeče největším vinařským střediskem na jižní Moravě. Až do poloviny 14. stol. patřil k nejdůležitějším úřadům z hlediska práva horenský úřad ve Falkenštejnu v Dolním Rakousku. V roce 1351 moravský markrabě Jan Jindřich ( ) nařídil řešit a rozhodovat viniční spory u perkmistrovského úřadu v Hustopečích. Velkou zásluhu na zvelebení vinohradnictví měl český král Karel IV. ( ), který vydal roku 1358 královské nařízení (bulu) o zakládání vinic. V tomto nařízení stálo, kdo a kde má vinice zakládat, jak velká má vinice být (16 viničních prutů dlouhá a 8 prutů široká, čili půl jitra - 76 x 38 m), osvobození od daní do 12 roku věku vinice a pak odvody desátku králi a majiteli pozemku z každé vinice po půl džberu ročně (30,5 l). V době husitských válek ( ) došlo k úpadku vinohradnictví. V roce 1497 vydává Vladislav II. Jagellonský ( ) nařízení o zapsání všech vinic do Gruntovní knihy perkmistrovské. Roku 1526 pražský perkmistr J. Legát nařizuje ochranu domácích vín uvalením zákazu dovozu cizích vín v době od sv. Havla (16. října) do sv. Jiří (24. dubna). Veškerá vína se dále musí napřed ocenit nežli se začnou šenkovat. Za císaře Rudolfa II. ( ) došlo opět k prudkému rozvoji našeho vinohradnictví. Na Moravě bylo v té době asi měřic ( ha), v Čechách měřic ( ha) vinic. Zmíněný rozmach ukončila třicetiletá válka ( ). Na přelomu 18. a 19. století dochází opět k dalšímu rozmachu, kdy v roce 1820 bylo zaznamenáno ha vinic na Moravě a ha vinic v Čechách. Se zrušením roboty (1848) se uvolnily pracovní síly ze zemědělství a odcházely do vznikajících průmyslových podniků. Poté byly z Ameriky zavlečeny nebezpečné houbové choroby a následně i révokaz (1890). Tyto okolnosti vedli k praktickému zničení většiny vinic u nás. Po obou světových válkách dochází k obnově vinic přizpůsobované již mechanizaci s čímž souviselo i zavádění nových tvarů. V roce 1985 byla plocha vinic kolem ha, z toho bylo ha plodných vinic. Po roce 1989 dochází k zásadním společenskoekonomickým změnám a postupně se celý hospodářský systém státu transformoval na tržní systém. Toto období bylo charakterizováno všeobecně nízkými investicemi do půdy a porostů, vybavení pěstitelů technikou a velkým úbytkem pracovních sil. Plochy vinic neustále klesaly, většina vinic byla přestárlá s průměrem kolem 17 let, chyběl značný počet keřů ve výsadbách, snižovalo se množství a kvalita ošetření, což mělo za následek snížení průměrného výnosu (asi o 1 t oproti průměru 80. let). 9

10 Počátkem 21. století, po počátečních zmatcích s restitucemi a s rozpadem vinařských družstev, prochází vinohradnictví další velkou, hlavně organizační přeměnou, která však výrazně zvýšila kvalitu produkovaných vín. Vstup do Evropské unie ( ) a nový Zákon o vinohradnictví a vinařství (č.321/2004 Sb.) dal vinařům právní jistoty, byly nově stanoveny vinařské oblasti (Čechy a Morava), podoblasti (mělnická, litoměřická, mikulovská, slovácká, velkopavlovická a znojemská), viniční tratě a vinařské obce. Tato zdánlivě formální záležitost má však pro propagaci a kvalitu vín nesmírný význam. Nejkvalitnější hrozny se už nyní pěstují pouze na zaregistrovaných viničních tratích, tedy v polohách, kde jsou dlouhodobě vhodné podmínky pro získání vysoce kvalitních hroznů, a u nichž je stanoveno, jaké odrůdy je zde možné pěstovat a do budoucna bude též určeno maximální možné množství sklizených hroznů. Opět došlo k nárůstu celkové plochy vinic a v současné době představuje produkční potenciál ČR ha. Obrázek č. 1: Pěstování a sklizeň révy vinné; kresba přejata z Bible Velislavovy (Kraus a kol., 1997) 10

11 2. Botanické zařazení, vznik a rozdělení kulturních odrůd révy vinné 2.1 Botanické členění rodu Vitis spp. Réva vinná (Vitis vinifera L. ssp. sativa (D.C.) Hegi) je liánovitá, světlomilná a teplomilná rostlina s mohutným kořenovým systémem, patřící do čeledi Vitaceae - révovité a rodu Vitis L. Její odrůdy, moštové i stolní, jsou v Evropě pěstovány po mnoho století mezi rovnoběžkou severní šířky (KUTINA a kol., 1991). Rod Vitis spp. dělí různí badatelé do různého počtu sekcí. PLANCHON J.E. (1887) jako první uvádí dvě sekce: I. Muscadinia (n = 20) a II. Euvitis (n = 19) s 9 sériemi, které později rozšířil P.GALET (2000) na 11 sekcí, dle morfologie a místa výskytu jednotlivých druhů. Tabulka č.1: Rozdíly mezi podrody révy vinné dle Galeta (1998) Podrod Euvitis - základní počet chromozomů je 2n=38 - borka se odlupuje v celých pásech - sekundární lýko má střídající se (tangenciální) vrstvy tvrdého a měkkého lýka - dřevo je měkké s velkými cévami - řez výhonu je vždy eliptický a nikdy čtyřúhelníkový - má přepážku (diafragmu), která přerušuje dřeň v nodech - úponky jsou naproti listu, dvoj nebo trojvidličnaté - má vlnaté, štětinkovité či speciální typy vlásků na vegetativních orgánech - hrozny mají mnoho bobulí, které se drží pevně stopky i po dosažení plné zralosti - bobule mají vhodný obsah cukrů i kyselin pro přímý konzum, výrobu šťáv i vína - semena jsou hruškovitého tvaru - listy jsou obvykle dlanité s 5 základními žilkami Podrod Muscadinia - základní počet chromozomů je 2n=40 - borka se neodlupuje, výhony mají nápadné lenticely - lýková vlákna druhotného lýka jsou umístěna na okraji - dřevo je tvrdé bez velkých cév s malou dření - chybí diafragma, dřeň je nepřerušovaná - úponky jsou naproti listu, jsou jednoduché - vegetativní část rostliny je vždy lysá - hrozny mají poměrně málo bobulí, které dozrávají nestejnoměrně a po dosažení zralosti opadávají - bobule jsou dužnaté s malým obsahem šťávy, mohou být konzumovány čerstvé, ale z důvodu nízké koncentrace cukru jsou nevhodné pro výrobu vína - semena jsou loďovitého tvaru s oválnou chalázou, při okraji s brázdami a hřbety - listy jsou vždy dlanité, slabě laločnaté či bez zřetelných laloků 11

12 Podle NEGRULA A.M.(1946) lze druhy rodu Vitis spp. rozdělit do tří ekologických skupin: 1. středo a severoamerická skupina s 28 druhy, 2. východoasijská skupina s více než 40 druhy, 3. euroasijská skupina s jedním druhem Vitis vinifera L., dělícím se dále na dva poddruhy: V. vinifera L. subsp. sylvestris (C.C. Gmel.) Hegi - réva vinná lesní (dále ji můžeme rozdělit na tři sortotypy: typica-typická, aberans-hladkolistá a balcanica-balkánská) a V. vinifera L. subsp. sativa (D.C.) Hegi - réva vinná pravá. Taxonomické zatřídění révy vinné pravé: Říše (Kingdom): Regnum Plantae - říše rostlinná Oddělení (Division): Magnoliophyta Cronquist Pododdělení (Subdivision): Magnoliophytina Frohne et Jensen Třída (Class): Magnoliopsida (Rosopsida Batsch) Podtřída (Subclassis): Peronosporomycetidae (Rosidae Takht.) Nadřád (SuperOrder): Vitanae Takht. et Reveal Řád (Order): Vitales Reveal Čeleď (Family): Vitaceae Juss. Podčeleď (Subfamily): Vitoideae Eaton Tribus (Tribus): Viteae Dumort. Rod (Genus): Vitis Linné Podrod (Subgenus): Euvitis a Muscadinia Planchon Druh (Species): Vitis vinifera Linné Poddruh (Subspecies): sativa Hegi Odrůda (Cultivar): Dělení kulturních odrůd révy vinné Odrůdy této révy vinné pravé (Vitis vinifera L. ssp. sativa (D.C.) Hegi) pak následně dále rozdělil opět do tří skupin podle ekologickogeografických podmínek, za kterých vznikaly: a) skupina západní - proles occidentalis (evropské moštové odrůdy). b) skupina černomořská - proles pontica, má dvě podskupiny: podskupina gruzínská (subproles georgica - většinou moštové odrůdy) a podskupina balkánská 12

13 (subproles pontica - moštové i stolní s velkým hroznem, ale jen se středně velkou bobulí). Hlavním znakem těchto odrůd je jen střední odolnost proti mrazu a pavučinovité nebo štětinovité obrvení listů. Vrcholek letorostů bývá silně plstnatý. Růst letorostů je bujný, réví silné. Plodnost odrůd je vysoká. Mnohé z nich se dají použít jak k výrobě vína, tak k jídlu. Je to proto, že člověku v těchto oblastech sloužila vinná réva jednak jako ovoce, i jako surovina k výrobě vína. Vybíral tedy odrůdy, které se hodily pro oba účely. c) skupina východní - proles orientalis, dělící se rovněž na dvě podskupiny: kaspická (subproles caspica) a maloasijská (subproles antasiatica). A právě z této skupiny vzešla většina stolních odrůd. Střediskem vzniku pravých stolních odrůd byla tedy Asie. Na východ od Kavkazu, kde se rozšířila hladkolistá forma lesní révy (Vitis vinifera ssp. sylvestris forma aberans), vznikaly postupně dvě různé skupiny odrůd. Starší skupina orientálních odrůd sdružuje odrůdy vzniklé okolo Kaspického moře v dobách před příchodem islámu. Odrůdy této kaspické podskupiny (Proles orientalis subproles caspica Negr. ) mají většinou velmi bujný růst, velké hrozny, ale drobné šťavnaté bobule ( Bajan širej, Terbaš, Tavkleri, Buaki aj.). Jsou vhodné i pro výrobu vína. S invazí Arabů do Střední Asie a rozšiřování islámu, který zakazuje pití alkoholických nápojů, byly všude vinice s moštovými odrůdami klučeny a nahrazovány odrůdami stolními. Tyto odrůdy vznikaly v Malé a Střední Asii (Proles orientalis subproles antasiatica Negr.). Patří sem odrůdy jako Chusajne, Tajfi, Nimrang, Sultanina, Afus-Ali a jiné. Jde o velmi málo plastické odrůdy zvyklé na velmi teplé ekologické podmínky. Mají většinou bujný růst, ale menší plodnost a nízkou mrazuodolnost. Proto se většinou nedají v jiných vinohradnických oblastech pěstovat (DOHNAL, KRAUS, PÁTEK, 1975). Obr.č.2: Vitis vinifera L. subsp. sylvestris (C.C. Gmel.) Hegi 13

14 Tabulka č.2: Rozdělení Vitis vinifera L. ssp. sativa Hegi Proles orientalis Proles pontica Proles occidentalis - očka jsou hladká a lysá - spodní strana listu je hladká, lysá, později se štětinkami - listové okraje jsou ohnuté směrem nahoru - hrozny jsou velké, volné, často rozvětvené s rameny - mají nízký obsah kyselin - bobule jsou oválné, vejčité až podlouhlé, střední až velké, dužnaté - semena jsou střední až velká s prodlouženým zobáčkem - výhony mají nižší plodnost - odrůdy mají delší vegetační období a nízkou mrazuvzdornost - odrůdy jsou většinou bílé a růžové, stolního typu - mnoho odrůd je částečně bezsemenných, některé úplně bezsemenné - Katta Kurgan, Nimrang, Kišmiš bělyj, Terbaš, Chrupky, aj. - očka jsou ojíněná, popelavě šedá až bílá - spodní strana listu je smíšeně ochmýřená (pavučinovitá + štětinovitá) - listové okraje jsou různě zakřivené - hrozny jsou středně velké, kompaktní, zřídka volné - mají vyšší obsah kyselin - bobule jsou většinou kulaté, střední až malé, šťavnaté - semena jsou malá, střední i velká - výhony mají vysokou plodnost - odrůdy jsou většinou mrazuvzdorné - vyskytuje se přibližně stejné množství bílých, růžových i modrých odrůd, stolní i moštové - mnoho odrůd je částečně bezsemenných, některé úplně bezsemenné - Rkaciteli, Saperavi, Korintka, Furmint, Plavaj, aj. - očka jsou slaběji ojíněná - spodní strana listu má pavučinovité ochmýření - listové okraje se otáčejí směrem dolů - hrozny jsou malé, střední i velké, většinou kompaktní - mají vyšší obsah kyselin - bobule jsou kulaté, zřídka oválné, malé až středně velké, šťavnaté - semena jsou malá s patrným zobáčkem - výhony jsou plodné až velmi plodné - odrůdy mají kratší vegetační období a jsou většinou mrazuvzdorné - odrůdy jsou obvykle bílé nebo modré, moštové - bezsemenné odrůdy se téměř nevyskytují - Cabernet Franc, Gamay, Malbec, Merlot, Semillon, Rulandské modré, Tramín, aj. 2.3 Dělení nativních druhů rév Klasifikace rodu Vitis spp. byla, a je i nyní, stále předmětem sporu systematických botaniků, šlechtitelů révy vinné i praktických zahradníků. Mnoho botaniků používalo pro několik morfologicky naprosto stejných druhů rozdílné názvy, čímž se dospělo k velkému počtu druhů převyšujících skutečný počet. Nicméně i tak jsou neustále zaznamenávány druhy nové, zejména z Číny a Střední Ameriky. Přesné určení skutečného počtu reálných 14

15 druhů má velký význam pro šlechtění révy vinné a tím i pro vinohradnictví samotné. Donedávna sloužil ke klasifikaci příslušného druhu přesný popis různých morfologických částí rostliny - ampelografie. Poslední ucelenou klasifikaci uvádí GALET (2000), jenž podrobně seřadil nejznámější druhy z podrodu Euvitis do 11. sérií, viz. tabulka č.3. Tab.č. 3: Rozdělení botanických druhů podrodu Euvitis dle Galeta (2000) Série Základní morfologické znaky Zastoupené druhy 1. Candicansae Druhy s plstnatým vrcholkem letorostu a tuhými, voskovitými, klínovitými listy 2. Labruscae Plstnatý vrcholek letorostu a velké, tuhé, puchýřnaté, vespod plstnaté klínové listy 3. Caribeae Plstnatý vrcholek letorostu, klínovité či srdčité listy s širokými nebo žádnými zoubky 4. Arizonae Druhy vyskytující se převážně na vých. pobřeží USA, citlivé na houb. choroby 5. Cinereae Druhy s měkkými, žebrovitými letorosty, pozdně dozrávající bobule 6. Aestivalae Silný, tuhý, velmi puchýřnatý, uťatý list se silnou voskovou vrstvou 7. Cordifoliae Druhy s ochmýřenými vrcholy letorostů, uťatým listem s voskovou vrstvou 8. Flexuosae Jde o asijské druhy se srdčitými nebo klínovitými listy či listy složenými 9. Spinosae Čínské druhy s trnovitými či červeně žlaznatými vlásky 10. Ripariae Druhy s klínovitými či ledvinovitými listy a vlnitými vlásky V. candicans, V. doaniana, V. Coriacea, V. Longii, V. Simpsonii, V. Champinii V. labrusca, V. Coignetiae V. caribaea, V. Blancoii, V. lanata V. arizonica, V. californica, V. girdiana, V. Treleasei V. cinerea, V. berlandieri, V. baileyana, V. bourgaeana V. aestivalis, V. Lincecumii, V. bicolor, V. Bourquina, V. rufotomentosa, V. gigas V. cordifolia, V. monticola, V. rubra, V. illex, V. Helleri V. flexuosa, V. amurensis, V. betulifolia, V.balansaeana, V.pentagona, V.Seguinii, V. Piasezkii, V. reticulata, V.Thunbergii, V. Embergeri, V. bryomiaefolia, V.Tsoii, V.chunganensis, V. Hancockii, V. pilosonerva, V. pseudoreticulata, V. hexamera, V. wenchowensis, V. chrysobotrys, V. pedicellata, V. Retordii, V. Silvestrii V. armata, V. Davidii, V. Romanetii V. riparia, V. rupestris 11. Viniferae Jde o druhy euro-asijského původu V. vinifera, V. sylvestris Podrod Muscadinia obsahuje doposud jen tři nativní druhy: V. rotundifolia Michaux (původem jih USA, Mexiko a Guatemala), V. munsoniana Simpson (východní pobřeží USA a Mexiko) a V. popenoi Fennell (Mexiko). Nejvýznamnější z této skupiny je prvně jmenovaný druh V. rotundifolia Mich., který je znám svou dobrou rezistencí k houbovým chorobám (zejména plísni révové), je imunní vůči révokazu, tolerantní k háďátkům (zejména rodu Xiphinema sp.) a bobule mají dobrou chuť a aroma. Nevýhodou je však citlivost k vyššímu obsahu aktivního vápníku v půdě, slabá kořenící schopnost, inkompabilita a tvorba sterilních hybridů s odrůdami V. vinifera L. OLMO v Kalifornii vyselektoval dva křížence mezi druhy V. vinifera x V. rotundifolia, 15

16 s označením VR a VR , které jsou komerčně hojně využívány v procesu šlechtění, jak pro tvorbu nových odrůd odolných proti houbovým chorobám, tak i pro tvorbu podnoží odolných k háďátkům (WALKER, 1994). Reciproké křížení je složité pro velmi špatné opylení blizny V. rotundifolia Michx. pylem druhu nebo odrůdy z podrodu Euvitis. Pylová láčka není schopná prorůst do zárodečného vaku mateřské Obr.č.3: Vitis rotundifolia Michx. rostliny (PATEL a OLMO, 1955). Díky různému počtu chromosomů (n = 13-19) mají vzniklí hybridi nízkou fertilitu pro jejich nedostatek při meiose (XU a LU, 2004). Mezi nejrozsáhlejší naleziště botanických druhů rodu Vitis spp. v oblasti Asie patří bezesporu Čína. Území Číny je rozsáhlé, s rozdílnými geologickými a geografickými podmínkami, dále velkými rozdíly reliéfu krajiny v různých oblastech a značnými rozdíly v podnebí způsobují výskyt velmi rozmanitých druhů rostlin i na relativně malém prostoru. První ucelenější popis divoce rostoucích rév na území Číny uvádí LI a kol. (1996) viz. tabulka č.4. Zdroj dále uvádí, že např. i botanický druh Vitis davidii Foe, má poměrně velké plody a v oblasti Yangzi river je dodnes pěstován jako stolní réva. Tab.č.4: Botanické druhy vyskytující se na území Číny dle Li a kol., 1996 a Liao a kol., 1997 V. amurensis Rupr. V. hancockii Hance V. quinquangularis Rehder V. armata Diels & Gilg V. hekouensis Li V. retordii Roman. du Caill. V. baihuashanensis Kang & Lu V. heyneana Roem. & Schult V. romanetii Roman. du Caill. V. balanseana Planch. V. hui Cheng V. ruyuanensis Li V. bellula Wang V. jingganensis Wang V. shenxiensis Li V. betulifolia Diels & Gilg V. lanceolatifolia Li V. sinocinerea Wang V. bryoniaefolia Bunge V. longquanensis Chiu V. silvestrii Pamp. V. chunganensis Hu V. luochengensis Wang V. tsoii Merr. V. chungii Metcalf V. menhaiensis Li V. wenchouensis Ling V. davidii Foex. V. mengziensis Li V. wilsonii Weitch. V. erythrophylla Wang V. pentagona Diels & Gilg V. wuhanensis Li V. fengqinensis Li V. piasezkii Maxim. V. yuenlingensis Wang V. ficifolia Bunge V. piloso-nervosa Metcalf V. yunnanensis Li V. flexuosa Thunb. V. psedoreticulata Wang V. zhejiang-adstricta Chiu 16

17 V poslední době se stále více objevují zajímavé studie, rozdělující jednotlivé druhy, odrůdy i samotné klony, do ucelených skupin pomocí analýzy DNA (skupiny genetické podobnosti). Tyto nové molekulárně genetické metody (RFLP, RAPD, SSR, AFLP, aj.) mohou usnadnit a zpřesnit systematickou a šlechtitelskou práci, zejména identifikaci odrůd. Obr.č.4: Genetické rozdělení rodu Vitis pomocí RAPD ( Čeleď Rod Podrod Druh Poddruh Odrůdy 17

18 3. Šlechtění révy vinné 3.1 Historie šlechtění révy Při pohledu hluboko do historie narazíme na údaj PLINIA STARŠÍHO o významu žlutého prášku jako zúrodňující látky u datlí a COLUMELU, který již v roce 50. po Kr. psal o potřebě výběru lepšího dřeva při množení rostlin, čímž položil základ pozdějšímu selekčnímu šlechtění. Ke stejným závěrům přišel i MAGNUS o tři sta let později. Podobných postřehů a návodů bylo ve středověku určitě více, ale bohužel upadly v zapomnění. K jejich znovuobjevení a prohloubení docházelo zejména v století. Tak např. zmiňovanou pohlavnost rostlin přesvědčivě prokázal až C. LINNÉ v pol. 18. století (NEČÁSEK a kol., 1979). Se šlechtěním révy vinné se plně začíná již koncem 18. století, zejména v Německu, Rakousko-Uhersku, Francii a Itálii, kdy se šlechtitelé zaměřili na hybridizaci a nutnou selekční činnost pomocí individuálního výběru (J.ENGELBERTH, G.A.FROELICH, W.RASCH, D.BLANKENHORN, H.GOETHE, a další). Zejména zavlečením houbových chorob a révokaze do Evropy, začíná mnoho odborníků z různých vinařských států se šlechtěním metodou mezidruhového křížení (P.Ch.OBERLIN, L.RAVAZ, I.COSMO, C.GRIMALDI, F.BACO, A.SEIBEL, B.SEYVE-VILLARD, C.BÖRNER, aj.). Rozvoj evropského šlechtění se nepochybně odrazil i v našich zemích. Nejvýznamnějšími osobnostmi začátku šlechtění révy u nás byli J. SEDLÁČEK ( ) a CH.C. ANDRÉ ( ). ANDRÉ přišel na Moravu ze Saska a působil zde jako pedagog. V roce 1816 založil v Brně Ovocnický spolek a jeho členům doporučil šlechtit ovocné druhy křížením. Poukazoval na nutnost prověřování dovážených zahraničních odrůd a kritizoval pěstitele, kteří již tehdy upřednostňovali množství úrody před její kvalitou. Později však musel pro liberální názory monarchii opustit, usadil se ve Stuttgartu a stal se členem Knightovy zahradnické společnosti v Londýně. Na jeho počest pojmenovali šlechtitelé z ŠSV ve Velkých Pavlovicích svoji novou modrou moštovou odrůdu názvem André. SEDLÁČEK působil jako ředitel Státních statků v Brně, kde roku 1820 založil velkou sbírku odrůd révy vinné. Jeho zásluhou se realizoval i výsev semen révy, přivezených zejména ze Španělska. Věřil, že nové odrůdy, které vyselektuje, budou již dobře přizpůsobené našemu prostředí. Jeho práci převzal opat starobrněnského kláštera F.C. NAP ( ), který nad klášterem později založil Ústav pro pokusné 18

19 šlechtění révy. Mezi důležitá jména té doby patří i F. SCHWARZMANN ( ??), který ve Bzenci roku 1891 z volného opylení V. riparia Michaux získal podnož Schwarzmann (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998). Propagátorem šlechtění na Slovensku byl P. OLEXÍK ( ). Zabýval se zejména šlechtěním okrasných rostlin a v r uspořádal v Brně velkou výstavu, jejíž součástí byla i kolekce různých odrůd révy vinné. Patřil i mezi blízké přátele J.G. MENDELA ( ). Další významnou osobností byl MATHIÁZS JÁNOS ( ). Narodil se v Mošarove u Prešova. Působil jako písař v Košicích, kde r založil sbírku odrůd révy (území dnešní košické botanické zahrady). Studoval jejich synonyma a snažil se zavést do odrůdové nomenklatury pořádek. Odrůdy dále selektoval a prováděl různá křížení. Jeho nejznámější odrůdou se stala Ezeréves Magyarország emléke (Tisícileté výročí Maďarska). V roce 1890 z obavy před zničením svého šlechtitelského materiálu mšičkou révokazem, prodal veškerý majetek v Košicích a přestěhoval svůj sortiment na imunní písky do Kecskemétu. Stagnace, způsobená první světovou válkou, skončila činností F. FRIMMELA ( ), který praktickou šlechtitelskou práci podložil genetickou teorií. Upozorňoval na nevyhnutelnost, zásady a způsoby udržovacího šlechtění a křížení zaměřoval na zvýšení jakosti, ale i na mezidruhové křížení pro posilnění rezistence odrůd. Pozornost věnoval i genetickým analýzám populací ze samoopylení různých odrůd révy, mutačnímu šlechtění a CH. DARWINEM propagované vegetativní hybridizaci (štěpování). Působil jako vedoucí Výzkumného šlechtitelského ústavu J.G. Mendela v Lednici na Moravě. Po roce 1920 se šlechtění révy přeneslo na šlechtitelské pracoviště do Znojma, jehož ředitelem byl R.A. STUMMER ( ). Po něm vedl šlecht. stanici až do vypuknutí druhé svět. války C. MÍŠA ( ). Z jeho materiálu byla jako první československá odrůda zapsána do registru povolených odrůd bílá moštová odrůda Veritas (r opětovně povolena). Hned po druhé světové válce se na Moravě vybudovala síť šlechtitelských stanic, jejichž cílem byla selekce materiálu, udržovací šlechtění a novošlechtění. Mimo Znojma to byly šlechtitelské stanice v Mutěnicích (zal. r. 1902), Polešovicích (1922), Velkých Pavlovicích (1945) a Perné (1946). Mezi významné osobnosti tohoto období patřil J. BLÁHA ( ), působil v Mutěnicích a Polešovicích, zabýval se studiem odrůd a selekcí révy a v roce 1952 vydal první československou ampelografii. Významným šlechtitelem se v Polešovicích stal V. KŘIVÁNEK (*1927), jeho doménou bylo udržovací šlechtění ušlechtilých i podnožových odrůd révy, klonová selekce, novošlechtění a ozdravování množitelského materiálu. Z jeho rukou vzešly modré 19

20 stolní odrůdy Olšava, Vitra a Pola, bílá moštová odrůda Muškát moravský a podnožová odrůda Amos. Dlouholetým vedoucím ve Velkých Pavlovicích byl J. HORÁK ( ) a za jeho působení zde vznikla vzpomínaná odrůda André. Šlechtitelskou stanici v Perné vedl J. VEVERKA ( ) a jeho zásluhou zde vznikly dvě bílé moštové odrůdy Pálava a Aurelius (MÍŠA a kol., 2005). V Čechách později vznikly další dvě stanice Karlštejn a Velké Žernoseky. Výzkumná stanice vinohradnická a vinařská v Karlštejně se pod vedením T. DOHNALA ( ) a později V. HUBÁČKA ( ) se zabývala udržovacím šlechtěním, selekcí odrůd a tvorbou genofondu. Šlechtitelská stanice ve Velkých Žernosekách se pod vedením F. SVOBODY, V. KRAUSE a L. SVOBODOVÉ mimo jiné zabývala i zvýšením rezistence révy proti mrazu a mutačním šlechtěním. Rezistentnímu šlechtění se V. KRAUS věnoval nadále i po příchodu do Lednice, kde spolu s M. MICHLOVSKÝM dali vzniknout prvním českým mezidruhovým odrůdám Malverina (povolena r. 2001), Laurot (povolena r. 2004), Nativa, Cerason, aj. Z jeho rukou vzešly i dvě modré moštové odrůdy barvířky Neronet a Rubinet a také podnožová réva LE-K 1. V neposlední řadě nelze zapomenout ani na L.GLOSE z Moravské Nové Vsi, jenž je autorem modré moštové odrůdy Cabernet Moravia a L. MICHLOVSKÉHO s F. ZATLOUKALEM z Perné, jenž jsou autory nově uznaných odrůd Agni, Ariana a Lena. Na Slovensku vznikly první šlechtitelské stanice až v letech , a to v Šenkvicích, Opatovské Nové Vsi (Veľký Krtíš) a v Orechovej (Sobranka), jejichž centrem se stal Výzkumný ústav vinohradnický a vinařský v Bratislavě. Mezi významné šlechtitele patří D. POSPÍŠILOVÁ, I. NOVÁK, D. SEKERA, V. BOBEKOVÁ, J. KÉPES, T. RUMAN a O. KORPÁS, který ve Strekove (Rúbaň) vybral z velkého množství kříženců nejvhodnější typy a začal je množit. Z moštových bílých odrůd jsou to především Děvín a Aromína, z modrých moštových Váh, Nitra, Hron, Dunaj a Rubín a ze stolních odrůd Diamant, Dóra, Achát, Ametyst, Opál, Rubanka a Jupiter (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998). I když naše země nepatří mezi vinohradnické a vinařské velmoci (co do kvantity), svojí úrovní a odbornou vyspělostí patří mezi přední vinařské země. Ostatně i historie pěstování révy vinné u nás tuto skutečnost názorně dokumentuje, zejména pak svými výsledky ve dvacátém století. Vinohradnictví a vinařství u nás je nejen neodmyslytelnou součástí zemědělské výroby, ale samy vinice se nezastupitelně začleňují do utváření charakteru krajiny a ochrany životního prostředí. Podstatnou měrou k naplnění těchto 20

21 úkolů se budou podílet i nové odrůdy, které jsou opět výsledkem činorodé, experimentální činnosti člověka šlechtitele. 3.2 Šlechtění na odolnost proti biotickým vlivům Šlechtěním se označuje záměrná tvořivá činnost, kterou člověk zdokonaluje vlastnosti rostlin. Podstatou šlechtění je technické využití genetických zákonitostí a genetické variability znaků s cílem získat nové odrůdy, v poslední době zejména odolné vůči biotickým vlivům. V praxi se tato činnost nazývá novošlechtěním. Nutnost tohoto rezistentního šlechtění souvisí se snahou zabránit nebo snížit poškození rostlin rozvojem chorob. Napadené rostliny vykazují snížený výnos, zhoršenou jakost produktu, sníženou vitalitu a mnohdy i hynou. Odolné odrůdy snižují nutnost používání chemických prostředků a tím přispívají k ochraně prostředí, k snížení narušování biologické rovnováhy (nedochází k ničení užitečné fauny) a především snižují náklady na pořízení drahých chemických prostředků. Rezistentní šlechtění rostlin se začalo více rozvíjet před lety a v současné době je prvořadým úkolem téměř u všech šlechtěných plodin. Šlechtěním často nelze zcela odstranit poškození a často jde jen o snahu omezit poškození chorobou na únosnou míru. Předpokladem úspěchu je spojení rezistence spolu s ostatními znaky na žádoucí úrovni. Podle STACKMANNA (objevitele ras u mnohých chorob) je šlechtění na rezistenci nikdy nekončícím bojem s přírodou. Příroda vytváří stále nové rasy a šlechtitel nové odolnější odrůdy. Choroby jsou živé organismy se stejnou tendencí v proměnlivosti jako rostliny (GRAMAN a ČURN, 1997) Rezistentní šlechtění Záměrné šlechtění rostlin začalo přibližně koncem 18. a začátkem 19. století cíleným výběrem semen či rostlin a záměrnou hybridizací vybraných rodičovských odrůd. Ve 20. století se začíná již s moderním pojetím šlechtění na základě kombinačního a zpětného křížení, mutačního křížení, vzdálené hybridizace a polyploidního šlechtění, atd. Současně se dále zdokonalují i samotné selekční postupy, využívají se nové poznatky zejména z oblasti genetiky, fyziologie, fytopatologie, biometriky (včetně uplatnění 21

22 moderní výpočetní techniky), zdokonalené laboratorní postupy při testování, s využíváním světových genofondů. Rezistentní šlechtění jako takové začalo až v první polovině 19. století. Významně k tomu přispěla epidemie plísně bramborové (Phytophthora infectans /Montagne/ de Bary) v Irsku a také rozšíření mšičky révokaze (Viteus vitifolii Fitch.) ve Francii. K většímu rozvoji tohoto šlechtění přispěly znalosti zejména rozvíjejícího se oboru mykologie a používání umělých infekcí při testování. Velký význam mělo i studium genetických vztahů parazita (patogena) a hostitele. V padesátých letech 20. století dochází ke spojení genetiky rezistence a virulence, došlo k vyslovení teoretických základů šlechtění gen proti genu, vycházející ze vztahů hostitel patogen. Tím byl položen základ pro šlechtění na odolnost křížením, tj. kombinacemi genů odolnosti. Šedesátá léta minulého století jsou ve znamení rozvoje teoretických základů. Zavedly se pojmy jako vertikální a horizontální rezistence, atd. V sedmdesátých letech nastal rozvoj studia genových interakcí, využívání mutací, aneuploidních linií apod. ve šlechtění na odolnost u mnoha druhů. V osmdesátých a devadesátých letech min. století se začínají více a více, vedle klasických šlechtitelských metod a postupů, uplatňovat metody molekulární genetiky, zejména v rezistentním šlechtění Proces rezistentního šlechtění a charakteristika základních pojmů Značné škody na pěstovaných rostlinách způsobují zejména parazitující viry, mykoplasmózy, bakterie a houby. Ochranné chemické prostředky jsou značně nákladné a někdy málo či dokonce neúčinné. Šlechtění samo není lacinou záležitostí a je často ztěžováno nedostupností genetických zdrojů, krátkou trvanlivostí či nízkou úrovní rezistence. Proces rezistentního šlechtění je poměrně složitý a musí vždy vycházet ze vzájemných vztahů hostitel-patogen-prostředí; dále charakteru dědičné proměnlivosti a vývoje hostitele (rostliny) i patogena a specifických vlivů prostředí. Tyto vzájemné vztahy vykazují značnou šíři, od různých symbióz až k totální destrukci. Podmínky prostředí mění stupeň náchylnosti (odolnosti) k patogenu, a ta se mění i během ontogeneze hostitele. Proměnlivost biotických složek spočívá v existenci druhů, 22

23 variet, ras, kmenů, biotypů, a také ve vzniku mnoha mutací, fyziologicky specializovaných ras apod., s různou agresivitou a virulencí (KŮDELA, 1989). Mezi hlavní předpoklady efektivního rezistentního šlechtění podle GRAMANA a ČURNA (1997) patří: - znalost biologie a bionomie patogena, včetně rasového spektra a možnosti zjištění rasové příslušnosti (např. pomocí testovacích rostlin) - znalost mechanismu rezistence, včetně typu odolnosti a genetického založení rezistence (často neznáme) - projev odolnosti (tolerance) či náchylnosti - existence genových zdrojů rezistence a možnost jejich využití - znalost techniky inokulací, umělých infekcí, v polních i skleníkových podmínkách, znalost optimálních podmínek pro rozvoj choroby i způsobů hodnocení stupně odolnosti (náchylnosti). Ze specifičnosti vztahů mezi hostitelem a patogenem byly vyvozeny základní termíny a klasifikace. Specifičností vztahů rozumíme skutečnost, že každý patogen má omezený okruh hostitelů (rodů, druhů, odrůd), který může napadat. U mnohých patogenů je známá specializace ve formě ras (kmenů) se specifickou schopností napadat jen některé odrůdy. Odolnost - je dědičně založená schopnost hostitelské rostliny (odrůdy) odolávat napadení patogena nebo zpomalovat jeho vývoj. Projev napadení závisí na interakci systému hostitele a patogena, a na podmínkách vnějšího prostředí (vliv teploty, vlhkosti, výživy, aj.). Napadení se posuzuje podle vnějšího stavu rostliny čili podle symptomů choroby na rostlině. Opakem odolnosti je náchylnost. Tolerance - je schopnost rostlin (odrůdy) snášet napadení patogenem aniž by došlo k výraznému snížení výnosu nebo zhoršení jakosti. Rostlina (porost) přitom vykazuje jisté symptomy napadení patogenem. Rezistence - je nejvyšším stupněm odolnosti. Opakem rezistence je senzitivita (citlivost). Vertikální rezistence - je rasově specifická, geneticky oligogenně založena, často se projevuje přecitlivělostí (hypersensitivitou) i imunitou, je méně vytrvalá a snadno bývá překonána jinou rasou. Dědičnost oligogenní znamená, že je založena jedním nebo několika málo major geny s dominantním, recesivním a neúplně dominantním 23

24 projevem s malou závislostí na prostředí. Oligogenně založená rezistence se ve štěpících generacích chová podle platných zákonů dědičnosti a to v závislosti na počtu genů a jejich projevu. Projev rezistence má většinou kvalitativní charakter (buď je nebo není napadena), který je snadno stanovitelný. Šlechtění na odolnost tohoto typu je relativně snazší, neboť vychází z hypotézy gen odolnosti proti genu patogenity. Horizontální rezistence - je rasově nespecifická, polygenně založená (s účinkem mnoha minor genů a s intermediálním projevem dědičnosti v generaci po křížení) a silně ovlivněna podmínkami prostředí. Projevuje se sníženým rozsahem napadení, zpomaleným průběhem infekce (epidemie) a redukcí množství patogena. Je trvalejší, dlouhodobější, avšak šlechtění je dost obtížné a náročné. Projev rezistence má spíše kvantitativní charakter (viz. obrázek č.4). Zdánlivá rezistence (nepravá, pseudorezistence) - je podmíněna např. raností odrůdy na základě časové disharmonie vývinu rostlin s vývojem patogena nebo morfologickými či fyziologickými zvláštnostmi (síla kutikuly, tvar epidermis, kleistogamické kvetení, aj.), přitom rostlina není odolná, ale nedojde k napadení nebo je napadena poněkud později. Polní rezistence - se vztahuje k interakci hostitele a patogena v průběhu celé vegetace v daném agroekosystému. Indukovaná rezistence - bývá vyvolána slabou primární infekcí. Obr. č.5.: Schéma účinku vertikální a horizontální rezistence na rozvoj patogena (GRAMAN a ČURN, 1997). 24

25 3.2.3 Šlechtění révy vinné na odolnost proti houbovým chorobám Jak již bylo řečeno, začátky šlechtění révy vinné na rezistenci k houbovým chorobám a škůdcům spadají do poloviny 19. století. V této době vznikají v Americe první hybridy amerických druhů a V. vinifera L., jako byly odrůdy Clinton, Noah, Isabella Delaware, aj. Další vlna rezistentního šlechtění začíná koncem 19. stol. a začátkem 20. století ve Francii. První hybridizací vznikaly tzv. ameriko-amerikáni (kříženci čistě amerických rév Vitis solonis, Vitis longii + dnešní standardní podnože 5 BB, 125 AA, 5C, CR 2, SO 4 ) a franko-amerikáni (kříženci evropské révy s americkou - jako i dnešní podnože Amos, LE-K1, G26 ), ale vznikaly i moštové a stolní kultivary tzv. staré francouzské přímoplodé hybridy, jejichž šlechtiteli jsou: A. SEIBEL, G. COUDERC, P.A. MILLARDET, P.CH. OBERLIN, F. BACO, atd. (HENDRICK, 1908; ZWEIGELT a STUMMER, 1929; DOHNAL a kol., 1975; BOUBALS, 1998). Ve 20. letech 20. století začíná se šlechtěním i B. SEYVE VILLARD, jehož kříženci se nyní při šlechtění nejvíce používají. Velmi dobrou odolnost proti plísni révové má jeho hybrid Villard Blanc (SV 12375) a z něj vzniklé další hybridy, které dále tuto vlastnost předávají do dalšího potomstva (CYPKO, 1982). V současné době je základním směrem ve šlechtění získání kvalitních odrůd se skupinovou odolností k mrazu, révokazu a základním chorobám révy vinné (plíseň révová, plíseň šedá a padlí révové). Ve většině případů jde o složité mezidruhové hybridy, tzv. interspecifické odrůdy. Interspecifické odrůdy révy vinné jsou odrůdy, které vznikly křížením druhu Vitis vinifera L. evropské révy s dalšími Vitis spp. americkými nebo asijskými druhy (BECKER, 1989). Nově vzniklí jedinci by měli mít zvýšenou odolnost zejména k houbovým chorobám a mšičce révokazu, popř. háďátkům či mrazu. Stupeň rezistence nebo naopak náchylnosti k houbovým chorobám je u interspecifických odrůd rozdílný podle klimatických podmínek stanoviště, ročního průběhu počasí, pěstitelského tvaru a ošetřování vinice. Šlechtitelé dávají přednost před výrazem rezistence, více termínu tolerance, protože tím dochází k vysvětlení, že se jedná o ohraničenou odolnost, která je ovlivňována pěstitelskými a klimatickými podmínkami na stanovišti. Čím více se blížíme dosažení vyšší odolnosti, tím více roste také nebezpečí prolomení této odolnosti škodlivými 25

26 organismy. Pro vysokou a trvalou rezistenci má vliv vícekrát geneticky zakotvená polní rezistence. V dnešní době již tedy existují odrůdy, které mají v normálních podmínkách dostatečnou toleranci proti plísni révové, plísni šedé a padlí révovému (tzv. komplexní hybrid) a nemusí se tudíž chemicky ošetřovat. Pokud jde o stupeň existujících odrůdových rozdílů, přichází zde ke slovu zejména vliv podnebí a počasí (ALLEWELDT, 1984). Tyto interspecifické odrůdy jsou navíc vysoce ekologické, neboť díky svým vlastnostem chrání životní prostředí. Ve vinohradnictví jsou to minerální hnojiva a ještě více prostředky ochrany rostlin, které ve velké míře znečišťují životní prostředí. Prostředky ochrany rostlin jsou stále dražší, zvyšují cenu produkce a škodí mnoha živočichům, mimo jiné také lidem. Tyto okolnosti vyžadují tedy odrůdy, které potřebují pouze max. 2-3 chemická ošetření, a tak použití chemických přípravků na ochranu rostlin snižují na minimum. Hlavním cílem šlechtění révy vinné je tedy kombinace rezistence k houbovým chorobám, se zachováním vysoké kvality plodů. Jde o komplexní vlastnosti, řídící se většinou mnoha dědičnými faktory. Díky polygenní rezistenci zůstává vybraná odrůda velmi dlouho rezistentní, ale na druhou stranu vyžaduje velmi vysoké náklady na šlechtění. Evropská kulturní réva je zejména proti plísni révové a mšičce révokazu vysoce náchylná. Buď nevlastní žádné genetické rezistentní vlastnosti, nebo by se dalo říci, že jsou tak slabé, že se ve středoevropských klimatických podmínkách neprojevují. Tyto vlastnosti proto přináší americké druhy v mezidruhových kříženích. Tyto divoké botanické druhy byly během svého miliony let trvajícího vývoje konfrontovány s patogeny, takže si během své evoluce vytvořily rezistentní vlastnosti (z asijských druhů se pro zvýšení odolnosti k mrazu využívá druh Vitis amurensis Rupr.). Druhy, které nebyly dlouhodobě těmto tlakům vystaveny, pochopitelně tyto vlastnosti nemají (SOTOLÁŘ, 2002). V poslední době se této problematice dostává stálé pozornosti, díky čemuž vznikly a dále vznikají nové odrůdy s dobrou hospodářskou použitelností a kvalitou hroznů, vhodné i do horších klimatických podmínek. Mezi největší evropské státy, které se zabývají šlechtěním interspecifických moštových odrůd patří zejména Německo. Známé jsou odrůdy Orion, Sirius, Staufer, Phoenix a Pollux (Geilweilerhof); Hibernal, Prinzipal, Saphira a Rondo (Geisenheim); či Merzling, Johanniter a Bronner (Freiburg). Dále Maďarsko s odrůdami Bianca, Göcsei zamatos, Kunbarat, Kunleány, Medina, Senior, Vértes csillaga, Zala gyöngye, aj.; Moldávie - Festivalnyj, Flakera, Demetra, Cvětočnyj, Riton, Univers, aj.; Ukrajina - 26

27 Golubok, Oděskij ustojčivyj, Rubin tajrovskij, aj.; Jugoslávie - Liza, Petra, Zlata, aj.; a Rakousko - Roesler, Rathay, Seifert, aj. I Česká republika nikterak nezaostává a patří mezi tyto státy. Naší nejznámější a první uznanou interspecifickou odrůdou je Malverina vyšlechtěná M. Michlovským. Z dalších odrůd jsou to např.: Hibia, Nativa, Laurot, Cerason a Erilon. Tab.č. 5: Šlechtitelské cíle Vysoká kvalita vína a stolních hroznů Zlepšení - chuti - barvy - charakteru dužniny - pevnosti slupky - velikosti hroznu - velikosti bobule - bezsemennost OBECNÉ CÍLE PŘI ŠLECHTĚNÍ RÉVY VINNÉ Odolnost k abiotickým vlivům - zimní mrazy - jarní mrazy - sucho - chlorózy Odolnost k biotickým vlivům (chorobám a škůdcům) Houbové choroby - plíseň révová - padlí révové - plíseň šedá Živočišní škůdci - mšička révokaz - háďátka Bakteriální choroby Virové choroby Vzdálená hybridizace a genetické manipulace Nové metody a postupy ve šlechtění rostlin umožňují i křížení dříve nemožná nebo velmi obtížně proveditelná. Jde o tzv. vzdálenou hybridizaci a genetické manipulace (GM rostliny = transgenní rostliny) Vzdálená hybridizace Vzdálená hybridizace využívá genové bohatství rozličných druhů (rodů) pro zvýšení užitečnosti kulturních rostlin přenosem prakticky významných znaků a vlastností (odolnost k chorobám, mrazuvzdornost, atd.). Stává se tak i evolučním faktorem, vedoucím ke vzniku zcela nových forem (druhů) spontánní i umělou cestou (GRAMAN a ČURN, 1997). Podle typů použitých rodičovských komponent lze dělit vzdálenou hybridizaci na mezidruhovou (interspecifickou) a mezirodovou (intergenerickou). Mezi hlavní obtíže vzdáleného křížení patří špatná křížitelnost a sterilita hybridů. Metod k překonání prezygotických (cytologické, morfologické a anatomické rozdíly) i 27

28 postzygotických (narušení vývinu embria a endospermu vedoucí k somatoplastické sterilitě) překážek je mnoho a vycházejí z odstranění jejich příčin. Např. pro klíčení pylové láčky a k oplození se využívá dekapitace blizny, potření blizny cukerným roztokem, opylování jen starších blizen, opylování směsí pylu více odrůd, aj. Různá ploidita komponent se řeší haploidizací či polyploidizací (JACKSON a kol., 2000). Inkompatibilita fyziologická i genetická se odstraňuje pomocí genetického mostu (metoda prostředníka), k novějším metodám patří včasná extirpace a dopěstování zárodku na živném médiu v podmínkách in vitro. Barieru pohlavní inkompatibility lze obejít i somatickou hybridizací (při mutačním šlechtění), kdy dochází k splynutí protoplastů různého původu (GRAMAN a ČURN, 1997). Potomstvo vzdálených hybridů se vyznačuje větší genetickou proměnlivostí a u mnoha znaků se vyskytuje heterose (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998) Transgenní rostliny Proces vzniku nových odrůd křížením pomocí vzdálené hybridizace je pracný a značně zdlouhavý. I proto vznikají nové odrůdy, či spíše starovové odrůdy, pomocí transgrese genů, a to nejenom genů z rostlin rodu Vitis spp. Jde o to, lokalizovat gen nebo sekvenci genů odpovědných za rezistenci, mrazuvzdornost, tvorbu antokyanů aj. v jedné rostlině a přenést jej do rostliny druhé, tento gen postrádající (VIVIER, 2005). Metody transformace rostlin obecně dělíme na přímé a nepřímé. Mezi nepřímé metody patří: Transformace vpichem (jde o počáteční metodu transformace rostlin, principem je vpich bakteriální suspenze do různých částí rostlin a tvorba tumorů, oddělení tumorů a samostatná kultivace in vitro, dochází k autonomii k růstovým látkám) Disková metoda transformace (byla vypracována pro listové disky, dnes se používá v mnoha modifikacích, zajišťuje kombinaci vysoké transformační frekvence se snadnou a rychlou selekcí regenerovaných transformantů, HORSCH a kol., 1985) Transformace semen (metoda je zatím použitelná pouze u rodu Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., získáme velký počet transgenních rostlin v nesterilních podmínkách, není nutná eliminace baktérií pomocí antibiotik, nedochází k tvorbě kalusu, je vyloučena somaklonální variabilita, FELDMANN a MARKS, 1987) 28

29 Infiltrace (transformace probíhá přes infiltrační médium, ve dvou litrech infiltračního média je možné infiltrovat až 500 rostlin, BECHTOLD a kol., 2000) Transformace protoplastů (dnes se již nepoužívá, je pracná, nutnost delší regenerace buněčných stěn, tumory získané po transformaci protoplastů jsou homogenní, MARTON a kol., 1979). Mezi přímé metody řadíme (přenos genů bez použití Agobacteria): Polyetylenglykol PEG (metoda umožňuje přenos již libovolných úseků DNA, RUMLOVÁ a kol., 2003) Elektroporace (využívá se stenosměrný proud ke vzniku reversibilních pórů v membráně protoplastu, ALBERTS a kol., 2002) Mikroprojektily (provádí se vstřelováním mikroprojektilů - kuličky z inertních kovů (zlato, wolfram) o průměru okolo 1 μm obalené DNA, REGENASS-KLOTZ, 2005) Lipozómy (proces je uskutečňován pomocí mikroskopické lipidové kapénky s roztokem DNA, struktura lipozómů je podobná struktuře střední lamely plasmalemy, což usnadňuje přenos do buňky) Mikroinjekce (provádí se pomocí mikromanipulátoru, DNA se vnáší přímo do jádra buňky, tím se snižuje nepříznivý vliv nukleáz a zabraňuje se výskytu zlomů, KNOBLAUCH a kol., 1999). Přenos genetické informace a samotný vznik transgenních rostlin byl zprvu umožněn pomocí bakterií rodu Agrobacterium sp., konkrétně A. tumefaciens Smith & Townsend nebo A. rhizogenes Conn., dnes se více využívají tzv.biolistické metody (ostřelování částicemi), mikroinjekce DNA a nově indukovaný laser. Agrobacterium tumefaciens (syn. Rhizobacterium tumefaciens) je druh gramnegativní bakterie, která infikuje dvouděložné rostliny a vytváří nádory v rostlinných pletivech. Princip vzniku nádoru je založen na průniku části DNA bakterie - Ti-plazmidu (tzv. T-DNA) do rostlinné buňky a její polonáhodné začlenění do genomu rostliny. Inkorporovaná část bakteriální DNA obsahuje sadu genů, z nichž nejdůležitější jsou geny pro produkci rostlinných hormonů, které vedou k vytvoření nádoru, a geny pro produkci opinů - zvláštního typu aminokyselin, který slouží metabolismu 29

30 agrobakterií jako energetický zdroj. Agrobacterium tumefaciens sice patří do čeledi Rhizobiaceae stejně jako dusík fixující hlízkové baktérie, které žijí s rostlinami v mutualismu, ale narozdíl od nich je čistým parazitem, který rostlinu vyčerpává a nepřináší jí žádný profit. Bakterie se pro své vlastnosti začalo brzy využívat v genetickém inženýrství. Jako první byl kompletně zmapován (osekvenován) genom kmenu A. tumefaciens C58. Genom tohoto kmene obsahuje cirkulární chromozóm, 2 plazmidy a lineární chromozóm. Přítomnost kovalentně vázaného cirkulárního chromozómu je až na velmi vzácné výjimky společná všem bakteriím, ale dva velice specifické plasmidy a lineární chromozóm jsou specialitou rodu Agrobacterium. Plazmidy se označují jako ptic58 a patc58. Plazmid ptic58 obsahuje geny zodpovědné za procesy související s virulencí bakterie (tzv. vir geny). Bez jeho přítomnosti nedochází k infekci a vytváření nádorů, patc58 obsahuje část, která se přenáší do infikované buňky (tzv. T-DNA). Ta obsahuje geny související se syntézou rostliných hormonů a geny pro syntézu opinů. V případě, že se ocitne v bakterii, která neobsahuje ptic58, při konjugaci ji opouští. Schopnost A. tumefaciens přenášet své geny do rostlinných buněk je bohatě využívána v rostlinných biotechnologiích k cílenému zanášení konkrétních genů do rostlinného genomu a vytváření tzv. transgenních rostlin. Plazmid T-DNA, který je přenášen do rostliny je ideální nástroj pro genové inženýrství, které dokáže včlenit do tohoto plazmidu vybrané geny, obvykle gen(y) pro novou žádanou vlastnost(i) plus gen, který by přispěl k identifikaci úspěšně infikovaných buněk, respektive rostlinek. Za velice výhodný je považován fakt, že bakterie jsou organismy haploidní, které se množí nepohlavně - díky čemuž je upravený vektor stabilní - změny na něm provedené nemohou vzniknout jinak než mutací. A. tumefaciens je dnes taktéž objektem lékařského výzkumu, neboť způsob, jakým vnáší svůj materiál do hostitelských buněk je v mnoha ohledech podobný procesům a postupům, které využívají patogeny při inzerci svého materiálu do lidských buněk (VAN DEN EEDE a kol, 2004). Je také zajímavé, že A. tumefaciens není jediný organismus, který způsobuje nádory v rostlinných pletivech. Podobný cíl sledují s podobným výsledkem i některé druhy hmyzu (respektive jeho larvy), který si tak vytváří vhodné prostředí pro vývoj larválních stádií. 30

31 Dnes díky osekvenovaným (známým) částem DNA různých rostlin můžeme již do jiných rostlin vpravit konkrétní gen, kodující žádanou vlastnost. Např. YAMAMOTO a kol. (2000) získal transgenní muškátovou révu (V. vinifera cv. NeoMuscut ) odolnou proti padlí révovému (Erysiphe /Uncinula/ necator Schwein) a částečně i proti antragnóze (Elisinoe ampelina Shear), přenesením genu RCC2 z chitinásy rýže (JAYASANKAR, 2003; YAMAMOTO a kol., 2005). PAUQUET a kol. (1999) získal také révu rezistentní proti padlí pomocí genu RUN1, získaného z V. rotundifolia Michx. Tuto révu dále křížili s odrůdou Cabernet Sauvignon a nyní sledují projev genu a jeho přesnou lokalizaci u získaného potomstva. GÖLLES a kol. (2000), získal révu rezistentní k virům Arabis mosaic virus, Grapevine fanleaf virus, Grapevine virus A a B, vpravením konstruktu chimérického proteinu do rostliny získaného právě z těchto virů, výsledkem je odpuzující reakce bránící napadení těmito viry. Dále již máme lokalizovány geny pro změnu barvy bobulí (ufgt a dfr geny), proti hnědnutí bobulí (ppo gen), proti sprchávání (sh4 gen), geny zvyšující cukernatost (inv gen) a mrazuvzdornost (gen gfp), atd. Gen mrazuodolnosti gfp byl však získán z mořské ryby druhu Aequorea victoria Murbach a Shearer a nyní je snaha získat jej minimálně z některého rostlinného druhu, nejlépe čeledi Vitaceae, konkr. V. amurensis Rupr. (BOUQUET a kol., 2003; KOLEKTIV CSIRO, 2005). Je tedy zřejmé, že s cílem získat nové odolnější odrůdy se vedle klasického šlechtění budou stále více a více uplatňovat i metody genových manipulací. Otázkou však zůstává použití těchto odrůd v praxi, a to jak po stránce právní, tak i etické. 31

32 4. Genové zdroje rodu Vitis spp., způsoby jejich uchovávání, identifikace a využití 4.1 Genové zdroje rodu Vitis spp. Na úvod této kapitoly, která je nezbytnou součástí kvalitního a úspěšného šlechtění nejen u révy vinné, ale i ostatních kulturních rostlin, je třeba vysvětlit některé základní pojmy z pohledu genetiky (BEŽO a BEŽOVÁ, 1998): Genové zdroje rostlin znamenají genetickou jednotku rostlinného druhu, která je schopná zabezpečit tvorbu jedné nebo několika vlastností druhu ve svém genomu (semeno, plod, vegetativní rozmnožovací orgán, meristémová kultura, embryo kultura a celistvá rostlina). Genové sbírky znamenají hledání, sběr, hodnocení a uchovávání genetických jednotek rostlin, schopných zabezpečit vlastnosti druhu. Biodiversita je úroveň celkové nebo místní biologické rozmanitosti, často zjednodušeně kvantifikovaná jako počet druhů nebo vyšších taxonů na Zemi. Zvyšování počtu druhů je považováno za znamení vyšší genetické pestrosti. Při šlechtění rostlin je velmi důležitá znalost a pravost každé rostliny, poznání její fyziologie a hlavních kvalitativních vlastností: K získání znalostí o dané rostlině, musí šlechtitel vnímat svůj objekt v historickém i geografickém vývoji a najít rozdíly u nejvíce důležitých vlastností v interakci s okolním prostředím. VAVILOV, Základem genetických výzkumů genových zdrojů je založení sbírek rostlinných druhů, identifikace genotypových rozdílů mezi druhy a odrůdami, a v neposlední řadě podrobný genetický výzkum k zjištění počtu a lokalizaci vhodných alel pro šlechtění (MEREZHKO, 1984). Česká kolekce genových zdrojů rév je soustředěna na třech výzkumných pracovištích: Výzkumná stanice vinařská Karlštejn, Šlechtitelská stanice vinařská Ampelos a.s. ve Znojmě a Zahradnická fakulta MZLU v Lednici. Koordinátorem kolekce genových zdrojů je Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha-Ruzyně. V celé kolekci ČR je soustředěno přibližně 700 různých botanických druhů a odrůd. Tyto kolekce jsou součástí mezinárodního programu GENREZ CT 96 No 81, zaměřeným na udržování a hodnocení genových zdrojů (HUBÁČKOVÁ, 2001). 32

33 Uchovávání genových zdrojů révy se nejčastěji děje pomocí polních sbírek nebo-li polních kolekcích. Každý genotyp (druh, odrůda, klon) je zastoupen 15 keři. Založení a ošetřování těchto sbírek je však velmi nákladné, nemluvě o negativním působení vlivů vnějšího prostředí (mráz, choroby, škůdci..). Konzervace pomocí semenných bank není vhodná, protože pro vysokou heterozygotnost, dochází k rozbití kombinace požadovaných genů a ztrátu odrůdových morfologických a kvalitativních vlastností (TORREGROSA a kol., 2001). Další možností úchovy genových zdrojů je pomocí explantátů tzv. in vitro kultury se sníženou rychlostí růstu, ovšem i zde číhají rizika zejména v podobě složení kultivačního média a ovlivnění morfogeneze (GALZY, 1985; GALZY a kol., 1990). PLESSIS a kol. (1991) uvádí zatím poslední možnost úchovy gen. zdrojů a tou je kryoprezervace axilárních pupenů zmrazením v kapalném dusíku. 4.2 Identifikace genových zdrojů Správná identifikace druhu a odrůdy, popř. klonu je nezbytně nutná z hlediska taxonomie (vznik synonym), sbírek genových zdrojů (duplicita vzorků) i samotné vinohradnické a vinařské legislativy. Charakteristické znaky různých druhů a odrůd se mohou rozdělit do následujících skupin (DETTWEILER, 1987) Morfologické znaky letorost, výhon, list, květ, hrozen, bobule, semeno,aj. Fenologické znaky rašení, kvetení, vyzrávání bobulí, aj. Fyziologické znaky výnos hroznů, cukernatost, mrazuvzdornost, aj. Biochemické znaky antokyaniny, enzymy, aromatické látky, aj. Znaky odolnosti proti chorobám a škůdcům Již klasickou metodou pro identifikaci odrůd révy je ampelografie (ampelos vinný keř, graphie popis), založenou na morfologickém popisu rostliny. Skládá se z bodového popisu jednotlivých rostlinných orgánů a znaků. Její součástí se dnes stala i ampelometrie, skládající se z výzkumu listů pomocí kvantitativně měřených a úhlových metod a uvologie zabývající se popisem měřitelných znaků u bobulí a hroznů. Pro správné ampelometrické určení daného jedince se využívá např.: 33

34 - vrchol mladého letorostu (holý či plstnatý; uzavřený, polootevřený, otevřený), - letorost (délka internodií), - výhon (barva réví, lenticely, kůra), - plně vyvinutý list (velikost, tvar, počet laloků, textura, zoubky na okraji čepele, řapík), - úponky (krátké či dlouhé; větvené, nevětvené), - hrozen (tvar; šířka a délka; hustota), - bobule (tvar; šířka a délka; barva; pevnost slupky; konzistence dužniny), - semena (tvar, velikost, počet), atd. Komplex všech těchto znaků tvoří tzv. klasifikátor. V současné době provádí UKZÚZ při registraci nových odrůd révy i ampelografické analýzy (DUS testy) podle mezinárodního klasifikátoru pro révu vinnou CPVO-T5/50/ Genetické zdroje rezistence a jejich šlechtitelské zhodnocení Za nejčastější zdroje (donory) rezistence proti biotickým vlivům (zejména mšička révokaz, padlí révové a plíseň révová) se dříve používaly americké botanické druhy a první kříženci mezi nimi a V. viniferou L. Je to dáno tím, že právě americké druhy révy byli během svého vývoje nejvíce konfrontovány s houbovými chorobami, které většinou pochází právě ze Severní Ameriky. Nejpoužívanějšími druhy byly: V. aestivalis Michx.(1803), V. labrusca L.(1753), V. lincecumi Buck.(1861), V. riparia Michx.(1803), V. rupestris Scheele (1848) a V. berlandieri Planch.(1880). Obr.6-7: Botanické druhy rév V. riparia Michx. a V. aestivalis Michx. 34

35 Druhy rostoucí v severních oblastech Ameriky jsou cenné navíc i svou dobrou mrazuvzdorností: V. aestivalis Michx., V. labrusca L., V. cinerea Engl., V. riparia Michx., V. cordifolia Michx., V. rupestris Scheele; ale také i asijské druhy jako V. amurensis Rupr. a V. yenshanensis Shen. Vysokou rezistenci proti houbovým chorobám, zejména proti padlí a plísním mají druhy jižnější: V. berlandieri Planch., V. monticola Buckl., V. candicans Engel., V. rupestris Scheele, V. rotundifolia Michx., V. aestivalis Michx., V. palmata (Vahl.)Baker, a V. labrusca L. Proti červené spále např.: V. cinerea Engl., V. rupestris Scheele, V. palmata, V. cordifolia Michx., V. longii Prince, V. riparia Michx., atd. (DOKUPIL, 1989). Nejvíce šlechtitelsky hodnotné jsou druhy s vyšší odolností k houbovým chorobám a navíc disponující i tzv. komplexní odolností vůči jiným biotickým a abiotickým činitelům. To znamená, že tyto druhy mají vždy více kladných vlastností. Názornější přehled o vlastnostech některých druhů rév ukazuje tabulka č. 6. Tab.č. 6: Vlastnosti některých druhů Vitis spp. z hlediska využití zdrojů odolnosti proti chorobám, škůdcům a nepříznivým činitelům prostředí (sestaveno podle He a Wang, 1986; Becker a Soop, 1990; Li a kol., 1996; Moore a Ballington, 1990; Zhang a kol, 1990 a WALKER, 1994). Škodlivý a stresový činitel Plíseň révová (Plasmopara viticola) Padlí révové (Uncinula necator) Plíseň šedá (Botrytinia fuckeliana) Červená spála (Pseudopeziza tracheiphyla) Kořenová háďátka druhu Meloidogyne spp. Háďátka druhu Xiphinema spp. Mšička révokaz (Dactulosphaira vitifoliae) Bakteriální nádorovitost (Agrobacterium vitis) Roncet révy vinné (Grapevine fanleaf virus) Vyšší obsah volného Ca v půdě Zasolení půd Sucho Zimní mrazy Vitis spp. vhodné jako zdroje rezistence V. riparia, V. rupestris, V. lincecumii, V. rotundifolia, V. flexuoza, V. yenshanensis, V. psedoreticulata, V. piasezkii, V. romanetii, V. bryonifolia V. aestivalis, V. cinerea, V. riparia, V. berlandieri, V. rotundifolia, V. candicans, V. monticola, V. labrusca V. riparia, V. rupestris, V. amurensis, V. vinifera V. vinifera, V. cinerea, V. riparia, V. rupestris, V. chantinii, V. palmata, V. chantinii, V. candicans, V. rotundifolia V. rotundifolia, V.cinerea, V. rufotomentosa V. riparia, V. rupestris, V. berlandieri, V. cinerea, V. chantinii, V. rotundifolia V. amurensis, V. labrusca V. rotundifolia, V. arizonica, V. rufotomentosa, V. candicans, V. riparia V. chantinii, V. candicans, V. berlandieri, V. monticola, V. cinerea V. berlandieri, V. chantinii, V. acerifolia V. vinifera, V. rupestris, V. chantinii, V. berlandieri V. amurensis, V. riparia, V. vulpina, V. labrusca, V. acerifolia, V. yenshanensis, V. adstricta, V. aestivalis, V. cordifolia, V. rupestris 35

36 V současném šlechtění proti houbovým chorobám se již převážně nepoužívají klasické původní (nativní) druhy rév, ale využívá se širokého počtu mezidruhových kříženců vycházejících zejména z francouzských přímoplodících hybridů. První takové hybridy vznikaly křížením amerických hybridů s evropskými odrůdami. První americké hybridy přivezl do Evropy (konkr. Francie) PLANCHON v roce 1873, jednalo se o odrůdy: Clinton, Noah, Taylor, Viala, York Madeira, Jacquez, aj. Křížením těchto hybridů s evropskými odrůdami vznikaly první přímoplodící hybridy (ZWEIGELT a STUMMER, 1929). Mezi dodnes nejpoužívanější donory rezistence můžeme řadit křížence Seibela a Seyve-Villarda (viz. tab.č.7). Tyto elity se vyznačují vysokou všeobecnou i specifickou kombinační schopností, dávají poměrně větší počet rezistentních a přitom i poměrně kvalitních semenáčků (Cypko, 1982). Tabulka č.7: Nejpoužívanější kříženci Seibela a Seyve-Villarda jako zdroje rezistence proti houbovým chorobám (sestaveno podle Zweigelt a Stummer, 1929). Nejpoužívanější hybridi Seibela a Seyve-Villarda Název hybrida Křížení Aurore ( S ) S 788 x S 29 Cascade ( S ) S x S Gloire de Seibel ( S ) S 867 x S 452 Seibel Albert Chancellor ( S ) S x S 880 Plantet ( S ) S 867 x S Rayon d Or ( S ) S 405 x S Rougeon ( S ) S 880 x S Subereux ( S ) S x S Seibel S x S Seibel S x S Dattier de Saint-Vallier ( SV ) Panse x SV Garonnet ( SV ) S x S Muscat de Saint-Vallier ( SV ) SV x Panse Perle noire ( SV ) Panse précoce x SV Seyve-Villard Bertille Pierelle ( SV ) Panse x SV Roucaneuf ( SV ) S x S Seyval ( SV ) S x S Valerien ( SV )? Varousset ( SV ) S x S Villard blanc ( SV ) S x S Villard noir ( SV ) S x SV Seyve Villard 172 S x BS 450 Zpětným křížením s kvalitními evropskými odrůdami dochází ke zvýšenému zastoupení druhu V. vinifera (55-65%), čímž se podstatně zvyšuje kvalita, ale bohužel dochází také ke snížení počtu rezistentních semenáčků v dané kombinaci. Geneticky 36

37 kontrolované rekombinace mezidruhových kříženců vedou k tomu, že v každé nové generaci se vytváří jedinci více a více podobní rodičům (rodičovským partnerům). Z toho se dá usuzovat, že zpětné křížení je třeba uskutečňovat s takovými odrůdami, jejichž vlastnosti vyžadujeme u nové odrůdy. Avšak stále se opakujícím zpětným křížením dochází k eliminaci pozitivních genů, a proto je nutné, dialelní křížení vybraných elit mezi sebou (MICHLOVSKÝ, 1987). Podstatnou úlohu při šlechtění hraje výběr vhodných rodičovských komponentů, jak donorů rezistence, tak i kvality. I u donorů kvality je třeba brát na vědomí všechny vlastnosti těchto odrůd. Např. pro tvorbu stolních odrůd maximálně využívat velkoplodé odrůdy východní skupiny (proles orientalis) vyznačující se poutavým vzhledem hroznu a bobulí; dobrou transportabilností a skladovatelností; žádanými chuťovými vlastnostmi atd. Pro tvorbu moštových odrůd používat jen novošlechtěnce plně adaptované k podmínkám našich vinařských oblastí, dosahující požadované rezistence a technologické kvality, dosahující vyšší cukernatosti, odpovídající chuťovým požadavkům konzumentů, popř. s originálními aromatickými látkami (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1988) Šlechtitelské zhodnocení některých vybraných druhů rév Při šlechtění nových interspecifických moštových, stolních i podnožových odrůd odolných proti houbovým chorobám se dnes nejvíce uplatňují: 1. Kříženci s Vitis rotundifolia Michx. V. rotundifolia Michaux. se vyskytuje na jihu USA, Mexiku a Guatemale, je známa svou dobrou rezistencí k houbovým chorobám (DAI a kol., 1994), imunitou vůči révokazu a Piercově chorobě (DEARING a CHARLES, 1948) a také tolerancí k háďátkům (WALKER, 1994). Původní odrůdy V. rotundifolia Michx. jsou dvoudomé, proto je nutné vysadit i opylovače (rostliny se samčím květem), odrůdy jsou pak opylovány větrem a včelami (DEARING a CHARLES, 1948). Zdroj dále uvádí i nejpěstovanější odrůdy (se samičím květem), např.: Black Beauty, Black Fry, Darlene, Jumbo, Sugargate, Summit, Supreme a Sweet Jenny s velmi velkými hrozny a vysokou cukernatostí. 37

38 Dnešní odrůdy jsou již většinou oboupohlavné (např.: Carlos, Noble, Redgate, Regale drobnoplodé; a Cowart, Dixieland, Dixie Red, Magnolia, Nesbitt, Sterling s velkým hroznem a vyšší cukernatostí), jejich bobule mají dobrou chuť a aroma. U odrůdy Fry Seedless se dokonce projevuje i partenokarpie (SAMPSON a kol., 2001). Mimo samotného praktického využití odrůd V. rotundifolia Michx., se tyto odrůdy poměrně často využívají v kříženích s odrůdami jiných druhů, nejčastěji V. vinifera L. První komerčně hojně využívané hybridy mezi těmito druhy získal OLMO v Kalifornii. Tyto hybridy se vyznačují vysokou rezistencí k houbovým chorobám a háďátkům (WALKER, 1994). Také LU a kol. (2000) hodnotili nově získané hybridy mezi V. vinifera x V. rotundifolia a tvrdí, že mnohé hybridy vykazovaly rezistenci k Piercově chorobě, antragnóze a plísni révové. V novější práci popisují WALKER a JIN (2000) úspěšné křížení mezi V. rupestris x V. rotundifolia, vysektované semenáčky se používají zejména jako podnože rezistentní k háďátku Xiphinema index Thorne & Allen a roncetu révy vinné (GFLV - Grapevine fanleaf virus). KOZMA a DULA (2003) ve své práci popisují využití V. rotundifolia jako zdroje rezistence proti padlí révovému ve složitém křížení mezi druhy V. rotundifolia x V. vinifera x Franko-americký hybrid x V. amurensis. V. rotundifolia Michaux v dnešní době patří mezi významné donory rezistence a uplatňuje se v složitých mezidruhových kříženích zaměřených na komplexní odolnost proti mnohým biotickým činitelům. 2. Kříženci s Vitis amurensis Rupr. Vitis amurensis Ruprecht se vyskytuje od Kavkazu až po Čínu a vytváří mnoho biotypů s velmi rozdílnými vlastnostmi. Pro naše podmínky je nutné hledat typ s vyšší mrazuvzdorností a současně se zvýšenou odolností proti plísni révové; typ který tyto vlastnosti bude dobře odevzdávat do potomstev bez toho, aby byla ovlivněna (snížena) jakost vína; typ s přiměřeným obsahem kyselin a charakteristickou ovocnou aromatikou. Těmto požadavkům se nejvíce blíží biotypy ze Severní Číny (např. V. amurensis Peking ). První kříženci byly vytvořeny už I.V. Mičurinem. Jeho následovníci (F.L. Meleško, I.A. Kostrikin, J.I. Potapenko, aj.) dosáhli využíváním tohoto mrazuodolného asijského druhu značné úspěchy. V minulosti byla nejvíce používána odrůda Severnyj (semenáč odrůdy Malingre x V. amurensis), pro dobrou mrazuvzdornost, odolnost proti 38

39 plísni a padlí révovému; pro samičí květy a velmi dobrou kombinační schopnost (DOKUPIL, 1989). V dnešní době se nejčastěji používají odrůdy: Zarja Severa, Pamjať Mičurina, Severnyj, Amur, Saperavi severnyj, Mičurinec v Rusku; Alfold, Kunbarát, Kunleany, Krystal Bibor v Maďarsku; Zlata, Petra, Rani rizling v bývalé Jugoslavii; Solaris, Bronner, Rondo v Německu atd. (POTAPENKO, 1995; KOZMA, 2000; CINDRIČ a kol. 2000; BECKER, 2002). V ČR je registrována podnožová odrůda Amos. 3. Kříženci s Vitis labrusca L. Vitis labrusca Linné se vyskytuje po celé severní polokouli Ameriky. Ve kříženích s V. viniferou L. zvětšuje bobule, zvyšuje odolnost k padlí, přednostně přenáší své typické aroma, ale žel ve víně se následně vyskytuje tzv. liščina fox. Přesto díky ní vznikají především stolní chuťově velmi zajímavé odrůdy (i bezsemenné): jako Alden, Venus, Lakemont seedless, R y seedless, Vincent, Ventura, aj. Aromatická látka zodpovědná za fox se nazývá furaneol (2,5-dimethyl-4-hydroxy-2,3-dihydro-3-furanon). Je senzoricky zjistitelná již i v malém množství cca ppb. (DOKUPIL, 1989). Americké labruscoidy (hybridy mezi Vitis sp. x V. labrusca) přivezl do Evropy, konkr. Francie, PLANCHON již v roce 1873: Clinton, Noah, Taylor, aj. (ZWEIGELT a STUMMER, 1929). Dalšími odrůdami byly Isabella, Dalaware, Othello, Catawba, Concord, Russkij Konkord, Champion, Ontario, atd. Některé z těchto odrůd se v malém měřítku (zahrádkářsky) pěstují i v ČR dodnes. 4. Kříženci s Vitis aestivalis Michaux Vitis aestivalis Michaux se vyskytuje na jihovýchodě Severní Ameriky a má tři variety: aestivalis, bicolor a lincecumi. Přičemž zejména ta posledně jmenovaná se nejvíce objevuje i v křížení tzv. prvních přímoplodých hybridů (např. Couderc noir od šlechtitele G.Couderce, Aramon petit od A.Seibela, aj.). DOKUPIL (1989) uvádí, že tato réva je odolná proti 39

40 houbovým chorobám, zejména proti padlí, plísni a červené spále. Geny této révy můžeme najít např. v těchto moderních odrůdách: Aron, Bianca, Malverina, Nero, Orion, Phoenix, Prim, Suzi, Zalagyöngye, aj. 4. Kříženci s Vitis cinerea Engel. Vitis cinerea Engelmann má vyšší odolnost až rezistenci vůči plísni révové, červené spále, padlí i mrazu a dobře snáší volný vápník v půdě (Dokupil, 1989). Tento druh se v kříženích plně využívá až posledních 60 let zejména v Německu. Známá je především podnožová odrůda Börner svou vysokou odolností k mšičce révokazu. Vzešla z křížení V. riparia 183 G x V. cinerea Arnold. Podnož vyselektoval Helmut Becker v Geisenheimu z Naumburgských semenáčů po Carlu Börnerovi ( ). BECKER (2000) dále navíc uvádí že genetická odolnost chrání chemicky neošetřovaná novošlechtění (konkr. Börner, Rici, Cina ) proti infekci k plísni révové, padlí révovému i plísni šedé, v přinejmenším stejné míře, jako vynaložené, ale ne vždy termínově správně použité ošetření fungicidy ve stejných stanovištních podmínkách. Závěrem: dříve se ve šlechtění více využívaly druhy jako V. rupestris Scheele, V. riparia Michaux, V. berlandieri Planchon, V. aestivalis Michaux a V. labrusca Linné. V dnešní době jsou to zejména druhy jako V. rotundifolia Michaux, V. amurensis Ruprecht, V. cinerea Engelmann a v neposlední řadě se hlavně američtí šlechtitelé pokouší využít některé další novější druhy jako např. V. candicans (Engelm.) Gray (syn.: Vitis mustangensis Buckley). 4.4 Principy odolnosti k houbovým chorobám Všichni původci onemocnění potřebují přinejmenším v určité vývojové fázi živiny od hostitelské rostliny nebo zužitkovávají výměnu látek ke svému rozmnožování. Velký počet hub, baktérií, fytoplasmóz a virů jsou během celého životního cyklu závislé na hostitelské rostlině. Napadené rostliny nejsou vystaveny původcům onemocnění bez jakékoli ochrany, ale v průběhu vývoje si vytvořily celou řadu obranných mechanismů. 40

41 Některé tyto mechanismy patří k typickým projevům rostlinných druhů (BUSAM a kol, 1997; VOGT a SCHRUFT, 2000). Schopnost jakéhokoli živého organismu odolávat patogenům (do určité míry) se nazývá nespecifická imunita. Chrání rostlinu proti široké skupině nespecializovaných heterotrofních organismů. Postupnou specializací parazitů došlo i u rostlin k vytvoření specializace v oblasti imunity a vznikla tzv. přirozená specifická imunita, tj. nedostupnost živého těla rostliny pro mikroorganismy těch druhů, které svým evolučním vývojem překlenuli ochrannou bariéru přirozené imunity. Specifickou imunitu lze rozdělit na: - pasivní imunitu, při které nemohou z různých příčin patogeny (či jejich toxické a jiné látky) dosáhnout živé tkáně hostitelské rostliny - aktivní imunitu, kdy patogen sice vstoupí do kontaktu s živými tkáněmi rostliny, avšak ty se záhy stávají nedostupné či odumírají vlivem činnosti parazita, dochází k omezení jeho činnosti a postupné smrti (DOKUPIL, 1989). I BAUMGARTNER a kol. (1998) uvádí, že pro ochranu proti houbovým chorobám rostliny využívají rozmanité množství fyzikálních a chemických způsobů. Vedle pasivních mechanických bariér (štětinky a plstnatost listů, vrstva vosku, tloušťka a pevnost buněčných stěn, atd.) existují také často i aktivní mechanismy, s jejichž pomocí rostliny rozpoznají vetřelce a zakročí proti němu (např. vznik dalších překážek patogenu, syntéza a uvolnění konkrétních obranných látek), obdobně jako bílé krvinky u člověka. VOGT a SCHRUFT (2000) dále uvádí, že ve všech případech, kde jsou obranné reakce rostliny rychlejší než houbová infekce, dochází k potlačení dalšího vývoje onemocnění a nedochází dále k žádnému či dojde jen k slabému vypuknutí onemocnění. Takové rostliny lze považovat za rezistentní proti původcům onemocnění. Jakmile však původce onemocnění překoná obranu hostitelské rostliny a je navíc schopen dále se vyvíjet a přecházet do své rozmnožovací fáze, mluvíme o rostlině náchylné. FRIEND (1977 a 1979) tvrdí, že mezi nejdůležitější skupinu látek, které jsou zapojeny do biochemické aktivní ochrany rostlin proti patogenům, patří rostlinné fenoly. Např. resveratrol (trans-3,5,4,-trihydroxystilben) je fytoalexin, vytvářený u révy vinné jako odpověď na napadení houbovými chorobami (LANGCAKE a PRYCE, 1976). Další pozitivní korelace mezi produkcí stilbenů a rezistencí k houbovým chorobám dokazují i mnohé další studie (DRECKS a CREASY, 1989; JEANDET a kol., 1995; PIERMATTEI a kol.,1999; MELZOCH a kol., 2001; TŘÍSKA a kol., 2004). 41

42 MELZOCH a kol. (2001) popisuje antioxidanty quercetin a resveratrol jako přírodní fenolické sloučeniny ze skupiny fytoalexinů (rostlinných obranných látek) a lze je nalézt v každé rostlině. Dále uvádí, že nejvíce resveratrolu se nachází v moruších, hroznech a burských oříšcích. Resveratrol je syntetizován zejména v bobulích iniciací ultrafialového záření nebo stresem, reakcí na napadení patogeny, a to prokazatelně plísní šedou a plísní révovou. Jeho obsah v hroznech je závislý ještě i na samotné odrůdě, zdravotním stavu keře, expozici, množství slunečního záření, atd. Autor dále uvádí, že v průběhu zrání dochází k distribuci polyfenolických látek směrem k hroznu a proto se nejvyšší koncentrace vyskytovaly v třapinách hroznů (konkr. resorcin, katechin, fluoroglucin, aj.), stejně jako trans-resveratrol. Obsah quercetinu byl nejvyšší v listech. Nalezené koncentrace se zvyšovaly směrem k napadeným místům, což vysvětluje jejich protiplísňovou aktivitu. Tyto látky se vyznačují především antioxidačními a antimikrobiálními účinky a trans-resveratrolu jsou přisuzovány i antimutagenní a chemoprotektivní účinky (NICHOLSON, 1992; HANZLÍKOVÁ a kol., 2001) Resveratrol se v rostlinných pletivech objevuje jako volný nebo glukosidicky vázaný. Doposud se ve všech studiích stanovoval jen resveratrol volný a zejména jeho forma trans. Tato forma se však vlivem slunečního záření rychle mění na formu cis, což výsledky mnohých prací zkresluje, nehledě nato, že stále ještě nejsme schopni stanovit veškerý obsah resveratrolu (BALÍK, 2007). HANZLÍKOVÁ a kol. (2001) stanovovala veškerý resveratrol ve víně tak, že jeho glukosidickou formu piceid, převáděla pomocí enzymu β- glucosidasy na volný resveratrol. PIERMATTEI a kol (1999) tvrdí, že bobule odebrané z odrůdy Sangiovese napadené padlím révovým, měly menší poměr antokyanů a fenolů ve slupkách oproti zdravým bobulím, ale zato vykazovaly více trans-resveratrolu, kaftarové a koutarové kyseliny. BAVARESCO a kol. (1997) poukazuje i na jiné fytoalexinní látky stilbenoidního charakteru, zejména epsilon-viniferin a pterostilben. Dále uvádí, že kumulace rostlinných fytoalexinnů do určité míry brání vytvoření viditelných symptomů plísně šedé na hroznech. Podobné výsledky interpretuje i TABACCHI (1994) když uvádí, že pterostilben (trans-3,5- dimethoxy-4-hydroxystilben) inhibuje klíčení a růst plísně šedé na bobulích révy. Stejně se chová i katechin (GOETZ a kol., 1999). Odolnost k plísni révové lze tedy v zásadě rozdělit na pasivní (mechanickou imunitu) a aktivní (fyziologickou imunitu). Nejčastějším projevem pasivní imunity révy 42

43 vinné proti plísni révové jsou různé zvláštnosti stavby krycích tkání rostlin. Například podle BOUBALSE (1959) u silně ochlupených odrůd, konkrétně Pinot Meunier (Mlynářka), nepřipustilo toto ochlupení spodní strany listové čepele žádnou možnost kontaktu kapky suspenze s inokulem a průduchy. K projevům aktivní imunity můžeme zařadit uhynutí klíčních vláken při proniknutí do průduchové štěrbiny. I LORENZ (1988) uvádí, že při sledování infekce plísní révovou na bobulích, u některých odrůd rychleji došlo k zkorkovatění štěrbinovitých otvorů na napadených bobulích, tím k znefunkčnění lenticel a následně zamezení další možné infekce. Naproti tomu VERDEREVSKIJ (1989) tvrdí, že u rodu Vitis spp. neexistuje žádná aktivní odolnost proti pronikání zoospor do rostliny. U vysoce odolných jedinců existuje po napadení jen specifická obranná reakce, při které znekrotizují průduchy. Buďto nekrotizují jen svěrací buňky (tzv. nekrózy průduchové) anebo nekrotizuje i část buněk parenchymatického pletiva, přičemž k úplnému odumření buněk nedochází. Mycelium dále přetrvává v mezibuněčných prostorách a pomalu vytváří haustoria. V závislosti na stupni odolnosti rostliny může rozvoj mycelia probíhat tak potlačeně, že patogen není schopen vytvářet sporangiofory. Oba typy nekróz se vyskytují u odolných amerických druhů. Zajímavý pasivní mechanismus obrany révy proti plísni révové popisují ve svých pracích i GALET (1986) a KAST (1989). GALET (1986) zjistil, že zejména keře s nižším vzrůstem a malými listy se zdají být více odolné, než keře stejné odrůdy pěstované v půdě dostatečně zásobované vodou, kde probíhá růst mnohem rychleji. KAST (1989) pak uvádí, že listy menší než 2 cm (malé průduchy) a bobule od velikosti hrášku nejsou napadány plísní révovou (sílící vosková vrstva). Odolnost (rezistence) rostlin je tedy podmíněna jistým souborem dědičných vlastností a znaků odrůdy (hybrida), které vedou k zabránění či nižšímu stupni napadení patogenem v porovnání s neodolnou odrůdou. Rostliny reagují např. tvorbou kalusů, závalů či regenerují. Mezi zajímavé mechanismy obrany rostlin vůči patogenům řadíme i - nonpreferenci (antixenoza), což je vylučování odpuzující látek rostlinou (většinou proti škůdcům); - antibiozu, což je negativní působení hostitele na růst a vývoj narušitele; - pasivní odolnost, je to soubor vlastností založených na anatomických, morfologických, fyziologických či biochemických zvláštnostech (odolnost se většinou projevuje sníženou početností populace patogena) a 43

44 - toleranci, což je schopnost rostlin kompenzovat ztráty vyvolané patogenem (GRAMAN a ČURN, 1997). V poslední době je snaha o vytvoření velmi odolných až rezistentních odrůd s komplexní imunitou k houbovým chorobám, vzájemným křížením rév (odrůd), které tyto vlastnosti vykazují. Komplexní imunita nebo odolnost rostlin se opět vytváří v průběhu evoluce tam, kde jsou přítomny i infekční podmínky nakažlivých chorob nebo abiotických faktorů, přispívajících k výběru rostlin, přizpůsobených daným podmínkám. Za těchto podmínek jsou rostliny i patogeny geneticky velmi proměnlivé. Vznikají nové biotypy rostlin odolné vůči daným patogenům, které ovšem také vytváří nové a nové rasy. Navzdory tomu, vždy určitá část rostlin vydrží útok patogena a přežije. Společný evoluční vývoj vede tedy k utváření imunity k patogenům, popřípadě i k tvorbě skupinové komplexní imunity (VAVILOV, 1966; LEBEDA a SEDLÁŘOVÁ, 2004). 4.5 Deskriptory k vyhodnocení úrovně odolnosti proti plísni révové Pro vyhodnocení úrovně napadení plísní révovou u rodu Vitis spp. slouží různé deskriptory (klasifikátory), zejména deskriptor OIV (Office International de la Vigne et du Vin, 1983) a z něj vycházející klasifikátory IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) a UPOV (International Union for the Protection of New Varieties of Plants). Tyto klasifikátory jsou však až příliš složité, obsahují příliš mnoho úrovní napadení, přechody mezi těmito jednotlivými stupni nejsou úplně přehledně stanoveny, a proto si mnozí autoři zabývající se testováním plísně révové vytvořili vlastní jednodušší modifikace (např. REUVENI, 1998; COHEN, 1999; KOZMA, 2003; aj.) Deskriptory OIV, IPGRI a UPOV Jde o evropské zharmonizované klasifikátory rodu Vitis L., které byly sjednoceny a sloučeny v jeden. Podle něj byl i v ČR v roce 1999 zpracován tentýž klasifikátor, sloužící jako podklad pro dokumentaci víceletých výsledků hodnocení popisných znaků genetických zdrojů kolekce révy vinné v České republice. Publikován byl v rámci Národního programu konzervace a využití genetických zdrojů rostlin a je přizpůsoben pro 44

45 evidenci v centrální dokumentaci genetických zdrojů EVIGEZ (EVIdence GEnových Zdrojů). Jeho konečná verze přesně sleduje klasifikátor publikovaný EU (European Union), který vychází hlavně z klasifikátorů OIV, IBPGR/IPGRI a UPOV (tyto byly harmonizovány a sloučeny) a je doplněna o znak rezistence k zimním mrazům, k abiotickému faktoru, který se v podmínkách České republiky výrazně uplatňuje (HUBÁČKOVÁ a FABEROVÁ, 1999). Pro úplnost je vždy připojeno i číslo deskriptoru OIV. Klasifikátor zahrnuje 71 popisných znaků, které jsou doplněné o 4 znaky vztahující se k pokusným podmínkám hodnocení. Nedílnou součástí je i národní evidenční číslo (ECN) hodnoceného genetického zdroje (GZR) jako jeho jednoznačný identifikátor v rámci kolekce. Součástí klasifikátoru je přehled dalších druhů rodu Vitis L. a jejich kódování pro EVIGEZ (HUBÁČKOVÁ a FABEROVÁ, 1999) Tabulka č.8: Harmonizovaný deskriptor hodnocení napadení listů plísní révovou pro odrůdy révy vinné a Vitis species. OIV Paris (Office International de la Vigne et du Vin), 1983 (Zdroj: KOLEKTIV AUTORŮ OIV, 1983) EVIGEZ č. deskr./ Descr. no. 65 Pořad č./ Number Znak: List: stupeň rezistence k plísní révové Descriptor: Leaf: degree of resistance to Plasmopara OIV 452 (modified) Stupnice / Scale: velmi nízký nízký střední vysoký velmi vysoký (very low) (low) (medium) (high) (very high) Příklady odrůd / Example varieties: 41 B - Chasselas x Berlandieri ( Al. Millardet 1882 ) B 45

46 Indikace: Hodnotí se rozsah plísní infikovaných skvrn na listech 4-6 keřů (t.j. 4-6 opakování), asi 3 týdny od začátku kvetení. 1 = neohraničené rozsáhlé skvrny způsobené infekcí nebo úplně infikované listové čepele - silná fruktifikace houby - zřetelné a husté mycelium - velmi raný opad listů; 3 = rozsáhlé neohraničené skvrny způsobené infekcí - velmi silná fruktifikace houby - četné mycelium - opad ne tak raný jako ve stupnici 1; 5 = ohraničené skvrny o velikosti 1-2 cm v průměru - více nebo méně silná fruktifikace houby - nepravidelná tvorba mycelia; 7 = nižší nekrotizace skvrn - nižší fruktifikace houby - méně mycelia; 9 = tečkovité nekrózy nebo bez symptomů, žádná fruktifikace houby nebo mycelium Vyhodnocení infekce - Devíti-bodová stupnice dle deskriptoru OIV list (1983): 1. Velmi nízká odolnost (odrůda silně náchylná) 3. Nízká odolnost (odrůda náchylná) 5. Střední odolnost (středně náchylná tolerantní odrůda) 7. Vysoká odolnost (slabě náchylná rezistentní) 9. Téměř úplná odolnost (velmi silná rezistence) 46

47 Obr.č. 8: Praktická ukázka stupňů 9,7 a 5 dle harmonizovaného deskriptoru OIV 1983 (Zdroj: KOLEKTIV AUTORŮ OIV, 1983) Deskriptor EPPO Dalším významným klasifikátorem pro hodnocení napadení plísně révové na listech révy je deskriptor EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization), PP 1/31(3), Tento klasifikátor je využíván zejména v polních podmínkách při registraci nových chemických přípravků používaných proti plísni révové a je upřednostňován organizací SRS (Státní rostlinolékařská správa ČR). Vyhodnocovací klíč dle metodiky EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization), 2002: 1 = bez příznaků choroby; 2 = drobné olejové skvrny do 5%; 3 = olejové skvrny od 5-10%; 4 = větší olejové skvrny od 10-25%; 5 = velké slité olejové skvrny od 25-50%; 6 = velké slité olejové skvrny od 50-75%; 7 = plně zasažený nekrotický list nad 75% 47

48 Obr.č. 9: Deskriptor EPPO procentické vyjádření napadení horní strany listů PP 1/31(3). (Zdroj: ) Deskriptory podle Reuvena (1998) a Cohena (1999) Tyto klasifikátory byly vyvinuty pro testování odolnosti patogena k určitým chemickým látkám používaným při ochraně rostlin proti plísni révové v laboratorních podmínkách na listových discích. Vyhodnocení infikovaných terčů se u těchto deskriptorů provádí o několik dní později, minimálně až po 8 dnech (cca dnů). V posledních letech se stoupající chemickou ochranou (širší škálou účinných látek), se touto problematikou zabývá mnoho týmů a vznikají pochopitelně další klasifikátory více vhodné k daným použitým metodikám (Reuveni, 1998 a 2003; Cohen a kol., 1999). 48

49 Tab.č. 9a: Klasifikátor podle Reuvena 1998 Třída Stupnice napadení (%) Příznaky 0 0% Bez viditelných symptomů infekce % Slabá infekce a sporulace % Olejové skvrny a sporulace do 25% % Slité olejové skvrny a silná sporulace do 50% 4 > 50% Slité olejové skvrny, velmi silná sporulace, nekrózy Tab.č. 9b: Cohenův klasifikátor 1999 Třída Procento napadení Příznaky 0 0% Bez viditelných symptomů infekce 1 > 25% Chlorotické skvrny, začínající nekrózy % Větší chlorotické skvrny, nekrózy % Velké chlorotické skvrny, sporulace, nekrózy 4 > 75% Slité chlorotické skvrny, sporulace, velké nekrózy Deskriptor míry napadení interspecifických hybridů podle Kozmy a Duly (2003) Jde o velmi přísný a přitom jednoduchý 5-ti bodový klasifikátor určený k hodnocení míry odolnosti proti plísni révové u interspecifických hybridů. Vyhodnocení infikovaných disků se provádí vždy každý pátý den po infekci + následná kontrola po 7 dnech od inokulace. Podobné klasifikátory použili již BARLASS a kol. (1986) či BROWN a kol. (1999). Tab.č. 10: Stupnice napadení plísně révové podle KOZMA a DULA (2003) Úroveň Procento napadení Příznaky 1 0% Bez příznaků nebo slabá hypersenzitivní reakce 2 0,1 10% Slabá hypersensitivní reakce, velmi lehká sporulace % Hypersenzitivní reakce, olejové skvrny, sporulace % Olejové skvrny, silná sporulace, začínající nekrózy 5 > 50% Olejové skvrny, silná sporulace, sporangia, nekrózy 49

50 5. Plíseň révová 5.1 Introdukce plísně révové do Evropy Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl. & de Toni (řád: Peronosporales, čeleď: Peronosporaceae) - původce choroby plísně révové, je diploidní obligátní biotrofická houbová choroba, která byla zavlečena do Evropy ze Severní Ameriky v roce 1878, z amerických nativních rév a prvních amerických hybridů mezi V. vinifera L. x V. labrusca L. (např. Catawba -1802, Isabella -1816, Delaware -1850, aj.). Rozšíření patogena bylo překvapivě rychlé: v 1879 se již vyskytoval všude ve Francii a Itálii, o rok později v Německu - Moselském regionu (MÜLLER a SHLEUMER, 1934) a v 1881 i v Řecku - Messinia region (GENNADIOS, 1889). Dá se předpokládat, že se k nám plíseň révová dostala ve shodném čase, tedy přibližně kolem roku 1881 konkrétně na Moravu a v roce 1986 pak i do Čech (BENADA a kol., 1962). Již za dvacet let po té, vypukla první opravdu katastrofální epidemie v roce 1900, kdy v krátkém čase byly zničeny až dvě třetiny z očekávaného výnosu téměř v celé Evropě (MÜLLER a SHLEUMER, 1934; SAREJANNI, 1951). Od té doby, plíseň révová představuje nejvíce škodlivou chorobu révy v evropských zejména vlhkých regionech. První introdukovanou houbou z nového světa do Evropy bylo padlí révové (Uncinula necator /Schw./ Burr.) roku S dovozem dalších rév se do Evropy dostala mšička révokaz (Dactylosphaera vitifolii /Fitch./ Shimer) v roce 1860 a až jako třetí se do Evropy introdukovala i plíseň révová. Navzdory pravděpodobné relativně nízké populaci zavlečené do Evropy (konkrétně Francie), plíseň révová velmi dobře uspěla v kolonizaci u mnoha různě citlivých odrůd a přizpůsobila se velmi různým klimatický podmínkám po celé Evropě a dnes i Asii. Celková vnímavost u druhu Vitis vinifera L. a příznivé meteorologické podmínky, v kombinaci s různorodými reprodukčními schopnostmi z organismu, tj. pohlavní i nepohlavní reprodukce (MCDONALD a LINDE 2002), usnadnilo velmi rychlé namnožení patogena až na epidemickou úroveň. V evropských oblastech s vyšší vlhkostí, choroba spolehlivě zničí veškerou úrodu bez použití příslušné ochrany. Historicky první účinnou obranou proti plísni révové byl postřik bordeauxskou jíchou (v roce1880) s proti plísňovým materiálem založeným na bázi mědi (PSCHEIDT a OCAMB, 1999). Připravovala se použitím roztoků modré skalice a vápenného mléka, čili síran měďnatý CuSO 4 + hydroxid vápenatý Ca(OH) 2, smícháním vzniká síran vápenatý Ca(SO) 4 a konečně vlastní účinná složka hydroxid měďnatý 50

51 Cu(OH) 2. K postřikům vinic se běžně používala 1 2% koncentrace. Pro přípravu 1% bordeauxské směsi je třeba na každých 100 litrů vody 1 kg modré skalice a 1 kg hašeného vápna (reakce by měla mít neutrální reakci). V poslední době používáme hned několik účinných látek a to různě v kombinacích jako: metalaxyl, cymoxanil, mankozeb, zineb, oxichlorid mědi, captan, folped, metiram, azoxystrobine aj. Dle každého roku zasahujeme proti plísni révové cca 2-6x během vegetace. Například ve Švýcarsku a Německu se běžně ošetřuje až 7-9x za sezónu. I proto je snaha o tzv. integrované vinohradnictví, se snahou maximálně snížit počet aplikací fungicidů pomocí různých prognóz. V neposlední řadě se již objevují i odrůdy různě odolné k plísni révové, vhodné zejména pro ekologické vinohradnictví a vinařství. 5.2 Hostitelské rostliny Mezi hostitelské rostliny plísně révové patří zejména réva vinná (Vitis vinifera L.), dále některé další druhy rodu Vitis (V. labrusca L., V. rubra Mich., V. amurensis Rupr., aj.), některé mezidruhové hybridy a i některé další rody z čeledi Vitaceae Juss., jako např. Parthenocissus sp. Planch. (WILSON, 1908). PSCHEIDT (2002) popisuje již výzmané rožšíření plísně révové na loubinci třírohém - Parthenocissus tricuspidata (Sieb. et Zucc.) PLANCH., v západním Oregonu. Faktem dále zůstává, že několik druhů z čeledi Vitaceae (konkr. Ampelopsis sp., Cissus sp., Parthenocissus sp.) byly prokazatelně potvrzeny jako hostitelské rostliny jiné houbové choroby - Pseudocercospora vitis (Lév.) Speg. (FARR a kol., 1989). Tato houba již byla nalezena v Brazílii, Evropě, Indii, Japonsku, Severní Americe, Koreji, Pákistánu, Saudské Arábii a Jižní Africe (ELLIS, 1971; SHIN, 1997). V roce 1910 SPEGAZZINI poprvé pozoroval její příznaky i na evropské révě (V. vinifera L.), v roce 2004 SISTERNA a RONCO popisují příslušné příznaky i na V. labrusca L. pěstované v Argentině. Podobně byl potvrzen rod Parthenocissus sp. jako hostitelská rostlina další houbové choroby červené spály - Pseudopeziza tracheiphylla Műll. (KORF a kol., 1986). Rody Ampelopsis sp. a Parthenocissus sp. jsou mimo jiné i hostitelskými rostlinami pro tzv. Pírsovu chorobu (Pierce s disease), jejímž původcem je nyní neméně nebezpečná baktérie Xylella fastidiosa Wells. (HOPKINS a ADLERZ, 1988). 51

52 Tab.č. 11: Klasifikace čeledi Vitaceae Juss. podle Galeta (1988) 1. Vitis L. Euvitis PLANCH. Muscadinia PLANCH. 10. Landukia PLANCH. 2. Acareosperma GAGNEP. 11. Nothocissus LATIFF. 3. Ampelocissus PLANCH. 12. Paleovitis REID et CHANDLER 4. Ampelopsis PLANCH. 13. Parthenocissus PLANCH. 5. Cayratia PLANCH. 14. Pterisanthes BLUME. 6. Cissites HEER. 15. Pterocissus URB. et EKM. 7. Cissus L. 16. Puria NAIR. 8. Clematicissus PLANCH. 17. Rhoicissus PLANCH. 9. Cyphostemma PLANCH. 18. Tetrastigma PLANCH. Mezi jednotlivými druhy, ale i rody jsou výrazné rozdíly k náchylnosti k napadení plísní révovou. Existují rovněž také určité rozdíly v náchylnosti i mezi jednotlivými odrůdami evropské révy vinné. Mezi citlivé odrůdy patří zejména Aurelius, Irsai Oliver, Lena, Muškát moravský, Muškát Ottonel (je citlivý i na bordeauxskou jíchu), Müller Thurgau, Neuburské, Rulandské bílé, Sauvignon, Cabernet Sauvignon, Frankovka, Modrý Portugal a Rulandské modré (BRAUN a VANEK, 1990; RICHTER a kol., 2002). Tolerance či rezistence proti plísni révové se projevuje pozdějším napadením porostů. Révu vinnou napadá jen druh Plasmopara viticola Berk. & Curt. Samotný rod Plasmopara sp. (řád Peronosporales) je však druhově velmi rozsáhlý s dalšími příbuznými rody jako Pseudoperonospora sp., Bremia sp., Albugo sp., či Phytophthora sp. (řád Pythiales), aj. Obr.10-12: Rody nejvíce příbuzné z rodem Vitis sp. - Parthenocissus tricuspidata(sieb. et Zucc.) PLANCH., Parthenocissus quinquefolia (L.) PLANCHON, Ampelopsis brevipedunculata var. variegata MAXIM. 52

53 Dendrogram 1: Řád Peronosporales - příbuzenské vztahy jednotlivých rodů a druhů sestavené pomocí metody RAPD (RIETHMÜLLER a kol., 2002) 53

54 5.3 Taxonomie plísně révové Taxonomicky patří plíseň révová (Plasmopara viticola BERL. & de TONI.) do soustavy Vitae (živé organismy), nadříše Eukaryotae (jaderní), říše Chromista, oddělení Oomycota (houby vaječné), třídy Oomycetes, řádu Peronosporales, čeledi Peronosporaceae a rodu Plasmopara (CAVALIER-SMITH, 1981; AINSWORTH a BISBY, 2001). Systémové zatřídění plísně révové (ang. Downy mildew) Říše (Kingdom): Chromista (Stramenopila) Oddělení (Phylum): Oomycota Třída (Class): Oomycetes Podtřída: Peronosporomycetidae Řád (Order): Peronosporales Čeleď (Family): Peronosporaceae Rod (Genus): Plasmopara Druh (Species): viticola Říše Chromista má tři oddělení Hyphochytriomycota, Labyrinthulomycota a Oomycota. CAVALIER-SMITH (1989) však tuto říši rozšířil o další čtyři oddělení, konkr. Chromophyta, Heterokontophyta, Haptophyta a Cryptophyta, kam se řadí vodní organismy, jako zlativky, rozsivky, různobrvky aj. Třída Oomycetes se skládá ze dvou podtříd: a to z podtř. Saprolegniomycetidae (s jedním řádem Saprolegniales) a podtř. Peronosporomycetidae, skládající se dále z šesti řádů: Lagenidiales, Leptomitales, Rhipidiales, Sclerosporales, Peronosporales a Pythiales; z nichž poslední dva jmenované jsou hospodářsky velmi významné svými rody jako jsou Pythium spp., Phytophthora spp., Bremia spp., Peronospora spp., Pseudoperonospora spp. a Plasmopara spp. Řád Peronosporales má dvě čeledi Albuginaceae a Peronosporaceae. Do čeledi Peronosporaceae náleží i jiné hospodářky velmi významné rody vegetující na zelenině, révě, léčivých rostlinách a okrasných rostlinách (viz. tabulka číslo 12). I když rody z čeledi Peronosporaceae většinou patří mezi tzv. obligátní patogeny (napadají jen jeden konkrétní hostitelský druh; popřípadě blízce příbuzný druh), jsou mezi 54

55 nimi i vyjímky (tzv. polyfágní patogeny), jako např. rod Bremia spp., jehož druh B. lactucae Regel napadá hned celou řadu rostlin. Nejrozsáhlejším rodem patřícím do čeledi Peronosporaceae je samotný rod Peronospora spp. čítající cca 36 druhů (RIETHMÜLLER a kol., 2002). Tab.č. 12: Některé hospodářsky škodlivé taxony z čeledi Peronosporaceae (RIETHMÜLLER a kol., 2002) Rod Druh Hostitel Basidiophora Ba. entospora Roze a Cornu Conyza canadensis L. Bremia B. lactucae Regel Cirsium oleraceum Cronq., Lactuca sativa L., Lapsana communis L., Senecio vulgaris L., Sonchus asper Hill. Bremiella Br. baudysii (Skalický) Const. Berula erecta (Huds.) Coville Br. megasperma Wilson Viola rafinesquii Greene Paraperonospora Pa. leptosperma Constant. Tripleurospermum perforatum Laínz Peronospora Pe. aestivalis Syd. Medicago sativa L. Pe. alta Fuckel. Plantago major L. Pe. brassicae Gäum. Raphanus raphanistrum L. Pe. destructor (Berk.) Casp. Allium cepa L. Pe. myosotidis De Bary Myosotis spp. Pe. parasitica Pers. Capsella bursa-pastoris L. Pe. sorghi West. a Uppal. Sorghum vulgare Pers. Pe. sparsa Berk. Prunus laurocerasus L. Pe. tabacina Adam Nicotiana obtusifolia Mert. a Gaeotti Pe. trifolii-hybridi Gäum. Trifolium hybridum L. Plasmopara Pl. geranii Berl. a De Toni Geranium maculatum L. Pl. helianthi Novot. Heliathus annuus L. Pl. obducens Schroet. Impatiens capensis Meerb. Pl. pimpinellae Savul. Pimpinella major (L.) Huds. Pl. pygmaea (Unger) Schroet. Anemone ranunculoides L. Pl. viticola Berk. a Curtis Vitis vinifera L. Pseudoperonospora Ps. cubensis Berk. a Curtis Cucumis sativus L. Ps. humuli Wilson Humulus lupulus L. Ps. urticae Salmon a Ware Urtica dioica L. 55

56 5.4 Příznaky onemocnění Plíseň révová může způsobovat podstatné ztráty na výnosu a oslabení rostliny napadením listů, ale i napadením květenství a hroznů. Nejprve napadá plně vyvinuté a zejména starší listy (primární infekce), později se více objevuje na mladších listech a zálístcích (VERCESI a kol., 1999). Na napadených listech se objevují žlutozelené až žlutavé, různě velké difúzní skvrny. V pozdějších fázích vegetace, zejména na starších listech, se v blízkosti hlavních nervů objevují drobné žilkami ohraničené skvrny. Vyjímečně dochází k žloutnutí celých listů. Za příznivých podmínek se na spodní straně skvrn objevuje bělavý povlak sporangioforů a sporangií. Postižená místa nekrotizují, silně napadené listy předčasně opadávají. EMMET a kol. (1992) popisují příznaky na listech jako nažloutlé, olejové skvrny na horní straně listové čepele, vznikající rozkladem chlorofylu, měnící se později v nekrotické skvrny, které se nakonec spojují do velkých nekrotických oblastí. Charakteristickým projevem plísně révové jsou pak bílé sporangiofory a sporangia, vyrůstající z průduchů na spodní straně listu. Při silnějším tlaku se napadení objevuje i na květenstvích nebo mladých hroznech, které pak hnědnou a zasychají. Květenství, které je napadeno před anebo během kvetení se vybarvuje světle zeleně, později nahnědle až nafialověle. Tato reakce je viditelná nejen na květech, ale i na napadených květních stopkách, popř. celé třapině. Infikovaná květenství většinou odumírají a zůstávají v zaschlém stavu po delší čas viset na keři. Bobule mohou být infikovány průduchy pouze do velikosti 2,5 mm (LORENZ, 1988), později jen pokud proroste podhoubí (mycelium) přes třapinu či stopku nebo při poranění (obaleči, kroupy). Napadené bobule se zbarvují šedohnědě, postižená pletiva se propadají, na průřezu pozorujeme nápadnou hnědavou mechovitou nekrózu dužniny a dále sesychají (viz. obrázky č. 11, 12 a 13). Při napadení starších hroznů se vytvářejí porosty houby jen na třapině a stopkách bobulí. K časným výskytům onemocnění a k napadení květenství však dochází v našich podmínkách jen výjimečně (např. rok 1995). Pravidelně ale dochází k výskytům a šíření onemocnění v období po odkvětu (od konce června). Ztráta listů nemusí znamenat jen ztrátu sezónní úrody, může také způsobit i další ztráty v následující sezóně, špatným vyzráním letorostů ve výhony. Dochází k špatné diferenciaci pupenů (nedostatečné založení květních lat) a nedostatečné tvorbě zásobních látek. Nevyzrálé výhony jsou pak velmi citlivé k dalším chorobám (zejména padlí révovému) a zimním mrazům. U mladých vinic může silné napadení způsobit i jejich úhyn. 56

57 Obr.č : Příznaky plísně révové na listech a bobulích révy (Zdroj: SRS, 2000) Plíseň révová je rozšířena ve všech významných vinohradnických oblastech na světě. Je, vedle padlí, nejvážnější chorobou révy vinné v Evropě. Škody vyvolané peronosporou mohou být značné, v závislosti na průběhu povětrnosti, srážek a teploty. Ztráty mohou dosahovat 50% i více a v některých oblastech má tedy mimořádný význam. 5.5 Biologie houby, podmínky infekce Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl. & de Toni, původce plísně révové, je biotrofní parazit, který žije výhradně na zelených orgánech s průduchy na rostlinách patřící do rodu Vitis sp. Plíseň révová se řadí k polycyklickým onemocněním a může v průběhu vegetačního období vytvořit celou řadu vegetačních cyklů. Houba osidluje svým podhoubím mezibuněčné prostory hostitelské tkáně a zahajuje krátkými rozdvojenými hyfami kontakt s buňkami parenchymu. Tato vlákna (hyfy) pronikají přes buněčné stěny buněk hostitele a vytváří pak haustoria, která odebírají takto napadeným buňkám živiny. Pro nepohlavní rozmnožování se vytváří nosiče sporangií (sporangiofory), které vystupují z průduchů na povrchovou plochu listu a dále se na nich vytvářejí nejprve kulovitě, později citronovitě tvarovaná zralá sporangia. Z každého průduchu vyčnívá hned několik sprangioforů, takže už při malé infekci se tvoří velké množství spor. V této fázi 57

58 jsou sporangiofory patrné jako bílé povlaky houby. Po prasknutí sporangia se objeví 4-10 zoospor, pohybující se pomocí dvou bičíků k průduchům. Jakmile zoospory na razí na průduch ztrácí oba bičíky a obalí se cystou. Ze zoospor pak rostou klíční vlákna, která pronikají průduchy do rostliny, kde vytváří malá váčkovitá haustoria, sloužící k výživě patogena. Pohlavní rozmnožování nastává tvorbou oospor. Oospory mají tlusté vícevrstevné stěny a velmi dobře snáší sucho i nízké teploty. Oospora klíčí v následujícím roce na jaře vláknem, které ztloustne a vytváří primární sporangium (BENADA, 1962). S podrobným sledováním bionomie patogena se začalo někdy kolem roku Bylo zjištěno, že P. viticola přesvědčivě přezimuje, ve formě silnostěnných oospor na listech nebo zbytcích bobulí (GREGORY, 1915). Předpokládá se, že dozrávání těchto oospor je etapové a děje se tak během relativně krátké doby (polovina až konec května) a i pokud do poloviny června nenastane klíčení a primární infekce, vyklíčí oospory až později za příhodnějších podmínek (CORTESI a ZERBETTO, 1991). Za vhodných klimatických podmínek oospora na jaře vyklíčí a vytvoří makrosporangium, obsahující až 60 pohyblivých zoospor, které se pomocí dvou bičíků a ovlhčeného listu musí dostat přes průduchy do listového parenchymu, kde způsobují primární infekci. Inkubační doba je velmi proměnlivá, ale nastává v průměru od pěti do deseti dnů. Symptomy se projevují jako nažloutlé body (olejovité skvrnky), na kterých se ze spodní strany později objevují sporangiofory a nastává sporulace. Vhodné podmínky pro tvorbu spór (sporulaci) jsou: stoupající vlhkost a teplota kolem 18 C. Sporulace probíhá nejčastěji na spodní straně z listů a na povrchu mladých bobulí. Sekundární nákaza probíhá dále cyklicky, za stejných vlhkostních a teplotních podmínek, jako u primární infekce (BLÄSER a WELTZIEN, 1979; LAFON a CLERJEAU, 1988; SCHRUFT a KASSEMEYER, 1999). Sekundární sporangia jsou uvolněna ze sporangioforů a jsou dále rozptylována do okolí (rosa, déšť, vítr). Zoospory, uvolněné následně ze sporangií, pak mohou nakazit další rostlinu (viz. obrázek č.14). 58

59 5.5.1 Vývojový cyklus plísně révové Každoročně přezimují oospory v pletivu odumřelých napadených listů a na povrchu půdy pod keři révy vinné. HILL (1989) uvádí, že dostanou-li se oospory v opadlém listí do půdy, mohou si podržet svou klíčivost i 5 let. Na jaře za příznivých teplotních a vlhkostních podmínek oospory klíčí, vytváří se sporangiofory se sporangii a zoosporami, které jsou zdrojem primárních infekcí. Během vegetace dochází k sekundárním infekcím pomocí sporangií se zoosporami, vytvářející se na větvených sporangioforech, vyrůstajících z průduchů na spodní straně listové čepele a na dalších napadených zelených částech keře. Obr. č. 16: Plasmopara viticola Berk. & Curt. - Vývojový cyklus (design autor) 59

60 Oospory Oospory se vyvíjejí v pletivech napadených částí rostlin (převážně v houbovém parenchymu listů, zřídka v bobulích) během pozdního léta a na podzim. Oospory vznikají splynutím samičího oogonia a samčího antheridia. Oogonia jsou kulovitá, antheridia kyjovitá a obojí vznikají oddělením přepážkou od hyfy. Oogonia jsou mnohojaderná, během vývoje se jádra hromadí na periferii v periplasmě a jen uprostřed zůstává jediné jádro sloužící k oplodnění. Po přiblížení antheridia k oogoniu a po dotyku se vytváří oplodňovací hyfa, kterou prochází jedno samčí jádro a splývá s centrálním jádrem samičím (probíhá karyogamie). V oplodněném oogoniu se postupně vyvíjí tlustostěnná oospora a z periplasmy vzniká nepravidelně skulpturovaná stěna (HEFFER a kol., 2002). Oospory jsou kulovitého tvaru, μm v průměru, pokryté mohutným vícevrstevným oogoniovým obalem nažloutlé barvy, tvořeným tenkým exosporem a silným endosporem. Ke klíčení oospor dochází každoročně v průběhu měsíce května (KONŮPKA, 1953). Oospora vyklíčí v nerozvětvené krátké vlákno (sporangiofor), na jehož konci se vytvoří velké sporangium (makrosporangium) vejčitého tvaru o rozměrech x 26-41μm. K primární infekci dochází po přenosu makrosporangií z úrovně povrchu půdy na povrch rostlinných pletiv, většinou na nejníže položené listy a letorosty, pomocí dešťových kapek při jarních srážkách. Z makrosporangia se uvolní až 40 zoospor o velikosti 6-10 μm opatřených dvěma bičíky. Zoospory se pohybují směrem k průduchům, ztrácí bičíky a klíčí ve vlákno, pronikající průduchy do vnitřních pletiv (RIEMANN a kol., 2002) Sporangiofory Sporangiofory vyrůstají ze shluku hyf v substomatální dutině a to průduchy na spodní straně listů, případně průduchy ze stopek, bobulí a pokožky letorostu ve svazcích po dvou až pěti. Sporangiofory sekundární infekce jsou laterálně větvené v nejhořejší části, postranní větve vyrůstají v pravém úhlu, zvláště sekundární a terciální větve jsou pak nápadně zkrácené a na konci uťaté. Sporangiofory jsou μm dlouhé, 6-11 μm široké, na bázi rozšířené, hyalinní (RUMBOLZ a kol, 2002). 60

61 Obr.č.17-18: Sporangiofory začínající vystupovat z průduchů. Fota:RUMBOLZ a kol., 2002 Obr.č.19-20: Sekundární sporangia na sporangioforech. Fota: RUMBOLZ a kol., Sporangia a zoospory Sporangia (mikrosporangia) jsou rovněž hyalinní, podlouhle vejčitého až eliptického tvaru, zakončená apikální papilou, o rozměrech 9-19 x μm. Klíčí většinou nepřímo, pomocí 4-6 zoospor téměř kulovitého tvaru, o velikosti cca 10 μm, opatřených dvěma bičíky. Bičíky vyrůstají po straně, kratší směřuje dopředu a delší dozadu. S jejich pomocí se zoospory aktivně pohybují směrem k průduchům. Sporangia pouze zřídka vyklíčí i přímo tj. hyfou bez tvorby zoospor. Klíční vlákna patogena prorůstají houbovým parenchymem hostitele a dále mezibuněčnými prostory (intercelulárami), vnikají do buněk, kde vytváří malá váčkovitá haustoria, sloužící k výživě patogena. Po vytvoření dostatečného množství zásobních látek (po uplynutí inkubační doby), projevující se postupnou chlorózou napadených pletiv, dochází k tvorbě reprodukčních orgánů, čili sporulaci a cyklus se dále opakuje. Vzniká sekundární a následné infekce (SCHRUFT a KASSEMEYER, 1999; RUMBOLZ a kol, 2002). 61

62 Obrázek č. 21: Hlavní vývojová stadia patogena a fáze infekce 1.. Přezimující pohlavní stádium po kopulaci antheridia s oogoniem vzniká oospora. 2..Oospora klíčí v nevětvený sporangiofor, na jehož konci se odškrtí makrosporangium se zoosporami. 3..Vniknutím zoospor do rostliny začíná fruktifikace vznikají typické olejové skvrny. 4..Uvolněním zoospor ze sporangií již větveného sporangioforu dochází ke sporulaci bělavé povlaky mycelia a sporangioforů Podmínky pro vznik infekce Onemocnění se šíří především za vlhkého deštivého a teplejšího počasí. Pro klíčení oospor je nezbytné dlouhodobější ovlhčení povrchu půdy dešťovými srážkami a vhodná teplota. K přenosu makrosporangií na hostitelské rostliny jsou zapotřebí zejména intenzivnější srážky (minimálně 10 mm/24 hod.) a vhodná teplota (min. nad 8 C, opt. 12 C a více). K vyklíčení zoospor je třeba i krátkodobější ovlhčení povrchu, vhodná teplota (min. nad 8 C, opt C a více) a dostatečně vyvinuté průduchy na hostitelské rostlině (min. velikost listů cca 20 mm x délka letorostů 100 mm). Infekce tedy může probíhat pouze ve vodním prostředí (ve vodním filmu či kapce ulpěné na povrchu listů vzniklé rosou případně deštěm) a jen v určitém teplotním rozmezí. Dle charakteru ovlhčení povrchu rostlinných pletiv se infekce rozlišují na rosné a dešťové. Další vývoj probíhá již uvnitř pletiv hostitelské rostliny až po období sporulace. Pro sporulaci je zapotřebí ovlhčení či vysoká relativní vzdušná vlhkost, vhodná teplota (min. 13 C, optimum C a více) a tma. Za příznivých podmínek dochází ke sporulaci za 4-6 hodin. Inkubační doba je nejkratší při teplotách C, přibližně 3,5-4 dny. Infekční perioda (sporulace, klíčení sporangií a infekce) může za vhodných podmínek proběhnout teoreticky za 6 hodin, prakticky ovšem cca 8-10 hodin. K časným výskytům choroby a k napadení 62

63 květenství dochází v našich podmínkách jen sporadicky (mimo pěstování ve skleníku), k pravidelnému výskytu a šíření dochází až v období po odkvětu révy (od poloviny června) (HILL, 1989; KAST, 1989; VANEK a kol, 2004) Klíčení oospor a uvolňování zoospor Pro klíčení oospor je nezbytné dlouhodobější ovlhčení povrchu půdy dešťovými srážkami a teplota minimálně 8 C, optimum je 12 C a více. Pro uvolnění zoospor stačí i krátkodobější ovlhčení listů (přeháňky, bouřky, rosa) a opět vhodná teplota. Zoospory jsou aktivní (uhnízdění a tvorba klíčních vláken) v širším rozmezí teplot cca 5-30 C s optimem C. Teplota významně ovlivňuje rychlost klíčení a tím i potřebnou dobu ovlhčení listů. Ovlhčení by nemělo být přerušeno po dobu více než 20 minut. Od uvolnění zoospor po jejich uhnízdění při splnění všech příznivých podmínek dochází přibližně za 2-4 hodiny (MÜLLER a SLEUMER, 1934; BENADA a kol., 1962; LANGCAKE a LOVELL, 1980) Inkubační doba Inkubační doba je ovlivněna především teplotou, ale i relativní vlhkostí vzduchu a pohybuje se v rozmezí 3,5-14 dní. Vývoj patogena v pletivu hostitelské rostliny probíhá v širokém teplotním rozmezí mezi 10 až 30 C, optimální podmínky jsou C. Inkubační dobou se rozumí doba od počátku infekce (obecně od počátku deště nebo ovlhčení) do objevení prvních příznaků choroby (fruktifikace). Tab.č. 13: Vliv teploty na inkubační dobu patogena (Zdroj: Teplota Inkubační doba C dny , ,

64 Sporulace Pro sporulaci je nezbytné ovlhčení listů (déšť, rosa) nebo vysoká relativní vlhkost vzduchu %, vhodná teplota (probíhá při teplotách C s optimem v rozmezí C po dobu nejméně 4 hodin) a tma (temná fáze min. 4 hod.). Minimální potřebná doba ovlhčení je 6 hodin, tj. ke sporulaci dojde pouze jsou-li všechny uvedené podmínky splněny v době mezi hod. SEČ (teplá vlhká noc). Maximální aktivita sporangií je mezi 6-8 hodinou ranní, praskání sporangií a uvolňování zoospor do prostředí je ovlivněno vlhkostí a větrem (MUŠKA a VIRGOVIČ, 1990) Přežívání sporangií Vytvořená sporangia přežívají různě dlouhou dobu v závislosti na vnější teplotě, relativní vlhkosti vzduchu a rovněž záleží, zda jsou připevněná na sporangioforech či volná. KAST (2001) tvrdí, že suchá odebraná sporangia se dají uchovat zmrazením přibližně do 2 let při 20 C, popř. celé sušené listy přes zimní období při 18 C (ale nastává vysoká mortalita) Infekční perioda Z hlediska vyhodnocení nebezpečí šíření patogena je rozhodující tzv. infekční perioda, která zahrnuje na sebe navazující sporulaci, uvolňování sporangií, klíčení a infekci. Za příhodných podmínek proběhne infekční perioda od 22 do hodin dopoledne následujícího dne, tj. po 8-10 (12) hodinách (KOLEKTIV SRS, 2000). Tabulka č. 14: Průběh infekce Primární infekce - z přezimujících oospor v pletivu napadených listů a v půdě. Sekundární infekce - probíhá za vegetace pomocí pohyblivých zoospor. 1. Klíčení oospor - vlhko, tma a stálá teplota nad 11 C (opt C). 2. Fruktifikace - vysoká relativní vlhkost vzduchu, teplotní optimum C, pak inkubační doba proběhne již za 4 dny. 3. Sporulace - uvolnění zoospor ze sporangií - vlhko, tma, stálá teplota (opt. 24 C), za příznivých podmínek proběhne za 4 hodiny. 64

65 6. Ochrana, prognóza a signalizace 6.1 Ochrana proti plísni révové Pěstitelský úspěch každého vinaře vinohradníka je závislý od zdravých a kvalitních hroznů. Základem úspěchu je jednak znalost a rozpoznání chorob a škůdců révy vinné a dobře provedená ucelená ochrana. Přednostně bychom měli uplatňovat tzv. preventivní pěstitelská opatření, omezující vhodné podmínky pro výskyt a šíření škodlivých činitelů. Jako prevenci proti plísni révové je vhodné včas provádět zelené práce a tím udržovat keře révy nepřehuštěné a vzdušné. Také pěstování odrůd s vyšší tolerancí až rezistencí omezuje nutnost chemické ochrany. Předpokladem racionální chemické ochrany je sledování vhodnosti podmínek pro výskyt onemocnění. Je to zejména množství srážek a průběh teplot. Existují systémy předpovědí, které s poměrně vysokou přesností stanoví potřebu chemické ochrany. V našich podmínkách se obvykle provádí jeden postřik těsně před květem a následně 2-3 postřiky po odkvětu v denních intervalech. V případě suchého počasí není nutné chemickou ochranu provádět. Mezi vhodné přípravky patří např. Curzate, Kuprikol, Ridomil, aj. (BRAUN A VANEK, 1990) Ochrana nepřímá Velmi významná jsou všechna preventivní opatření, která zajišťují vzdušnost porostu a keře (zkracují dobu ovlhčení) a tak redukují vhodnost podmínek pro šíření onemocnění, tj. výběr lokality, způsob vedení, správná výživa, včasné a úplné provádění zelených prací. V současné době jsou zaváděny do produkce i nové interspecifické odrůdy s různým stupněm tolerance až rezistence k plísni révové, vhodné zejména pro tzv. ekologické vinohradnictví (SEDLO, 1994) Ochrana přímá Významným faktorem jak z ekonomických, tak i ekologických důvodů je vymezení období, kdy je nezbytné chemické ošetření porostů, a to stanovením termínu prvního 65

66 ošetření a sledu potřeby dalších ošetření. Důležitým předpokladem racionální ochrany je sledování vhodných podmínek pro výskyt a šíření onemocnění. Potřeba ošetření před květem se většinou děje jen za mimořádně vhodných podmínek k výraznému rozvoji patogena. Za základní lze považovat dvě ošetření v období po odkvětu. Dále ošetřujeme dle podmínek až do fáze zaměkání bobulí. Počet a intenzita ošetření závisí na vhodnosti podmínek pro šíření choroby, intenzitě růstu a typu přípravku. V období delších suchých period ochranu neprovádíme. Pro první ošetření jsou vhodné především kontaktní, preventivně působící fungicidy. Za silnějšího tlaku upřednostníme kombinované fungicidy (kontaktní + systémové) a později pro poslední ošetření měďnaté fungicidy. Účinnost přípravků je významně ovlivněna vznikající rezistencí patogena. U systémových přípravků ze skupiny ftalimidů byla již prokázána snížená účinnost proti plísni révové. K omezení dalšího poklesu účinnosti dalších přípravků je nutné, používat různé přípravky během vegetace (stejný přípravek použít max. 2krát). U ftalimidů vzniká křížová rezistence a ani vzájemné střídání přípravků z této skupiny nezabrání vzniku rezistence (BUDÍN, 2001) Chemické přípravky Chemické přípravky na ochranu révy vinné proti plísni révové dělíme dle jejich účinné látky. Podle ní má každý přípravek různou dobu použitelnosti, dobu účinnosti i ochrannou lhůtu. Zejména znalost doby účinnosti přípravku nám pomáhá při stanovení intervalů mezi jednotlivými aplikacemi postřiků. Po jejím uplynutí, v případě trvajícího infekčního tlaku, je třeba aplikovat další postřik, aby byla ochrana účinná. Doba účinnosti je závislá především: na druhu přípravku (kontaktní či systémový přípravek) klimatické podmínky (vliv počasí) U kontaktního přípravku působí jeho účinná látka na povrchu rostliny. Po aplikaci je třeba, aby list s aplikovanou látkou dokonale oschnul. Účinnost by narušil jen dlouho trvající déšť nebo prudká přívalová bouřka (> 20 mm srážek). Přilnavost, prodloužení a ochranu účinné látky proti povětrnostním vlivům lze přidáním přídavného přípravku, většinou na bázi terpenů, do postřiku (např. Agrovital). U systémových přípravků proniká účinná látka do pletiv rostlin. Po aplikaci je nutná delší doba než postřik nabude účinnosti. Látka musí na listu nejenom oschnout, ale i proniknout (penetrovat) do pletiv rostliny, poté již deštivé počasí nezmenšuje účinnost. 66

67 V poslední době se stále více používají přípravky kombinované, obsahující účinnou látku jak kontaktní, tak i systémovou. Přípravky na ochranu proti plísni révové seřazených dle účinných látek ukazuje tabulka č. 12. Ochranná doba má hygienický charakter a omezuje riziko otravy z rezidují účinných látek postřiků. Vymezuje počet dní od doby aplikace do předpokládané sklizně příslušné plodiny (ACKERMANN a kol., 1991). Každý přípravek má své specifické vlastnosti, vycházející z použitých složek přípravku (skupenství přípravku, množství aplikační dávky, různá mísitelnost přípravků - tank mix, jiné nosné a pomocné látky, škodlivost pro člověka a životní prostředí), ale např. přilnavost na povrch listů některých měďnatých přípravků s účinnými látkami na bázi oxychloridu mědi či síranu měďnatého, nezávisí ani tak od účinné látky, ale od jemnosti částic přípravku (Vanek a kol. - GALATI, 2005). Tab.č. 15: Registrované přípravky na ochranu révy vinné proti plísni révové pro rok 2005 (sestaveno podle: SRS, 2005) Přípravky na bázi (účinná látka) Obchodní název přípravku Doba účinnosti Ochranná lhůta Azoxystrobin Quadris SC 8-12 dní 21 dní Captan Merpan 50 WP, Merpan dní 35 dní WG, Captan 50 WP Folpet Folpan 50 WP, Folpan 80 WG 8-10 dní 42 dní Hydroxid měďnatý Champion 50 WP 8-10 dní 35 dní Mancozeb Novozir MN 80, Dithane M 45, 8-10 dní 42 dní Dithane DG Neotec Metiram Polyram WG 8-10 dní 42 dní Oxychlorid mědi Kuprikol dní 35 dní Síran měďnatý -zásaditý Bordeauxská jícha (Modrá 5-10 dní 35 dní skalice), Cuproxat SC Kombinované (Cymoxanil + Mancozeb) Curzate M 8-10 dní 42 dní Kombinované (Dimethomorph Acrobat MZ dní 35 dní + Mancozeb) Kombinované (Fosetyl-Al + Mikal M dní 42 dní Mancozeb) Kombinované (Fosetyl-Al + Aliette Bordeaux WP 8-10 dní 35 dní Oxychlorid mědi) Kombinované (Mancozeb + Metalaxyl-M) Ridomil Gold MZ 68 WP dní 42 dní Kombinované (Metalaxyl-M + Ridomil Gold Plus 42.5 WP, dní 42 dní Oxychlorid mědi) 67

68 Kombinované (Tebuconazole Hattrick WP 8-10 dní 35 dní + Tolylfluanid) V poslední době se na trhu objevují stále nové přípravky proti plísni révové s různými či kombinovanými účinnými látkami. Zdálo by se, že choroba nemá šanci, ale v přírodě není nikdy nic definitivní a ekosystém nelze rozdělit na vítěze a poražené. Žádné zhoubné organismy svůj závod ve zbrojení nikdy nevzdaly. Naopak, přišly jiné, nové, zrádnější, zejména proto, že jsou schopny značně rychlé mutace. Postřiky tak zabírají již pouze vůči určitému typu, objeví-li se nová mutace, přestávají být stoprocentně účinné (KAST a kol, 2000). Patogen se stává časem rezistentním, částečně i proto, že tytéž postřiky užíváme příliš často. Je to jako začarovaný kruh pořád dokola, jak už ostatně konstatoval Darwin: Každý organismus v přírodě se snaží přizpůsobit, což znamená přijít vždy s něčím novým. My lidé vedeme nekonečný boj o přežití tak jako všechny ostatní druhy, a proto nikdy nemůžeme zcela zvítězit. Můžeme se nanejvýš velmi snažit, abychom s nepřítelem udrželi krok. Jak říká Červená královna Alence v říši divů: Musíš běžet ze všech sil, abys zůstala stát na místě. (TOMANOVÁ, 2005) 6.2 Prognóza a signalizace Studiem podmínek šíření škodlivého činitele na základě důkladného poznání jeho biologie můžeme předpovídat jeho výskyt (prognóza) a určit správný termín pro chemický zásah (signalizace). Čili pro předpověď infekčného tlaku daných chorob během vegetace nám slouží prognóza. Na optimální termín účinného postřiku proti daným chorobám nás upozorní signalizace. Role prognózy a signalizace má tedy za cíl včas určit práh škodlivosti daného patogena, správně odhadnout jeho další vývoj a navrhnout co nejoptimálnější řešení. Slouží tedy k indikaci jako kontrolní opatření (BRAUN A VANEK, 1990) Role prognózy, signalizace a práh škodlivosti Prognóza stanovuje s dostatečným předstihem (často na začátku vegetačního období) riziko výskytu škodlivých organismů. Prognózu výskytu je nutno během vegetace upřesňovat a stále sledovat výskyt škodlivých patogenů, k tomu se využívají různé metody, jako např.: 68

69 Metoda krátkodobé prognózy nebezpečí výskytu a signalizace ošetření proti plísni révové (Plasmopara viticola Berk. & Curt.) (autor Ing. P. Šteberla, SHMÚ Bratislava) Systém GALATI Vitis (autoři Ing. G. Vanek, CSc.; Doc. Dr. L. Szőke, PhD.; Ing. T. Vanek, GALATI Bratislava) Metodika prognózy a signalizace plísně révové, padlí a plísně šedé na révě vinné (autor Ing. A. Muška, ÚKSUP Bratislava) Signalizace určuje nejvhodnější termín zahájení ochrany. V úvahu se bere především intenzita výskytu a nejvhodnější doba ochranného zákroku. Při signalizaci ošetření proti houbovým patogenům se často využívá metod na základě sledování dosavadního průběhu počasí a jeho krátkodobé předpovědi. Správně provedené metody signalizace jsou přesné a výrazně omezují opakované používání ochranných opatření. Ekonomický práh škodlivosti je takový stupeň poškození rostlin, kdy ztráty na výnosech začínají převyšovat náklady na ošetření. Stanovení ekonomického prahu škodlivosti je velmi obtížné, protože závisí na ceně pesticidů + jejich aplikaci a současně závisí na výkupní ceně vypěstovaného produktu. V případech, kdy hlavním kritériem není jenom ekonomický zisk, je nutno zahájit ochranu rostlin na základě prahu škodlivosti, t.j. takového stupně poškození, který již rostliny nedokáží vyrovnat svojí regenerační schopností (KAZDA a kol., 2003) Princip prognózy a signalizace Pro omezení aplikací postřiků proti plísni révové jen na nezbytně nutné množství, si většina vinohradnických zemí vyvinula své prognostické modely. Tyto modely se zakládají na dobré znalosti klimatických podmínek nutných pro vznik infekce (teplotní a vlhkostní křivky dané oblasti). Poskytují určitou pomoc při tvorbě každoroční strategie v boji proti houbovým chorobám, jakož i základní indicie pro zvolení nejoptimálnějšího řešení. Prognóza a signalizace k plísni révové je tedy soustavná činnost, která sleduje aktuální podmínky možnosti vzniku a intenzity infekčního tlaku choroby. Prognostikuje (předpovídá) vznik choroby a signalizuje potřebnou ochranu chemickými, či biologickými přípravky a preparáty. Jen kvalitní předpověď v kombinaci se správnou aplikací chemického přípravku spolehlivěji zajistí zdravou úrodu hroznů, a to dokonce i u 69

70 citlivějších odrůd v nepříznivých (vlhkých) letech. Tyto modely nicméně často nepředpovídají skutečný kvantitativní vývoj epidemie, protože žádný z nich nemůže přesně určit sílu infekce u všech odrůd na daném stanovišti. Obecně, inklinují k přeceňování možného rizika infekce. Dnes se již pro tuto službu využívají věšinou různé počítačové programy přístupné přes internetovou sít (WWW - World Wide Web). Vychází se z poznatku, že rytmus vývinu patogena a infekce patogenem a jeho dynamika rozvoje, epidemiologie a následně rozsah spůsobených škod jsou v přímé závislosti především od aktuálního počasí, dále od probíhající fenofáze, citlivosti odrůdy, polohy, vedení, hustoty porostu, a pod. Užívatel na počátku sezóny uloží do počítače základní údaje, charakterizující danou vinici, klima lokality (zadá průměrné teploty a srážky pro každý měsíc v dané lokalitě), taktéž zadá údaje o citlivosti pěstované odrůdy (dle lokality). Poté průběžně zaznamenává informace o počasí v dané lokalitě (srážky, teploty), o použitých přípravcích a také průběhy jednotlivých fenofází. Zaběhlé programy již většinu z těchto dat generují samy automaticky. Při následné komunikaci s programem na základě zadaných dat, program oznámí míru infekčního tlaku a podle toho navrhne i zásah vhodným přípravkem na ochranu rostlin. V současné době jsou k dispozici zpravidla programy, které jsou již součástí výbavy meteorologických přístrojů, či různé samostatné programy využívající osobní počítače a služby nejbližších meteo-stanic, například přístroje od firem Amet, Metos, Meteos, Adcon, Biomat apod. Přístroje jsou umístěné ve vinohradě a zaznamenávají potřebné meteorologické údaje v nastavených frekvencích na magnetickou kartu nebo údaje přímo vysílají na modem počítače. Z programu softwaru je možno vyčíst v reálném čase stav infekčního tlaku patogena a signalizaci potřebných opatření. VANEK (2004) dále uvádí, že jakkoli dobrý program prognózy a signalizace nedokáže dostatečne omezovat chemické zásahy, jestliže není ve vinici dosaženo ekologická rovnováhy. Zkušenosti s ekologickými směry ve vinohradnictví dokazují, že réva při této rovnováze je schopna značnou část obrany prevzít na sebe, rostlina je schopná mobilizovat vlastní obranné reakce a chemická ochrana zůstává jen doplňkovým zásahem. 70

71 6.2.3 Stručná historie vzniku předpovědi a signalizace Již od počátku 20.let minulého století se mnozí odborníci (např. ISTVÁNFFI a PÁLINKÁS v Uhrách r. 1913, později v bývalém Československu pak zejména FOLTÝN) věnovali pozorování závislostí mezi meteorologickými hodnotami a výskytem chorob (všímali si zejména plísně révové). Brzy zjistili, že když se při určité minimální teplotě současně vyskytne určité množství srážek, nastanou předpoklady pro infekci. Signalizace ošetření se poté určuje podle délky inkubačního období závisejícího od dané teploty. Kolem roku 1930 francouz ARNAUT publikoval předpověď plísně révové podle rytmu dešťů v zimním a jarním období, přičemž kladl důraz na nadnormální srážky od listopadu do dubna a od května do června. V šedesátých letech 20-tého století z podnětu V. ZACHA vzniká v tehdejším Československu nová škola zabývající se právě prognostickými metodami. Její stoupenci (Makeš, Muška, Šteberla, aj.) přistupovali ke vztahu hostitel versus patogen na principu předpovědi dle rytmu srážek zejména v jarním období. Existují však i jiné principy předpovědí (TRAN MANH SUNG a kol., 1990), vycházející z předpokladu, že na sílu jarní infekce má rozhodující vliv množství přezimujících spór; a dále tzv. PaS metody založené na základě sledování teplot a četnosti optimálních teplot pro patogena (např. u padlí révového; VANEK, 2004). Budoucností jsou takové programy, které vhodně spojí všechny tyto principy, tj. principy krátkodobé i dlouhodobé prognózy a navíc budou brát v úvahu i další specifické okolnosti jako agrotechniku, volbu odrůdy, přesnou lokalitu, atd. (MUŠKA, 1986) Krátkodobé předpovědi a signalizace Principem těchto metod je porovnání křivky kumulativního úhrnu srážek s křivkou prognostického grafu vhodnosti podmínek pro výskyt plísně révové. Vyhodnocování vhodnosti podmínek vyžaduje sledování dešťových srážek pomocí srážkoměru. Naměřené údaje jsou tedy použitelné jen v blízkosti srážkoměrné stanice (3 km). Dešťové srážky se sledují od poloviny května a jejich týdenní úhrn (součet denních úhrnů) se každý týden jako kumulativní úhrn (součet týdenních úhrnů od počátku května) vynáší do prognostického grafu (viz. obr. č. 20). Spojnice vynesených bodů tvoří křivku průběhu dešťových srážek a podle jejího průběhu se vyhodnocuje nebezpečí výskytu plísně révové. 71

72 Obr.č. 22: Základní model prognostického grafu bez srovnávací křivky kumulativního úhrnu srážek (Zdroj: SRS, 2000; BUDÍN, 2003; GALATI, 2005) Legenda - pokud se křivka úhrnu srážek pohybuje v oblasti: a) nekalamitního výskytu (pod křivkou B) - je signalizováno ošetření po odkvětu a další cca za dní. b) sporadicko-kalamitního výskytu (mezi křivkami A a B) - v období 2 týdny před květem, je signalizováno ošetření před květem a další dvě ošetření po odkvětu v intervalu dní - v době kvetení a krátce po odkvětu jsou signalizována tři ošetření po odkvětu v intervalu cca dní c) kalamitního výskytu (nad prognostickou křivkou A) - provádí se pravidelné ošetření v intervalu 5-14 dní (podle úrovně infekčního tlaku, intenzity růstu a použitého přípravku) až do doby zaměkání bobulí Dlouhodobé předpovědi intenzity výskytu chorob Nástupem stále výkonější počítačové techniky a lepší poznání bionomie patogenů se v některých zemích objevují plně automatizované prognostické předpovědi. Algoritmy dnes využívaných metod prognózy a signalizace jsou zpravidla chráněným know-how. Mají svoje výhody i nevýhody podle toho, na které prvky dávají autori důraz. Všechny programy pracují s daty týkající se průběhu počasí (Podmínky pro prvotní nákazu jsou když za 24 hodin naprší víc jak 10mm srážek, minimální teplota neklesne pod 10 C nebo průměrná denní teplota pod 13 C. Podmínkou druhotné nákazy je 2 5 mm srážek a doba ovlhčenosti listů při teplotě nad 10 C aspoň 3 5 hodin); průběhu srážek (Čím vydatnější jsou srážky v jistém období, tím déle vlhká perioda proniká do následujícího suchého období); průběhu infekce (Sleduje se infekční perioda a sporulace); průběhu fenologického vývinu révy vinné (preventivní ochrana zelených částí zahrnující 72

73 postřiky těsně před kvetením, ihned po odkvětu a další dle potřeby) Většina dat se získává s automatických meteorologických stanic a vyhodnocení provádí počítačový program (má uživatelskou a servisní verzi) zabezpečující předpověď plísně révové (peronospóry), padlí révového (oidia), plísně šedé a bílé hniloby hroznů. Obsahuje také návrh chemické ochrany na základě reálného infekčního tlaku, přičemž zohledňuje citlivost odrůd na jednotlivé choroby, vliv stanoviště apod. Tyto programy využívá zejména ekologické vinohradnictví a integrovaná produkce. Obr.č. 23: Ukázka plně automatizovaného prognostického grafu (Zdroj: HAASBROEK a VERMEULEN, 2000) 73

74 Experimentální část 7. Cíl práce Cílem práce bylo zhodnotit zdroje rezistence révy vinné proti plísni révové (Plasmopara viticola /Berk. & Curt./ Berlese & de Toni) a posoudit možnosti jejich využití ve šlechtitelském procesu. Toho bylo dosaženo zejména testováním vybraných interspecifických odrůd, řadících se dnes již k druhu Vitis vinifera L., na odolnost proti plísni révové, vzájemným křížením těchto vybraných odrůd a následným zhodnocením získaného rostlinného materiálu. Dalším cílem této práce byl právě vývoj metody kultivace a množení plísně révové, včetně metody testování odolnosti šlechtitelského materiálu vůči patogenu v laboratorních podmínkách. K hodnocení rostlinného materiálu byl použit modifikovaný deskriptor vycházející z původního deskriptoru OIV (1983) vypracovaný pro révu vinnou. Cíle práce je možno shrnout do následujících bodů: - Nakřížení požadovaného výchozího materiálu. - Možnosti kultivace plísně révové. - Metody testování odolnosti proti plísni révové. - Testování odolnosti získaných semenáčů proti plísni révové. - Analýza získaných potomstev. 74

75 8. Materiál a metodiky 8.1 Nakřížení požadovaného výchozího materiálu Výběr výchozího materiálu Výběr rodičovských odrůd vycházel z obecného názoru, že právě tyto vybrané odrůdy mají určitou vyšší odolnost až rezistenci proti plísni révové, viz. některé práce jako: KOZMA, Jr., 2000; KORBULY, 2000 a 2002; KRAUS, 2005; a je tedy pravděpodobné, že při vzájemném křížení těchto odrůd mezi sebou vznikne vyšší procento odolnějších jedinců. Do pokusu (k vzájemnému křížení) byly vybrány tyto odrůdy: Bianca, Hibernal, Hibia, Kunleany a Merzling z vinice Mendelea ZF MZLU. Mezi nejodolnější odrůdy k plísni révové patří zejména odrůda Bianca (VANEK a kol., 1995; KOZMA, Jr., 2000). Odrůdy Merzling a Hibernal jsou nejen poměrně odolné k plísni révové, ale navíc splňují i předpoklad výroby kvalitního vína (BECKER, 2000; BASLER a PEFNNINGER, 2000). Nicméně pro potvrzení domněnky, že odrůda Hibernal již není zdaleka tak odolná, jak se obecně uvádí, se do pokusu přidal i hybrid Hibia. Odrůda Kunleany pro údajnou vyšší odolnost k plísni révové a dobrý přenos této vlastnosti do potomstev, navíc odolnost i k plísni šedé (Botryotinia fuckeliana /de Bary/ Whetzel.) a vynikající mrazuvzornost (KORBULY, 2000) Stručné popisy rodičovských odrůd BIANCA Synonyma: Egri Csillagok 40, Ecs 40. Původ odrůdy: Jedná se o maďarskou odrůdu, vyšlechtili ji J. Csizmazia a L. Bereznai v Egeru, křížením odrůd Villard Blanc (SV ) x Bouvierův hrozen. Charakteristika: List je středně velký, lesklý, hladký, trojlaločnatý s nevýraznými laloky až celokrajný. Řapíkový výkrojek je lyrovitý, otevřený. Řapík je středně dlouhý až dlouhý, narůžovělý. 75

76 Hrozen je středně velký, kuželovitý s křidélky, vzdušný. Průměrná hmotnost hroznu je 118g. Bobule středně velká, kulatá, zelenožluté barvy. Dužnina je řídká, neutrální chuti. Odrůda má středně bujný růst, později raší i kvete, zraje v polovině září. Odolnost vůči plísni révové je vysoká, padlí révovému opět vysoká a plísni šedé téměř úplná. Je citlivější k červené spále a je náchylnější ke sprchnutí. V nepříznivých letech hůře vyzrává réví, ale dobře regeneruje a obrůstá z podoček a spících pupenů. Plodnost je střední 8-12 t.ha -1, cukernatost v moštu je kg.hl -1, obsah kyselin je 8-10 g.l -1. Víno je typické odrůdové (podobné odrůdě Műller-Thurgau), s vyšším obsahem alkoholu, s výrazným buketem a vyššími kyselinami, které se rychle odbourávají HIBERNAL Synonyma: Geisenheim , Gm Původ odrůdy: Odrůdu vyšlechtil H. Becker a kol. v Geisenheimu (Německo) jako semenáč druhé filiální generace křížením odrůd Chancellor (Seibel 7 053) x Ryzlink rýnský kl Charakteristika: List je středně velký, spíše celokrajný. Čepel je vrásčitá a lehce zvlněná. Bazální výkrojek je úzce otevřený, ve tvaru písmene V. Řapík je středně dlouhý, zelený. Hrozen je malý, kuželovitý, středně hustý až hustý. Průměrná hmotnost hroznu je 112g. Bobule je malá, kulatá, hnědavě-žlutozelená. Dužnina řídká až chruplavá, sladké chuti. Odrůda je středně bujného až bujného růstu, vyniká vysokou mrazuvzdorností. Raší i kvete středně pozdně, dozrává koncem září až začátkem října. Odolnost k plísni révové je střední až vysoká, k padlí révovému rovněž střední až vysoká, k plísni šedé střední. Odrůda dobře snáší vápenité půdy. Plodnost je středně vysoká t.ha -1, cukernatost v moštu je kg.hl -1, obsah kyselin je 8,5-12 g.l -1. Víno je harmonické, plné, odrůdového charakteru podobné Ryzlinku rýnskému, s velmi příjemnou vůní. 76

77 HIBIA Synonymum: BV Původ odrůdy: Jedná se o českou odrůdu, vyšlechtěnou M. Michlovským a kol., vzniklou křížením odrůd Hibernal x Bianca. Charakteristika: List je středně velký, puchýřnatý, mírně trojlaločnatá až celokrajný. Bazální výkrojek je lyrovitý, otevřený. Řapík je středně dlouhý, narůžovělý. Hrozen je malý, kuželovitý, středně hustý. Průměrná hmotnost hroznu je 110g. Bobule je malá, kulatá, zelenožlutá. Dužnina je řídká, neutrální chuti. Odrůda je bujného růstu, réví vyzrává dobře. Raší i kvete středně pozdně, dozrává koncem září až začátkem října. Má vysokou odolnost vůči mrazům, houbovým chorobám i škůdcům. Plodnost je středně vysoká 9-12 t.ha -1, cukernatost v moštu je kg.hl -1, obsah kyselin je 8-11 g.l -1. Víno je harmonické, s jemným buketem kvetoucí louky, který později může přecházet až do dozrávajícího banánu KUNLEANY Synonymum: A -5-18, Kunleáni Původ odrůdy: Maďarská bílá moštová odrůda vyšlechtěná v Budapešti křížením odrůd (V. amurensis x V. vinifera F2 ) x Afus Ali. Charakteristika: List je středně velký, pětilaločnatý, se středně hlubokými výkroji. Bazální výkrojek je lyrovitý, většinou uzavřený s průsvitem. Řapík je středně dlouhý, výrazně narůžovělý. Hrozen je středně velký, kuželovitý, křídelnatý, středně hustý. Průměrná hmotnost hroznu je 139g. Bobule je středně velká, kulatá, žlutozelené barvy. Slupka je pevná, dužnina velmi řídká, sladké chuti. Odrůda je středně bujného růstu. Raší i kvete poměrně raně, zraje však až začátkem října. Odolnost vůči plísni révové je střední, k padlí révovému nižší, plísni šedé téměř úplná. Občas dochází k poškození jarními mrazy, ale dobře regeneruje. Plodnost je vyšší 8-14 t.ha -1, cukernatost v moštu je kg.hl -1, obsah kyselin je 6-8 g.l -1. Víno je jemné, stolního typu, s aroma i kyselinami. 77

78 MERZLING Synonyma: FR , F-2 Původ odrůdy: Německá odrůda vyšlechtěna N. Beckerem a kol. ve Freiburgu, křížením odrůd Seyval (SV 5 276) x (Ryzlink rýnský x Rulandské šedé). Charakteristika: List je středně velký, tří až pětilaločnatý s mírnými výkroji. Řapíkový výkrojek je lyrovitý, uzavřený. Horní strana listu je kožovitá, spodní jemně plstnatá. Řapík je středně dlouhý, zelené barvy. Hrozen je středně velký, kuželovitý, občas s křidélkem, středně hustý až hustý. Průměrná hmotnost hroznu je 143g. Bobule je středně velká, kulatá, žlutozelená, při přezrávání s hnědavým líčkem. Slupka je pevná, dužnina velmi řídká, sladké chuti. Odrůda má středně bujný růst, réví vyzrává dobře. Raší i kvete středně raně, brzy zaměká i zraje. Dozrává v polovině až koncem září. Odolnost k plísni révové je středně vysoká, padlí révovému rovněž středně vysoká, plísni šedé střední až nízká. Plodnost je vysoká t.ha -1, cukernatost v moštu je kg.hl -1, obsah kyselin je 7,5-11 g.l -1. Víno má příjemnou odrůdovou vůni po Ryzlinku rýnském, je harmonické, s jemnými kyselinami. (Zdroj: Sotolář - Multimediální atlas odrůd révy, 2006) Kastrace a opylení Všechny odrůdy nekvetou ve stejnou dobu a proto je nutné vývoj rostlin pozorně sledovat. Později kvetoucí odrůdy lze o několik dnů předrychlit pomocí igelitového obalu navléknutým na keř. Ke kastraci vybíráme jen řádně vyvinutá květenství vespod letorostu (ostatní květní laty nad nakastrovaným květenstvím odstraníme), taktéž samotný letorost by měl vyrůstat z horních oček a měl by mít rovný vzpřímený růst. Těsně před začátkem kvetení se provede kastrace na květenství budoucí mateřské odrůdy. Kastrace spočívá včasném odstranění čepičky (okvětních lístků) a všech tyčinek s prašníky, aby nedošlo k opylení vlastní pylem. Kastrace se provádí ručně prsty nebo pomocí speciální pinzety. Je nezbytné dbát na sterilitu rukou a pinzety. Vykastrovaná květenství byla většinou ihned opylena. Na drobných výrůstcích na blizně papily, se vytváří hustý lepkavý sekret většinou o něco dříve, než dozrají pylová zrna v prašnících. Pokud pyl otcovské odrůdy není ještě k dispozici, musí se vykastrované květenství izolovat, nejčastěji navléknutím papírového či celofánového sáčku. 78

79 Pyl se odebírá z otcovské odrůdy z plně rozvinutých kvítků oklepáním do Petriho misek, při dostatku květenství se mohou takto sbírat i plně nakvetlá celá květenství. Takto sesbíraný pyl se dá uchovat v ledničce při teplotě 4-6 C i několik dnů. Ideálním obdobím pro opylení je v dopoledních hodinách mezi 8-11 hodinou (rozkvétá nejvíce kvítků). Pyl se na blizny nanáší štětečkem. Na květenství se připevní papírový sáček s popisem daného křížení a datumem provedení. Sáčky je nutno kontrolovat a dle potřeby měnit (SEDLO, 1994; POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998). Obr.č. 24,25,26: Ukázka izolace, kastrace a opylení květenství (Zdroj: POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998) Sklizeň a stratifikace semen Jestliže byla kastrace a následné opylení a oplození úspěšné, začnou se záhy postupně objevovat a vyvíjet bobule. Střapec který takto vzniká, je povětšinou řidší. Hrozny se nechávají na keřích dobře vyzrát pro dobře vyvinutá semena, proto je třeba sáčky při dozrávání odstranit (vybarvení bobulí) a označit jmenovkou, popř. i zvýraznit stužkou apod. Po vyluštění semen z bobulí (ručně nebo nakvášením) se semena uloží v suché větratelné místnosti až do stratifikace (prosinec, leden). Ještě předtím je dobré namočit semena do vody, a ty které vyplavou na povrch, ihned vyloučíme neboť nejsou klíčivá (POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998). Před výsevem se semena stratifikují ve vlhkém písku v jednotlivých vrstvách podle příslušného křížení (kombinací). Stratifikace probíhá v proti myším zabezpečené nádobě ve sklepě či krechtu (při teplotě 2 8 C a vlhkosti 70 80%) nebo i venkovním prostředí. Možná je i stratifikace namáčením po 2-3 týdny v měkké vodě (SEDLO, 1994). ŘÍHA (2001) uvádí i za možnou stratifikaci uložení semen minimálně na 1 měsíc dole v ledničce (tep C) kopírování přírodních podmínek (kombinace sucha a pak následně vlhka a chladna). Snahou je maximálně odstranit vliv kyseliny abscisové a zabránit tzv. 79

80 přeléhavosti semen. Během stratifikačního procesu dochází k postupnému odbourávání inhibičních látek a k postupnému vzrůstu hladiny giberelinů. K odbourání kyseliny abscisové dochází v průběhu zhruba dvou až tří týdnů. Potom začíná stoupat hladina endogenních giberelinů, ve čtvrtém týdnu cytokininů a v sedmém týdnu auxinů. Vzestup auxinů je následkem ukončené stratifikace a souvisí se začínajícím klíčením (PROCHÁZKA, 1998) Výsev semen Semena se vyséváme od poloviny února do začátku března, do multisadbovačů 1,5-2,0 mm hluboko, na vzdálenost 20 mm. Jako substrát se používá písek s rašelinou v poměru 1:1 nebo kompostová zemina smíchaná s pískem 2:1. Semena umístíme do vytápěného skleníku, kde se pravidelně dvakrát denně zavlažují. Teplotu prostředí udržujeme při 25 C a semena asi po třech týdnech vyklíčí. Ještě před samotným vysazením je dobré namořit semena a po jejich vyklíčení malé rostlinky ošetřit proti houbovým chorobám. Po vytvoření 2-3 pravých listů se semenáčky přepichují do hrnků (ø90-120mm). (SEDLO, 1994; POSPÍŠILOVÁ a KORPÁS, 1998) 8.2 Možnosti úchovy a kultivace plísně révové Možnost množení a uchování plísně révové byla donedávna prakticky jen jediná a spočívala v neustálém přemnožování plísně (většinou na řízkovancích) pro tvorbu sporangií a spór. V poslední době se neustále provádí pokusy o snadnější kultivaci patogena, zejména uchování agresivních izolátů specifických ras patogena, schopných napadat i dříve velmi odolné (až rezistentní) hybridy a odrůdy. Máme spousty nových poznatků o životnosti sporangií, aktivitě zoospor a obranných reakcích rostlin Tzv. ze sušiny Suchá sporangia odebraná z napadených částí rostlin (izoláty) je podle KASTA (2001) možné skladovat přibližně po 2 roky při 20 C. Testy na životnost sporangií prokazovaly, že při teplotách vyšších (22-23 C a vyšší) se životnost sporangií pohybuje jen do dvou dnů, přičemž při teplotách okolo 20 C vydrží prokazatelně 3-5 dní. S nižší teplotou sporangia déle přežívají, jsou schopná růstu, ale s klesající životností (vysoká 80

81 mortalita). Vlhkost má vliv na jejich růst a uvolňování (aktivitu) zoospor, teplota pak na jejich životnost (KAST a STARK-URNAU, 2002) Kontinuální množení Prakticky jde o neustálé přemnožení plísně (cyklicky po cca 2 měsících) na řízcích či semenáčcích náchylných nebo sledovaných odrůd nebo jejich hybridů ve skleníku (nejčastěji na tzv. Garden množárenských stolech). Při kontinuálním screeningu lze využívat i použité infekční terče ihned po vyhodnocení (zůstává tak zachován původní rasově specifický izolát). Kontinuální množení je nejefektnější způsob udržení daného izolátu (vzorku) v dostatečném počtu a v dobré kondici (okamžitá použitelnost). (BARLASS, 1986; MERDINOGLU a kol., 2001) Jen čerstvá sporangia jsou správně aktivní, tj. při kontaktu s vodou (vytvoření inokulační suspenze) jsou uvolněny téměř všechny zoospory do 30 minut. Sporangia stará již 3-7 dní neuvolňují zoospory ne dříve jak za 180 minut (KAST a STARK-URNAU, 2002). 8.3 Metody testování odolnosti semenáčů proti plísni révové Laboratorní test tzv. terčíková metoda V dnešní době nejrychlejší a nepoužívanější metoda. Jde o snadnou metodu vycházející ze znalostí vývojových cyklů patogena při sekundárních a následných infekcích. Princip: Z plně vyvinutých mladších neinfekčních listů daného hybrida či odrůdy (konkrétně ze 4-6 kolénka od báze) odebereme vzorek, tj. 3-6 listových terčíků pokud možno z každého listu, korkovrtem o průměru 25 mm. Terčíky položíme horní plochou listové čepele na destilovanou vodou nasycený filtrační papír v Petriho misce (o průměru 100 mm). Listové fragmenty se dále infikují sporami patogena (LEHOCZKY, 1956). Vzorky plísně révové (sporangia) odebíráme z olejových skvrn, které buďto vysušíme (suchá odebraná sporangia můžeme skladovat přibližně 2 měsíce při 20 C; KAST a kol, 2000) nebo dále přemnožujeme na čerstvých listech příslušných odrůd v laboratoři (BARLASS a kol, 1986) či odebereme izolát přímo z infekční vinice (BROWN a kol., 1999). Infekční 81

82 suspenzi (inoculum - inokulát) připravíme jednoduchým způsobem tak, že 3-4 čerstvé infekční listy (nebo cca 5 plně infekčních terčíků) ponoříme do kádinky s destilovanou vodou (500 ml) a necháme minimálně půl hodiny odstát, kdy se do roztoku uvolní maximální počet sporangií. Starší listy uvolňují menší počet sporangií po delší dobu (Sporangia stará 3-7 dní neuvolňují zoospory dříve než za cca 180 minut; KAST a STARK- URNAU, 2002). V takto získaném čerstvém inokulu bývá přibližně sporangií v jediném mililitru. Toto množství je pro správný chod inokulace plně dostačující (je však třeba mikroskopicky jej ověřit). Poté 6 ml infekční suspenze (inokulát) se pomocí rozprašovače stejnoměrně nanese na šest připravených terčů v Petriho misce. V množství použitých sporangií pro inokulaci se pochopitelně všechny použité práce lehce liší. Je totiž velmi obtížné až nemožné použít vždy naprosto shodné množství spor pro následnou infikaci. Kultivace dále probíhá ve sterilním prostředí klimaboxu při 21±2 C a světelné periodě 12 hod.(den/noc). U všech pokusů bylo provedeno procentické vyhodnocení napadených částí disků vždy každý pátý den po infekci + následná kontrola po 7 dnech od inokulace. Tato technika slouží jako lehce použitelná provokační metoda zcela nezávislá na ročním období (BARLASS a kol, 1986; BROWN a kol., 1999; KAST a kol, 2000; KOZMA a kol, 2003) Klasické provokační metody - umělá infekce v pařeništi či skleníku Jde o donedávna velmi oblíbené a nenáročné standardní metody sloužící k ověření odolnosti nakříženého potomstva proti plísni révové. Rostlinný materiál se uměle infikuje (většinou pomocí postřikovače), podmínkou je stoprocentní relativní vlhkost, teplota C a pravidelné střídání světelné a temné fáze (12 hod.den/noc). Inokulum je připraveno jako u terčíkové metody (inokulace spodní strany listové min. 5 x 10 4 sporangia.ml -1 ). K udržení 100% relativní vlhkosti po 24 hodin a k zajištění potřebné infekce je třeba rosičů (ve sklenících se používá navíc i polyethylenová stanová množárna). Po inokulaci se stany ihned uzavřou (u pařeniště položíme okna). Po 24 hodinách se stany otevřou a rostliny nechají oschnout. O den později, jsou opět uzavřeny a otevřou se jen kvůli závlaze rostlin až do konce hodnocení. Tok vody a transpiraci držíme co nejblíže maximální vzdušné vlhkosti 100%. Pro omezení slunečního svitu a teploty na 21±2 C se využívají stínovky (v létě úpal, příliš vysoká 82

83 transpirace a teplota.). Světelná perioda se udržuje na 12 hod., možno použít přisvětlování. Vyhodnocení je přibližně stejné jako u terčíkové metody, čili po dnech od inokulace (BROWN a kol., 1999; KOZMA a kol, 2003). 8.4 Deskriptor k vyhodnocení provokačních metod Podle charakteru pokusu (např. testování účinnosti chemických přípravků proti plísni révové, polní screening u registračních zkoušek, aj.) se pro následné vyhodnocení úrovně napadení plísní révovou u rodu Vitis spp. používají různé deskriptory (klasifikátory), jako OIV, IPGRI, UPOV, EPPO aj. Tyto klasifikátory jsou však až příliš složité, obsahují příliš mnoho úrovní napadení, přechody mezi těmito jednotlivými stupni nejsou úplně přehledně stanoveny, a proto si mnozí autoři zabývající se testováním plísně révové vytvořili vlastní jednodušší modifikace (podrobný popis deskriptorů viz. Literární část kapitola 4.5). Podle potřeby konkrétního testování (interspecifických hybridů), pro přesnější a rychlejší vyhodnocování byl modifikován a využit deskriptor podle KOZMA a DULA (2003). Tab.č.16: Modifikovaná stupnice napadení plísně révové vycházející z deskriptoru míry napadení interspecifických hybridů podle KOZMA a DULA (2003) Úroveň Procento napadení Příznaky 1 0 0,5% Symptomy nebo hypersensitivní reakce, malinké skvrny, bez sporulace 2 0,5 10% Hypersensitivní reakce, velmi lehká sporulace % Hypersensitivní reakce, lehká sporulace % Velké olejové skvrny, silná sporulace 5 > 50% Velké olejové skvrny, velmi silná sporulace, nekrózy Tato upravená stupnice pak sloužila k vyhodnocení daných pokusů při vyhodnocování všech použitých metod v této práci. 83

84 9. Výsledky 9.1 Křížení daných odrůd Variabilita odolnosti k plísni révové byla studována ve dvou hybridních populacích v křížení s amurskou révou (Vitis amurensis RUPR. x Vitis vinifera L. x Franco-American hybrid); a v křížení čistě tzv. franko-amerických hybridů (Franko-americký hybrid x Vitis vinifera L.) ve všech možných kombinacích. Odrůdy Bianca, Merzling, Kunleany, Hibernal a Hibia byly kříženy vzájemně mezi sebou konkrétně takto: 1. Křížení hybridů Seyve Villarda a Seibela ( Bianca, Hibernal, Merzling ) s Vitis amurensis RUPR.( Kunleány ). 2. Křížení Franko-amerických hybridů vzájemně mezi sebou ( Bianca, Hibernal, Merzling, Hibia ). 3. Ověření přenosu genů odolnosti odrůdy Hibernal (vzájemné křížení mezi odrůdami Hibernal, Bianca, Hibia ). Celkem bylo provedeno 18 recipročních křížení (kombinací) Kastrace a opylení v roce 2002 Nakřížení požadovaného materiálu probíhalo po dva roky (2002 a následně 2003). U všech kombinací byly vždy nakastrovány a opyleny většinou minimálně tři květenství. Průběh kvetení u všech odrůd v daném roce byl poznamenán srážkovými dny a kolísavou teplotou. Jako první nakvétala odrůda Kunleany (v genomu obsahuje geny V. amurensis Rupr.), tj a o den později i odrůda Merzling. Obě odrůdy mají poměrně velké jednotlivé květy s krátkou čnělkou, tudíž kastrace (odstranění květní čepičky s tyčinkami a prašníky) jde velmi rychle a snadno. Až o devět dní později nakvétaly i ostatní odrůdy. Odrůda Hibernal má ze všech použitých odrůd v pokuse nejmenší kvítky (kratičkou čnělku) a nejhustší květní latu. Kastrování této odrůdy jde obtížněji a trvá delší dobu (cca minut). Obtížněji se kastruje i odrůda Bianca. Poměrně velké kvítky s protáhlou kalyptrou obsahují dlouhou křehkou čnělku, která i přes velkou snahu bývá při kastraci dosti často poškozována. Odrůda Hibia se i přestože tvoří menší květy kastruje poměrně snadno a dobře. Nepřízní počasí ( významné srážkové dny, prům. teplota jen 16,4 C, max. teplota 22,4 C) všechny odrůdy netvořily dostatek pylu po celou dobu kvetení. Bohužel 84

85 vlivem velmi rozdílného kvetení (rané odrůdy Kunleany, Merzling pozdní Hibia, Bianca, Hibernal ), obtížným kastrováním ( Bianca, Hibernal ) a dalšími nepředvídatelnými vlivy (počasí, mechanické poškození) byl konečný počet získaných semen nižší oproti původním předpokladům (min. 50 ks od kombinace), a proto bylo nutné téměř všechna křížení zopakovat i příští rok. Celé období kvetení trvalo 14 dnů od (viz. tab.č.17). Tab.č. 17: Jednotlivá křížení provedená v roce 2002 Nakastrované a opylené květní Datum Křížení - kombinace laty (ks) Kunleany x Merzling 10* Merzling x Kunleany Kunleany x Hibernal Merzling x Hibernal Merzling x Bianca Kunleany x Bianca Hibia x Merzling Bianca x Merzling Bianca x Hibia Merzling x Hibia Bianca x Hibernal Bianca x Merzling Bianca x Kunleany Hibernal x Bianca 6* Hibernal x Merzling Hibernal x Kunleany Hibernal x Hibia Hibia x Bianca Hibia x Hibernal 3 Poznámka: * u některých kombinací došlo ke ztrátě opylených květenství (nedošlo k oplození nebo došlo k vylomení letorostu) Kastrace a opylení v roce 2003 Průběh kvetení u všech odrůd v daném roce byl abnormálně rychlý díky horkým slunečním dnům a vysokým teplotám (průměrná teplota byla 22,3 C, maximální pak 30,7 C zdroj: Meteorologická stanice Mendeleum v Lednici). Jako první nakvétala opět odrůda Kunleany, a to již 29. května V rychlém sledu následovaly odrůdy Merzling, Hibia, Hibernal a Bianca. Kvetení probíhalo 7 dnů od (viz. tab.č.18). Všechny odrůdy tvořily dostatek pylu po celou dobu kvetení. 85

86 Tab.č. 18: Jednotlivá křížení provedená v roce 2003 Datum Křížení - kombinace Nakastrované a opylené květní laty (ks) Kunleany x Merzling Merzling x Kunleany Merzling x Hibernal Kunleany x Hibernal Hibia x Merzling Hibernal x Kunleany Hibernal x Merzling Bianca x Kunleany Bianca x Merzling Kunleany x Merzling 4* Kunleany x Hibernal Merzling x Kunleany Merzling x Bianca Merzling x Hibia Hibia x Hibernal Kunleany x Hibernal Kunleany x Bianca Merzling x Kunleany Merzling x Hibernal Merzling x Bianca Hibernal x Merzling Hibernal x Kunleany Bianca x Hibernal Bianca x Kunleany Kunleany x Bianca Merzling x Hibia Bianca x Merzling Bianca x Hibernal Hibia x Bianca Bianca x Hibia Hibernal x Bianca Bianca x Hibia Hibernal x Hibia 2 Poznámka: * u některých kombinací došlo ke ztrátě opylených květenství (nedošlo k řádnému opylení a oplození nebo došlo k vylomení letorostu) Sklizeň a stratifikace semen Nakastrovaná a opylená květenství pak byla průběžně kontrolována a doplněna o barevné jmenovky (výstražné oranžové barvy) s datem opylení a nakříženou kombinací. Asi 14 dnů před zaměkáním bobulí (červenec/srpen) byla z hroznů odstraněna větší část papírového sáčku (2/3) pro lepší vyzrávání bobulí. Zbylá část sáčku u báze hroznu plní docela dobrou roli jako jakýsi plašič proti špačkům (Sturnus vulgaris L.). Hrozny se sklidily asi v polovině října ( a 2003). 86

87 Po vyluštění semen z bobulí (ihned po sklizni hroznů) byla semena namořena přípravkem Fundazol 50 WP (0,1 %) a uložena v suché větratelné místnosti, aby dostatečně oschla (min. 3 týdny). Následně proběhla stratifikace semen ve speciální bedničce naplněnou vlhkým pískem a zabezpečenou proti myším. Semena byla uložena v jednotlivých vrstvách podle příslušného křížení (kombinací). Stratifikace probíhala ve sklepě při vlhkosti min. 75% a průměrné teplotě 9 C Výsev semen Semena byla vyseta v polovině ledna ( a ) do multisadbovačů, 1,5 mm hluboko, jako substrát se použil písek a rašelina 1:1, a byla umístěna do vytápěného skleníku, kde se pravidelně dvakrát denně zavlažovala. Teplota se pohybovala mezi 22 až 25 C. Po vytvoření 2-3 pravých listů se semenáčky přepíchaly do hrnků o průměru 80 mm (později pak 120 mm). Bohužel vlivem počasí a velmi rozdílného kvetení (rané odrůdy Kunleany, Merzling pozdní Hibia, Bianca, Hibernal ), obtížným kastrováním ( Bianca, Hibernal ) a dalšími nepředvídatelnými vlivy (mechanické poškození, špatná klíčivost semen) činil počet získaných semenáčků z křížení probíhajícího v roce 2002 jen 694 kusů z celkového počtu semen (viz. Tab.č.19). Tab.č.19: Počty získaných semen a následně semenáčků za rok 2002 Nakastrovaná květenství (ks) Získaná semena (ks) Získané rostliny (ks) Křížení Bianca x Merzling Bianca x Hibernal Bianca x Kunleany Bianca x Hibia Kunleany x Bianca Kunleany x Hibernal Kunleany x Merzling Hibernal x Bianca Hibernal x Kunleany Hibernal x Merzling Hibernal x Hibia Merzling x Bianca Merzling x Hibernal Merzling x Kunleany Merzling x Hibia Hibia x Bianca Hibia x Merzling Hibia x Hibernal (ks) (ks) 694 (ks) 87

88 V následujícím roce 2003 se i přes poměrně krátké květní období všech daných odrůd, způsobené velmi vysokými teplotami (průměrná teplota byla 22,3 C, maximální pak 30,7 C zdroj: Meteorologická stanice Mendeleum v Lednici), se podařilo získat semenáčků z semen (viz. níže Tab.č.20). O víkendových dnech února 2004 žel byly některé semenáčky napadeny a zcela zničeny lalokonoscem rýhovaným (Otiorhynchus sulcatus Fabricius), (Foto viz. Příloha obrázky č.23-26), a do pokusu k ověření odolnosti k plísni révové přišlo tedy jen 573 semenáčků z celkového počtu ks vzešlých! Bohužel tedy i přes veškeré vynaložené úsilí získat co nejvíce nakastrovaných a opylených květních lat v brzkém horkém létě roku 2003, a tím dostatek semen a semenáčků pro následné testování jejich odolnosti proti plísni révové, byla část semenáčků zcela zničena dospělci lalokonosce rýhovaného (Otiorhynchus sulcatus Fabricius) jenž se ve skleníku objevil ve velkých počtech. Téměř okamžitě byl aplikován přípravek Furadan 350 F, nicméně již bylo žírem zničeno (cca 550 ks) semenáčků. Taktéž některé slabé rostlinky (poškozené nebo s bílými virózními skvrnami na listech jenž se nedaly použít jako terče a také příliš slabě rostoucí semenáče) byly z dalšího pokusu vyřazeny. Tab.č.20: Počty získaných semen a následně semenáčků za rok 2003 Nakastrovaná květenství (ks) Získaná semena (ks) Získané rostliny (ks) Křížení Bianca x Merzling Bianca x Hibernal Bianca x Kunleany Bianca x Hibia Kunleany x Bianca * Kunleany x Hibernal * Kunleany x Merzling * Hibernal x Bianca Hibernal x Kunleany Hibernal x Merzling Hibernal x Hibia Merzling x Bianca * Merzling x Hibernal * Merzling x Kunleany * Merzling x Hibia Hibia x Bianca Hibia x Merzling Hibia x Hibernal (ks) (ks) (ks) 88

89 *Semenáče byly napadeny lalokonoscem rýhovaným (Otiorhynchus sulcatus Fabricius). Do dalšího pokusu k testování těchto semenáčků proti plísni révové byla použita jen zbylá část semenáčů z této kombinace křížení Klíčivost semen v jednotlivých kombinacích Dále byla taktéž stanovena klíčivost v jednotlivých hybridních kombinacích (viz. obr.27 a 28). Klíčivost je vyjádřena v procentech a rozdělena podle použitých odrůd v vzájemných kříženích na klíčivost z pohledu matečné odrůdy a následně otcovské v jednotlivých kombinacích. V následujících dvou grafech je již znázorněna celková klíčivost z obou dvou sledovaných let z pohledu použitých odrůd ve vzájemných kříženích jako matka versus otec. Nejvyšší celkovou klíčivost semen za oba dva sledované roky z pohledu mateční odrůdy vykazovala odrůda Kunleany = 69,66%, dále odrůda Bianca = 63,72%, Merzling = 59,20%, podobně odrůda Hibia = 54,63% a nejhůře klíčila semena u mateční odrůdy Hibernal = 24,12%. Průměrná celková klíčivost byla 54, 27%. Obr. č : Celkové klíčivosti z obou dvou sledovaných let z pohledu použitých odrůd ve vzájemných kříženích jako matka versus otec Celková klíčivost (matka) 2002 a 2003 [ % ] 59,20% 63,72% 24,12% 69,66% 54,63% Bianca Hibernal Hibia Kunleany Merzling 89

90 Celková klíčivost ( otec ) 2002 a 2003 % 42,30% 65,71% 54,64% 62,20% 65,38% Bianca Hibernal Hibia Kunleany Merzling Nejvyšší celkovou klíčivost semen za oba dva sledované roky z pohledu otcovské odrůdy vykazovala odrůda Bianca = 65,71%, podobně odrůda Hibernal = 65,38%, Hibia = 62,20%, dále odrůda Kunleany = 54,64% a nejhůře klíčila semena u otcovské odrůdy Merzling = 42,30%. Průměrná celková klíčivost byla 58, 05%. Nejlepší klíčivost vykazovala odrůda Bianca. U odrůdy Bianca nedošlo tolik k významnému výkyvu v klíčivosti semen jako u ostatních odrůd (prům.64,72% za oba roky), nicméně je třeba připomenout, že zisk semen nebyl tak velký jako u jiných kombinací (viz. Tab.19 a 20). Naopak u odrůdy Hibernal došlo k významnému poklesu klíčivosti jestliže byla tato odrůda použita jako mateční (klíčivost semen dosahovala jen 24,12%). Obecně lze říci, že celková klíčivost semen byla nízká, celkově dosahovala 56,156% v součtu obou let Ošetřování a semenáčků Po vysetí semen do plastových sadbovačů byly vzešlé semenáčky přesazeny do kontejnerů (o průměru 80 mm, později pak 120 mm) a umístěny ve skleníku při teplotě mezi 22 až 25 C, kde pokračoval jejich růst do vývinu zhruba šestého listu (do konce měsíce května). Po celou dobu jejich růstu nebyla aplikována žádná chemická ochrana, mimo přípravku Furadan 350 F v roce 2004 proti broukům lalokonosce rýhovaného. V této fázi byly i odebrány vzorky listů pro laboratorní testování. Po otestování semenáčků metodou umělé infikace terčů (tzv. terčíkovou metodou) byly semenáčky přemístěny do studeného pařeniště (v měsíci červnu). Teplota se 90

91 regulovala skly a ventilací, vlhkost rosiči. (teplota C, vlhkost 90%). Semenáče se pravidelně zavlažovaly, provádělo se kypření a zelené práce (držet jeden letorost na rostlinu). Semenáče nebyly chemicky ošetřovány proti žádným houbovým chorobám. Po adaptaci a dobrém prokořenění a růstu přesazených semenáčů v pařeništi byla následně provedena provokační zkouška odolnosti ( a ). Náhodně vybrané vyhodnocené semenáče (pro nedostatek místa vždy jen 10 ks od kombinace) k plísni révové získané v roce 2002 a otestované v roce 2003 byly přes zimu uskladněné ve vlhkém písku ve sklepě a na jaře roku 2004 vysazeny do volné půdy vinohradu (polní pokus prověření míry polní odolnosti). Semenáče se zakrátily na délku mm, kořenový systém na délku 50 mm a mimo horních dvou oček (pupenů) vyslepíme všechny očka na výhonu. Semenáče vysazujeme podle kombinací jednotlivých křížení do sponu 1,5 x 0,15 m (0,15 m od sebe v řádku a 1,5 m meziřadí - dle mechanizace) a řádně je označíme. Každá kombinace je směsí heterogenních semenáčů, které se navzájem většinou značně liší. Jejich hodnocení probíhalo v měsíci srpnu při přirozeném tlaku choroby (popis průběhu počasí a infekčního tlaku plísně révové v roce 2004, viz kap.č ). 9.2 Úchova a kultivace plísně révové Úchova sporangií plísně révové na infekčních zchlazených listech Čerstvé silně napadené listy plísní révovou (slité olejové skvrny zabírající přes 60% listové čepele) odebrané z vinice Mendelea na odrůdě Müller Thurgau (cca 35 ks) byly vloženy do igelitového sáčku a následně dány dolů do ledničky (zn. Minsk 10) při teplotě cca 5-8 C. Vždy po pěti dnech byla provedena kontrola životnosti sporangií, mikroskopicky viz. BENADA a kol., (1962): Sporangia si mohou uchovat klíčivost až 10 dní. U klíčivého sporangia je plazma homogenní, přilehlá ke stěnám, bílá, silně světlolomná. U Sporangia, které ztratilo klíčivost, je plazma zrnitá, od stěny odstálá a málo světlolomná. Pokus byl založen Ze spodní strany infekčních listů byl skalpelem odebrán vzorek sporangií (snaha minimalizovat fragmenty sporangioforů) a mikroskopicky 91

92 zkontrolována jejich životnost (laboratorním mikroskopem Olympus BX41). Další kontrola proběhla za 5 a poté 10 dnů. I po pěti dnech byl pozorován dostatek živých sporangií, sedmý den však došlo k zhnědnutí listů, což se projevilo úbytkem živých sporangií při hodnocení desátý den. Po 15-ti dnech již nebyla pozorována žádná živá sporangia (viz. obrázky č.29-32). Obr.č. 29,30,31,32: Čerstvá sporangia/po pěti/deseti dnech/15 dnech (mikroskop Olympus BX41, zvětšení 60x; foto autor, 2002) Obr.č. 33: Detail živých sporangií při zvětšení 100x (foto autor, 2002) 92

93 9.2.2 Úchova sporangií plísně na přirozeně seschlých a zamrazených infekčních listech Seschlé silně napadené listy plísní révovou (olejové skvrny zabírající přes 60% listové čepele), opět odebrané z odrůdy Müller Thurgau (cca 35 ks), byly vloženy do igelitového sáčku a následně do mrazícího boxu ledničky (zn. Minsk 10) při teplotě -18 C. Vždy po sedmi dnech byla provedena mikroskopicky kontrola životnosti sporangií. Podle KASTA (2001) je totiž možné uchovat tyto sporangia při 20 C přibližně až po 2 roky. S nižší teplotou sporangia déle přežívají, jsou schopná růstu, ale s klesající životností (vysoká mortalita). Vlhkost má vliv na jejich růst a uvolňování (aktivitu) zoospor, teplota pak na jejich životnost (KAST, 2001; KAST a STARK-URNAU, 2002). Tento jednoduchý test na životnost sporangií, žel neprokázal skutečnost, že jsou sporangia schopna přežít delší dobu při minusových teplotních hodnotách. V těchto podmínkách přečkají pouze oospory. Oospory, ale nebyly nalezeny. Tvrzení ISTVÁNFFIHO (1904), že plíseň révová je schopna přečkat zimní období mimo oospor i tlustoblannějším myceliem se při těchto podmínkách také nepotvrdilo. Již při první kontrole sedmý den od založení pokusu ( ) byla všechna sporangia mrtvá. Pokus byl opakován se stejným výsledkem. Obr.č. 34 a 35: Sporangia před a po ukončení pokusu (Olympus BX41 při zvětšení 40x) 93

94 9.2.3 Úchova a kultivace plísně v in vitro podmínkách Kultivace sporangií plísně révové na agarovém kultivačním médiu MURASHIGE-SKOOG I přes pečlivé prohledání všech literárních pramenů se nepodařilo dohledat žádnou metodiku kultivace plísně révové na agarovém kultivačním médiu, vyjma zmínky, že se to údajně povedlo jistému Piothovi, viz. BENADA a kol. (1962): Jen velmi složitou a nákladnou metodikou se zdařilo vypěstovat plíseň révovou v in vitro podmínkách Piothovi v roce 1957, jenže to bylo již před 50 lety a onu metodiku se nepodařilo dohledat. Z čehož usuzuji, že kultivace plísně révové na médiu v podmínkách in vitro není možná. Nicméně byl proveden pokus k ověření této myšlenky. Jako růstové médium bylo použito klasické modifikované médium MS (MURASHIGE-SKOOG, 1962) - MURASHIGE-SKOOG A22 (viz. tabulka č.21) určené pro révu vinnou. Médium připravíme dokonalým rozvařením agaru, poté přidáváme adekvátní množství zásobních roztoků v pořadí: makroelementy, roztok chloridu vápenatého, mikroelementy, vitamíny, fytohormony, síran železnatý, Na 2 EDTA a sacharózu (30 g. l -1 ). Upravíme ph na hodnotu 6,2-6,5 pomocí 5% vodného roztoku NaOH. Médium se dále vloží do autoklávu na dobu 25 minut, při teplotě 120 C a přetlaku 100 kpa. Dále byl odebrán infekční materiál zespod listu s čerstvými olejovými skvrnami ze standardní citlivé odrůdy Müller-Thurgau z vinice Mendelea (červenec-srpen 2002). Sterilovaným očkem byl odebrán nepatrný vzorek sporangií (pokud možno bez shluku sporangioforů) ve sterilních podmínkách flow boxu a tento byl nanesen na kultivační médium v nádobkách o objemu 2 dcl se 40 ml média (tzv. skleničky od kojenecké výživy ). Pokusné nádobky byly přeneseny do kultivační místnosti s intenzitou osvětlení Luxů za použití zářivek studeného bílého světla, režim osvětlení byl stálý střídání 12 hod. světla a 12 hod. tmy, teplota v rozmezí C. Zhledem k předpokládanému negativnímu výsledku se zhotovila ještě další tři stejná média, kde se však použily jen jednoduché cukry v poměru 30 g. l -1 fruktózy, 30 g. l -1 glukózy a kombinace obou g. l -1 fruktózy a glukózy. Kultivace plísně se ani v jednom případě nezdařila. 94

95 Tab.č. 21: Složení kultivačního média Modifikované MS (MURASHIGE-SKOOG A22) podle LABOŇOVÁ, 2003 Obsahové látky Množství (mg.l -1 ) NH 4 NO KNO MgSO 4 x 7H 2 O 370 KH 2 PO CaCl 2 x 2H 2 O 440 FeSO 4 x 7H 2 O 27 Na 2 EDTA 37 MnSO 4 16,9 ZnSO 4 x 7H 2 O 8,6 Na 2 MoO 4 x 2H 2 O 0,25 CuSO 4 x 5H 2 O 0,025 H 3 BO 3 12,4 KI 0,83 CoCl 2 x 6H 2 O 0,025 AlCl 2 x 6H 2 O 0,025 Sacharóza Agar (Plant Agar) BA 1,5 IBA 0,03 Thiamin 2 Kyselina nikotinová 1 Glycin 2 Myo-inositol 100 ph 6,3 Po nezdaru s cukernou složkou MS A22, byla změněna podstata tohoto média přidáním obsahu zhomogenizovaného listu révy vinné do agaru. Další postup v přípravě konečného média i pokusu s cukernou složkou byl pak shodný s předešlým pokusem. Pokus byl tedy přesto opakován s tím rozdílem, že do media byl přidán homogenizát z listů révy (odrůdy Müller-Thurgau ). Žel je nutno konstatovat, že i v tomto případě byl výsledek negativní Kultivace sporangií plísně révové na kultuře ve zkumavkách Pokus byl založen v srpnu Jako výchozí materiál pro založení in vitro kultury byly použity mladé 50 mm fazochy (tzv. zálístky - osy letorostu druhého řádu) odrůdy Müller-Thurgau, pěstované v technické izolaci (podle metodiky SCHENK a 95

96 HILDERBRANDT, 1972; LABOŇOVÁ, 2003). Při odběru musí být zahradnické nůžky vždy u každé další rostliny dezinfikovány 70% etanolem, aby se zabránilo případnému přenosu endogenních infekcí. Odebrané segmenty rostlin ihned desinfikujeme ponořením do vodného 0,2% roztoku HgCl 2 s kapkou smáčedla, po dobu 5-ti minut. Opláchnutí se provádí sterilní destilovanou vodou (provádí se nejméně 3x). Povrchová dezinfekce probíhá ve sterilních podmínkách flow boxu. Po sterilaci jsou řezné plochy segmentů zpravidla poškozeny sterilizačním činidlem, proto se doporučuje odříznout koncová část explantátu (cca 3-4 mm). Poté explantáty umístíme do kultivačních nádob zapíchnutím do živného média - úžlabní meristém, krytý řapíkem, by však měl zůstat neponořen (KŘIŽAN a kol., 2004). Podle LABOŇOVÉ (2003) se pro kultivaci zálístkových explantátů osvědčilo modifikované médium MURASHIGE-SKOOG A22 (viz. níže tabulka č. 22). Médium připravíme standardně dokonalým rozvařením agaru (cca v jedné čtvrtině celkového objemu média). Poté přidáváme adekvátní množství zásobních roztoků v pořadí: makroelementy, roztok chloridu vápenatého, mikroelementy, vitamíny, fytohormony, síran železnatý, Na 2 EDTA a sacharózu (30 g. l -1 ). Upravíme ph na hodnotu 6, pomocí 5% vodného roztoku NaOH. Médium se dále vloží do autoklávu na dobu 25 minut, při teplotě 120 C a přetlaku 100 kpa. Po zakořenění 50 kusů explantátů (12-14 dní) ve zkumavkách o objemu 0,5 litru se provedla infikace za sterilních podmínek flow boxu, nanesením čerstvých sporangioforů s aktivními sporami plísně révové, očkem na spodní strany listů. K infikaci byly použity sterilní diskové izoláty z kontinuálního množení (terče v Petriho miskách). Zkumavky byly následně uzavřeny uzávěrem z hliníkové folie pro udržení maximální vzdušné vlhkosti a odneseny do kultivační místnosti. Podmínky kultivační místnosti byly následující: intenzita osvětlení Luxů za použití zářivek studeného bílého světla, režim osvětlení stálý střídání 12 hod. světla a 12 hod. tmy, teplota v přísném rozmezí C. Teploty vyšší než 25 C způsobují žloutnutí explantátů a tím úhyn plísně! Naopak teploty nižší zpomalují růst explantátů a umožňují tak prodloužení kultury (GALZY a kol., 1990). 96

97 Tab.č. 22: Složení kultivačního média Modifikované MS (LABOŇOVÁ, 2003) Obsahové látky Multiplikace (mg.l -1 ) Kořenění (mg.l -1 ) NH 4 NO KNO MgSO 4 x 7H 2 O KH 2 PO CaCl 2 x 2H 2 O FeSO 4 x 7H 2 O Na 2 EDTA MnSO 4 16,9 16,9 ZnSO 4 x 7H 2 O 8,6 8,6 Na 2 MoO 4 x 2H 2 O 0,25 0,25 CuSO 4 x 5H 2 O 0,025 0,025 H 3 BO 3 12,4 12,4 KI 0,83 0,83 CoCl 2 x 6H 2 O 0,025 0,025 AlCl 2 x 6H 2 O 0,025 0,025 Sacharóza Agar (Plant Agar) BA 1,5 0 IBA 0,03 1,2 Thiamin 2 10 Kyselina nikotinová 1 1 Glycin 2 0 Myo-inositol ph 6,3 6 Kultivace plísně révové ve zkumavkách na zakalusených zálistcích je možná, nicméně je nutné překonat problémy s udržením dokonalé sterility zejména při odběru sporangií. Pravděpodobně díky této skutečnosti přežily pouze dvě nainfikované rostlinky z celkového počtu padesáti kusů. Při dodržení optimální teploty, vysoké vlhkosti a opt. režimu osvětlení došlo dále k šíření plísně na lístečcích rostlinek, které pak vydržely necelé dva měsíce (do doby než došly živiny v médiu). Je nutno říci, že takto získáme (uchováme) jen omezené množství sporangií, vhodné jen k možné dlouhodobější úchově cenných izolátů (agresivních ras plísně) s možností okamžitého přemnožení na rostlinách např. v nádobách ve skleníku. 97

98 Obr.č : Kalusová a zálístková kultura v in vitro podmínkách (Foto:autor, 2003) Kontinuální přemnožování plísně z infekčních terčů Jde momentálně o nejběžnější způsob kultivace plísně révové, zejména pro úchovu nových odolných a agresivních ras patogena, ať již k některým účinným látkám používaným při chemické ochraně proti plísni révové či některým odrůdám jako takovým (dříve považovaných jako dostatečně odolné). (KAST a kol., 2000; MERDINOGLU a kol., 2003; GOBBIN, 2004) K zabezpečení dostatku aktivních sporangií pro infekci na testování odolnosti nakříženého hybridního potomstva sloužily zejména nainfikované disky po otestování jednotlivých předchozích kombinací. Primární infekční listy byly odebrány z vinice Mendelea z odrůdy Müller-Thurgau. Testování probíhalo po dva roky ( ) od měsíce května do srpna. Životnost disků se obvykle pohybovala dnů (než zahnědly). Při kontinuálním screeningu se tedy využívají i použité infekční terče ihned po vyhodnocení (zůstává tak zachován původní rasově specifický izolát). Kontinuální množení je nejefektnější způsob udržení daného izolátu (vzorku) v dostatečném počtu a v dobré kondici (okamžitá použitelnost). (BARLASS, 1986; MERDINOGLU a kol., 2001) Jen čerstvá sporangia jsou správně aktivní, tj. při kontaktu s vodou (vytvoření inokulační suspenze) jsou uvolněny téměř všechny zoospory do 30 minut. Sporangia stará již 3-7 dní neuvolňují zoospory ne dříve jak za 180 minut (KAST a STARK-URNAU, 2002). 98

99 9.3 Testování odolnosti proti plísni révové Laboratorní test pomocí listových disků (terčíková metoda) Jde o přesnou metodu vycházející ze znalostí vývojových cyklů patogena při sekundárních a dalších cyklických infekcí. Pokus probíhal ve tvou etapách ( ) vždy shodným způsobem. Po únorové stratifikaci byla semena vyseta do multiplat ve skleníku, následně pak byly semenáčky přepíchány do kontejnerů o průměru 80 mm, později pak 120 mm, a dále kultivovány. Koncem května byla část semenáčů vysázena do pařeniště, část do polního pokusu a zbylá část byla ponechána ve skleníku pro odběr kontrolních disků. Z plně vyvinutých neinfekčních listů odebraných ze 4-6 kolénka od báze se odebral vzorek, tj. min. 2 listové terčíky z každého listu, korkovrtem o průměru 25 mm. Tyto listy, respektive stáří těchto listů, obvykle poskytnou spolehlivější hodnocení než další starší listy (STAUDT a KASSEMEYER, 1995). Disky se dále nainfikovaly sporami patogena z infekčních listů kontrolní odrůdy Müller-Thurgau, odebraných z vinice Mendelea. Kultivace probíhala ve sterilním prostředí klimaboxu při 22 C, 100% relativní vzdušné vlhkosti a periodického střídání světla a tmy v 12-ti hodinových intervalech. Každý pátý a sedmý den po infekci se provedlo vyhodnocení. K vyhodnocení se použil modifikovaný pěti bodový deskriptor KOZMY a DULY, ( vycházející ze starší stupnice OIV, 1983), konkrétně takto: ,5% symptomy nebo hypersensitivní reakce, drobné skvrny, bez sporulace 2. 0,5-10% hypersensitivní reakce, velmi lehká sporulace % hypersensitivní reakce, lehká sporulace % olejové skvrny, silná sporulace 5. > 50% olejové skvrny, velmi silná sporulace, sporangia, nekrózy. Tato technika slouží jako lehce použitelná provokační metoda zcela nezávislá na ročním období a většina disků snadno podléhá plísni révové, přičemž ještě v době hodnocení (4-6 dní) jsou většinou ještě dostatečně svěží a zelené (BROWN a kol., 1999). Jako kontrola byla vybrána citlivá bílá moštová odrůda Müller-Thurgau a matečné rostliny. 99

100 Otestování odolnosti rodičovských odrůd Nejprve bylo třeba zjistit (potvrdit či popřít) míru odolnosti samotných rodičovských odrůd. Testování proběhlo na řízkovancích daných odrůd terčíkovou metodou. Dřevité řízky parentálních odrůd spolu se standardní citlivou odrůdou Müller Thurgau (používanou jako kontrola ke zjištění že inokulum je aktivní a následné míry napadení), dlouhé cca 350 mm byly odebrány v měsíci lednu ( ) z vinice Mendelea a umístěny do vytápěného skleníku pro zakoření. K pokusu pak bylo využito vždy dvacet dobře prokořeněných nejlépe rostoucích rostlin od každé odrůdy. Po odebrání listů ( ) byla provedena jejich umělá infikace terčíkovou metodou (postup viz. kapitola 8.3.1) a po 7 dnech provedeno vyhodnocení, viz. tabulka č. 23. Zcela náhodou se zjistilo, že se na nainfikovaných diskových listových fragmentech z odrůdy Bianca, které byly standardně vyhodnoceny po 7 dnech stupněm jedna čili bez příznaků a které byly dále ponechány v podmínkách klimaboxu, že se na těchto discích zhruba po dnech také objevovala mírná sporulace plísně révové! Tab.č. 23: Testování filiální generace na odolnost proti plísni révové terčíkovou metodou (2003) Rezistentní Rez/Tol Tolerantní Citlivá Náchylná Odrůda Úroveň (stupeň) rezistence Celkem Bianca :0 Kunleany :3 Merzling :4 Hibia :5 Hibernal :17 Muller-Thurgau :18 V tabulce č.23 jsou odrůdy seřazeny od nejodolnější ( Bianca ) po nejvíce náchylnou ( Müller-Thurgau ). Výsledky potvrdily obecný názor, že odrůda Bianca má velmi vysokou odolnost k plísni révové. Případné příznaky se projevují až po 18 dnech (v optimálních in vitro podmínkách), zejména při silnější koncentraci inokula (dvojnásobná koncentrace). Velmi odolná se zdá být i odrůda Kunleany. Uspokojivé výsledky dávaly i odrůdy Merzling a Hibia, které se taktéž jeví jako dostatečně odolné. Jen tolerantní až 100

101 citlivá byla odrůda Hibernal, podobně jako senzitivní odrůda Müller-Thurgau. Závěrem lze říci, že lednický izolát plísně révové odebraný z vinice Mendelea roku 2003 je destruktivní k interspecifické odrůdě Hibernal, která vůči němu de facto pozbyla svých vlastností odolnosti. Různé stupně odolnosti u sledovaných odrůd ukázky transparentních terčů ukazuje obr.č.38. Obr.č. 38: Obrazová stupnice napadení disků u matečních odrůd včetně kontrolní odrůdy Müller Thurgau Otestování nakřížených semenáčů v roce