Allergenicity kit, BAT tabletky vs. účinné látky

Transkript

1 Allergenicity kit, BAT tabletky vs. účinné látky Pavol Bologa Janka Nosková Jela Petrisková Nina Kojtálová Uživateľské stretnutie prietokovej cytometrie Beckman Coulter, Bořetice,

2 Bazofily Ich granulá sa farbia bázickými farbivami na tmavomodro Aktivované sú počas zápalu, predovšetkým pri alergickej reakcii Cirkulujú v krvi, morfologicky sú podobné mastocytom Obsahujú veľké množstvo zápalových mediátorov (histamín) Obsahujú vysokoafinitný receptor pre imunoglobulín IgE (Fc RI)

3 Allergenicity Kit (1) Kit určený na stanovenie alergie na bunkovej úrovni Požadovaná populácia buniek je označená zmesou monoklonalných protilátok (CD3-PC7-CD203c-PE- CRTH2-FITC) za prítomnosti alergénu Erytrocyty sú lyzované a vzorky meriame na cytometri Navios Beckman Coulter Po vylúčení T lymfocytov (CD3 pozit. bunky) sú analyzované len bazofily a to na základe expresie CRTH2 a CD203c

4 Neaktivované bazofily sú identifikované ako CRTH2 poz. CD203c slabo pozit. CD3 negat. Aktivované bazofily sú identifikované ako CRTH2 poz. CD203c silne pozit. CD3 negat. Allergenicity Kit (2)

5 Alergény navodzujú aktiváciu bazofilov prepojením ich povrchových IgE, čo vedie k uvoľneniu medátorov a expresii aktivačných znakov na povrchu bazofilov Allergenicity Kit (3)

6 Allergenicity Kit (4) CD203c- povrchový znak, sa nachádza len na bazofiloch a je rozpoznaný protilátkou 97A6 (ektonukleotid pyrofosfatáza/fosfodiesteráza 3) CRTH2-chemoatraktantná receptor homologická molekula exprimovaná na Th2 lymfocytoch, ide o receptor, ktorý má spojenie s G-proteínmi a slúži ako receptor pre prostaglandín D2 (PGD2)

7 Allergenicity Kit (5) Pre každého pacienta sa spolu s alergénom meria pozitívna aj negatívna kontrola Negatívna kontrola - pufor PBS Pozitívna kontrola - lyofilizát (0,2 mg, obsahuje PBS s BSA v koncentrácii 2 mg/ml)

8 Negatívna kontrola nezrazená krv + PBS + monoklonová protilátka + aktivačný roztok Pozitívna kontrola nezrazená krv + monoklonová protilátka + anti IgE (stimulačný účinok)+ chemotaktický peptid N-formyl-Met-Leu-Phe (fmlp) (nešpecifická stimulácia) Vzorka nezrazená krv + účinná látka (riedenie 1:10, 1:100) + monoklonová protilátka Inkubácia 30 v termostate pri 37 o C, lýza, premytie, meranie.

9 Allergenicity Kit (6) Aktivačný roztok tlmivý roztok obohatený vápnikom, ktorý umožňuje navodenie in vitro procesu aktivácie bazofilov Stopovací roztok tlmivý roztok obsahujúci EDTA, ktorý v podmienkách in vitro zastavuje proces aktivácie bazofilov Lyzačný roztok hlavnou zložkou je cyklický amín, ktorý po kontakte s karboanhydrázou na povrch erytrocytov, vytvára látku, ktorá má na erytrocyty vysoko lytické účinky

10

11 BAT indikácie - Lieková alergie - Alergia na hmyz (včela, osa) - Alergia na potraviny a inhalačné alergény

12 BAT - negat. a pozit. kontrola Negat. kontrola hodnota nesmie byť väčšia ako 5 % Pozit. kontrola hodnota nesmie byť menšia ako 10 %

13 BAT kritérium pozitivity pre vzorky Lieky - 5 % aktivovaných bazofilov Potraviny a inhalačné alergény - 15 % aktivovaných bazofilov Hmyz (včela, osa) - 10 % aktivovaných bazofilov

14 Ak na stimuláciu nepoužívame presne definované účinné látky, ale používame tabletky

15 V čom rozpúšťame tabletky?

16 Liekopis: Penicilín - mierne rozpustný vo vode, lepšie v etanole, éteri, chloroforme a organických rozpúšťadlách. Doxycyklin veľmi málo rozpustný vo vode, dobre rozpustný v zriedených kyselinách a hydroxidoch, nepatrne rozpustný v alkoholoch, prakticky nerozpustný v chloroforme a dietylétere. Paracetamol mierne rozpustný vo vode, ľahko rozpustný v etanole 96%, veľmi ťažko rozpustný v éteri a v dichlórmetáne. Pyrazolon ťažko rozpustný vo vode, dobre rozpustný v dichlórmetáne a v alkohole 96%, dobre rozpustný v éteri. Fenobarbital ťažko rozpustný vo vode, dobre rozpustný v etanole 96% a v éteri. S alkalickými hydroxidmi, uhličitanmi a s amoniakom tvorí vo vode rozpustné zlúčeniny. Fenacetin - veľmi málo rozpustný vo vode, je rozpustný vo vriacej vode(1:70), rozpustný v alkohole (1:16). Prednizol - prakticky nerozpustný vo vode, ťažko rozpustný v etanole 96% a v dichlormetáne.

17 Ako pôsobia rozpúšťadlá na bunky?

18 Voda, fyziologický roztok Etanol vyzrážanie DNA Chloroform denaturácia bielkovín Dietyléter dezinfekčný prostriedok Kyseliny koagulácia bielkovín Hydroxid prechádza bielkovinou Organické rozpúšťadlá - prchavé kvapaliny s negatívnym účinkom na centrálny nervový systém, periférne nervy, na kožu, dýchací systém, myokard, pečeň, krvotvorné tkanivo, rozmnožovací systém.

19 Pracujeme so živými bunkami. Cieľ udržať bunky živé.

20 Ak sa nerozpustí účinná látka, možno sa rozpustia adjuvanciá

21 Rozpúšťame tabletku vo vode (vo fyziologickom roztoku, PBS) BAT pozitívny výsledok Na ktorú zložku tabletky? Máme istotu, že máme v roztoku obsiahnutú aj účinnú zložku? Ak nie, je to pozitivita na adjuvanciá? Ak áno na ktoré? Nachádzajú sa aj v iných tabletkách? Ktorých sa má pacient vyvarovať?

22 Rozpúšťame tabletku vo vode (vo fyziologickom roztoku) BAT negatívny výsledok Máme istotu, že máme v roztoku obsiahnutú aj účinnú zložku? Môžem lekárovi vydať výsledok ako negatívny?

23

24 Ak ku stimulácii použíjeme presne definované účinné látky BAT pozitívny výsledok Na danú účinnú zložku. BAT - negatívny výsledok Na danú účinnú zložku.

25 BAT účinné látky: V ponuke máme asi cca 80 alergénov

26 BAT - Rozšírenie laboratórnej diagnostiky alergií - Diagnostika alergických a pseudoalergických reakcií nedokázaných serologickými testami - Žiadne riziko pre pacienta - Vyšetrenie väčšieho počtu alergénov z malého množstva vzorky

27 Ďakujem za pozornosť