Univerzita Karlova. Přírodovědecká fakulta. Klinická a toxikologická analýza

Transkript

1 Univerzita Karlova Přírodovědecká fakulta Klinická a toxikologická analýza Anna Haunerová Fotosyntéza a aktivita šikimátdehydrogenasy kostřavy v závislosti na podmínkách kultivace Photosynthesis and shikimate dehydrogenase activity of Festuca rubra in relation to cultivation conditions Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: doc. RNDr. Helena Ryšlavá, CSc. Praha 2017

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne: Podpis: 2

3 Abstrakt Měnící se klimatické podmínky, především sucho, mají vliv na rostlinný metabolismus. Cílem práce bylo zjištění vlivu různých podmínek kultivace rostlin na aktivitu dvou enzymů: ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasy (Rubisco) a šikimátdehydrogenasy (SDH). Jako modelová rostlina byla zvolena kostřava (Festuca rubra L.), která pocházela ze čtyř různých stanovišť v západním Norsku. Tato stanoviště se lišila nadmořskou výškou a ročním úhrnem srážek. Rostliny byly dále pěstovány v růstových komorách, které simulovaly extrémní podmínky z původních stanovišť, a to z hlediska vlhkosti a teploty. V extraktech z listů kostřavy byla stanovena koncentrace rozpustných proteinů a aktivita Rubisco a SDH. Bylo zjištěno, že podmínky v růstových komorách působily mírný stres, který nebyl natolik silný, aby ovlivnil aktivitu Rubisco, ale byl dostatečný k tomu, aby ovlivnil aktivitu SDH. V růstových komorách, ve kterých byl držen suchý režim, byla aktivita SDH vyšší než v růstových komorách s vysokou vlhkostí. SDH může být tedy součástí odpovědi rostliny na stres z nedostatku vody. Klíčová slova kostřava, ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa, rostlinný stres, šikimátdehydrogenasa, 3

4 Poděkování Ráda bych především poděkovala doc. RNDr. Heleně Ryšlavé, CSc. za veškerou podporu, trpělivost a ochotu při vedení mé bakalářské práce. Také bych ráda poděkovala doc. RNDr. Zuzaně Münzbergové, Ph.D. a Mgr. Blance Vlasákové, Ph.D. za možnost podílet se na tomto projektu a za poskytnuté vzorky, informace a rady. V neposlední řadě děkuji své rodině a přátelům za neutuchající podporu při studiu a potřebnou motivaci. 4

5 Obsah 1 Teoretická část Calvinův cyklus Karboxylace ribulosa-1,5-bisfosfátu Redukce 3-fosfoglycerátu na glyceraldehyd-3-fosfát Regenerace ribulosa-1,5-bisfosfátu Ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa Regulace ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasy Fotorespirace Syntéza aromatických aminokyselin a sekundárních metabolitů Syntéza aromatických aminokyselin šikimátovou drahou Šikimátdehydrogenasa Sekundární metabolity Abiotický stres Nedostatek vody Nadbytek vody Cíl práce Experimentální část Chemikálie Přístroje Metody Pěstování rostlin kostřavy Příprava extraktů z listů kostřavy Stanovení aktivity ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasy Stanovení aktivity šikimátdehydrogenasy Stanovení koncentrace rozpustných proteinů Zpracování výsledků Výsledky Koncentrace rozpustných proteinů v listech kostřavy Aktivita šikimátdehydrogenasy v listech kostřavy Aktivita ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa v listech kostřavy Diskuze Závěr Citovaná literatura

6 Seznam zkratek AMP ATP DHQD HEPES NAD + NADP + PEP PVP RuBP Rubisco SDH 2-amino-2-methylpropanol adenosintrifosfát dehydrochinátdehydratasa N-2-hydroxyethylpiperazin-N`-2-ethansulfonová kyselina nikotinamidadenindinukleotid nikotinamidadenindinukleotidfosfát fosfoenolpyruvát polyvinylpolypyrrolidon ribulosa-1,5-bisfosfát ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa šikimátdehydrogenasa 6

7 1 Teoretická část 1.1 Calvinův cyklus V Calvinově cyklu dochází k přeměně CO 2 na jednoduché redukované organické sloučeniny, procesu též nazývanému asimilace CO 2. V této přeměně jsou využity produkty světelné fáze fotosyntézy, NADPH a ATP (1). Cyklus je pojmenován po Melvinu Calvinovi, kterému se společně s Andrewem Bensonem a Jamesem Basshamem podařilo v letech objasnit mechanismus, kterým cyklus fotosyntetické asimilace CO 2 probíhá, za což mu byla v roce 1961 udělena Nobelova cena za chemii. Cyklus lze rozdělit do tří fází: karboxylace, redukce a regenerace (Obr. 1). Obr. 1 Tři fáze Calvinova cyklu se stechiometrií (v závorkách), převzato a upraveno z (2). Ačkoli je Calvinův cyklus součástí temnostní fáze fotosyntézy a dalo by se předpokládat, že funguje za nepřítomnosti světla, vzhledem k regulačním procesům některých enzymů, které ke své aktivitě světlo vyžadují, v rostlinách Calvinův cyklus bez světelného záření neprobíhá (3). 7

8 1.1.1 Karboxylace ribulosa-1,5-bisfosfátu V této části dochází ke klíčovému ději cyklu, a to k připojení CO 2 na akceptorovou molekulu ribulosa-1,5-bisfosfátu (RuBP) za vzniku dvou molekul 3-fosfoglycerátu. Tuto reakci katalyzuje enzym ribulosa-1,5- bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa (EC ), často zkracována jako Rubisco. Karbamoyl na Lys 201 na sebe váže vodík z třetího uhlíku RuBP a způsobuje izomerizaci molekuly z keto na reaktivní endiolovou formu (Obr. 2). Obr. 2 Mechanismus karboxylace RuBP v Calvinově cyklu, převzato a upraveno z (3). Ta následně váže molekulu oxidu uhličitého za vzniku β-oxokyseliny (Obr. 3), která je dále hydratována. Hydratovaný intermediát hydrolyzuje za vzniku dvou molekul 3-fosfoglycerátu. Obr. 3 Vznik dvou molekul 3-fosfoglycerátu z nestabilního meziproduktu v Calvinově cyklu, převzato a upraveno z (3). 8

9 1.1.2 Redukce 3-fosfoglycerátu na glyceraldehyd-3-fosfát V této části cyklu je 3-fosfoglycerát fosforylován za vzniku 1,3-bisfosfoglycerátu (Obr. 4), tuto reakci katalyzuje enzym fosfoglycerátkinasa (EC ) za spotřeby ATP. Dále je 1,3-bisfosfoglycerát redukován NADP dependentní glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasou (EC ) na glyceraldehyd-3-fosfát, který je triosafosfátisomerasou (EC ) izomerován na dihydroxyacetonfosfát. Obr. 4 Redukce 3-fosfoglycerátu na glyceraldehyd-3-fosfát a dihydroxyacetonfosfát, převzato a upraveno z (3) Fixací tří molekul CO 2 vzniká šest molekul glyceraldehyd-3-fosfátu, ze kterých pouze jedna slouží organismu k dalším biosyntetickým pochodům (3). Může být transportována ve formě dihydroxyacetonfosfátu do cytosolu a být využita ihned jako zdroj energie, většinou je však glyceraldehyd-3-fosfát však přeměněn na sacharosu, která je využita jako transportní sacharid (dodání zdroje energie a intermediátů pro syntézy do nefosyntetických částí rostliny), nebo v chloroplastu kondenzuje s molekulou dihydroxyacetonfosfátu za vzniku fruktosa-1,6-bisfosfátu, ze kterého je následně syntetizován škrob (2). Zbylých pět molekul glyceraldehyd-3-fosfátu dokončuje Calvinův cyklus za účelem regenerace tří molekul RuBP (3) Regenerace ribulosa-1,5-bisfosfátu Regenerace RuBP vychází z molekuly glyceraldehyd-3-fosfátu a dihydroxyacetonfosfátu. Sledem reakcí katalyzovaných enzymy ze skupiny isomeras, transketolas, aldolas, hydrolas a kinas jsou vytvořeny tři pětiuhlíkaté molekuly (Obr. 5). Zmíněná řada enzymů je známá z pentosového cyklu (1). 9

10 Obr. 5 Regenerace RuBP, v rámečku uvedeny katalyzující enzymy. Převzato a upraveno z (3). Z pětiuhlíkatých meziproduktů dále vzniká ribulosa-5-fosfát. Přeměnu xylulosa-5-fosfátu na tento produkt katalyzuje enzym ribulosa-5-fosfátepimerasa, přeměnu ribosa-5-fosfátu katalyzuje ribosa-5-fosfátisomerasa. Krokem, který uzavírá cyklus, je fosforylace ribulosa-5-fosfátu za spotřeby ATP a katalýzy ribulosa-5- fosfátkinasy. Z pěti molekul glyceraldehyd-3-fosfátu/dihydroxyacetonfosfátu tedy vznikají 3 molekuly RuBP (3). 1.2 Ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa Ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa neboli Rubisco (EC ) je klíčovým enzymem Calvinova cyklu. Jedná se o jeden z nejdůležitějších enzymů na Zemi, umožňuje asimilaci vzdušného CO 2 za vzniku organických látek. Tento proces katalyzuje Rubisco jako karboxylasa. Má také oxygenasovou aktivitu, potom děj, který 10

11 katalyzuje, nazýváme fotorespirace. Rubisco se v přírodě vyskytuje ve dvou formách, formu I lze nalézt hlavně v cévnatých rostlinách, řasách a sinicích, formu II nalézáme ve fotosyntetizujících bakteriích. Více zastoupená je forma I (Obr. 6) a jedná se o jeden z největších enzymů v přírodě, se svými 8 velkými (51-58 kda, v závislosti na druhu rostliny) a 8 malými podjednotkami (12-18 kda), dosahuje Rubisco celkové molekulové hmotnosti kolem 560 kda (3). Každá z 8 velkých podjednotek obsahuje jedno aktivní centrum, malé podjednotky mají zřejmě regulační funkci, ovšem na samotný proces asimilace CO 2 nemají vliv (4). Obr. 6 Kalotový model formy I enzymu Rubisco z Spinacia oleracea (PDB ID: 8RUC), pohled ze shora (A) a ze strany (B). Modře jsou znázorněny malé podjednotky, žlutě červeně velké podjednotky. Převzato z (5). Forma II je strukturně jednodušší (Obr. 7), obsahuje dvě podjednotky (2). Obr. 7 Stužkový model formy II enzymu Rubisco z Rhodospirillum rubrum (PDB ID: 9RUB). Aktivní centrum s navázaným ribulosa-1,5-bisfosfátem - A. Modře a tmavě červeně jsou znázorněny jednotlivé podjednotky, zeleně je znázorněn hořečnatý kation. Převzato z (6). 11

12 Rubisco není v porovnání s jinými enzymy příliš efektivní. Jedno aktivní centrum je schopno katalyzovat asimilaci asi tří molekul oxidu uhličitého za sekundu. Rostliny tento nedostatek kompenzují zvýšeným množstvím enzymu, který často tvoří až 50 % rozpustných proteinů v chloroplastu, což z Rubisco činí nejzastoupenější enzym v přírodě (3) Regulace ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasy Jako první enzym v celém procesu je Rubisco hlavním cílem regulace. Každá jeho velká podjednotka o délce 470 aminokyselin obsahuje v 201 pozici lysin. K aktivaci enzymu je nutné, aby ε-amino skupina Lys 201 reagovala s molekulou CO 2 (jinou, než která bude podstupovat asimilaci) za tvorby karbamátu, na který se naváže Mg 2+ ion (Obr. 8). Obr. 8 Aktivace lysinu v aktivním centru Rubisco. Převzato z (3). Této neenzymatické reakci brání molekula RuBP, která je navázána v těsné blízkosti aminoskupiny lysinu a aktivační místo tak blokuje. K aktivaci dochází pomocí enzymu Rubiscoaktivasy, která za spotřeby ATP katalyzuje uvolnění RuBP z vazného místa a tím dojde k odblokování aminoskupiny Lys 201. Rubiscoaktivasa je nepřímo aktivována světlem pomocí redoxního mechanismu (Obr. 9), kdy je aktivita enzymu regulována cysteinovými zbytky. Bez přístupu světla dochází k oxidaci sulfanylových skupin na disulfidické můstky, enzym není v tomto stavu aktivní. Při osvětlení se spustí výměna elektronů mezi fotosystémem I, ferredoxinem, thioredoxinem a aktivovaným enzymem, dochází k redukci disulfidických můstků a následným konformačním změnám, které mají za následek zvýšení enzymové aktivity. 12

13 Obr. 9 Světelná aktivace enzymů, převzato a upraveno z (2) Výše zmíněným způsobem jsou v Calvinově cyklu regulovány ještě další 4 enzymy: ribulosa-5-fosfátkinasa, fruktosa-1,6-bisfosfatasa, seduheptulosa-1,7-bisfosfatasa a NADP dependentní glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa. Rubisco je regulován také 2-karboxyarabinitol-1-fosfátem, který je rostlinou syntetizován v nepřítomnosti světla. Tato sloučenina je analogem k β-oxokyselině, meziproduktu tvorby 3-fosfoglycerátu, jejím nahrazením 2-karboxyarabinitol-1-fosfátem je Rubisco inaktivováno. 2-karboxyarabinitol-1-fosfát je posléze rozložen za přítomnosti světla či odstraněn Rubiscoaktivasou (2). Světelná aktivace Rubisco také probíhá způsobeným pohybem Mg 2+ iontů z lumenu do stromatu, který je doprovázen opačným pohybem H + iontů do thylakoidu. Tímto se ve stromatu zvyšuje ph přibližně ze 7 na 8, což jsou, spolu se zvýšenou koncentrací Mg 2+ iontů, jsou pro Rubisco optimální podmínky (7) Fotorespirace Mimo karboxylasové se Rubisco vyznačuje také aktivitou oxygenasovou, reakční proces, v němž takto Rubisco figuruje, se nazývá fotorespirace (respirace z důvodu, že při osvětlení dochází k využití kyslíku a produkci oxidu uhličitého, při této respiraci však ATP nevzniká, nýbrž je spotřebováno). Vzhledem k nízké substrátové specificitě tohoto enzymu dochází k soupeření molekul kyslíku a oxidu uhličitého na aktivních místech Rubisco a tím pádem asimilaci O 2 do molekuly RuBP místo CO 2. Ačkoli je hodnota Michaelisovy konstanty Rubisco pro CO 2 mnohonásobně nižší než pro O 2, dochází z důvodu velkého rozdílu v koncentraci těchto plynů v atmosféře (kdy v rostlině bývá často ještě nižší koncentrace CO 2 než ve vzduchu) k boční reakci, při které se spotřebuje kyslík a vzniká oxid uhličitý. Poměr karboxylasové a oxygenasové 13

14 aktivity se v rostlinách při 25 C pohybuje od 2:1 do 4:1. K oxygenasové aktivitě přispívá vyšší teplota, přičemž afinita enzymu k CO 2 se zvyšující teplotou klesá, stejně tak se v těchto podmínkách zvyšuje poměr rozpuštěného kyslíku k oxidu uhličitému, v neposlední řadě dochází vlivem asimilace CO 2 ke snižování koncentrace CO 2 v buňce, a tudíž se zvyšuje pravděpodobnost oxygenace. Při fotorespiraci se na molekulu RuBP naváže kyslík, vzniká nestabilní pětiuhlíkatá molekula, která se rozpadá na 3-fosfoglycerát a dvouuhlíkatý 2-fosfoglykolát. Ze dvou molekul 2-fosfoglykolátu postupně vznikne jedna molekula CO 2 a jeden 3-fosfoglycerát, který se dále zapojí do Calvinova cyklu (Obr. 10) (3). Obr. 10 Porovnání fotorespirace a Calvinova cyklu. 1.3 Syntéza aromatických aminokyselin a sekundárních metabolitů Fenylalanin, tyrosin a tryptofan jsou v rostlinách syntetizovány metabolickou drahou vycházející z látek sacharidové povahy a jejich přeměnou vzniká produkt, po kterém je celá dráha pojmenována: šikimát. Ten je dále přeměněn na chorismát, první větvící bod celého procesu, ze kterého jsou aromatické aminokyseliny syntetizovány. Jejich biosyntéza má pro rostliny velký význam, jelikož to jsou prekurzory celé škály sekundárních metabolitů. Ty představují velmi rozmanitou skupinu látek a jsou syntetizovány speciálními a omezeně se vyskytujícími drahami. Často jsou specifické pro jeden druh organismu a v žádném jiném jejich syntéza neprobíhá. Jedná se většinou o deriváty intermediátů primárního metabolismu (2). 14

15 1.3.1 Syntéza aromatických aminokyselin šikimátovou drahou Šikimátová dráha byla objevena Bernardem Davisem a Davidem Sprinsonem a popsána jako cesta k syntéze aromatických aminokyselin: tryptofanu, fenylalaninu a tyrosinu, v rostlinách, houbách a mikroorganismech (8). V prvních čtyřech krocích této sedmikrokové biosyntézy vznikají kondenzací fosfoenolpyruvátu a erythrosa-4-fosfátu sloučeniny vedoucí k šikimátu. Ten dále reaguje s fosfoenolpyruvátem za vzniku o tři uhlíky delšího chorismátu (Obr. 11). Obr. 11 Šikimátová dráha s příslušnými enzymy (v rámečku). Převzato a upraveno z (2). Šikimátová dráha je ideálním terčem herbicidů, jelikož neprobíhá v organismech živočichů. Nejvíce užívaným herbicidem celosvětově je glyfosát (prodáván pod názvem Roundup), strukturní analog fosfoenolpyruvátu, který inhibuje šestý enzym šikimátové dráhy: 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsynthasu a tím i syntézu aromatických aminokyselin, což je pro rostliny fatální. 15

16 1.3.2 Šikimátdehydrogenasa V rostlinách je třetí a čtvrtý krok šikimátové dráhy (Obr. 11) katalyzován jedním enzymem se dvěma enzymovými funkcemi. Třetí krok, tedy dehydratace 3-dehydrochinátu, je katalyzován enzymem dehydrochinátdehydratasou (DHQD, EC ) a čtvrtý krok, redukce 3-dehydrošikimátu na šikimát, je katalyzován SDH (EC ) (9). Strukturně se enzym skládá ze dvou domén, z nichž každá odpovídá jedné ze zmíněných enzymových aktivit (Obr. 12). Obr. 12 Model struktury DHQD/SDH z Arabidopsis thaliana, (PDB ID: 2GPT). Vlevo doména DHQD s navázaným tartarátem (A), vpravo doména SDH s navázaným šikimátem (B). Převzato a upraveno z (10). Mimo zmíněné má SDH ještě třetí funkci: meziprodukt šikimátové dráhy, 3-dehydrošikimát, je prekurzor vzniku kyseliny gallové v rostlinách a houbách. Kyselina gallová (3,4,5-trihydroxybenzoová) je základem pro biosyntézu hydrolyzovatelných taninů, které se řadí mezi významné sekundární rostlinné metabolity (11). Vzniká z 3-dehydrošikimátu (Obr. 13). 16

17 d Obr. 13 Syntéza šikimátu a kyseliny gallové v rostlinách. Za katalýzy SDH může z 3-dehydrošikimátu vznikat šikimát (A) s možností zpětné oxidace, nebo vzniká kyselina gallová (B). Převzato a upraveno z (12) Sekundární metabolity Šikimátovou drahou a následnými reakcemi vzniklých aromatických aminokyselin vzniká celá škála sekundárních metabolitů o různých strukturách. Významnou podskupinou sekundárních metabolitů odvozených od aromatických aminokyselin jsou fenylpropanoidy, sloučeniny nesoucí na svém aromatickém jádře navázaný tříuhlíkatý řetězec - tato struktura vyplývá ze struktur fenylalaninu a tyrosinu. Z aminokyselin syntetizovaných šikimátovou drahou vznikají klíčové meziprodukty - kyselina skořicová a její hydroxy/methoxyderiváty: kyselina p-kumarová, kávová, ferulová či sinapová, ze kterých jsou syntetizovány další produkty. Tato syntéza je často označována jako fenylpropanoidová dráha (13). Důležitým zástupcem sekundárních metabolitů z řad fenylpropanoidů jsou lignany. Vznikají oxidativní dimerizací dvou fenylpropanových jednotek (C 6 -C 3 ) 2 a rostlinám slouží jako obranný mechanismus proti patogenům, např. některé rostliny v případě poškození vylučují pinoresinol toxický pro mikroorganismy (3). V případě poškození rostliny či napadení patogeny jsou dále důležité kumariny odvozené od kyseliny p-kumarové, jež se řadí mezi fytoalexiny - spolu se stilbeny, mezi jejichž významné zástupce patří resveratrol a viniferin. Dalšími zástupci fenylpropanoidů jsou flavonoidy. Prekurzory flavonoidů jsou chalkony, syntetizovány z 3 molekul malonyl-coa a molekuly p-kumaryl-coa, za katalýzy chalkonsynthasy. Chalkony jsou dále isomerovány na flavanony, z nich dále 17

18 vznikají flavony, flavonoly, anthokyaniny a isoflavony. Mnohé z těchto látek slouží k obraně rostliny před škůdci či býložravci (rotenon, medicarpin). Dalším zástupcem fenolických sekundárních metabolitů jsou taniny. Hydrolyzovatelné taniny jsou tvořeny molekulami kyseliny gallové navázaných na molekuly hexosy. Kondenzované taniny jsou polymerované flavonoidy sloužící jako obrana proti býložravcům či mikroorganismům (13). 1.4 Abiotický stres Abiotickým je u rostlin nazýván takový typ stresu, který je zapříčiněn neživým prostředím rostliny, tedy klimatickými, geografickými a půdními podmínkami. Mezi stresory řadíme nedostatek či přebytek vody a nízké či vysoké teploty, nedostatek či nadbytek minerálních živin, silné ozáření aj. Odolnost či náchylnost vůči stresu se odvíjí od druhu, genotypu a vývojového stadia rostliny. Od těchto a dalších faktorů odvíjí i reakce organismu na stres. Odpověď organismu na stejný stresor se může lišit v závislosti na délce, intenzitě a míře působení stresoru. V rostlinách může docházet k různým reakcím, od změny v genové expresi a buněčném metabolismu po změny v růstu, vývoji a rozmnožování rostliny. Reakce jsou spuštěny buď přímo stresorem, nebo mohou být důsledkem poškození organismu (14) Nedostatek vody Vodní deficit v rostlině může být způsoben různými podmínkami prostředí: suchem, půdou s vysokou koncentrací solí a nízkými teplotami. Voda se přirozeně pohybuje z místa o vysokém vodním potenciálu do místa o nízkém vodním potenciálu. Jednou z hlavních složek vodního potenciálu je potenciál osmotický, který odpovídá záporné hodnotě osmotického tlaku. S tím souvisí proces, kterým se rostlina vyrovnává s nedostatkem vody, a sice osmotické přizpůsobení. Rostlina nemůže kořeny extrahovat vodu z půdy, pokud není vodní potenciál v buňce nižší, než v půdě. Snížení vodního potenciálu rostlina zajistí zvýšením osmotického tlaku uvnitř v cytosolu. To provádí zvýšením koncentrace tzv. kompatibilních solutů, což jsou nízkomolekulární látky organické povahy, které na rozdíl od anorganických iontů nijak neinterferují s buněčným metabolismem a přitom jsou osmoticky aktivní. Mezi tyto látky patří například prolin, glycin-betain, pinitol, mannitol atd. (14) 18

19 1.4.2 Nadbytek vody Nadbytek vody škodí rostlině blokováním přístupu kyslíku do půdy, čímž je omezeno buněčné dýchání a syntéza ATP. Buňka tedy syntetizuje ATP cestou glykolýzy a NAD + je regenerován fermentačními reakcemi za vzniku alkoholu a laktátu z pyruvátu. V případě delšího zavodnění je syntetizován rostlinný hormon ethylen, který dává signál k biosyntéze aerenchymu - speciálního druhu pletiva obsahujícího dutiny naplněné vzduchem, které napomáhají výměně plynů s prostředím (14). 19

20 2 Cíl práce Tato práce je součástí projektu doc. RNDr. Zuzany Münzbergové, Ph.D., který se zabývá schopností rostlin přizpůsobit se měnícím klimatickým podmínkám a možnostem předpovědět chování určitých druhů rostlin a ekosystémů. V této práci je modelovou rostlinou kostřava (Festuca Rubra L.) pocházející ze čtyř stanovišť v západním Norsku lišících se nadmořskou výškou a množstvím srážek. Tyto rostliny byly dále pěstovány v růstových komorách simulujících extrémní podmínky původních stanovišť z hlediska teploty a vlhkosti. Cílem této práce bylo stanovit v extraktech listů rostlin kostřavy aktivitu SDH, aktivitu Rubisco, koncentraci rozpustných proteinů a zjistit, zda jsou tyto parametry ovlivněny podmínkami v růstových komorách či původními stanovišti. 20

21 3 Experimentální část 3.1 Chemikálie Název Čistota /aktivita Výrobce polyvinylpolypyrrolidon Sigma-Aldrich HEPES Sigma-Aldrich ATP 99 %, Sigma-Aldrich NADH disodná sůl 97 %, Sigma-Aldrich fosfokreatin 97 %, Sigma-Aldrich 3-fosfoglycerátkinasa z S. cerevisiae 1410 U/mg prot. Sigma-Aldrich glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa z králičího svalu 75 U/mg prot. Sigma-Aldrich kreatinfosfokinasa z králičího svalu 150 U/mg prot. Sigma-Aldrich ribosa-5-fosfát 98 % Sigma-Aldrich 2-amino-2-methylpropanol Sigma-Aldrich kyselina šikimová 99 % Sigma-Aldrich NADP sodná sůl 97 % Panreac AppliChem Bradfordovo činidlo Sigma-Aldrich 3.2 Přístroje Spektrofotometr Ultrospec 2100 Pro Spektrofotometr UV-Vis Helios Centrifuga Universal 32 R Amersham Pharmacia Biotech, Sweden Thermo Electron Corporation, USA Hettich, Německo 21

22 3.3 Metody Pěstování rostlin kostřavy Pěstování rostlin v růstových komorách a odběr vzorků provedli pracovníci Botanického ústavu Akademie věd České republiky v Průhonicích (15). Jako model byla vybrána kostřava červená (Festuca rubra L.) pocházející původně ze čtyř stanovišť v západním Norsku. Stanoviště se výrazně lišila podmínkami; nadmořskou výškou, a tedy průměrnou roční teplotou, a ročním úhrnem srážek (Tabulka 1). Tabulka 1: Původní stanoviště rostlin a jejich podmínky. Stanoviště Srážky [mm] Vlhkost [%] Teplota [ C] Nadmořská výška [m n. m.] Ulvehaugen ,5±5,7 6, Skjellingahaugen ,6±6,6 6, Fauske ,8±3,0 10, Øvstedalen ,5±5,7 10, Tyto čtyři skupiny rostlin byly vypěstovány v růstových komorách (A, B, C, D), které simulovaly čtyři klimatické extrémy z původních stanovišť (Tabulka 2). Teplota v růstových komorách byla nastavena do chladného nebo teplého režimu a byla postupně měněna podle ročního období vždy napodobující teploty z původních lokalit (Tabulka 3). Tabulka 2: Růstové komory a jejich teplotní režimy. Označení růstové komory Teplotní režim v komoře A chladný vlhký B teplý vlhký C chladný suchý D teplý suchý Tabulka 3: Teploty v růstových komorách podle režimů. Chladný Teplý Dny Průměrná teplota [ C] 1-4 9,8 10, ,5 9, ,5 10, ,5 12, ,4 12, ,5 14,8 Z hlediska vlhkosti byl v růstových komorách držen buď suchý režim: pokud vlhkost půdy byla nižší než 15 %, byla jedna rostlina zalita 20 ml vody, nebo vlhký režim: v tácku pod květináčem bylo vždy 1,5 cm vody. Odběry probíhaly mezi 10:00 a 12:30 ve dnech Veškerá biomasa 22

23 byla ustřižena 2,5 cm nad povrchem, byly odstřiženy zaschlé špičky a odstraněny veškeré suché části. Biomasa byla nastříhána na přibližně 3 cm kousky a zvážena. Vzorky byly zabaleny do alobalu a vhozeny do tekutého dusíku. Dále byly skladovány při - 80 C Příprava extraktů z listů kostřavy Vzorky kostřavy o známé hmotnosti byly homogenizovány v prostředí kapalného dusíku. Ke vzorkům byl přidán 100 mm Tris HCl pufr (1 mm DTT, 1 mm EDTA, 5 mm MgCl 2, 5% glycerol, ph = 7,8) o objemu, který odpovídal pětinásobku hmotnosti vzorku. Ke směsi bylo přidáno asi 20 mg PVP, vzorky byly centrifugovány po dobu 15 minut při 4 C při otáčkách/min (9324 g) Stanovení aktivity ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasy Stanovení aktivity Rubisco spočívalo ve spektrofotometrickém měření absorbance NADH při 340 nm. Při měření byl pozorován pokles absorbance NADH, které je spotřebováno NADH dependentní glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasou (Obr. 14). Metoda byla převzata z (16). Obr. 14 Stanovení aktivity Rubisco pomocí spřažených reakcí. Podtrženě jsou označeny látky dodané do reakční směsi. Aktivita Rubisco byla měřena v 1cm kyvetě obsahující 1 ml roztoku 1,0 mm MgCl 2, 23

24 1,25 mm NaHCO 3, 1,0 mm ribosa-5-fosfátu, 3,0 mm ATP, 4,9 mm fosfokreatinu, 0,24 mm NADH, 0,48 U/ml fosfoglycerátkinasy, 0,48 U/ml NADH dependentní glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasy a 0,48 U/ml kreatinfosfokinasy. Pro přípravu roztoků byl použit 50 mm HEPES pufr (ph = 8). Do kyvety byly nejdříve pipetovány příslušné objemy roztoků NaHCO 3 a MgCl 2, dále 50 µl extraktu, ribosa-5-fosfát a poté roztok enzymů a substrátů. Byla měřena absorbance roztoku v průběhu 5 minut při 340 nm. Pro výpočet aktivity byl použit molární absorpční koeficient NADH (ε = mol -1 l cm -1 ). Aktivita byla vztažena na g čerstvé hmotnosti nebo na mg proteinu Stanovení aktivity šikimátdehydrogenasy Stanovení aktivity SDH spočívalo ve spektrofotometrickém měření absorbance NADPH při 340 nm (Obr. 15). Obr. 15 Reakce katalyzovaná SDH. Měření bylo prováděno v 1cm kyvetě obsahující 1 ml roztoku 3 mm šikimátu, 0,2 mm NADP +, 100 mm AMP pufru (ph = 9). Do kyvety bylo pipetováno 950 µl roztoku se všemi reagenciemi a 50 µl extraktu. Byla měřena absorbance roztoku v průběhu 5 minut při 340 nm. Byla měřena absorbance roztoku v průběhu 5 minut při 340 nm. Pro výpočet aktivity byl použit molární absorpční koeficient NADH (ε = mol -1 l cm -1 ). Aktivita byla vztažena na g čerstvé hmotnosti nebo na mg proteinu Stanovení koncentrace rozpustných proteinů Koncentrace rozpustných proteinů v extraktu byla stanovena metodou dle Bradforda. Jako standardní protein byl použit hovězí sérový albumin. Z připravené kalibrační řady (c BSA = 0-1,4 mg/ml) a extraktů bylo pipetováno 33,3 µl k 1 ml Bradfordova činidla, roztok byl inkubován 10 minut a byla naměřena jeho absorbance při 595 nm. 24

25 3.3.6 Zpracování výsledků V každé z 16 skupin byla změřena aktivita 5 10 vzorků listů kostřavy. Výsledky byly zpracovány pomocí statistického programu ANOVA, který umožňuje porovnání více parametrů mezi sebou. 25

26 Koncentrace rozpustných proteinů [mg/ml] 4 Výsledky Aktivity enzymů byly stanoveny ve vzorcích rostlin kostřavy (Festuca rubra L.) pocházejících z oblasti západního Norska. Byly k dispozici rostliny ze 4 různých stanovišť, která se lišila podmínkami, ve kterých kostřavy vyrostly (Tabulka 1, str. 22). Každá tato skupina rostlin byla posléze pěstována ve 4 různých růstových komorách, které simulovaly podmínky původních stanovišť, a to z hlediska teploty s ohledem na roční období a z hlediska vlhkosti (Tabulky 2 a 3, str. 22). Z listů rostlin byly připraveny extrakty, ve kterých byly spektrofotometricky stanoveny aktivity Rubisco a SDH, a také koncentrace rozpustných proteinů. 4.1 Koncentrace rozpustných proteinů v listech kostřavy Po spektrofotometrickém stanovení koncentrace rozpustných proteinů v extraktech z listů kostřavy byla data porovnána v jednotlivých růstových komorách (Obr. 16). 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 Skjelingahaugen Ovstedalen Ulvehaugen Fauske 0,00 A B C D Obr. 16 Koncentrace rozpustných proteinů v extraktech rostlin kostřavy pocházejících z rozdílných stanovišť (S.,O.,U.,F.) a pěstovaných v rozdílných podmínkách růstových komor (A-D). Nejvyšší koncentrace byla naměřena v růstové komoře C, tedy v té, která byla chladná a suchá. Nejnižší koncentrace byly naopak naměřeny v komorách A a B, obě dvě byly vlhké. 4.2 Aktivita šikimátdehydrogenasy v listech kostřavy Stanovená aktivita SDH v extraktech z listů kostřavy byla vyjádřena jako aktivita vztažená na gram čerstvé hmotnosti rostliny a porovnána podle jednotlivých stanovišť a růstových komor (Obr. 17), dále byla vyjádřena jako aktivita vztažená na mg proteinu (specifická aktivita) a porovnána podle stanovišť a růstových komor (Obr. 18). 26

27 Specifická aktivita SDH [nmol min -1 mg -1 ] Specifická aktivita SDH [nmol min -1 mg -1 ] Aktivita SDH v gramu čerstvé hmotnosti [nmol min -1 g -1 ] Aktivita SDH v gramu čerstvé hmotnosti [nmol min -1 g -1 ] A B A B Skjelingahau gen Ovstedalen C D Ulvehaugen Fauske 0 0 A B C D Obr. 17 Aktivita SDH vztažená na gram čerstvé hmotnosti. Srovnání aktivit z různých růstových komor v jednotlivých stanovištích (A) a aktivit z různých stanovišť v jednotlivých růstových komorách (B). Aktivity SDH vztažené na gram čerstvé hmotnosti jsou vyšší v růstových komorách C a D, což jsou komory, ve kterých byl dodržován suchý režim. Nejvyšší aktivitu v těchto komorách vykazují rostliny původem z Øvstedalen, což je stanoviště s vyššími srážkami a vyšší teplotou. Nižší aktivity SDH pozorujeme naopak v komorách A a B, ve kterých byl držen vlhký režim. Zajímavá je aktivita SDH ve stanovišti Skjelingahaugen, která je nejnižší ze všech stanovišť. V této původní oblasti byly rostliny zvyklé na vyšší srážky a nižší teplotu. A B A B C D A B C D Skjelingahau gen Ovstedalen Ulvehaugen Fauske Obr. 18 Specifická aktivita SDH. Srovnání aktivit z různých růstových komor v jednotlivých stanovištích (A) a aktivit z různých stanovišť v jednotlivých růstových komorách (B). Specifické aktivity SDH mají podobný trend jako aktivity vztažené na gram čerstvé hmotnosti. Významněji se zde projevuje nízká aktivita ve stanovišti Skjelingahaugen. Statisticky významný rozdíl (Tabulky 4,5) je mezi komorami C a D (chladná - teplá, 27

28 obě suché) ve stanovištích Skjelingahaugen a Øvstedalen. Aktivita SDH zůstává po zahrnutí obsahu proteinů nejvyšší v růstové komoře D (teplá a suchá). U komory C naopak pozorujeme významný pokles oproti aktivitě vztažené na gram čerstvé hmotnosti. Tabulka 4 Statistika ANOVA k Obr. 18 A, zjištění statisticky významných rozdílů specifické aktivity SDH pro jednotlivá stanoviště (první písmeno označuje růstovou komoru, druhé písmeno stanoviště, P = Pearsonovy koeficienty t-testu). Skjelingahaugen (S) P Statisticky významný rozdíl Ulvehaugen (U) P Statisticky významný rozdíl AS BS NE AU BU NE AS CS NE AU CU NE AS DS NE AU DU NE BS CS NE BU CU NE BS DS NE BU DU NE CS DS ANO CU DU NE Øvstedalen (O) P Statisticky významný rozdíl Fauske (F) P Statisticky významný rozdíl AO BO NE AF BF ANO AO CO NE AF CF NE AO DO ANO AF DF ANO BO CO NE BF CF NE BO DO ANO BF DF NE CO DO ANO CF DF NE Tabulka 5 Statistika ANOVA k Obr. 18 B, zjištění statisticky významných rozdílů specifické aktivity SDH pro jednotlivé růstové komory (první písmeno označuje růstovou komoru, druhé písmeno stanoviště, P = Pearsonovy koeficienty t-testu). A P Statisticky významný rozdíl C P Statisticky významný rozdíl AS AO ANO CS CO ANO AS AU ANO CS CU ANO AS AF NE CS CF ANO AO AU NE CO CU NE AU AF NE CU CF NE AF AO NE CF CO NE B P Statisticky významný rozdíl D P Statisticky významný rozdíl BS BO ANO DS DO ANO BS BU ANO DS DU ANO BS BF ANO DS DF ANO BO BU NE DO DU NE BU BF NE DU DF NE BF BO NE DF DO NE 28

29 Specifická aktivita Rubisco [nmol min-1 mg-1] Specifická aktivita Rubisco [nmol min-1 mg-1] Aktivita Rubisco na gram čerstvé hmotnosti [nmol min -1 g -1 ] Aktivita Rubisco na gram čerstvé hmotnosti [nmol min -1 g -1 ] 4.3 Aktivita ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa v listech kostřavy Stanovená aktivita Rubisco v extraktech z listů kostřavy byla vyjádřena jako aktivita vztažená na gram čerstvé hmotnosti rostliny a porovnána podle jednotlivých stanovišť a růstových komor (Obr. 19), dále byla vyjádřena jako aktivita vztažená na mg proteinu (specifická aktivita) a porovnána podle jednotlivých stanovišť a růstových komor (Obr. 20). A 70,0 B 70,0 60,0 60,0 50,0 40,0 30,0 A B 50,0 40,0 30,0 Skjelingahau gen Ovstedalen Ulvehaugen 20,0 10,0 C D 20,0 10,0 Fauske 0,0 0,0 A B C D Obr. 19 Aktivita Rubisco vztažená na gram čerstvé hmotnosti. Srovnání aktivit z různých růstových komor v jednotlivých stanovištích (A) a aktivit z různých stanovišť v jednotlivých růstových komorách (B). Vzhledem k velkým rozptylům hodnot lze říct, že aktivita Rubisco na gram čerstvé hmotnosti se v jednotlivých stanovištích ani komorách významně neliší. A 9 A B 9 Skjelingahaugen 8 B 8 Ovstedalen 7 C 7 Ulvehaugen 6 D 6 Fauske A B C D Obr. 20 Specifická aktivita Rubisco. Srovnání aktivit z různých růstových komor v jednotlivých stanovištích (A), a aktivit z různých stanovišť v jednotlivých růstových komorách (B). Specifické aktivity Rubisco s odvoláním na statistiku (Tabulky 6,7) vykazují pouze 29

30 jednu významnou odchylku, a sice rostliny ze stanoviště Øvstedalen, které byly pěstovány v komoře C. Jednalo se o rostliny zvyklé na vysokou vlhkost a vyšší teplotu, které byly umístěny do suché a chladné komory. Specifická aktivita Rubisco byla v tomto případě statisticky významně nižší. Tabulka 6 Statistika ANOVA k Obr. 20 A, zjištění statisticky významných rozdílů specifické aktivity Rubisco pro jednotlivá stanoviště (první písmeno označuje růstovou komoru, druhé písmeno stanoviště, P = Pearsonovy koeficienty t-testu). Skjelingahaugen (S) P Statisticky významný rozdíl Ulvehaugen (U) P Statisticky významný rozdíl AS x BS NE AU x BU NE AS x CS NE AU x CU NE AS x DS NE AU x DU NE BS x CS NE BU x CU NE BS x DS NE BU x DU NE CS x DS NE CU x DU NE Ovstedalen (O) P Statisticky významný rozdíl Fauske (F) P Statisticky významný rozdíl AO x BO NE AF x BF NE AO x CO NE AF x CF NE AO x DO NE AF x DF NE BO x CO ANO BF x CF NE BO x DO NE BF x DF NE CO x DO ANO CF x DF NE Tabulka 7 Statistika ANOVA k Obr. 20 B, zjištění statisticky významných rozdílů specifické aktivity Rubisco pro jednotlivé růstové komory (první písmeno označuje růstovou komoru, druhé písmeno stanoviště, P = Pearsonovy koeficienty t-testu). A P Statisticky významný rozdíl C P Statisticky významný rozdíl AS x AO NE CS x CO NE AS x AU NE CS x CU NE AS x AF NE CS x CF NE AO x AU NE CO x CU ANO AU x AF NE CU x CF NE AF x AO NE CF x CO NE B P Statisticky významný rozdíl D P Statisticky významný rozdíl BS x BO NE DS x DO NE BS x BU NE DS x DU NE BS x BF NE DS x DF NE BO x BU NE DO x DU NE BU x BF NE DU x DF NE BF x BO NE DF x DO NE 30

31 5 Diskuze Rostliny jako fotoautotrofní organismy získávají energii (ATP), redukční ekvivalenty (NADPH) a organické látky pomocí fotosyntézy. Metabolismus rostlin a tedy i fotosyntéza jsou ovlivněny okolním prostředím. V případě podmínek, které nejsou optimální pro růst rostliny, mluvíme o stresu. Mezi faktory, které mohou stres způsobit, patří sucho, zasolená půda, vysoká či nízká teplota nebo nedostatek živin (14). Je otázkou, jak se rostliny dokáží přizpůsobit měnícím se klimatickým podmínkám. Do budoucna hrozí především nedostatek vody a zvyšující se průměrná roční teplota (17). V této práci byla sledována aktivita klíčového fotosyntetického enzymu Rubisco a aktivita SDH. Rubisco je enzym regulovaný na mnoha úrovních: pomocí ph, Mg 2+ iontů a Rubiscoaktivasy. Sucho ovlivňuje základní složky fotosyntézy: tok elektronů thylakoidní membránou i Calvinův cyklus. Jednou z prvních reakcí na nedostatek vody je uzavírání průduchů a tedy snížená dostupnost oxidu uhličitého pro Rubisco, což vede ke snížení maximální rychlosti karboxylace. V podmínkách značeného deficitu vody dochází také ke zvýšení koncentrace reaktivních forem kyslíku, a tedy ke zvýšené degradaci Rubisco (18). Z našich výsledků vyplývá, že aktivita Rubisco se v rostlinách kostřavy v odlišných podmínkách růstových komor statisticky významně nelišila (Tabulka 7, str. 30). Ani původní stanoviště, ze kterého rostliny pocházely, nebylo faktorem, který by statisticky významně ovlivnil aktivitu Rubisco (Tabulka 6). Lze tedy říci, že ani teplota ani sucho v růstových komorách nebyly stresovým faktorem, který by ovlivnil karboxylasovou aktivitu Rubisco. SDH je enzym, který katalyzuje vznik aromatických aminokyselin, z nichž může být syntetizována celá řada fenolických látek, např. flavonoidy, anthokyany, lignin, lignany, taniny (3). Rostliny na stresové podmínky mohou reagovat syntézou sekundárních metabolitů, často fenylpropanoidní drahou od aromatických aminokyselin (19). Je známo, že exprese enzymu fenylalaninammoniumlyasy (který katalyzuje přeměnu fenylalaninu na kyselinu skořicovou) se zvyšuje v souvislosti s biotickým stresem u rostlin (infekce oomycetou Phytophthora sojae (20)). Dále bylo zjištěno, že v souvislosti s biotickým stresem (způsobeným Y virem bramboru) u rostlin tabáku se zvyšuje aktivita SDH (21). 31

32 V této práci bylo zjištěno, že aktivita SDH se lišila v souvislosti s různými růstovými komorami (Obr. 18, str. 27). Vyšší aktivita SDH byla naměřena v listech kostřav pěstovaných v komorách C a D, tedy suchých. Zvolený vodní režim v těchto komorách pravděpodobně působil dostatečně velký stres, aby se projevil na aktivitě tohoto enzymu. Roli ve změně aktivity SDH hrálo i původní stanoviště rostliny. Nízká aktivita SDH byla zjištěna v listech rostlin původem ze Skjelingahaugen, kde byl dostatek srážek a nízká průměrná roční teplota. SDH je tedy součástí odpovědi rostliny na stresové podmínky. Podmínky v růstových komorách znamenaly tedy mírný stres, který nebyl tak velký, aby ovlivnil aktivitu Rubisco, ale byl dostatečný pro aktivaci syntézy aromatických aminokyselin a pravděpodobně dalších fenolických látek fenylpropanoidní cestou. 32

33 6 Závěr 1. V extraktech z listů kostřavy červené (Festuca rubra L.) byla změřena aktivita Rubisco. Nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly mezi rostlinami pěstovanými za odlišných podmínek v růstových komorách ani v závislosti na původním stanovišti. 2. V extraktech z listů kostřavy byla změřena aktivita SDH. Různé podmínky v růstových komorách měly vliv na aktivitu tohoto enzymu: vyšší aktivita byla zjištěna v komorách se suchým režimem. Původní stanoviště mělo také vliv na aktivitu: nejnižší hodnota byla naměřena v listech rostlin pocházejících ze Skjelingahaugen, což je stanoviště s nadmořskou výškou 1088 m, a ročním úhrnem srážek 2725 mm. 33

34 Citovaná literatura 1. Kodíček, M.; Valentová, O.; Hynek, R.: Biochemie, chemický pohled na biologický svět. Praha, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Nelson, D. L.; Cox, M. M.: Lehninger, Principles of Biochemistry. 6. vydání, New York, W. H. Freeman and Company, Heldt H. W.; Piechulla, B.: Plant Biochemistry, 4. vydání, Elsevier, Morell, M. K.; Wilkin, J. M.; Kane, H. J.; Andrews, J. T.: Side Reactions Catalyzed by Ribulose-bisphosphate Carboxylase in the Presence and Absence of Small Subunits. Journal of Biological Chemistry 272:9, , Andersson, I.; Knight, S.; Branden, C. I.: RCSB Protein Data Bank. Activated Spinach Rubisco Complexed with 2-carboxy arabinitol bisphosphate, Dostupné z URL: < [cit ]. 6. Lundqvist, T.; Schneider, G.: RCSB Protein Data Bank, Crystal Structure of Activated Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase complexed with ribulose-1,5- bisphosphate, Dostupné z URL: < [cit ]. 7. McDonald, M. S. Photobiology of Higher Plants. Chichester, John Wiley & Sons, Klaus, H. M.: The Shikimate Pathway: Early Steps in the Biosynthesis of Aromatic Compounds. The Plant Cell 7:7, , Singh, S. A.; Christendat, D.: Structure of Arabidopsis Dehydroquinate Dehydratase-Shikimate Dehydrogenase and Implications for Metabolic Channeling in the Shikimate Pathway. Biochemistry 45, , Singh, S. A.; Christendat, D.: RCSB Protein Data Bank, Crystal structure of Arabidopsis Dehydroquinate dehydratase-shikimate dehydrogenase in complex with tartrate and shikimate, Dostupné z URL: < [cit ]. 11. Ossipov, V.; Salminen, J. P.; Ossipova, S.; Haukioja, E.: Gallic acid and hydrolysable tannins are formed in birch leaves from an intermediate compound of the shikimate pathway. Biochemical Systematics and Ecology 31, 3-16, Bontpart, T.; Marlin, T.; Vialet, S.; Guiraud, J. L. a další: Two shikimate dehydrogenases, VvSDH3 and VvSDH4, are involved in gallic acid biosynthesis in grapevine. Journal of Experimental Botany 67:11, , Harmatha, J.: Fenylpropanoidy, lignany a jejich biologické účinky. Chemie a biochemie přírodních látek, Cyklus Organická chemie 27, , Buchanan, B.; Gruissem, W.; Jones, R.: Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Rockville, American Society of Plant Physiologists, Münzbergová, Z.; Hadincová, V.; Skálová, H.; Vandvik, V.: Genetic differentiation and plasticity interact along temperature and precipitation gradients to determine plant performance under climate change. Journals of Ecology 5:105, , Zítková, J.: Vliv zvýšené koncentrace oxidu uhličitého na denní chod obsahu a aktivity enzymu Rubisco. Vysoké učení technické v Brně, Society, American Meteorological: Ametsoc.org, An Information Statement of the American Meteorological Society, Dostupné z URL: < [cit ]. 18. Kaur, G. a Asthir, B.: Molecular Responses to Drought Stress in Plants. Biologia Plantarum 61:2, ,

35 19. Dixon, R. A., Paiva a L., N.: Stress-Induced Phenylpropanoid Metabolism. American Society of Plant Physiologists 7, , Zhang, C.; Wang, X.; Zhang, F.; Dong, L.; Wu, J. a další: Phenylalanine Ammonia-lyase 2.1 Contributes to the Soybean Response Towards Phytophthora sojae Infection. Scientific Reports 7:7242, Kovaľová, T.: Vliv stresu na NADP-dependentní enzymy ve vyšších rostlinách. Univerzita Karlova v Praze,