PROTEOMICKÝ EXPERIMENT

Transkript

1 2017

2 KLASICKÁ STRATEGIE PROTEOMICKÝ EXPERIMENT Štěpení všech bílkovin (trypsin) Separace směsi BÍLKOVIN Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace Separace směsi PEPTIDŮ Štěpení vybraných bílkovin + čištění peptidů Měření přesné hmotnosti peptidů ( a jejich fragmentů) Získání hmotnostních spekter SHOT-GUN STRATEGIE Porovnání hmotností sady peptidů (jejich fragmentů) s údaji o všech dostupných ORFs v databázích Identifikace bílkovin (+ kvantifikace)

3 KLASICKÁ STRATEGIE 2-DE-MS (proteiny) SHOT-GUN STRATEGIE 2D-LC-MS IEF-LC-MS (peptidy)

4 SEPARAČNÍ METODY chromatografie elektroforézy 2-DE příprava vzorků izoelektrická fokusace ekvilibrace SDS-PAGE detekce bílkovin a DIGE zpracování dat a vyhodnocení digesce vzorku a extrakce peptidů limty a záludnosti 2-DE

5 Elektroforéza Specifická mobilita u = z 6phr z - náboj h viskozita r Stokesův poloměr částice Elektroforéza v roztoku Elektroforéza v gelu Izoelektrická fokusace

6 1807 F.F. Reuss 1930 Arne Tiselius volná a papírová elektroforéza (1948 Nobelova cena) 1955 O. Smithies škrobový gel 1959 Raymond and Weintraub - polyakrylamidový gel 1961 Svensson and Vesterberg IEF a amfolyty 1970 U.K. Laemli SDS PAGE 1975 Patrick O Farrell 2-DE

7 POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY 1959 Raymond and Weintraub- první AA gel Složení a příprava gelu: akrylamid (monomerní) bis-akrylamid (zesíťování polymeru) APS (peroxodisíran amonný,katalyzátor, produkuje volné radikály), TEMED (tetramethylethylenediamine, stabilizuje volné radikály) pufr a SDS Celková koncentrace akrylamidu a bis-akrylamidu určuje KONCENTRACI (T) gelu v procentech (2-20 %) Poměr bis-akrylamidu a akrylamidu POROZITU (C) gelu. APS v zásaditém prostředí může reagovat s Trisem, koncentrace co nejnižší ve prospěch TEMEDu.

8 POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE dělení na základě izoelektrického bodu v gradientu ph DENATURUJÍCÍ SDS-ELEKTROFORÉZA dělení na základě MW proteinu NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA dělení na základě velikosti (průměru částice) a náboje

9 SDS ELEKTROFORÉZA SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Bílkoviny se rozdělují na základě jejich MW Záporně nabité SDS tvoří komplexy s bílkovinami a stíní náboje proteinu (1,4g SDS :1g proteinu) Komplex má jednotkový náboj na hmotnostní jednotku. Všechny komplexy jsou záporně nabité a migrují k anodě PUFR: Tris-Cl/Tris-glycin 0.1 % SDS ph 8.8 Redukce disulfidických můstků (Dithiothreitol, Dithioerythrol, TCEP, beta-mercaptoethanol)

10

11 Dvojrozměrná elektroforéza, 2-DE

12 150 kda DVOJROZMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA (2-DE) Rozděluje proteiny nejdříve podle jejich náboje a následně kolmo na směr původní migrace dle jejich MW ph 4 ph 7 Jaterní homogenát, 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 10 kda 1025 spotů

13 Izoelektrická fokusace - pohyb nabité částice v gradientu ph Celkový náboj proteinu (net charge) je součtem všech jeho negativních i pozitivních nábojů. Kyselé a zásadité skupiny polypeptidu jsou protonovány a deprotonovány v závislosti na ph prostředí. Amfoterní molekula (bílkovina) v elektrickém poli v gradientu ph migruje do bodu, kde je její celkový náboj rovný nule. ph tohoto bodu odpovídá izoelektrickému bodu (pi) dané bílkoviny. ph < pi ph=pi ph > pi migruje k - migruje k +

14 TEORETICKÁ DISOCIAČNÍ KŘIVKA DVOU BÍLKOVIN Net charge +3 NH 3 + NH 3 + pi Bílkovina v elektrickém poli v gradientu ph migruje do bodu, kde je její celkový náboj rovnen nule. pi ph ph pufru se vzorkem COO - -4 COO - + pi ph 3 ph 11 pi -

15 1975

16 1957 1/11/1955

17 Typický 2-DE experiment ph gradient solubilizace IEF redukce/alkylace SDS elektroforéza Vizualizace Štěpení trypsinem a identifikace pomocí MS Vyříznutí vybraných skvrn Diferenční obrazová analýza

18 LYZAČNÍ PUFR PRO IEF: solubilizace Močovina, thiomočovina chaotropní činidlo, zvýšení rozpustnosti, denaturace bílkovin solubilizace Detergent (CHAPS) čistý zwitteriontový detergent zvýšení rozpustnosti snížení agregace bílkovin redukce S-S- Redukční činidlo (DTT) redukce disulfidický můstků (ionizují se nad ph 8, migrují pryč ze stripu na alkalickém konci) DTT, DTE versus TCEP (Tris[2-carboxyethyl] phosphine, tributylphosphine běh elektroforézy a ph gradient Nosičové amfolyty -- (carrier ampholytes, IPG buffers) jsou náhražkou pufrů, je to směs ionizovatelných látek vytvářejí potřebný ph gardient Pigment (BFB) pro snazší manipulaci Typický lyzační/rehydratační pufr 7 M Močovina Každá sůl škodí vaší separaci! Vše nabité pryč! PŘÍPRAVA VZORKŮ 2 M Thiomočovina 2-4 % CHAPS 0.2 % DTT (TCEP, tributylfosfin) % Nosičové amfolyty (IPG pufr) % BFB

19 TEORETICKÁ DISOCIAČNÍ KŘIVKA DVOU BÍLKOVIN Net charge +3 NH 3 + NH 3 + pi Bílkovina v elektrickém poli v gradientu ph migruje do bodu, kde je její celkový náboj rovnen nule. pi ph ph pufru se vzorkem COO - -4 COO - + pi ph 3 ph 11 pi -

20 ZAKOTVENÉ PH GRADIENTY (IMMOBILIZED ph GRADIENTS IPG) Derivovaný akrylamid s disociovatelnými karboxy- a aminoskupinami

21 IPG STRIPY (IPG STRIPS) 3 mm široké, 0.5 mm silné, dehydrované - trvanlivost, reproducibilita, plastova podložka, stabilita, nemigrují, neinterferují s nimi redukční činidla.

22 ZOOMING ph ph 4-5 ph 5-6 ph 5,5-6, Celkem 1754

23 REHYDRATACE IPG STRIPŮ A NANÁŠKA VZORKU REHYDRATAČNÍ NANÁŠKA versus CUP LOADING PRO: Rehydratace a nanáška spojeny v jeden krok Proteiny rovnoměrně rozložené, neprecipitují v místě nanášky Aktivní rehydratace zlepšuje vstup velkých bílkovin do gelu PROTI: Vzorek je dlouhodobě při pokojové teplotě PRO: IEF ve vysoce kyselých a zásaditých gradientech probíhá lépe PROTI: Proteiny s pi blízko bodu nanášky mají nízkou rozpustnost a mobilitu a mají tendenci precipitovat na povrchu gelu

24 PODMÍNKY IZOELEKTRICKÉ FOKUSACE Optimalizace podmínek pro každý vzorek, typ stripu a nanášky. Platí zvlášť pro: větší nanášky, a větší a hydrofobnější proteiny. Teplota: kolem 20 o C ( PREVENCE KARBAMYLACE! versus krystalizace močoviny za nízkých teplot) Aktivní chlazení!!! Dochází k přehřívání na tzv. HOT SPOTS Nízký proud! Vysoké napětí Kyselina izokyanatá N konec nebo epsilon aminoskupina lyzinu Elektrické podmínky : microa na strip, U co nejvyšší, kroky nebo pozvolný vzestup V praxi až 10 kv. Celková fokusace pro cm stripy kvh Prevence oxidace a vysychání stripu : parafinový olej

25 TYPICKÝ IEF BĚH V BIO-RAD Protean IEF Cell 18 cm strip ph 3-10 Rehydratační nanáška 1mg 50 microa / strip Celkem Vh + hold t [h]

26 INSTRUMENTACE IEF

27 EKVILIBRACE STRIPŮ PŘED DRUHÝM ROZMĚREM Cíle ekvilibrace: Převést bílkoviny do pufrů vhodných pro redukci, alkylaci a SDS separaci Maximalizovat přenos bílkovin ze stripu Redukovat disulfidické můstky Alkylovat cysteiny

28 Protein Redukce disulfidických vazeb Thiol-disulfidová výměna DTT s proteinem Protein Protein Protein

29 Alkylace iodacetamidem Protein Protein Karbamidometyl

30 EKVILIBRACE STRIPŮ PŘED DRUHÝM ROZMĚREM Cíle ekvilibrace: Převést bílkoviny do pufrů vhodných pro redukci, alkylaci a SDS separaci Maximalizovat přenos bílkovin ze stripu Redukovat disulfidické můstky Alkylovat cysteiny EKVILIBRAČNÍ PUFR (EQP): 50 mm Tris ph 8.8 2% SDS, 6 M močovina 30 % glycerol Redukce: Alkylace: min EQP + 1% DTT (dithiothreitol) min EQP % iodacetamid (!)

31 ELEKTROENDOOSMOTICKÝ EFEKT Nepohyblivé (zakotvené) nabité skupiny v elektrickém poli!! Po ekvilibraci v neutrálním nebo zásaditém pufru: katoda COOH disociovaná na COO-, aminoskupiny zůstávají nedisociované Disociovaný karboxyl je přitahována k anodě (+), ale nemůže. To je kompenzováno migrací H 3 O+ ke katodě (-) Voda nese rozpuštěné částice směrem ke katodě! COO- H3O + Následky: H3O + IEF : SDS-PAGE : bobtnání katodického (bazického) konce zhošená separace ztráta bílkovin na vstupu do gelu zhoršená separace + anoda

32

33 SEPARAČNÍ METODY chromatografie elektroforézy 2-DE příprava vzorků izoelektrická fokusace ekvilibrace SDS-PAGE speciální metody detekce bílkovin a DIGE zpracování dat a vyhodnocení digesce vzorku a extrakce peptidů limty a záludnosti 2-DE

34

35 DETEKCE a VIZUALIZACE BÍLKOVIN V GELECH Citlivost Možnost kvantifikace Linearita signálu Dynamický rozsah Kompatibilita s MS Cena (nízká toxicita) Kolorimetrické viditelné barvení CBB Stříbro Fluorescenční barvení A DIGE Sypro Deep Purple Flamingo Krypton Cy2, Cy3, Cy5 FlaSH Radioaktivní detekce

36 DETEKCE BÍLKOVIN VIDITELNÝMI PIGMENTY COOMASSIE BLUE G250/ R250! Různá účinnost na různé proteiny! Barví: Lys, Arg, His, Tyr (Trp, Leu) COOMASSIE BRILIANT BLUE R 250 G 250

37 DETEKCE BÍLKOVIN VIDITELNÝMI PIGMENTY COOMASSIE BLUE G250/ R250! Různá účinnost na různé proteiny! Barví: Lys, Arg, His, Tyr (Trp, Leu) COOMASSIE BRILIANT BLUE R 250 KOLOIDNÍ CBB (CBB-G250) G 250 KLASICKÁ CBB (CBB-R250) Citlivost ng Alkohol-kyselina Odbarvování proteinů Špatná kvantifikace Nízká cena Citlivost ng Alkohol - kyselina síran amonný Steady state (bez ztráty při odbarvení) Dobrá kvantifikace Středně vysoká cena FLUORESCENČNÍ CBB (CBB-G250) Citlivost pod 1 ng! Detekce IR laserem

38 Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů ph 4 ph 7

39 DETEKCE BÍLKOVIN VIDITELNÝMI PIGMENTY DETEKCE STŘÍBŘENÍM Redukce dusičnanu stříbrného na kovové stříbro, Citlivost 0.5 ng! nízká cena Vícekrokový postup (až 20) Citlivý na přesnost Nízký dynamický rozsah Negativní barvení Komplikace s MS (glutaraldehyd a nízká extrakce peptidů) Problematická reproducibilita barví : Lys, Arg, His, Tyr, Trp

40 FLUORESCENČNÍ DETEKCE (4 8 ng/band) (4 8 ng/band) (1 2 ng/band; comparable to silver staining) (4 8 ng/band) Pigmenty se váží na detergentový (SDS) obal proteinu Sypro Ruby (kromě Sypro Ruby, ta se váže na bazické AA a Tyr, Trp) SYPRO RUBY (Molecular Probes) FLAMINGO (BIO-RAD) (DEEP) LAVA PURPLE (GE-Amersham) KRYPTON (Pierce) Dobrá kvantifikace Kompatibilní s dalším barvením Minimum kroků Dynamický rozsah Fluorescenční scanner (excitace také v UV, kromě Kryptonu) Sběr spotů je komplikovaný Vysoká cena, ale..ale je tu ruthenium a bathophenantrolinsulfát Flamingo

41 DIGE - Differential gel electrophoresis

42 2D-DIGE : 2D DIFFERENČNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (Cy2, Cy3, Cy5 Difference gel electrophoresis) Cyaninové fluorofory Maleimid - Cys (-SH) Succinimid - N-term a Lys (e)

43 EXPERIMENTÁLNÍ USPOŘÁDÁNÍ PRO DIGE Minimální versus maximální značení Rozdíly v migraci, off-set

44

45 Citlivost Cy ng Cy ng Cy ng Pro: vysoká citlivost, redukce počtu gelů a technických artefaktů Proti: cena, složitější statistika, nezbytnost 2-3 laserového scanneru, malá proteinová nanáška možný problém s identifikací

46 RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ Inkorporace značených aminokyselin ( 35 S methionin, beta zářič) nebo jiných prekurzorů ŽIVÝMI buňkami - metabolické značení Vysoká citlivost Nejvyšší dynamické rozsah ALE. Gel je nutné usušit před detekcí Klasická radiografie je nepraktická Fosfoimager nezbytný Rizika práce s izotopy Studium PTM!!!

47 Viditelné Klasická CBB nízká citlivost Koloidní CBB Stříbření střední citlivost, dobrá kvantifikace vysoká citlivost Fluorescenční Sypro, Flamingo, Lava a Krypton vyšší citlivost, kvantifikace, dynamický rozsah, F-scanner IR CBB nezbytnost IR laseru, vysoka citlivost i rozsah DIGE Cy-2, 3, 5 a další vysoká citlivost, cena!, scanner a software Radioaktivní detekce 35S a další nejvyšší citivost,kvantifikace, dynamický rozsah, P-imager

48

49 Softwarové vyhodnocení 2D gelů Komerční: PDQuest Phoretix Progenesis Decodon ProFinder Bio Numerics a další Volně dostupné: GelScape Open2Dprot Služby: Ludesi

50 Detekce spotů Matching a odečtení pozadí Normalizace a kvantifikace 6 x 4,5 x