ELISA-VIDITEST anti-complement faktor H IgG

Transkript

1 ELISAVIDITEST anticomplement faktor H IgG č.š. (a) Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, Jesenice u Prahy, tel.: , info@vidia.cz, 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISAVIDITEST anticomplement faktor H IgG 2. POUŽITÍ TESTU: Souprava ELISA VIDITEST anticomplement factor H je určena pro detekci protilátek třídy IgG proti lidskému faktoru H v lidském séru nebo plazmě. Faktor H je glykoprotein vyskytující se v plazmě v koncentracích okolo 500 µg/ml. Jeho hlavní funkcí je regulace aktivity komplementu. Imunopatologická reakce s tvorbou inhibičních autoprotilátek proti faktoru H způsobuje dysregulaci komplementu, a je spojována s rozvojem autoimunitní formy tzv. atypického hemolytickouremického syndromu (AIHUS). Test na přítomnost protilátek proti faktoru H je doporučen provádět ve všech případech podezření na HUS, a to v časné fázi nemoci. Přibližně 30% případů AIHUS provázely v prodromálním stadiu nemoci průjmy, které jsou příznačné pro klasickou formu HUS způsobenou Shigga toxin pozitivními kmeny bakterií Ecoli. Při potvrzení diagnózy AIHUS má odstranění protilátek z oběhu plazmaferézou anebo utlumení jejich tvorby imunosupresivními léky pozitivní vliv na průběh nemoci. 3. PRINCIP TESTU: ELISAVIDITEST anticomplement factor H je imunoanalytický test na přítomnost protilátek proti faktoru H. Na dně jamiček mikrotitrační destičky je navázán přečištěný lidský faktor H. Pokud se protilátky proti faktoru H nacházejí ve vzorku vyšetřovaného séra/plazmy, vyvazují se na imobilizovaný faktor H, navyvázané protilátky jsou odmyty. Na protilátky jsou v dalším kroku navazovány zvířecí antilidské protilátky značené enzymem křenovou peroxidázou. Nevyvázané značené protilátky jsou odmyty a v jamičkách po přidání chromogenního substrát pro enzym proběhne reakce provázená barevnou změnou roztoku. Reakce je zastavena přidáním STOP roztoku. Množství protilátek proti faktoru H v testovaném vzorku je přímo úměrné intenzitě zabarvení. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA potažené čištěným faktorem H izolovaným z lidské plazmy 48 jamiček 50 µl ANTICFH IgG STANDARD ( AU/ml 1) ) 1 lahvička 100 µl IgGHRP KONJUGÁT detekční antilidská protilátka značená křenovou peroxidázou, 100x koncentrovaný roztok 1 lahvička 125 ml promývacího roztoku 10x konc. 1 lahvička 125 ml ředicího roztoku r.t.u. 1 lahvička 10 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. 2) 1 lahvička 10 ml stop roztoku r.t.u. 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) AU/mL, arteficiální jednotky/ml 2) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 1

2 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná / deionizovaná voda Mikropipety a špičky k mikropipetám (20, 200, 1000 µl) Odměrný válec (1000 ml) pro ředění promývacího roztoku Zařízení na promývání ELISA stripů / osmikanálový dávkovač Přířezy z buničinné vaty ELISA reader Poznámka! Doporučujeme použití přesného dávkovače (např. Multipette Xtream Eppendorf) pro pipetování TMB roztoku a STOP roztoku. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: Všechny složky soupravy nechte před použitím vytemperovat na laboratorní teplotu (~ 20 min), roztoky před použitím důkladně promíchejte. PROMÝVACÍ ROZTOK Pracovní koncentraci promývacího roztoku získáte naředěním koncentrátu 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 40 ml koncentrátu ml dh 2 O). Zkontrolujte homogenitu koncentrátu před naředěním, pokud jsou v koncentrovaném roztoku patrné krystaly soli, zahřejte ho ve vodní lázni na +32 C až +37 C a vyčkejte do rozpuštění krystalů. Před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 měsíc při teplotě +2 C až +8 C. DETEKČNÍ PROTILÁTKA S HRP (IgGHRP KONJUGÁT) IgGHRP KONJUGÁT řeďte 100x v ŘEDÍCÍM ROZTOKU. Pro jeden strip á 8 jamiček si připravte minimálně 1 ml pracovního roztoku IgGHRP KONJUGÁTU. Pro přípravu potřebného množství roztoku pro určitý počet stripů (26) můžete použít doporučené objemy uvedené v tabulce č. 1 Naředěný IgGHRP KONJUGÁT neskladujte! Tabulka č. 1: Doporučená ředění IgGHRP Počet stripů IgGHRP 100X koncentrovaný roztok Ředící roztok (ml) (µl) STANDARD AntiCFH IgG Standard je dodáván v koncentraci AU/ml. Postupným ředěním koncentrátu získáte sadu standardů pro test. Připravte si do stojánku osm 1,5 ml PP mikrozkumavek a označte je 250 AU, 125 AU, 62.5 AU, 31 AU, 15 AU, 7.8 AU, 4 AU, 0 AU. Do mikrozkumavek napipetujte postupně 800 µl, 400 µl, 400 µl, 400 µl, 400 µl, 400 µ, 400 µl, 400 µl, 400 µl ŘEDÍCÍHO ROZTOKU. Promíchejte zásobní koncentrát STANDARDU na vortexu a napipetujte 20 µl koncentrátu do první zkumavky (250 AU). Promíchejte obsah, odeberte 400 µl a přidejte do zkumavky 125AU. Dále řeďte dvojkově µl, abyste získali celou řadu od 250 AU/ml až po 3.9 AU/ml. Do zkumavky s označením 0 AU nic nepřidávejte, nulový standard je samotný ŘEDÍCÍ ROZTOK. Měňte špičky po každém ředění, obsah zkumavek vždy dobře promíchejte. 2

3 Pro snazší pochopení postupu se podívejte níže na obrázek Ředění standardu AntiCFH. Obrázek č. 1 ředění Standardu AntiCFH STANDARD Anti CFH IgG AU/ml 20 µl 400 µl 400 µl 400 µl 400 µl 400 µl 400 µl 800 µl 400 µl 400 µl 400 µl 400 µl 400 µl 400 µl 400 µl ŘEDÍCÍ ROZTOK, TMB roztok, STOP roztok neřeďte! Jsou v pracovní koncentraci! VZORKY Vzorky sér a plazmy uchovávejte při při teplotě 18 C nebo nižší. Vzorky plazmy rozmrazujte rychle (nejlépe ve vodní lázni při +37 C) při pomalém rozmrazování mohou plazmatické proteiny precipitovat, vzorky séra můžete nechat rozmrazit při laboratorní teplotě. Vzorky před testem řeďte minimálně 100x ŘEDÍCÍM ROZTOKEM (např. 5 µl vzorku µl ŘEDÍCÍHO ROZTOKU). Připravte si dostatečný objem ředěného vzorku (100 µl/jamičku), každý vzorek doporučujeme testovat ve dvou paralelách. Pokud očekáváte koncentraci vyšší než 250 /ml nařeďte vzorek dvojkově ŘEDÍCÍM ROZTOKEM, aby se koncentrace pohybovala v rozmezí 4250 /ml. 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Nechte všechny složky soupravy vytemperovat na laboratorní teplotu (~ 20 min). b. Připravte pracovní koncentrace (potřebný objem) pro PROMÝVACÍ ROZTOK a HRP KONJUGÁT. c. Nařeďte si STANDARD AntiCFH IgG na koncentrace 250, 125, 62.5, 31.25, 15.6, 7.8, 3.9 a 0 /ml. d. Nařeďte vzorky ŘEDÍCÍM PUFREM. e. Vyjměte stripy z obalu, oddělte potřebný počet. Nepoužité dvojstripy spolu s vysoušedlem vložte do igelitového sáčku, uzavřete a skladujte při 4 C. 3

4 f. Napipetujte á 100 µl Standardů (0250 /ml) a vzorků do jamiček (viz. Pipetovací schéma). g. Přelepte destičku adhezivní folií nebo překryjte víčkem. Překrytí jamiček omezuje odpařování vody během inkubace. h. Inkubujte 1 hodinu při laboratorní teplotě (2028 st C). i. Vyklepněte obsah jamek do sběrné nádoby obsahující desinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Napipetujte do jamiček á μl promývacího roztoku a obsah vyklepněte do sběrné nádoby. Obraťte destičku a odstraňte zbytky kapaliny z jamiček vyklepnutím na vrstvu buničiny. Opakujte promývací krok ještě 4x (celkem promytí 5x). j. Napipetujte á 100 µl HRPKONJUGÁTU do jamiček. k. Inkubujte 1 hodinu při laboratorní teplotě (2028 st C). l. Vyklepněte obsah jamek do sběrné nádoby obsahující desinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Napipetujte do jamiček á μl promývacího roztoku a obsah vyklepněte do sběrné nádoby. Obraťte destičku a odstraňte zbytky kapaliny z jamiček vyklepnutím na vrstvu buničiny. Opakujte promývací krok ještě 4x (celkem promytí 5x). m. Napipetujte do jamiček á 100 μl TMB roztoku. n. Inkubujte v temnu 20 +/ 1 minut. o. Napipetujte do jamiček á 100 μl STOP roztoku. p. Poklepejte zlehka na destičku, abyste zajistili promíchání STOP roztoku s roztokem TMB. q. Odečtěte absorbanci při 450 nm, doporučujeme použít referenční filtr v rozsahu nm. Obr. č. 2 Schéma aplikace vzorků (S=STANDARD, V=VZOREK): A S0 S0 V1 V 1 B S4 S4 V2 V2 C S8 S8 V3 V3 D S15 S15 V4 V4 E S31 S F S62 S62 G S125 S125 H S250 S ZPRACOVÁNÍ DAT: Odečtěte absobrance při referenční vlnové délce od absorbance při 450 nm (většina ELISA readerů provádí automaticky). 4

5 Vypočítejte průměry absorbancí sousedních jamiček v dvojstripech. Odečtěte od všech spočítaných průměrů hodnotu průměru Standardu 0 (Blank Difference). Sestrojte graf závislosti absorbance (osa Y) na koncentraci v /ml (osa X). Proložte křivku mezi body (můžete použít např. aplikaci Microsoft Excel). Lineární proložení přímky mezi body je spolehlivé jen do koncentrace 125 /ml, jestliže chcete použít celý rozsah standardu od 4250 /ml musíte použít pro proložení křivky regresní model (např. cubic spline). Vypočtěte koncentrace protilátek proti faktoru H (/ml) v testovaných vzorcích z rovnice popisující proloženou křivku. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Vzorky s koncentrací nižší než 4 /ml (nejnižší standard) nejsou hodnotitelné jinak než, že obsahují méně než 4 /ml protilátek. Vzorky s koncentrací vyšší než 250 /ml můžete hodnotit buď jako vzorky s koncentrací vyšší než 250 /ml nebo je ještě více zřeďte v ředícím pufru a otestujte znovu ředěné, např. 200x a 400x (naměřenou koncentraci potom vynásobte faktorem ředění = 2x anebo 4x). 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: Obrázek č. 3: Příklad linearity vzestupu absorbance AntiCFH IgG v rozsahu 0125 /ml Standard anti complement factor H IgG OD 450/620 nm Blank Diff 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,0114x R 2 = 0, AU/ml 10.1 Platnost testu Hodnoty absorbance 450/620 nm STANDARDU 0 nesmí být vyšší než 0,100. Hodnoty absorbance nejvyššího standardu (250 /ml) musí být vyšší než 2,000. Rozdíl absorbance nejnižšího standardu (3,9 /ml) a absorbance nulového standardu musí být větší nebo roven 0, Opakovatelnost (intraassay) (N = počet jamek na téže destičce): N vzorek AVG /ml SD CV (%) 27 Sérum B 5 0, Sérum A , Reprodukovatelnost (interassay) (N= počet opakovaných testování) N vzorek AVG /ml SD CV (%) 8 sérum A 400x sérum A 800x sérum A 1600x sérum A 3200x

6 10.4 Detekční limit Detekční limit byl stanoven jako 3x SD z průměrné absorbance nulového standardu z 8 nezávislých měření. Detekční limit testu je 0,6 AU/ml Linearita Pozitivní vzorky byly testovány v ředění 100x a dále naředěné dvojkově v rozsahu 200x6400x. Vzorek 1 Vzorek 2 ředění 200x 400x 800x 1600x 3200x 6400x 200x 400x 800x 1600x 3200x 6400x Pozorované (/ml) >MAX >MAX >MAX Očekávané (AU/ml) P/O (%) Interference Hemolytické a lipemické vzorky nemají vliv na výsledek testu do koncentrace 50mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Testy musí provádět kvalifikovaní a proškolení pracovníci. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. Předměty, které přišly do styku se vzorky (byly potřísněny), autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující STOP roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. STOP roztok obsahuje 0,4 M roztok kyseliny sírové, pracujte s ním opatrně. Při potřísnění kůže nebo sliznice, opláchněte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. 12. UPOZORNĚNÍ: Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. Pracujte tak, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci reagencií, reagencie po použití pečlivě uzavírejte. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci. TMB roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. Dodržujte pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: nedostatečným vytemperováním a promícháním reagencií před použitím nepřesným pipetováním. potřísněním okrajů jamek vzorky nebo HRPKONJUGÁTEM 6

7 použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: Soupravu a její složky skladujte při teplotě +2 C až +8 C. Složky nezmrazujte, chraňte je před přímým slunečním zářením. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. Nespotřebované stripy dobře uzavřete do plastikového sáčku společně s desikantem (vysoušedlem). Takto uložené stripy jsou stabilní po dobu 4 týdnů. Po použití pečlivě uzavřete lahvičky reagencií víčky. Naředěný nespotřebovaný PROMÝVACÍ ROZTOK je stabilní po dobu 4 týdnů, pokud je uchováván při teplotě +2 C až +8 C. Soupravy se přepravují chlazené. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. 14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Připravte si pracovní koncentrace reagencií, ředící řadu Standardů a nařeďte vzorky Napipetujte 100 μl Standardů a naředěných vzorků do jamiček Inkubujte 1 hodinu 5x promyjte ( μl/jamku) Napipetujte 100 μl HRPkonjugátu Inkubujte 1 hodinu 5x promyjte ( μl/jamku) Napipetujte á 100 μl TMB Inkubujte 20 minut Napipetujte á 100 μl STOP roztoku Změřte absorbanci při 450 nm s referencí při nm 7

8 Literatura: AntiFactor H autoantibodies associated with atypical hemolytic uremic syndrome. DragonDurey MA, Loirat C, Cloarec S, Macher MA, Blouin J, Nivet H, Weiss L, Fridman WH, FrémeauxBacchi V. J Am Soc Nephrol Feb;16(2): Successful pretransplant management of a patient with antifactor H autoantibodiesassociated haemolytic uraemic syndrome. Kwon T, DragonDurey MA, Macher MA, Baudouin V, Maisin A, Peuchmaur M, FremeauxBacchi V, Loirat C. Nephrol Dial Transplant Jun;23(6): Factor H autoantibodies in atypical hemolytic uremic syndrome correlate with CFHR1/CFHR3 deficiency. Józsi M, Licht C, Strobel S, Zipfel SL, Richter H, Heinen S, Zipfel PF, Skerka C. Blood Feb 1;111(3): Antifactor H autoantibodyassociated hemolytic uremic syndrome: review of literature of the autoimmune form of HUS. DragonDurey MA, Blanc C, Garnier A, Hofer J, Sethi SK, Zimmerhackl LB. Semin Thromb Hemost Sep;36(6): Datum poslední verze tohoto návodu: 16/03/2011 8