Antimikrobiální látky. Bakterie - bakteriociny Kvasinky Killer fenomén

Transkript

1 Antimikrobiální látky Bakterie - bakteriociny Kvasinky Killer fenomén Ing. Hana Sýkorová, Ph.D. 2014

2 Bakteriociny Látky peptidové povahy, ribosomální syntéza Produkce: bakterie G + i G - Inhibiční účinek převážně na úzké spektrum mikroorganismů, často blízce příbuzné rody Různý způsob účinku, biochemické vlastnosti, mol. hmotnost

3 Bakteriociny 1925 identifikace látky s inhibičním účinkem E.coli kolicin 1928 inhibiční účinek nisinu (léčba mastitidy skotu) 1953 Jacob: zavedení označení bakteriocin 2009 popsáno 177 bakteriocinů (BACTIBASE)

4 G (BMK 113) G - 19 Archea 3 Bakteriociny

5 Bakteriociny - délka řetězce 84% bakteriocinů řetězec délky ak

6 Bakteriociny G základní třídy (podle velikosti) - původně pro laktobacily (Klaenhammer) Třída I: lantibiotika -malé peptidy (2-3 kda) obsahující lanthionin Třída II: nízkomolekulární (do 10 kda) -tepelně odolné hydrofobní peptidy Třída III: vysokomolekulární (>30 kda) -tepelně labilní Třída IV: komplexní -proteinová a neproteinová část (lipid, sacharid)

8 Třída I - lantibiotika krátké peptidy (20-40 ak) posttranslační úpravy lanthionin nebo 3-methyl-lanthionin lanthionin

9 Třída I - lantibiotika podle struktury dvě podskupiny: IA - podlouhlé flexibilní amfipatické (polární a nepolární část) molekuly - nisin IB - neohebná globulární struktura - mersacidin Aktivní forma: - jednopeptidová lantibiotika (nisin) - dvoupeptidová lantibiotika (lacticin 3147)

10 Třída I - lantibiotika IA: thioetherové můstky lanthionin Ala-S-Ala IB: 3-methyl-lanthionin Abu-S-Ala Abu = 2-aminobutyric acid Dha = dehydrated Serine Dhb = dehydrated Threonine

11 Třída I lantibiotika: Nisin Produkce: Lactococcus lactis 34 ak (posttranslační modifikace) 6 různých forem (A, B, C, D, E, Z) Účinek zejména na G +, včetně spór G - odolnější, zvýšením permeability vnější membrány (teplota, chelatační činidla) inhibiční účinek Konzervant - E234 tavené i čerstvé sýry, fermentované masné a zeleninové výrobky Komerční produkt Nisaplin (2,5% nisin A, NaCl)

12 Třída I lantibiotika: biosyntéza Geny pro syntézu častá lokalizace na plasmidu organizace v operonu: biosyntéza prekurzoru modifikace sekrece extracelulární proteáza regulace zajištění imunity proti vlastnímu bakteriocinu

13 Třída I lantibiotika: biosyntéza Figure 1 A schematic diagram of the biosynthesis of lantibiotics: (1) Formation of prebacteriocin; (2) The prebacteriocin is modified by LanB and LanC, translocated through a dedicated ABC-transporter LanT and processed by LanP, resulting in the release of mature bacteriocin; (3) Histidine protein kinase (HPK) senses the presence of bacteriocin and autophosphorylates; (4) The phosphoryl group (P) is subsequently transferred to the response regulator (RR); (5) RR activates transcription of the regulated genes; and (6) Producer immunity mediated by immunity proteins, LanI, and dedicated ABC-transport proteins, LanFEG.

14 Třída I lantibiotika: biosyntéza

15 Třída I lantibiotika: biosyntéza Prekursor NisA NisB dehydratace NisC cyklizace NisT transport NisP extracelulární proteáza nisin A

16 Třída I lantibiotika: mechanismus účinku Typ IA tvorba pórů wedge type barrel-stave type

17 Třída I lantibiotika: mechanismus účinku Typ IA tvorba pórů - nisin vazba na membránu (lipid II) vytvoření póru 2nm (stechiometrie 8:4 nisin:lipid II )

18 Třída I lantibiotika: mechanismus účinku Typ IA tvorba pórů lacticin 3147 vazba proteinu A1 na membránu (lipid II) vytvoření vazebného místa pro protein A2 vytvoření póru 0,6nm(stechiometrie 4:4:4 A1:A2:lipid II )

19 Třída I lantibiotika: mechanismus účinku Typ IB inhibice syntézy buněčné stěny

20 Třída I lantibiotika: imunita dva systémy působící společně: LanI na vnější straně membrány, zabraňuje tvorbě pórů LanFEG transportní protein, bakteriocin z membrány zpět

22 Třída II. tepelně odolné hydrofobní proteiny do 10 kda membránově aktivní neobsahují lanthionin bez posttranslačních modifikací Podskupiny: IIa: pediocinové (pediocin-like) IIb: dvoupeptidové IIc: jiné

23 Třída IIa pediocinové bakteriociny Silný účinek proti listeriím Produkce zejména BMK pediocin Pediococcus spp. (preparát ALTA) sakacin Lactobacillus sakei N-koncová sekvence YGNGV (Tyr-Gly-Asn-Gly-Val) Můstek Cys-Cys na N-konci Hydrofobní C-koncová doména

24 Třída IIa pediocinové bakteriociny Mechanismus účinku

25 Třída IIa pediocinové bakteriociny Mechanismus účinku receptor = man-pts (mannose phosphotransferase system) vznik póru v membráně

26 Třída IIb dvoupeptidové bakteriociny dva peptidy (pro max účinek ideálně 1:1) dva strukturní geny pro dva proteiny jeden gen pro imunitní protein mechanismus účinku podobný jako IIa - póry lactococcin G Lactococcus lactis plantaricin EF Lactobacillus plantarum

27 Třída IIb dvoupeptidové bakteriociny Mechanismus účinku transmembránová helix-helix struktura interakce zesílení poračního účinku

28 Bakteriociny G + : mechanismus účinku

29 Bakteriociny G - Koliciny - E. coli - velké molekuly (25-80 kda) - SOS regulace Mikrociny - < 10 kda - bez SOS regulace Pyociny - podobné bakteriofágům - nukleáza- i proteáza-rezistentní - Pseudomonas sp.

30 G - : Koliciny poprvé identifikován r.1925 (Gratia) produkce E.coli Klebsiella sp., Enterobacter sp., Serratia sp. - colicine-like dva typy účinku: nukleázová aktivita, tvorba pórů produkce spojená s lyzí buňky = letální biosyntéza geny lokalizovány na plasmidech (Col-plasmid): - toxin (cxa) - imunitní protein (cxi) - lytický protein (uvolnění toxinu) (cxl)

31 G - : Koliciny Restrikční mapa plasmidu pcolu cua - gen pro aktivní protein kolicinu cui - gen pro imunitní protein cul - gen pro lytický protein porační aktivita - imunitní protein v opačném směru - dva promotory nukleázová aktivita - imunitní protein ve stejném směru - jeden promotor

32 G - : Koliciny Funkční domény kolicinu 1. T translokační - translokace kolicinu do cílové buňky (N-konec) 2. R receptorová - specifická vazba na receptor (střední část) 3. C cytotoxická - letální efekt kolicinu (C-konec)

33 G - : Koliciny - syntéza SOS indukce vyčerpání živin, UV záření, mitomycin C SOS systém DNA oprav LexA represor poškození DNA aktivace RecA proteinázová aktivita rozštěpení represoru LexA indukce exprese kolicinu

34 G - : Koliciny - syntéza imunitní protein (CxI) - čas pro produkci dostatečného množství kolicinu před lyzí producentské buňky - u kolicinů s nukleázou aktivitou simultánní exprese pod jedním promotorem ochrana vlastních NA lytický protein (CxL) - gen cxl transkribován v případě indukce cxa - aktivuje fosfolipázu A permeabilizace c.m. uvolnění kolicinu

35 G - : Koliciny - účinek vazba na receptor a translokace receptor pro vitamin B12 (Btu) nebo pro transport železa translokace přes vnější membránu, periplasmatický prostor, u kolicinů s nukleázovou aktivitou translokace i přes cytoplasmatickou membránu

36 G - : Koliciny účinek 1. tvorba iontových kanálů v cytoplasmatické m. 2. nukleázová aktivita (DNA i RNA)

37 G - : Koliciny syntéza spojená lyzí buňky PROČ?

38 G - : Koliciny syntéza spojená lyzí buňky hypotézy: PROČ? aktivace SOS systému = DNA je poškozena - buňka by stejně zanikla altruismus kolicin produkuje jen část populace výhodnější podmínky pro vlastní klon

40 G - : Mikrociny malé peptidy (< 10 kda) produkce : Enterobacteriaceae ani SOS indukce ani letální syntéza hydrofobní, termostabilní, odolné vůči extrémnímu ph a proteázám = obdoba G + geny pro biosyntézu na plasmidech i chromosomech syntéza ve formě prekursoru, enzymatické modifikace různá struktura, různý mechanismus účinku (tvorba pórů, narušení potenciálu buněčné m.)

42 G - : Pyociny r.1954 (Jacob) produkce: Pseudomonas sp. až 90% Ps. aeruginosa alespoň jeden pyocin lokalizace genů výhradně na chromosomu SOS indukce (mitomycin C) typy R a F struktura podobná bakteriofágům typ S colicin-like - proteáza senzitivní protein - účinek: tvorba pórů nebo DNázová a RNázová aktivita - genová kazeta neobsahuje gen pro lyzační protein oproti kolicinům jiný mechanismus uvolnění toxinu

43 G - : Pyociny R: non-flexible and contracile tails of bacteriofages (~ fág P2) F: phage tails with a flexible and non-coctracile rod-like particles (~ fág λ) adsorpce na povrch cílové buňky, vytvoření póru na rozdíl od fágů se v cílových buňkách nereplikují

44 Bakteriociny shrnutí G + (4 třídy) I lantibiotika - lanthionin, posttranslační úpravy, tvorba pórů, inhibice syntézy b.s. (lipid II), př. nisin, lacticin IIa pediocinové membránově aktivní, účinek proti listeriím, koncová sekvence YGNGV IIb dvoupeptidové póry (lactococcin) G - (3 skupiny) koliciny Col plasmidy, SOS regulace, letální biosyntéza, porační nebo nukleázová aktivita mikrociny pyociny (R,F strukturně podobné bakteriofágům)

45 Bakteriociny shrnutí

46 Bakteriociny stanovení antimikrobiální aktivity Blank Metoda vrstveného agaru producentský kmen zamíchaný do agaru ve spodní vrstvě cílový MO rozetřený na horní vrstvě výhoda simulace kontaktu nevýhoda časová náročnost, spotřeba materiálu

47 Bakteriociny stanovení antimikrobiální aktivity Jamková difuzní metoda testuje se pouze supernatant potenciálního producenta cílový MO v agaru (často tzv. soft agar cca 0,7% agaru) výhoda více stanovení na jedné misce určení charakteru antimikrobiálního účinku různě ošetřený supernatant (např. vliv kyselin - neutralizovaný sup., vliv peroxidu - sup. s katalázou, účinek bakteriocinu - sup. s proteinázou )

48 Bakteriociny využití kontrola růstu nežádoucích MO zejména třída I a II G + bakteriociny BMK - GRAS status (generally recognized as safe) způsoby aplikace: kultura produkující bakteriocin čistý bakteriocin přídavek fermentovaného produktu

49 Bakteriociny využití Startovací kultury (fermentace mléčných, masných a zeleninových výrobků) Prodloužení trvanlivosti potravin, obalové materiály výroba sýrů vinařství omezení SO 2 Listeria, Clostridium (včetně spor), Staphylococcus

50 Bakteriociny využití a. analýza mikroflóry v sýrech s různými startovacími kulturami b. Cottage cheese a různé startovací kultury c. kravské vemeno ošetřené bakteriocinem d. aplikace mutantního Staphylococcus mutans (produkce bakteriocinu) do ústní dutiny kompetice s kmeny produkujícími kyselinu (prevence zubního kazu)

51 Bakteriociny využití alternativa k běžně používaným antibiotikům (např. Campylobacter ve střevním traktu drůbeže) zatím nepopsán vznik/přenos rezistence

52 Bakteriociny využití Lbc. salivarius dva kmeny: bakteriocin +/- myši infikované L. monocytogenes L. monocytogenes s genem pro luciferázu po 30 min po podání kultury produkující bakteriocin žádná detekce světla

53 Killer fenomén kvasinek

54 Killer fenomén killer kmeny sekrece proteinového nebo glykoproteinového toxinu s letálním účinkem pro citlivé kmeny kvasinek 1963 S.cerevisiae (Bevan a Makower) Candida, Cryprococcus, Debaryomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia

55 Killer fenomén Young 1978 : 11 tříd killer faktorů. Kvasinky náležející do stejné třídy se nezabíjejí. Podle vztahu ke killer faktoru lze kvasinky dělit: K killery - produkují toxin a jsou rezistentní (K+R+) N neutrální - neprodukující, ale rezistentní (K-R+) S sensitivní - usmrcované killer faktorem (K-R-)

56 Killer fenomén lokalizace genů pro toxin: dsrna ve formě virus-like particles (VPL) S.cerevisiae lineární dsdna (cytoplasma) - Kuyveromyces chromosom (jádro) - Pichia mechanismus působení: narušení cytoplasmatické membrány a destabilizace buňky (K1 a K2) inhibice syntézy DNA a zablokování buňky v G1 fázi buněčného cyklu (K28)

57 Killer - S. cerevisiae dsrna toxiny K1, K2, (K3), K28 produkce toxinu vyžaduje dva typy dsrna (virus-like particles): M satellite virus (toxin) kb L-A helper virus (kapsidové proteiny) kb

58 Killer - S. cerevisiae

59 Killer - S. cerevisiae The killer virus (M) and the helper virus (L-A) are both double-stranded RNA (dsrna) viruses. They compete for the L-A-encoded viral proteins Gag and Gag Pol, which are essential for (a) single-stranded RNA (ssrna) encapsidation, (b) virion assembly, (c) negative-strand RNA synthesis (replication), (d) positive-strand RNA synthesis (transcription) and extrusion from the particles into the cytosol, (e) ssrna translation and (f) ssrna binding.

60 Killer - S. cerevisiae chromozomální geny hostitelské buňky potřebné k produkci toxinu: MAK (maitance of killer genes) - více než 30 různých genů - udržení obou dsrna virů - většina kóduje ribosomální proteiny SKI (superkiller genes) - 6 genů - antivirový systém buňky - snižování počtu cytoplasmatických dsrna

61 Killer - S. cerevisiae Processing a sekrece toxinu

62 Killer - S. cerevisiae Processing a sekrece toxinu

63 Killer - S. cerevisiae Sestřih a úpravy podobné úpravám hormonů v savčích buňkách Analogy in K28 preprotoxin processing in yeast and proinsulin maturation in mammalian cells (h-kex2p, human homologue to yeast endopeptidase Kex2p).

64 Killer - S. cerevisiae Mechanismus účinku 1. vazba na receptor R1 v buněčné stěně K1 a K2: β-1,6-d-glukan K28: α-1,3,-mannoprotein 2. translokace a interakce s receptorem R2 v b. membráně 3. působení toxinu K1 a K2: vytvoření póru K28: přes GA a ER do jádra (klíčová signální sekvence HDEL na C-konci), inhibice syntézy DNA, zablokování v G1 fázi

65 Killer fenomén - význam taxonomie kvasinek modelový systém pro studium kontroly a exprese eukaryotických virů možné vektory pro expresi a sekreci polypeptidů biotechnologie přirozené konzervanty, protiplísňové přípravky, kontrola kontaminace v prvních fázích kvašení vína

66 Killer fenomén - shrnutí killer faktor toxin kvasinky náležející do stejné třídy se nezabíjejí (K, S, N) Saccharomyces cerevisiae K1, K2, K28 dsrna - virus like particles (dva druhy částic) plus chromosomální geny MAK a SKI processing přes ER a GA (analogie se savčími hormony) účinek receptory v membráně, porační aktivita (K1, K2), zastavení v G1 fázi (K28) využití taxonomie, biotechnologie

67 Děkuji za pozornost.