Elektromigrační metody

Transkript

1 Elektrický proud a přenos hmoty v elektrolytech Metody chemického výzkumu Elektrolyty = roztoky, které vedou elektrický proud = roztoky solí, kyselin a zásad Elektrolytická disociace = v látkách dochází k rozštěpení vazeb a ke vzniku iontů Elektromigrační metody Stupeňdisociace α =udávámíru disociace, ležív intervalu 0< α< 1 počet disociovaných molekul α= celkový počet molekul v roztoku α>30% - silnéelektrolyty 2% < α < 30% - středně silné elektrolyty α<2% - slabéelektrolyty Elektrický proud v kovech = pohyb elektronů X Elektrický proud v roztoku = usměrněný pohyb iontů 2 Elektrický proud a přenos hmoty v elektrolytech Elektrický proud a přenos hmoty v elektrolytech V elektrolytech je přenos elektrického náboje zároveň přenosem hmoty. Změna vodivosti v důsledku ředění souvisí - se změnami v disociaci molekul - s interakcemi mezi ionty a molekulami rozpouštědla - dochází k migraci látek - mění se složení elektrolytu, v okolí elektrod chemické reakce Měrnávodivost κ -základnícharakteristika elektrolytů, závislána koncentraci všech iontův roztoku - [S.cm -1 ] - je závislá na použitém rozpouštědle κ = F * Σ c j z j µ j j=1 Molárnívodivost λ κ λ= c n F Faradayova konstanta zj náboj iontu j -měrnávodivost roztoku κ, v němžna jednotkový objem připadájeden mol částic n, zodpovědných za vodivost, tj. nejběžněji na molárníkoncentraci c - [S.m 2.mol -1 ] cj koncentrace iontu j µj elektroforetická pohyblivost iontu j s vyšší koncentrací roztoku klesá vodivost Silné elektrolyty - zcela disociovány, s vyšší koncentrací je menší schopnost pohybu iontů λ= λ -k* c -soli anorganických a organických kyselin, většina anorganických kyselin a zásad λ -měrnávodivost roztoku při nekonečném zředění, zanedbávávzájemnéinterakce k - empirická konstanta Slabé elektrolyty - koncentrace iontů je dána stupněm disociace, změna koncentrace mění stupeň disociace a λ= λ * α -některéorganické, anorganickékyseliny a zásady (kyselina mravenčí, octová, boritá, NH 3 ) λ -měrnávodivost roztoku při nekonečném zředění, zanedbávávzájemnéinterakce α- stupeň disociace Kohlrauschův zákon o nezávislé migraci iontů - vyjadřuje, že jednotlivé ionty se v nekonečně zředěném roztoku neovlivňují(100% disociace) - molární vodivost je v nekonečně zředěném roztoku dána součtem na sobě nezávislých členů Vodivost roztoku je dána koncentrací, nábojem, pohyblivostí iontů a teplotou. 3 λ = v k * λ k + v a * λ a λ -tabelované molárnívodivosti příslušných iontů v k, v a počet kationtůa aniontů, tvořících molekulu elektrolytu 4

2 Elektromigrace = pohyb iontů a / nebo nabitých částic v roztoku působením elektrického pole Elektroforetickárychlost a pohyblivost Na nabitou částici v roztoku majívliv 2 opačně orientované síly: Elektroforetická rychlost v = rychlost pohybu iontu, je přímo úměrná intenzitě elektrického pole E - směr pohybu je dán znaménkem jeho náboje a orientací elektrického pole v = E * µ= U/l * µ E intenzita elektrického pole [V/m] µ elektroforetickámobilita[m 2 V -1 s -1 ] U vloženénapětí [V] l velikost gradientu napětí[m] F e = -F f 1. sílaelektrického pole F e F e = Q * E Q celkový náboj, součet nábojů na povrchu částice[c] E intenzita konstantního elektrického pole [V/m] - z rovnosti působících sil vyplývá F e = -F f E * Q v = 6 * π* η* r Q celkový náboj η viskozita prostředí r poloměr kulové částice v rychlost pohybu iontu 2. frikční(třecí) síla prostředíf f F f = f * v A B C f frikčníkoeficient v rychlost pohybu iontu pro kulové částice je frakčnísíla dána Stokesovýmzákonem F f = 6 * π* η* r * v η viskozita prostředí r poloměr kulové částice v rychlost pohybu iontu 5 6 Elektroforetickárychlost a pohyblivost Elektrolyty v elektromigračních metodách Elektroforetická pohyblivost (mobilita) µ = kvalitativní veličina ionogenních látek, charakteristická pro dané prostředí a teplotu Efektivnípohyblivost (mobilita) µ eff = součet pohyblivostíjednotlivých iontových forem, vynásobených příslušným molárním zlomkem µ eff = Σµ i * x i µ eff,cit = µ * x +µ * x + µ * x +µ * x Cit3- Cit3- H 3 Cit H 3 Cit H 2 Cit - H 2Cit- HCit 2- HCit2- Pufr = tlumivý roztok = roztok, který přidáním kyseliny nebo zásady výrazně nezmění své ph - většinou roztoky konjugovaných acidobazických párů, slabých kyselin a bází - např. kyselina octová/octan, kyselina boritá/boritan, amoniak/amonná sůl apod. Hlavní úlohou pufrů je:- umožnit průchod elektrického proudu - udržovat vhodné ph prostředí pro separaci ovlivňování rovnováh cílené změny v efektivních elektroforetických mobilitách S rostoucí koncentrací elektrolytu klesá elektroforetická pohyblivost iontu. -z Debye-Hückelovyteorie kolem každého iontu v roztoku se vytváří iontová sféra pokles volných iontů Iontová síla I charakterizuje celkovou koncentraci náboje suma přes všechny ionty v roztoku pro zředěné roztoky platí: I = 0,5 Σ c i * z i 2 z relativnínáboj iontu c koncentrace jednotlivých iontů Pufračníkapacita = množstvísilnékyseliny nebo báze, jejížpřídavek Kritéria výběru vhodného pufru: do 1 litru pufru vyvolá jednotkovou změnu ph -největšípufračníkapacita při ph= pka -měníse s ředěním, přídavkem soli a teplotou výběr podle pracovní oblasti ph čistota a inertnost iontová síla a rozpustnost UV absorpce rozsah pufru= pka ±1 Iontovápohyblivost µ 0 = elektroforetickápohyblivost extrapolovanána nulovou iontovou sílu - závislá pouze na teplotě a použitém rozpouštědle - s rostoucí teplotou se iontová pohyblivost zvyšuje toxicita, cena Lakmusový papírek = orientační kontrola ph µ T = µ T0 [1 + 0,02 (T T 0 )] T teplota pracovní[ C] T 0 teplota standardní25 C 7 8

3 Elektrolyty v elektromigračních metodách Elektrolyty v elektromigračních metodách K nejběžnějším patří acetátový, citrátový, borátový a fosfátový pufr. Biologické pufry = zwitteriontové pufry, označované jako Good buffers (N. E. Goodet al1966) -základem je N-substituovaný taurinnebo glycin -rozsah použitíph5-9 - inertní vůči enzymatickému působení - netoxické vůči buňkám, neprostupují membránou - neabsorbují v UV-Vis oblasti Vybrané biologické pufry Příprava, skladování a zacházení s pufrem: - výběr pufru, příprava roztoku o zvolené koncentraci a ph Směsné pufry = kombinují více složek - kontrola, případně úprava ph na kalibrovaném ph-metru - použití čerstvých roztoků- hrozba mikrobiální kontaminace! - možnost zmražení méně doporučovaná -dodržovat sterilnípodmínky -kontaminace odběrem např. špičky ph 4.01 ftalátový ph 7.01 fosfátový ph9.01 borátový 9 TBE ph8.3 Tris, kyselina boritá, EDTA TAE ph8.3 Tris, kyselina octová, EDTA Britton-Robinsonův pufr - univerzální 2-12 kyselina boritá, octová, fosforečná + NaOH 10 Elektromigrační metody Trocha historie 1937 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius první elektroforetická separace proteinů krevního séra - Nobelova cena za chemii (1948) TiseliusA., Electrophoresisofserumglobulin. I, Biochem. J. (1937) 31( ) Stellan Hjertén sestrojil první plně automatizovaný systém pro A. Tiselius kapilární elektroforézu (kapilára s průměrem 1-3 mm) 1981 James W. Jorgenson a Krynn S. Lukacs první elektroforetická separace různých iontů(aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou elektroforézou ve velmi tenké v kapiláře o průměru 75 µm Jorgenson J. W., LukacsK. D., Free-ZoneElectrophoresisinGlassCapillaries, CLlin. Chem. 27/9, (1981) S. Hjertén J. Jorgenson 11 Elektromigračnímetody = založenéna rozdílnépohyblivosti nabitých částic v roztoku vlivem působenístejnosměrného elektrického pole - separace probíhá na základě rozdílné elektroforetické pohyblivosti částic směrem k opačně nabitým elektrodám - jednotlivé techniky se liší jak principem, tak instrumentálním provedením, použitím pracovního elektrolytu apod. Plošné techniky - papírová nízká citlivost a reprodukovatelnost v závislosti na kvalitě papíru - gelová na polyakryamidovém gelu (PAGE), na agarózovém gelu analýza bílkovin, DNA Kapilární techniky Zónová elektroforéza (CZE) Izotachoforéza(ITP) Gelová elektroforéza (CGE) Izoelektrickáfokusace(CIEF) Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Elektrochromatografie(CEC) Afinitní elektroforéza (ACE) CZE publikací CGE publikací ITP publikací * * -listopad

4 Kapilární zónová elektroforéza = moving boundary electrophoresis technika pohyblivého rozhraní - separace analytů v prostředí homogenního jednoho základního elektrolytu (BGE) o konstantním složení - separace probíhá za konstantního napětí Elektroosmotický tok Křemenná separační kapilára - vyrobena z taveného křemene (fused-silica capillary) -vnitřníprůměr µm, vnějšíprůměr µm -délka dle požadavků cm - vnější vrstva polyimidu(15 µm) chrání před mechanickým poškozením - odstranění části polyimidu = detekční okénko pro UV-Vis detekci Elektroosmotický tok (EOF) - je důsledkem náboje vnitřního povrchu křemenných kapilár - disociace silanolových skupin na stěně kapiláry jí uděluje záporný náboj -po sepnutíelektrického pole docházík pohybu nabitých částic a tím i k pohybu celékapaliny Instrumentace: separačníkapilára zdroj separačního napětí vialky s pufrem, v nichž jsou elektrody a konce kapilár detektor vyhodnocovanísystém absorbance (mau) 12 da M P 10 dcm P 8 dtm P dg M P 6 4 U M P dm C M P tim e (m in) Elektroosmotický tok Silanolové skupiny přitahují kationty elektrolytu a vzniká elektrická dvojvrstva, kterou tvoří vrstva Sternova(Helmholtzova) částečně fixovaná ke stěně kapiláry Gouy Chapmanova difúzní, volná výměna s ostatními ionty roztoku - na rozhraní vrstev je vytvořen elektrický potenciál ζ Rychlostní profil EOF = téměř pravoúhlý -ve srovnánís laminárním prouděním hydrodynamického toku je zanedbatelný příspěvek k celkové disperzi zóny Elektroforetickárychlost EOF µ EOF ζ*ε µ EOF = η ζ elektrokinetický potenciál ε permitivita roztoku η - viskozita roztoku v EOF = E * µ EOF Experimentální zjištění EOF pomocí neutrálního markeru- migrační čas ovlivňuje pouze elektroosmóza -neutrálnímarker mesityloxid, aceton, dimethylformamid, voda profil laminárního toku (A) a elektroosmotickéhotoku (B) A B 15 Elektroosmotický tok -díky EOF lze stanovit kationtyi aniontyv jednéanalýze - slouží k mobilizaci zón zakoncentrovaných izoelektrickou fokusací - vysoká rychlost EOF může zapříčinit nedostatečnou separaci kationtů - nízká rychlost EOF umožní interakce kationtů se stěnou kapiláry absorpce, nesymetrie píků - opačně orientovaný EOF může znemožnit detekci analytů Změna elektroosmotického toku µ EOF změnou ph nízký EOF při kyselém ph změnou iontové síly pufru rostoucíiontovásíla snižuje potenciál a tím i EOF Xgenerace tepla modifikací vnitřního povrchu kapiláry - potlačení nebo obrácení náboje pokrytím stěny kapiláry, tzv. coating - permanentní modifikace kovalentní vazba např. s polymerem - dynamická modifikace - přídavek polymeru do pufru ph změnou elektrického pole nízké napětí, nízká selektivita X vysoké napětí, vyšší generace tepla změnou teploty vyšší teplota, změna viskozity, vyšší EOF 16

5 Účinnost elektroforetické separace Počet teoretických pater N = měřítko účinnosti elektroforetické separace N = 5,54 * (t R /w ½ ) 2 = 16 * (t R /w) 2 t r migračníčas píku w 1/2 šířka píku v polovinějeho výšky w šířka píku při jeho základně - při elektroforéze dochází k migraci iontů a současně k rozmývání zón difúzí píky tvaru Gaussovy křivky σ= vzdálenost, kterou prodifunduje průměrný ion za dobu t -vztah mezi difúzním koeficientem D a tzv. rozptylem σ 2 udává Einstein-Smoluchowskéhorovnice σ 2 = 2 * D * t - účinnost separace je v omezeném rozsahu přímo úměrná vloženému napětí N = µ* U / 2 * D µ elektroforetická mobilita iontu U vložené separačnínapětí výška h w i w = 4σ w 1/ 2 inflexní body w i= 2σ w 1/2= 2,354σ Účinnost elektroforetické separace V reálném experimentu však rozptyl σ 2 ovlivňuje řada vlivů: difúze elektromigračnídisperze sorpce Jouleovoteplo nástřik, detekce atd. Difúze Sorpce - nelze odstranit, pouze ovlivnit např. snížením teploty, zvýšením viskozity apod. - nízký difúzní koeficient úzké píky -interakce analytůs nábojem na stěněkapiláry - vede k asymetrii píků, v horším případě ke ztrátě analytu coating Jouleovo teplo - způsobené průchodem elektrického proudu kapilárou chlazení Elektrodisperze - Ohmova závislost proudu na napětí volba vhodného separačního napětí - rozdílná pohyblivost analytu a spoluiontu stejného náboje z elektrolytu - minimalizace vlivu správnou volbou elektrolytu s co nejpodobnější pohyblivostí vyšší napětí větší generované teplot pokles separace Ekvivalent počtu teoretického patra H = počet teoretických pater vztažený na délku kapiláry l H = l / N = σ 2 / l 17 A -frontování B -symetrie C -chvostování 18 Instrumentace Dávkování v CZE - dávkovaný objem v jednotkách nanolitrů otázka reprodukovatelnosti - nepraktičnost při využití dávkovacích kohoutů či jiných injektorů Instrumentace Elektrokinetické dávkování - v některých případech jediný možný postup kapilární gelová elektroforéza - dávkovací napětí bývá obvykle nižší než separační Hydrodynamické dávkování - nejjednodušší, využití sifonového efektu - rozdíl hladin (ruční dávkování) - využití přetlaku či podtlaku (komerční přístroje) - pro výpočet dávkovaného objemu slouží Hagen-Poiseuilleova rovnice P * d 4 * π* t d V d = 128 * η* l t P tlakový spád na kapiláře d vnitřníprůměr kapiláry t d doba nástřiku η viskozita elektrolytu l t celková délka kapiláry koncentrační poměr ve vzorku nemusí odpovídat poměru v nadávkované zóně - výpočet nadávkovaného objemu t d * U d V d = π* r 2 *l s t 0 * U s r vnitřnípoloměr kapiláry l s efektivnídélka kapiláry t d doba, po kterou bylo aplikováno napětí t 0 migračníčas EOF U d napětípři dávkování U s napětíseparační rozdíl hladin přetlak podtlak 19 20

6 Instrumentace Detekce v CZE -online detekce přímo v kapiláře X sběr frakcía offline detekce - různá citlivost jednotlivých detektorů - možnost derivatizace analytů pro lepší detekovatelnost Nejběžnější detektory: absorpční fotometrický, s diodovým polem fluorescenční konduktometrický ampérometrický hmotnostně-spektrometrický Elektroferogram a jeho vyhodnocení Elektroferogram = grafický záznam separace po zpracování signálu detektoru - další uváděná označení elektroforegram, elektroforetogram, elektroforeogram Výpočet elektroforetické pohyblivosti z migračního času analytu l t * l s 1 1 µ= U t m t 0 l t celková délka kapiláry l s efektivnídélka kapiláry U separačnínapětí t m migračníčas analytu t 0 migračníčas EOF RozlišenípíkůL a C paprsek paprsek paprsek EOF 2 *(t C t L ) R L,C = w L + w C t C, t L migračníčasy píků w C, w L šířka píkůu základny detekční okénko bublinková cela Z -cela Separace organických a anorganických iontů ve víně Informace z publikace: -uncoatedfusedsilicacapillary50 µm ID, 50/60 cm -separationvoltage+15 /-15kV, injection0,5 psi/5 sec, detectionat270 nm -newcapillarytreatment 0,1 M NaOH20 min, Milli-Q water5 min, electrolytesolution5 min -BGE = 9mM pyridine, 12 mmglycolicacid, 5 mm18-crown-6-ether, ph3.6 Separace polysacharidů v mořské vodě -capillary75 µm, 115 cm, 105 cm to thedetector -voltage 18 kv, injectionpressure(50 mbar) for1 s -detectionat224 nm -BGE: 8 mmdmp, 1.5 mmctab, ph12.00 Nepřímá UV-Vis detekce: = pracovníelektrolyt absorbuje v danéoblasti a průchod analytu detektorem se zaznamená poklesem absorbance negativní pík R. Stella et. al. Foodchemistry, 124 (2011) G. Qiujuet. al., Analytica Chimica Acta, 662 (2010) 193. (1) xylose; (2) mannose; (3) rhamnose; (4) glucose; (5) galactose; (6) fucose; (7) 24

7 Separace iontů těžkých kovů v odpadních vodách Separace proteinů -capillary50 µm id, 40/48 cm length -runningbuffer10 mmhis/ 4 mmtartrate, ph5.5 -injection3 kv/5 sec, - separation voltage- positive 15 kv, conductivity detection - cross-linked PVA coated capillary - 40/48.5 cm effective/total length, 50 m ID -BGE 40 mmsodiumphosphateph kV, injection3 kv/5 sec Zesíťovaný polyvinylalkohol potlačený EOF 1, cytochrome c; 2, lysozyme; 3, trypsinogen; 4, -chymotrypsinogen H.F.Lauet. al., Electrophoresis, 32 (2011) D.Belderet. al., Electrophoresis, 22 (2001) Prenatální diagnostika vrozených vad Downův syndrom - odběr plodové vody v 15.týdnu těhotenství - separace markerů Downova syndromu STR oblasti na chromozómu 21-1 pík nebo 2 píky v poměru 1:1 normálnígenotyp -3 píky v poměru 1:1:1 (trisomie21.chromozomu), 2 píky v poměru 2:1 genotyp s vrozenou vadou - poly(n-acroyloyl amino ethoxy ethanol) coated capillary -BGE = TBE (89 mmtris, 89 mmboricacid, 2 mmedta) ph8.3, 2,5 µm ethidiumbromid, 8% PVA Separace mikroorganismů - buněčné stěny a membrány mají rozdílný obsah proteinů, lipidů a lipopolysacharidů různý náboj -fusedsilica(l eff = 25 cm, L tot = 33.5 cm) - buffer was % PEO dissolved in MES (2[-(N-morpholino)ethanesulfonic acid]), ph = 6.1 -detectionat214 nm, U = 20 kv, injection200 mbar/s Helicobacter pylori Serratia marcescens C. Gelfiet. al., JournalofChromatography A, 718 (1995) B. Buszewski et. al., BiomedChromatogr, 21 (2007)

8 Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza (EMMA) = electrophoretically mediated microanalysis - analýza enzymových aktivit, zjištění koncentrace substrátů, inhibičních konstant apod. CE-MS analýza - spojení obou technik zvyšuje potenciál v separaci, identifikaci i kvantifikaci látek -látky se stejnou molekulovou hmotností nelze stanovit na MS, ale lze po předchozí separaci a obráceně koelujícílátky v jednom píku CE lze odlišit na MS spektrech - vhodné při analýze komplexních vzorků vysoká účinnost, rychlost - nízká spotřeba vzorků a médií, možnost využití online prekoncentrace - potřeba vytvořit uzavřený elektrický okruh s vysokým napětím přes separační kapiláru - vhodný výběr elektrolytu předejít zanášení zdroje a ucpání kapilár, interferencím apod. Z. Glatz et. al., JournalofChromatography B, 814 (2006) Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií Iontové zdroje pro CE-MS ESI pro polární látky, první použitý zdroj (Olivares a kol. Anal.Chem. 59 (1987) 1230) typické základní elektrolyty kys. octová, mravenčí, uhličitan amonný + přídavek org. rozpouštědel APPI/APCI pro málo polární a nepolární látky, lepší kompatibilita s netěkavými složkami elektrolytu tj. dokonce použití fosfátů MALDI offline spojení(sběr frakcíz CE, příménanášeníseparace z kapiláry na MALDI destičku apod.) vše záleží na konstrukci iontového zdroje, geometrii a způsobu spojení obou technik Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií Separace β-laktoglobulinů v mléce - sledování autenticity mléka pančování ovčího a kozího mléka mlékem kravským -srovnánívýskytu vybraných β-laktoglobulinůve vzorku -CE-ESI-MS analýza, BGE 1M kyselina mravenčíph=1.9, - sheath liquid: voda, methanol, k. mravenčí(78:20:2 v/v), 1 µl/min směs mléka kravské:kozí 50:50 kravský β-lg A kravský β-lg B kozíβ-lg kozíα-la kozíβ-lg ovčíβ-lg A + β-lg C Aplikace CE-MS kravský β-lg A + β-lg B - klinická biochemie a diagnostika - analýza tělních tekutin (komplexní vzorky) potřeba automatizovaného vyhodnocení MS spekter - analýza životního prostředí a potravin - hodnocení kvality a kontrola bezpečnosti Výhody: vysokárychlost (high-throughput, příznivý poměr cena/výkon (vs. LC/MS), vysoká selektivita a citlivost aplikovatelnost jedné metody na více typů vzorků(= tolerance k interferentům) kravský α-la ovčíβ-la CE-MS analýza α-la a β-lg v a, kravském, b, ovčím a c, kozím mléce směs mléka kravské:kozí 10:90 kravskýβ-lg A kravskýβ-lg B kozíβ-lg 31 L. Mülleret. al., Electrophoresis, 29 (2008)

9 Elektroforetická analýza na čipech Kapilární izotachoforéza µ-tas micrototalanalysissystem - miniaturizace všechny kroky analýzy v jednom -maláspotřeba vzorku (pl nl) - předúprava vzorku přímo na čipu - přenosnost labon a chip -vyleptaná soustava kanálků plastické hmoty, křemen, sklo obsahují děliče toku kapaliny, ventily apod. - nejčastěji v oblasti analýzy biologicky významných látek nukleové kyseliny a proteiny Hlavní cíl u-tas: vyvinout jednotku, která by dokázala zachytit požadovanou buňku a analyzovat její genomický, proteomický, metabolomický, glykomický či jiný profil - dva základní elektrolyty - LEADING = vedoucí elektrolyt největší pohyblivost v systému - TERMINATING = koncový elektrolyt nejmenší pohyblivost v systému µ TE < µ analytů < µ LE - separace probíhá za konstantního proudu vytvoření potenciálového gradientu - po dosažení ustáleného stavu se zóny pohybují stejnou rychlostí - lze v jedné analýze separovat pouze anionty nebo kationty - problematická výroba technologie -cena P. Smejkal, F. Foret: Chem. Listy, 106 (2012) Kapilární izotachoforéza V každém místě separačního prostoru musí být platit: Kapilární izotachoforéza µ podmínka elektroneutrality- součet nábojů kationtů a aniontů musí být v každém makroskopickém objemu stejný Σc i * z i = 0 podmínka kontinuality popisující časové změny koncentrace jednotlivých iontů v daném místě Kohlrauschova regulační funkce ω - vystihující existenci diskontinuit, v průběhu separace se migrující zóny vzorku musí koncentračně přizpůsobit původní hodnotě ω c funkce v zóněvedoucího elektrolyt, dokud nenídosaženo i (x)* z ω(x) = Σ i rovnovážného stavu m i = koncentrace látek v zónách konstantní a daná neměnnou koncentrací vedoucího elektrolytu - koncentrace látek v původním vzorku nemá vliv na výslednou koncentraci látky v izotachoforetické zóně µ X µ L - µ C c X = c L * * µ X -µ C µ L Ohmůvzákon proudováhustota je konstantnípro daný separačníprostor o průřezu S a hnacím proudu I. E * κ= I/S c x koncentrace látky x v zóně c L koncetracevedoucího iontu ve vedoucízóně µ x efektivnípohyblivost látky x µ L efektivnípohyblivost vedoucího iontu L µ C efektivnípohyblivost protiiontuc κ měrnávodivost roztoku 35 E -každázóna obsahuje pouze 1 druh iontů - v každé zóně je přítomen také protiion vedoucího elektrolytu - koncentrace v zóně je konstantní, mimo ni nulová - pořadí zón podle klesající efektivní elektroforetické pohyblivosti Samozaostřovací efekt - vlastnosti se mezi zónami mění skokem -kation chce přejít do zóny před sebou zóna nižšího potenciálu snížení hnací síly návrat zpět -kation chce přejít do zóny za sebou zóna vyššího potenciálu zvýšení hnací síly návrat zpět 36

10 Izotachoforéza Závěrem - zakoncentrování stopových koncentrací analytů až o několik řádů -využitíprekoncentracepřed kapilárnízónovou elektroforézou Elektromigrační metody -separace od iontůpo celébiomolekulyažbuňky - spolu s chromatografickými metodami největší význam v separačních analýzách - široké uplatnění nejen v praxi, ale také v rozličných odvětvích vědy a aplikovaného výzkumu -díky miniaturizaci a vývoji nových detekčních technik obrovský budoucípotenciál Literatura Foret, F., Křivánková, L., Boček, P.: CapillaryZoneElectrophoresis, VCH VerlagsgesellschaftmbH, Weinheim, Germany, Dolník, V., Úvod do kapilární elektroforézy, Brno, HighPerformance CapillaryElectrophoresis. A primer. Revisededitionby H.H. LauerandG. P. Rozing, Agilent Technologies, Germany Odborné časopisy: 39