Univerzita Karlova v Praze

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie Diplomová práce Příprava a charakterizace rekombinantního adenylát cyklázového toxoidu bakterie Bordetella pertussis nesoucího mykobakteriální antigen TB7.7 Bc. Pavel Mikulecký Školitel: Ing. Ondřej Staněk Laboratoř Molekulární biologie bakteriálních patogenů Mikrobiologický ústav Akademie věd České republiky, v.v.i. Praha 2010

2 Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracoval samostatně pod vedením školitele Ing. Ondřeje Staňka a jen s použitím citované literatury. Podpis:

3 Poděkování Rád bych poděkoval svému školiteli Ondřeji Staňkovi za vedení diplomové práce, za odbornou pomoc a cenné rady. Velmi děkuji Marcele Šimšové za pomoc při přípravě textu diplomové práce a za její hodnotné připomínky. Poděkování patří také Ireně Linhartové a Jiřímu Mašínovi za spolupráci na některých pokusech, laborantkám Haně Kubínové, Soně Charvátové a všem členům laboratoře za příjemné pracovní prostředí. Dále také děkuji Petrovi Šebovi, vedoucímu laboratoře, za finanční zajištění a prostor pro práci. V neposlední řadě děkuji svým rodičům za naděje, které ve mě vložili, a za jejich finanční podporu. Na závěr bych rád poděkoval své přítelkyni Zuzaně Kunertové za její lásku, pochopení a podporu.

4 Příprava a charakterizace rekombinantního adenylát cyklázového toxoidu bakterie Bordetella pertussis nesoucího mykobakteriální antigen TB7.7 Abstrakt Bakterie Mycobacterium tuberculosis je původcem smrtelné nemoci nazývané tuberkulóza představující celosvětový problém. Předpokládá se, že na světě žijí až dvě miliardy infikovaných lidí, u kterých bakterie přetrvává ve své latentní fázi. Specifická, citlivá, rychlá a ekonomicky dostupná metoda pro identifikaci nakažených jedinců je stále žádaná. V současné době se jako nejlepší varianta diagnostického přístupu jeví in vitro krevní testy, ve kterých se pro restimulaci specifických T lymfocytů používají mykobakteriální antigeny odvozené od virulentního kmene. Pro zvýšení efektivity dopravy antigenů do antigen prezentujících buněk se testuje mnoho přístupů, přičemž jedním z nich je geneticky detoxifikovaný adenylát cyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis. Předkládaná práce se zabývá přípravou a následnou charakterizací biologických vlastností CyaA proteinu, který ve své translokační doméně nese mykobakteriální antigen TB7.7. Experimentální výsledky ukazují, že fúzní protein CyaA-TB7.7 má zachovanou kanálotvornou aktivitu a je schopen dopravit antigeny na povrch APC s molekulami MHC II. Detoxifikovaný CyaA protein s vloženým mykobakteriálním antigenem TB7.7 bude použit pro doplnění současně testovaných přístupů, kterým je i in vitro restimulace krevních vzorků, a sloužit tak jako další diagnostický nástroj pro nalezení osob s latentní formou tuberkulózy. Klíčová slova Bordetella pertussis, adenylát cyklázový toxin, CyaA, Mycobacterium tuberculosis, tuberkulóza, antigen TB7.7, doprava antigenů, diagnostika.

5 Construction and characterization of recombinant adenylate cyclase toxoid of bacterium Bordetella pertussis carrying mycobacterial antigen TB7.7 Abstract Bacterium Mycobacterium tuberculosis is an etiological agent of a deadly disease called tuberculosis that presents a global problem. According to The World Health Organization there are more than 2 billions people infected with latent tuberculosis all over the world. There is still need of specific, sensitive, quick and economic available method for identification of infected individuals. Currently in vitro blood tests are considered to be the best way of diagnosis. They are based on restimulation of specific T lymphocytes by mycobacterial antigens derived from virulent strains. There are several different approaches for enhancing of direct antigen delivery into antigen presenting cells and promising one is a genetically detoxified adenylate cyclase toxin (CyaA) of bacteria Bordetella pertussis. The main aim of the thesis includes construction and subsequent characterization of biological properties of CyaA protein carrying specific mycobacterial antigen TB7.7 in translocating domain. Here is shown that fusion protein CyaA-TB7.7 can form cation selective pores in target cell membranes and is able to deliver antigens into the cytosol of APC to be presented on surface with molecules MHC class II. Genetically detoxified CyaATB7.7 protein will be used to supplement current approaches such as also in vitro restimulation of blood samples and will serve as supplementing diagnostic tool for identification of people with latent form of tuberculosis. Keywords Bordetella pertussis, adenylate cyclase toxin, CyaA, Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, antigen TB7.7, antigen delivery, diagnostics.

6 Obsah Poděkování...3 Abstrakt...4 Klíčová slova...4 Abstract...5 Keywords Úvod Přehled literatury Bakterie Bordetella pertussis a černý kašel Faktory virulence bakterie Bordetella pertussis Adenylát cyklázový toxin Geny podílející se na produkci, aktivaci a sekreci toxinu CyaA Struktura CyaA Funkce CyaA Imunitní odpovědi a doprava antigenů pomocí CyaA Mycobacterium tuberculosis a tuberkulóza Infekce bakterií M. tuberculosis M. tuberculosis a buněčně zprostředkovaná imunita Role cytokinů při infekci bakterií M. tuberculosis Patologie tuberkulózy při koinfekci virem HIV Vakcinační strategie proti tuberkulóze Léčba tuberkulózy Diagnostika aktivní tuberkulózy Diagnostika latentní tuberkulózy Tuberkulinový kožní test Krevní testy Diagnosticky významné mykobakteriální antigeny Antigeny ESAT-6 a CFP Antigen TB Další mykobakteriální antigeny CyaA toxoidy s mykobakteriálními antigeny Materiál a metody Chemikálie, materiál a přístrojové vybavení Chemikálie Přístrojové vybavení Enzymy Protilátky Restrikční endonukleázy Syntetické oligonukleotidy

7 Roztoky a pufry Kultivační média pro bakteriální kultury Tekutá kultivační média Tuhá kultivační média Kultivační média pro tkáňové linie Plazmidy Bakteriální kmeny Tkáňové linie Metody a pracovní postupy Uchovávání bakteriálních kmenů Příprava superkompetentních buněk Escherichia coli Transformace plazmidové DNA do superkompetentních buněk Izolace plazmidové DNA Minipreparace plazmidové DNA Midipreparace plazmidové DNA pomocí Lego kitu Manipulace s DNA Štěpení plazmidové DNA restrikčními endonukleázami Defosforylace 5'-konců lineární plazmidové DNA Ligace DNA fragmentů Amplifikace fragmentů plazmidové DNA Elektroforéza DNA fragmentů v agarózovém gelu Izolace DNA fragmentů z agarózového gelu Spojení syntetických oligonukletidů Sekvenace plazmidové DNA Produkce a purifikace CyaA proteinů Produkce proteinů v 2 ml kulturách Produkce proteinů v 500 ml kulturách Příprava močovinového extraktu CyaA proteinů Purifikace proteinů iontoměničovou chromatografií na DEAE-Sepharose Purifikace proteinů hydrofobní chromatografií na Phenyl-Sepharose Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) Stanovení koncentrace proteinů Stanovení vlastností CyaA proteinů Stanovení adenylát cyklázové aktivity Stanovení vazebné aktivity CyaA na makrofázích Stanovení hemolytické aktivity CyaA Stanovení hladiny intracelulárního camp v makrofázích Stanovení prezentace antigenů s MHC molekulami I. třídy Stanovení prezentace antigenů s MHC molekulami II. třídy IL-2 ELISA Práce s tkáňovými liniemi Uchovávání tkáňových linií Rozmražení buněk Izolace a maturace dendritických buněk z kostní dřeně Pasážování buněk Stanovení počtu buněk v suspenzi pomocí Bürkerovy komůrky

8 4. Výsledky Příprava plazmidů pro produkci CyaA proteinů PCR amplifikace DNA sekvence kódující kontrolní OVA epitop PCR amplifikace DNA sekvence kódující antigen TB Konstrukce expresních vektorů pro produkci CyaA proteinů Produkce a purifikace vytvořených CyaA proteinů Charakterizace biologických vlastností CyaA proteinů Adenylát cyklázová aktivita CyaA proteinů Vazebná aktivita CyaA proteinů Hemolytická aktivita CyaA proteinů Invazivní aktivita CyaA proteinů Konstrukce expresních vektorů pro zlepšení translokace AC domény Prezentace antigenu s molekulami MHC I a MHC II Diskuze Závěr Seznam použité literatury Seznam použitých zkratek

9 1. Úvod Rekombinantní adenylát cyklázový toxin (CyaA, ACT) bakterie Bordetella pertussis, základní faktor virulence, je jedinečný toxin, jehož katalytická adenylát cyklázová (AC) doména obsahuje tzv. permisivní místa, kam lze genetickou modifikací vkládat krátké peptidy a antigeny bez ovlivnění stability toxinu. Další důležitou vlastností toxinu CyaA je jeho specifická vazba na receptor CD11b/CD18, jenž se nachází na povrchu buněk jako jsou makrofágy, dendritické buňky nebo neutrofily. Díky svým vlastnostem může být geneticky detoxifikovaný adenylát cyklázový toxin použit jako nereplikativní vektor pro přímou dopravu antigenů do antigen prezentujících buněk (APC), které je zpracují a vystaví na svém povrchu. Bylo ukázáno, že peptidy a antigeny vložené do CyaA toxinu jsou prezentovány s glykoproteiny hlavního histokompatibilního komplexu I. třídy (MHC I) i II. třídy (MHC II) a indukují příslušné imunitní odpovědi. V předchozích pracích byl detoxifikovaný CyaA toxin úspěšně použit jako vektor pro dopravu mykobakteriálních antigenů ESAT-6 a CFP-10, které jsou imunodominantní a specifické pro virulentní kmeny komplexu Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Bakterie M. tuberculosis způsobuje velmi závažné onemocnění nazývané tuberkulóza, jenž stále představuje velký celosvětový problém, a odhaduje se, že až jedna třetina světové populace je infikována touto bakterií. Nakažení lidé nevykazují žádné vnější příznaky nemoci a bakterie v nich přetrvává v tzv. latentní fázi, která je obtížně diagnostikovatelná. Standardní metodou diagnostiky latentní tuberkulózy je tuberkulinový kožní test (TST Tuberculin Skin Test), jehož specificita a citlivost je nízká a odečítání výsledků je subjektivní, neboť záleží na zkušenostech vyšetřující osoby. Novějšími metodami jsou krevní testy, při nichž jsou využívány mykobakteriální antigeny k in vitro restimulaci specifických T lymfocytů a vyvolání imunitních odpovědí v odebraném vzorku krve. Jednou z hlavních molekul, které jsou tvořeny antigen specificky stimulovanými T lymfocyty, je cytokin interferon gama (IFN-γ), jehož míru produkce lze detekovat metodou ELISA nebo ELISPOT. Komerční krevní testy vykazují vyšší specificitu a citlivost než tuberkulinový kožní test a nejsou ovlivněny předchozí vakcinací kmenem M. bovis BCG a infekcí netuberkulózními mykobakteriemi. Na druhou stranu mohou poskytovat falešně pozitivní a negativní výsledky a jsou příliš drahé pro rutinní použití v zemích třetího světa, kde je výskyt tuberkulózy nejvyšší. Proto je stále nutné hledat nové způsoby diagnostiky latentní tuberkulózy, které budou specifické, citlivé, automatizovatelné, rychlé a finančně dostupné. Pro vylepšení krevních testů lze použít detoxifikovaný CyaA toxin dopravující 9

10 antigeny přímo do APC, přičemž minulé studie prokázaly diagnostický potenciál fúzních toxoidů CyaA-ESAT-6 a CyaA-CFP-10. Existují další antigeny vyskytující pouze u virulentních mykobakteriálních kmenů a chybí u vakcinačního kmene M. bovis BCG. Jedním z nich je i antigen TB7.7. Záměrem této diplomové práce je využít unikátních vlastností adenylát cyklázového toxinu a vytvořit nový fúzní protein CyaA-TB7.7, který by mohl zvyšovat specificitu a citlivost krevních testů, restimulovat více antigen specifických T lymfocytů a celkově sloužit jako další z diagnostických nástrojů latentní tuberkulózy. Kroky vedoucí ke splnění vytyčeného cíle jsou následující: 1. Konstrukce expresních vektorů pro produkci rekombinantního toxinu CyaA, do kterého je genetickou modifikací vložen diagnosticky významný mykobakteriální antigen TB7.7 a kontrolní epitop odvozený od ovalbuminu v definovaných permisivních místech. 2. Produkce a následná purifikace rekombinantních CyaA proteinů nesoucích antigen TB7.7 a kontrolní epitop. 3. Charakterizace biologických vlastností vytvořených rekombinantních CyaA proteinů. 10

11 2. Přehled literatury 2.1. Bakterie Bordetella pertussis a černý kašel Bordetella pertussis (B. pertussis) je krátká, gramnegativní, nepohyblivá, striktně aerobní bakterie způsobující vysoce nakažlivé infekční respirační onemocnění nazývané černý kašel. Přenáší se kapénkovou cestou a postihuje především děti v předškolním věku, u kterých nemoc způsobuje vážné komplikace. Infekce se vyskytuje i u dospělých lidí, ale často s mírnějšími projevy než u dětí. Černý kašel lze charakterizovat jako lokalizované onemocnění dýchacích cest se specifickými příznaky, jako je paroxysmální kašel, neurologické projevy ("pertussová encefalopatie") a leukocytóza. Inkubační doba je ve většině případů 7 až 10 dnů a onemocnění probíhá 6 až 12 týdnů ve třech klinických stádiích katarálním, paroxysmálním a rekonvalescenčím. Katarální stádium trvá 1 až 2 týdny, kdy bakterie kolonizuje epitel horních cest dýchacích, množí se a lze ji vykultivovat z faryngeálních výtěrů. První známky nemoci vypadají jako běžné nachlazení s rýmou, chrapotem a necharakteristickým kašlem. V této fázi lze rozvoj onemocnění a délku trvání ovlivnit antimikrobiální léčbou kombinací chloramfenikolu, erytromycinu nebo ampicilinu. Ve 2. až 3. týdnu nastupuje paroxysmální stádium trvající 2 až 8 týdnů, někdy i déle. Kultivace bakterií z horních cest dýchacích je obtížná a antimikrobiální léčba nepomáhá utlumit průběh nemoci. V tomto období se objevují charakteristické opakující se záchvaty prudkého, suchého a křečovitého kašle, které jsou způsobeny bakteriálními faktory virulence. Poslední stádium rekonvalescence trvá průměrně 1 až 2 týdny, kdy záchvaty kašle pomalu mizí a postupně dochází k uzdravení nemocných jedinců Faktory virulence bakterie Bordetella pertussis B. pertussis produkuje celou řadu faktorů virulence navozujících stav lokální imunosuprese, čímž je umožněno bakterii úspěšně kolonizovat dýchací cesty. Faktory virulence pomáhají bakterii vstupovat do hostitele, čelit jeho imunitní obraně, interagovat s cílovými buňkami a přetrvávat v hostitelském organizmu. Rozdělují se do dvou skupin na adheziny a toxiny. Důležitou roli při infekci hrají adheziny usnadňující vazbu bakterie na epitel dýchacích cest. Hlavní adhezivní molekulou je vláknitý hemaglutinin (FHA), který je spojen s vnější bakteriální membránou nebo je sekretován do extracelulárního prostoru (Locht et al., 1993). Mezi adheziny dále patří fimbrie (Fim), pertaktin (PRN) a tracheální kolonizační faktor (TCF) (Antoine et al., 2000; Locht et al., 2001; Mooi, 1988; Smith et al., 2001; Weiss and Hewlett, 11

12 1986). Mezi toxiny se řadí adenylát cyklázový toxin (CyaA, ACT), pertusový toxin (PTX) fungující i jako adhezin, dermonektrotický toxin (DNT), tracheální cytotoxin (TCT) a endotoxin lipopolysacharid (LPS) (Antoine et al., 2000; Locht et al., 2001; Mooi, 1988; Smith et al., 2001; Weiss and Hewlett, 1986) Adenylát cyklázový toxin Adenylát cyklázový toxin (CyaA nebo ACT) je klíčovým faktorem virulence bakterie B. pertussis, neboť bylo zjištěno, že kmeny bakterie mutantní v genu pro CyaA jsou avirulentní (Gross et al., 1992; Khelef et al., 1992; Weiss and Hewlett, 1986). Dále bylo ukázáno, že toxin hraje důležitou roli během prvních fází kolonizace respiračního systému (Goodwin and Weiss, 1990; Khelef et al., 1992). CyaA toxin patří mezi tzv. RTX (Repeats In Toxin) rodinu bakteriálních toxinů, kam jsou řazeny například leukotoxiny LtxA bakterie Actinobacillus actinomycetemcomitans (Lally et al., 1989) a LktA bakterie Pasteurella haemolytica (Chang et al., 1987) nebo αhemolyzin (HlyA) bakterie E. coli (Cavalieri et al., 1984) a hemolyzin ApxI A bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae (Frey et al., 1991). RTX toxiny jsou si podobné ve více ohledech uspořádáním genů na chromozomu, sekrečním mechanizmem rozpoznávajícím C-koncový sekreční signál toxinu, nutností posttranslační modifikace nebo tvorbou pórů v membránách cílových buněk. Hlavním charakteristickým rysem této rodiny je série nonapeptidových vápník vazebných opakování bohatých na glycin a aspartát prototypu G-GX-G-X-D-X-[L/I/V/W/Y/F]-X (Lally et al., 1999) Geny podílející se na produkci, aktivaci a sekreci toxinu CyaA Exprese adenylát cyklázového toxinu vykazuje rysy charakteristické pro celou rodinu RTX toxinů. Syntéza, aktivace a sekrece CyaA toxinu je zajištěna pěti strukturními geny (Obr. 1), které jsou na chromozomu bakterie umístěny bezprostředně za sebou na lokusu cyacabde (Glaser et al., 1988). Lokus je pod kontrolou dvousložkového transdukčního systému BvgA/S, jenž je hlavním regulátorem genů odpovědných za virulenci B. pertussis (Scarlato et al., 1991). Gen cyaa kóduje neaktivní protoxin procyaa, který je aktivován posttranslační úpravou spočívající v palmitoylaci ε-aminoskupin lyzinů 860 a 983 nacházejících se v RTX doméně (Hackett et al., 1994). Modifikaci zajišťuje acyltransferáza kódovaná genem cyac 12

13 (Barry et al., 1991; Sebo et al., 1991) a geny cyabde kódují proteiny nutné pro sekreci toxinu CyaA. Protein CyaB je ATPáza vnitřní membrány, protein CyaD je transmembránový fúzní protein a CyaE tvoří složku kanálu vnější membrány (Smith et al., 2001). Geny cyaabde jsou přepisovány do jedné mrna ze společného promotoru umístěného před genem CyaA (Laoide and Ullmann, 1990). Další promotor, který leží mezi geny cyaa a cyab, je konstitutivní povahy a umožňuje syntézu pouze malého množství mrna cyabde (Laoide and Ullmann, 1990). Gen cyac je umístěn před genem cyaa a je přepisován v opačném směru než ostatní geny (Glaser et al., 1988). cyac cyaa cyab cyad cyae Obr. 1. Schématické znázornění lokusu cyacabde. Vznik aktivního adenylát cyklázového toxinu je zajištěn pěti strukturními geny kódovanými na lokusu cyacabde. Červeně je zobrazen gen kódující neaktivní procyaa toxin, modře geny kódující proteiny nezbytné pro sekreci protoxinu procyaa a zeleně gen pro aktivaci toxinu. Černě jsou znázorněny promotory, z nichž jsou geny přepisovány (upraveno dle Smith et al., 2001) Struktura CyaA Adenylát cyklázový toxin je 1706 aminokyselin dlouhý protein o molekulové hmotnosti 177 kda. Skládá se ze dvou strukturně a funkčně odlišných domén (Obr. 2) N-koncové 400 aminokyselin dlouhé katalytické adenylát cyklázové (AC) domény a C-koncové 1306 aminokyselin dlouhé RTX hemolytické domény (Glaser et al., 1988). Katalytická AC doména může být proteolýzou rozdělena na dvě subdomény T25 tvořenou aminokyselinami a T18 sestávající z aminokyselin (Ladant, 1988). Obě subdomény obsahují místa důležitá pro vazbu kalmodulinu (Bouhss et al., 1993; Guo et al., 2005) a bylo zjištěno, že izolované T25 a T18 fragmenty mohou být pomocí kalmodulinu spojeny v komplex s plně funkční AC aktivitou (Ladant et al., 1989; Munier et al., 1991). AC doména dále obsahuje tzv. permisivní místa, kam lze geneticky vložit krátké oligopeptidy nebo antigeny, aniž by došlo k ovlivnění stability toxinu (Ladant et al., 1992; Osicka et al., 2000). 13

14 Permisivní místa Lys860 Lys983 Vazebné místo pro receptor Sekreční signál N C 0 T Hydrofobní T18 doména AC doména 1000 Acylační místa Repetitivní doména (vazba Ca2+ ) RTX doména Obr. 2. Schématické znázornění toxinu CyaA. CyaA je 1706 aminokyselin dlouhý toxin skládající se ze dvou hlavních částí N-koncové katalytické adenylát cyklázové AC domény a C-koncové RTX hemolyzinové domény. AC doména je tvořena subdoménami T25 a T18 a obsahuje tzv. permisivní místa. RTX doména se dělí na hydrofobní doménu, místa pro posttranslační modifikaci, vápník vazebnou doménu, vazebné místo pro receptor a sekreční signál (upraveno dle Guo et al., 2005). RTX doména je rozdělena na několik segmentů hydrofobní kanálotvornou doménu (Benz et al., 1994), cílová místa pro posttranslační palmitoylaci (Hackett et al., 1994), vápník-vazebnou doménu obsahující sérii kopií sekvencí bohatých na glycin a aspartát (Rose et al., 1995), vazebné místo pro receptor CD11b/CD18 (Guermonprez et al., 2001) a C-koncový sekreční signál (Sebo and Ladant, 1993) Funkce CyaA Biologické vlastnosti toxinu CyaA jsou zásadní pro virulenci druhu Bordetella a umožňují bakteriím překonat první obrannou linii přirozeného imunitního systému (Goodwin and Weiss, 1990; Weiss and Goodwin, 1989). Dosud byly popsány tři biologické aktivity toxinu, které jsou schématicky zobrazeny v navrženém a nedávno aktualizovaném modelu interakce CyaA s membránou cílových buněk (Obr. 3). Unikátní schopností toxinu CyaA je translokace jeho katalytické AC domény přímo přes cytoplazmatickou membránu cílových buněk, aniž by docházelo k receptorem zprostředkované endocytóze (Basler et al., 2007; Gordon et al., 1988; Guermonprez et al., 1999; Schlecht et al., 2004). Doprava AC domény do buněk je realizována celým monomerním CyaA toxinem (Bellalou et al., 1990; Iwaki et al., 1995) a po translokaci dochází v cytozolu buněk k odštěpení AC domény buněčnými proteázami (Rogel and Hanski, 1992). Zbytek toxinu pravděpodobně není schopen oligomerizovat a hromadí se ve formě monomeru v membráně buněk (Vojtova-Vodolanova et al., 2009). Uvnitř buněk dochází 14

15 k navázání intracelulárního kalmodulinu na AC doménu a předpokládá se, že tato vazba spouští konformační změny důležité pro stabilizaci enzymaticky aktivní formy AC domény (Karst et al., 2010). Hlavní biologickou aktivitou toxinu CyaA je nekontrolovaná přeměna buněčného ATP na cyklický adenosin monofosfát (camp) (Confer and Eaton, 1982; Hanski and Farfel, 1985; Wolff et al., 1980), jenž slouží jako klíčový druhý posel. Rychlý vzestup koncentrace camp ovlivňuje funkčnost fagocytárních buněk, které přestávají vykonávat své baktericidní funkce, jako je chemotaxe nebo produkce superoxidu (Confer and Eaton, 1982; Friedman et al., 1987; Weingart et al., 2000). Intoxikace adenylát cyklázovým toxinem vede k celkovému narušení buněčné signalizace (Kamanova et al., 2008; Ladant and Ullmann, 1999; Rogel et al., 1989), eventuálně končící až programovou smrtí buněk (Basler et al., 2006; Hewlett et al., 2006; Khelef et al., 1993). AC AC RTX RTX AC RTX AC RTX Kanálový prekurzor Inzerce Kationty AC RTX RTX AC RTX Štěpení buněčnými proteázami Translokační prekurzor ATP camp AC Inzerce Ca2+ Translokace RTX Inzerce Meziprodukt AC RTX Kanálotvorný prekurzor RTX AC AC RTX Oligomerní kationselektivní prekurzor Obr. 3. Model interakce CyaA s membránou cílové buňky. AC adenylát cyklázová doména, RTX RTX doména. Předpokládá se existence translokačního a kanálotvorného prekurzoru. Kanálotvorný prekurzor tvoří v membráně cílových buněk oligomerní kationselektivní kanály (Basler et al., 2007; Osickova et al., 1999). Translokační a kanálotvorný prekurzor spolu pravděpodobně interagují a vytvářejí oligomerní meziprodukt (Iwaki et al., 2000). Translokační prekurzor dopravuje AC doménu do cytozolu cílových buněk, kde dochází k odštěpení této domény buněčnými proteázami (Rogel and Hanski, 1992). Monomerní molekula CyaA, která dopravila AC doménu do buněk, už nemůže být součástí oligomerního kanálu (upraveno dle Vojtova-Vodolanova et al., 2009). Nově popsanou aktivitou je ovlivnění signalizačních drah nárůstem intracelulární koncentrace vápenatých iontů. K vysoké hladině Ca2+ iontů v buňkách přispívá přeměna ATP na camp AC doménou a vyčerpání buněčného ATP, které je nezbytné pro funkčnost pump čerpajících vápník ven z buněk. Vápenaté ionty se do buněk nedostávají kanály otevřenými molekulami camp nebo kation-selektivními kanály vytvořenými toxinem CyaA, ale vstupují 15

16 z extracelulárního prostoru během translokace AC domény (Fiser et al., 2007). Další aktivitou toxinu je schopnost tvořit malé oligomerní kation-selektivní póry v plazmatické membráně cílových buněk pomocí RTX domény (Bellalou et al., 1990; Benz et al., 1994; Ladant and Ullmann, 1999; Szabo et al., 1994), což způsobuje permeabilizaci membrán přispívající k smrti buněk (Basler et al., 2006; Hewlett et al., 2006). Vytvořenými póry proudí do buněk molekuly vody a celý proces může iniciovat koloidní osmotickou lýzu červených krvinek nazývanou hemolytická aktivita toxinu (Bellalou et al., 1990; Benz et al., 1994; Ehrmann et al., 1991; Szabo et al., 1994). Narozdíl od translokace AC domény, která je zajištěna celým toxinem (Bellalou et al., 1990; Iwaki et al., 1995), není vznik kanálů závislý na přítomnosti AC domény toxinu (Sakamoto et al., 1992). Toxin CyaA je produkován jako inaktivní protoxin procyaa, pro jehož cytotoxickou aktivitu je nezbytná kovalentní posttranslační palmitoylace na ε-aminoskupinách lyzinů 860 a 983 v RTX doméně (Barry et al., 1991; Benz et al., 1994; Hackett et al., 1994; Rogel et al., 1989). Modifikaci zajišťuje acyltransferáza CyaC, která je produkována spolu s toxinem CyaA v buňkách B. pertussis (Barry et al., 1991). Konformace acylovaného toxinu se pravděpodobně liší od neacylovaného procyaa a předpokládá se, že acylace ovlivňuje tendenci toxinu tvořit oligomery v membránách (Masin et al., 2004). V RTX doméně se mezi aminokyselinami až nachází oblast obsahující 45 nonapeptidových opakujících se sekvencí bohatých na aspartát a glycin (Hewlett et al., 1991; Knapp et al., 2003; Rose et al., 1995). V této repetitivní doméně jsou vytvořena vazebná místa pro vápenaté ionty a jejich navázání způsobuje výrazné konformační změny v molekule CyaA nezbytné pro biologické aktivity toxinu (Rhodes et al., 2001; Rose et al., 1995). Důležitou součástí toxinu CyaA je vazebné místo pro specifický αmβ2 intergrinový receptor (CD11b/CD18, Mac-1 nebo CR3) nacházející se na povrchu myeloidních fagocytárních buněk, jako jsou neutrofily, makrofágy a dendritické buňky (El-Azami-ElIdrissi et al., 2003; Guermonprez et al., 2001). Jedná se o silně glykosylovaný receptor (Asada et al., 1991) a toxin přímo rozeznává oligosacharidové řetězce na receptoru CD11b/CD18 (Morova et al., 2008). Dále bylo ukázáno, že glykosylace hraje zásadní roli při vazbě CyaA na cílové buňky (Morova et al., 2008). 16

17 Imunitní odpovědi a doprava antigenů pomocí CyaA Existují dva základní typy antigen specifických imunitních odpovědí humorální a buněčně zprostředkovaná. Při napadení organizmu cizorodými látkami, mikroorganizmy nebo viry se uplatňují oba typy zároveň, ale v různé míře. Humorální imunitní odpověď je zajištěna působením protilátek produkovanými B lymfocyty a buněčně zprostředkovaná reakce je založená na T lymfocytech, které se dají rozdělit do dvou hlavních skupin nesou na svém povrchu buď koreceptor CD4, nebo CD8. CD4+ T lymfocyty jsou prekurzory pomocných T lymfocytů (TH), jenž lze dále rozčlenit na TH1, TH2, TH3, TH17 a několik dalších skupin podle velikosti buněk, funkce a produkovaných cytokinů. TH1 buňky mají za úkol stimulovat makrofágy k přeměně na tzv. aktivované makrofágy mající schopnost zabíjet intracelulární parazity. Funkcí TH2 lymfocytů je podpora B lymfocytů při jejich diferenciaci v plazmatické buňky, které produkují velké množství protilátek. Nově objevené TH17 lymfocyty tvoří cytokiny stimulující epiteliální buňky k produkci antimikrobiálních proteinů chránící buňky před napadením extracelulárními bakteriemi. CD4+ T lymfocyty rozpoznávají epitopy s molekulami MHC II nacházející se na povrchu antigen prezentujících buněk, jako jsou dendritické buňky, monocyty, makrofágy a B lymfocyty. Vystavené epitopy pocházejí z exogenních proteinů, jenž jsou endocytovány antigen prezentujícími buňkami, kde vzniklé endozomy fúzují s lysozomy obsahující hydrolázy štěpící pohlcené proteiny. Následuje splynutí s váčkem z Golgiho aparátu, v němž se nachází prekurzory molekul MHC II. Vytvoří se komplex MHC II-epitop, který je vystavený na povrchu APC a rozeznávaný pomocnými CD4+ T lymfocyty. Stimulované T lymfocyty produkují různé cytokiny, jako jsou IL-4, IL-10, IL-22 nebo interferon gama (IFN-γ). CD8+ T lymfocyty jsou prekurzory cytotoxických T lymfocytů (CTL) uplatňující se nejvíce při infekčních a nádorových onemocněních. Ničí buňky infikované viry nebo intracelulárními parazity a také poškozené či nefunkční buňky. CD8+ T lymfocyty rozeznávající epitopy pocházejí především z endogenních proteinů, tj. produkovaných buňkou, s molekulami MHC I nacházejících se na všech buňkách s jádrem. Proteiny jsou v cytoplazmě antigen prezentujících buněk degradovány proteazomem, který štěpí jak vlastní buněčné proteiny, tak i antigeny pocházející z intracelulárních parazitů, replikujících se virů nebo specifické antigeny nádorových buněk. Vzniklé peptidové fragmenty jsou poté přeneseny prostřednictvím specifických membránových přenašečů označovaných jako TAP (Transporters Associated With Antigen Processing) do endoplazmatického retikula, kde dochází k jejich vazbě s molekulami MHC I. Komplex MHC I-epitop je poté transportován 17

18 do Golgiho aparátu a posléze na povrch buněk. Zde dochází k jeho rozeznání CD8+ T lymfocyty. Při setkání s napadenými buňkami začnou CTL produkovat cytotoxiny perforin a granulyzin, což nakonec vede k programované smrti (apoptóze) infikovaných buněk. Další způsob, jak T lymfocyty vyvolávají apoptózu u nakažených buněk, je exprese povrchového Fas ligandu (FasL), který se váže na Fas receptor cílových buněk. Stimulované cytotoxické T lymfocyty uvolňují cytokiny, jako je IFN-γ aktivující další složky imunitního systému. Toxin CyaA dokáže vnikat do různých typů eukaryotických buněk a specificky se vázat na profesionální antigen prezentující buňky, jenž mají na svém povrchu receptor CD11b/CD18 (El-Azami-El-Idrissi et al., 2003; Guermonprez et al., 2001). To vedlo k myšlence využít adenylát cyklázový toxin jako nereplikativní invazivní vektor pro dopravu cizorodých epitopů přímo do cytozolu cílových buněk. Experimentálně bylo potvrzeno, že antigeny dopravené pomocí adenylát cyklázového toxinu mohou být vystaveny na povrchu antigen prezentujících buněk jak s molekulou MHC I, tak s molekulou MHC II (Obr. 4) (Dadaglio et al., 2000; Loucka et al., 2002; Osicka et al., 2000; Sebo et al., 1995; Simsova et al., 2004). Předpokladem pro použití toxinu CyaA, coby vektoru pro dopravu antigenů do cytozolu APC, je zachování jeho stability, a proto jsou antigeny vkládány do tzv. permisivních míst (Ladant et al., 1992; Osicka et al., 2000). Studie dokládají, že umístění peptidu za aminokyselinu 233 nemění vlastnosti adenylát cyklázového toxinu, který stále dokáže vnikat do buněk a přeměňovat ATP na camp (Osicka et al., 2000). Navzdory tomu bylo ukázáno, že inzerce celých antigenů nebo peptidů do jiných míst v AC doméně může měnit některé vlastnosti toxinu. Například vložení hexapeptidu do pozice 108 vede k čtyřnásobnému snížení specifické AC aktivity a nebo umístění epitopu odvozeného od ovalbuminu v místě 336 způsobuje detoxifikaci toxinu, ale neovlivňuje jeho invazivní aktivitu (Osicka et al., 2000). CyaA toxoidy schopné translokovat neenzymaticky aktivní AC domény mohou fungovat jako nástroje pro dopravu různých antigenů přímo do antigen prezentujících buněk, čemuž napomáhá afinita CyaA k receptoru CD11B/CD18. Již dříve bylo popsáno, že CyaA je schopný dopravit do buněk epitopy z viru lymfocytární choriomeningitidy (LCMV) (Sebo et al., 1995) nebo maltózu vázajícího proteinu (MalE) z E. coli (Loucka et al., 2002) a indukovat in vivo a in vitro imunitní reakce. Dále bylo zjištěno, že geneticky detoxifikovaný adenylát cyklázový toxin může sloužit jako nereplikativní vektor pro dopravu mykobakteriálních antigenů přímo do APC (Vordermeier et al., 2004; Wilkinson et al., 2005). Je tak možno využít systém fúzních CyaA proteinů jako diagnostický nástroj pro detekci tuberkulózy. 18

19 Prezentace na MHC I Antigen Receptor CD11b/CD18 Prezentace na MHC II RT X RT X AC Tvorba kanálů Proteazom Antigen prezentující buňka RT X AC AC Translokace do cytozolu AC RT X AC RT X Endozom TAP MHC II peptid Endoplazmatické retikulum MHC I peptid MHC II MHC I Golgiho aparát CD8+ T buněčný receptor CD4+ T buněčný receptor CD4+ T lymfocyt CD8+ T lymfocyt Obr. 4. Doprava antigenu pomocí CyaA. Existují dvě dráhy, kterými toxin CyaA dopravuje antigeny na povrch antigen prezentujících buněk. První cesta zahrnuje translokaci AC domény nesoucí antigen do cytozolu, kde jsou antigeny zpracovány v proteazomu. Peptidy jsou poté přemístěny přes TAP do endoplazmatického retikula a navázány k nově vznikajícím molekulám MHC I. Komplex MHC I-peptid je vystaven na povrchu CD8+ T lymfocytům. Druhý způsob spočívá v endocytóze toxinu CyaA a následném zpracováním nesených antigenů. Vzniklé peptidy jsou poté vystaveny s molekulou MHC II CD4+ T lymfocytům (upraveno dle Simsova et al., 2004) Mycobacterium tuberculosis a tuberkulóza Acidorezistentní bakterie Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) (Obr. 5) byla poprvé popsána Robertem Kochem dne 24. března Řadí se mezi fakultativně intracelulární patogeny, protože přežívá a roste uvnitř makrofágů nebo granulocytů. Jako obligátně aerobní mikroorganizmus potřebuje ke svému životu nutně kyslík, a proto nejčastěji napadá dýchací ústrojí. M. tuberculosis má dlouhou generační dobu, přibližně hodin, v porovnání s například Escherichia coli, která se za ideálních podmínek dělí jednou za 20 minut. Mykobakterie byly dlouhou dobu považovány za nesporulující organizmy, ale nedávná studie ukazuje, že Mycobacterium marinum a pravděpodobně i další kmeny tvoří spóry (Ghosh et al., 2009). Buněčná stěna mykobakterií se stejně jako u jiných mikroorganismů skládá z vrstvy peptidoglykanu, ale navíc obsahuje další vnější obal s velkým množstvím lipidů. Největší zastoupení mají kyseliny mykolové, které ovlivňují propustnost buněčné stěny a dodávají jí 19

20 vysokou hydrofobicitu. Jedinečná stavba buněčné stěny a její vlastnosti způsobují rezistenci na většinu běžných antibiotik (Jarlier and Nikaido, 1994), odolnost proti osmotické lýze a usnadňují přežívání uvnitř makrofágů. Obr. 5. Elektronmikroskopický snímek bakterie Mycobacterium tuberculosis. Obarvený snímek ze skenovacího elektronového mikroskopu se zvětšením 15549x detailně zachycuje strukturu buněčné stěny. Velikost bakterie se pohybuje mezi 2 4 μm na délku a 0,2 0,5 μm na šířku (upraveno dle Public Health Image Library ID #9997). Tuberkulóza (TBC), dříve známá také pod názvem souchotiny či úbytě, je plicní infekční onemocnění způsobené komplexem blízce příbuzných mykobakterií (M. tuberculosis complex), kam patří M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti a M. canetti. Mnoho let se předpokládalo, že se na člověka tuberkulóza přenesla ze skotu, jelikož rozpětí hostitelů je u M. bovis daleko širší než u M. tuberculosis. Ovšem ve studii zabývající se delecemi a inzercemi v genomu komplexu M. tuberculosis byl prokázán nezávislý vývoj M. tuberculosis a M. bovis z původního předka (Brosch et al., 2002). TBC se přenáší kapénkovou infekcí z člověka na člověka a vzácněji může být zdrojem nemoci zvíře jako je např. domácí skot. Jedinec s neléčenou aktivní formou nemoci infikuje ročně v průměru 10 až 15 dalších lidí a pravděpodobnost nákazy závisí na délce vystavení a na počtu přenesených infekčních kapének. Podle některých odhadů je téměř třetina světové populace nakažena bakterií M. tuberculosis. Světová zdravotnická organizace v roce 2007 zaznamenala 9,27 miliónů lidí s tuberkulózou a 1,77 miliónů osob na tuto chorobu zemřelo. Příznaky nemoci jsou kašel často doprovázený krví, bolesti v hrudi, slabost, úbytek váhy, nechutenství, horečky a noční pocení. Tuberkulóza je závažná choroba, která je jednou z hlavních příčin úmrtí v rozvojových zemích (Obr. 6). Ve vyspělých zemích se díky lepším životním podmínkám, hygieně, účinné 20

21 léčbě antibiotiky a očkování podařilo výskyt onemocnění výrazně snížit. V posledních letech však počet nakažených vzrůstá, hlavně díky migraci obyvatel, mezinárodnímu cestování, zhoršené imunitě a špatným životním podmínkám v zemích třetího světa. Dalším velkým problémem je zvyšující se množství multirezistentních kmenů a udává se, že až 5 % nakažených lidí je jimi infikováno. Standardně používaná antibiotika na ně nejsou účinná, a proto se léčba stává obtížnou a nákladnou (Wade and Zhang, 2004). Bez záznamu a více Obr. 6. Mapa výskytu tuberkulózy na obyvatel z roku Největší počet nemocných lidí se nachází na území Afriky, jihovýchodní Asie a západního Pacifiku, kde bylo dohromady zaznamenáno 83 % všech případů (Světová zdravotnická organizace). Významným faktorem přispívajícím k velkému rozšíření TBC je vysoká incidence viru HIV. Jedinci koinfikovaní virem HIV a bakterií M. tuberculosis mají 60 70% šanci, že u nich během života propukne aktivní onemocnění (Swaminathan et al., 2000), zatímco u osob napadených jen bakterií M. tuberculosis je pravděpodobnost reaktivace tuberkulózy 5 10 % (Raja, 2004; Selwyn et al., 1989) Infekce bakterií M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis do těla vstupuje respirační cestou a jako obligátně aerobní patogen nejčastěji infikuje plíce, odkud se do dalších částí těla šíří lymfatickým a krevním systémem. U 15 % pacientů se mimoplicní tuberkulóza objevuje v pohrudnici, lymfatickém systému, kostech, urogenitálním systému, mozkových blanách, pobřišnici nebo kůži (Raja, 2004). Dosud není známo, že by bakterie M. tuberculosis tvořila endo- nebo exotoxiny. Virulence pravděpodobně závisí na její schopnosti odolávat a přežívat obranné reakce imunitního systému hostitele. Bakterie sama o sobě nezpůsobuje žádné poškození tkání 21

22 (Menon, 1997) a patologické projevy tuberkulózy jsou zapříčiněny hostitelským imunitním systémem, který se snaží zastavit růst bakterie. Průběh onemocnění (Obr. 7) se liší v závislosti na genetickém profilu a rozdílné účinnosti imunitního systému napadených osob. U některých jedinců je bakterie M. tuberculosis z těla odstraněna a nedochází ke vzniku tuberkulózy. U většiny lidí se po přenosu kapének obsahujících bakterie rozvine tzv. primární infekce, která zhruba u 5 10 % případů vede k propuknutí aktivní tuberkulózy, převážně v prvních dvou letech po infekci (Comstock, 1982). U % nakažených osob nedochází k úplnému zničení bakterií, ale k potlačení jejích růstu, rozvoji buněčně zprostředkované imunity, vzniku granulomů a k navození tzv. latentní infekce. Jedinci s latentní tuberkulózou nevykazují žádné příznaky nemoci a dále ji nepřenáší (Parrish et al., 1998), může se však u nich kdykoliv v průběhu života rozvinout aktivní forma (Selwyn et al., 1989). Nejčastější příčinou reaktivace bývá léčba kortikosteroidy, nadměrné užívání alkoholu a drog, stárnutí nebo narušení imunitního systému, např. vlivem infekce virem HIV. Přenos infekce Primární infekce 5 10 % % Aktivní tuberkulóza Latentní infekce 5 10 % Reaktivace aktivní tuberkulózy Obr. 7. Průběh infekce bakterií M. tuberculosis. Po inhalaci infekčních kapének obsahujících bakterie dochází u většiny lidí k primární infekci, která se u 5 10 % infikovaných osob rozvine v aktivní onemocnění, nejčastěji v průběhu prvních dvou let. V % případů primární infekce přechází v latentní infekci, která se u 5 10 % lidí v průběhu života reaktivuje v aktivní tuberkulózu (upraveno dle Locht et al., 2007). 22

23 Pro interakci bakterie M. tuberculosis s hostitelskými buňkami je důležitý specifický povrchový glykoprotein lipoarabinomannan (LAM) (Schlesinger et al., 1994), který je součástí její buněčné stěny. Pomocí LAM se bakterie váže na povrch dendritických buněk a makrofágů přes lektinový receptor DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Non-Integrin), receptory komplemetu (CR1, CR2, CR3 a CR4) nebo mannózové receptory (Tailleux et al., 2003). Hlavní funkcí makrofágů a dendritických buněk je fagocytóza mikroorganizmů, jenž jsou pohlceny do fagozomálních váčků. Vzniklé fagozomy jsou následně spojeny s lysozomy a spolu tvoří fagolysozom, kde působí kyselé hydrolázy degradující bakterie. Zabránění spojení fagozomu s lysozomem je jedním z možných způsobů, které mykobakterie využívají k přežití uvnitř makrofágů (Armstrong and Hart, 1971; Hart et al., 1972; Moreira et al., 1997). Další obrannou reakcí makrofágů při infekci mykobakteriemi je produkce reaktivních forem kyslíku (ROI Reactive Oxygen Intermediates) a dusíku (RNI Reactive Nitrogen Intermediates). Peroxid vodíku, jeden z ROI vznikající při oxidativním vzplanutí, byl identifikovaný jako molekula působící proti mykobakteriím (Walker and Lowrie, 1981). Nicméně schopnost ROI zabít mykobakterie byla prokázána pouze na myším modelu (Flesch and Kaufmann, 1987), u lidí zatím ne. Makrofágy aktivované cytokiny interferonem gama (IFN-γ) a tumor necrosis factor α (TNF-α) tvoří oxid dusnatý (NO) a další RNI pomocí enzymu NOS2 (Inducible Form of Nitric Oxide Synthase) (Flynn and Chan, 2001). Již dříve bylo dokumentováno, že toxické dusíkaté oxidy hrají roli jak in vitro, tak in vivo, hlavně u myší (Selvaraj et al., 1988). Během 2 až 4 týdnů po infekci se rozvíjí buněčně zprostředkovaná imunita a do postižených míst jsou dopraveny lymfocyty a aktivované makrofágy. Po určité době vznikají v místech infekce granulomy, ve kterých jsou bakterie drženy a zabraňuje se jejich exponenciálnímu růstu. Bakterie v granulomech mohou přežívat i několik let, ale kdykoliv se mohou reaktivovat a pronikat do plicní tkáně, kde poté dochází k jejich masivnímu rozmnožení a nekróze. Poslední způsob zabránění šíření infekce představuje zhuštění vaziva v tkáni (fibróza) kolem místa nekrózy a následná kalcifikace M. tuberculosis a buněčně zprostředkovaná imunita M. tuberculosis je klasický případ patogenu, proti kterému se tělo chrání především spuštěním buněčně zprostředkované imunitní odpovědi (CMI Cell Mediated Immune). Bakterie přežívá uvnitř makrofágů, a proto pro její zastavení a odstranění jsou důležitější 23

24 efektorové T lymfocyty než protilátky. Během prvního týdne po infekci virulentním kmenem mykobakterie se u myší zvyšuje počet aktivovaných CD4+ a CD8+ T lymfocytů v lymfatických uzlinách poblíž plic (Feng et al., 1999; Serbina et al., 2000) a mezi 2 4 týdnem putují aktivované T lymfocyty do místa infekce, kde vznikají granulomy. Tyto útvary obsahují CD4+ a CD8+ T lymfocyty (Flynn et al., 1992; Randhawa, 1990), které udržují bakterii uvnitř granulomů a zabraňují reaktivaci onemocnění. Jednu z nejvýznamnějších rolí při ochraně proti M. tuberculosis hrají CD4+ T lymfocyty rozpoznávající na povrchu APC molekuly MHC II s antigeny, jenž pocházejí z fagocytovaných mykobakterií. Hlavní úlohou CD4+ T lymfocytů je tvorba IFN-γ a dalších cytokinů potřebných k aktivaci makrofágů zamezujících následně růst nebo přímo ničících bakterie. Studie na myším modelu s nefunkčními CD4+ T lymfocyty ukázaly jejich důležitost pro správnou imunitní reakci proti tuberkulóze (Caruso et al., 1999; Müller et al., 1987). Snížení počtu CD4+ T lymfocytů koinfekcí virem HIV u lidí vysoce zvyšuje náchylnost jak k rozvinutí nemoci po primární infekci, tak k reaktivaci latentní formy (Selwyn et al., 1989). Dále bylo ukázáno, že paměťové CD4+ T lymfocyty jsou nutné k získání imunity proti M. tuberculosis (Andersen and Smedegaard, 2000). Dalším typem buněk chránících tělo před infekcí jsou CD8+ T lymfocyty, jenž mají dvě efektorové funkce spouštějí programovanou buněčnou smrt u infikovaných makrofágů a tvoří různé cytokiny, jako jsou IFN-γ či IL-4. Studie ukazují, že CD8+ T lymfocyty jsou při infekci dopraveny do plic stejně rychle jako CD4+ T lymfocyty (Feng et al., 1999; Serbina and Flynn, 1999) a produkce cytokinů CD8+ T lymfocyty by mohla u pacientů s plicní TBC regulovat rovnováhu mezi TH1 a TH2 imunitní odpovědí. Mechanizmus, kterým mykobakteriální antigeny získávají přístup k MHC I molekulám, není úplně objasněn. Bakterie byly v makrofázích nalezeny mimo fagozomy 4 5 dní po infekci (McDonough et al., 1993), ale prezentace antigenů napadenými makrofágy CD8+ T lymfocytům se objevuje už 12 hodin po nakažení (Serbina et al., 2000; Teitelbaum et al., 1999). Mykobakterie je pravděpodobně schopná v membráně fagozomu vytvářet póry a využívat je k získání živin nebo přepravě metabolitů do cytoplazmy. Vedlejším efektem může být přenos širokého množství různých mykobakteriálních antigenů do cytozolu buněk, kde dojde k jejich zpracování a vystavení s molekulami MHC I. 24

25 Role cytokinů při infekci bakterií M. tuberculosis Spuštění imunitních odpovědí reagujících na vstup patogenu do těla závisí alespoň částečně na cytokinech, které ovlivňují všechny buňky imunitního systému. M. tuberculosis není žádnou výjimkou a infekce vyvolává produkci celé řady molekul. Chemokiny podporují buněčnou migraci a lokalizaci, ovlivňují aktivaci T lymfocytů (Bonecchi et al., 1998; Sallusto et al., 2000) a spolu s receptory chemokinů přispívají k tvorbě a údržbě granulomů při chronické infekci (Flynn and Chan, 2001). In vitro a in vivo studie na myším modelu ukazují, že M. tuberculosis vyvolává produkci různých chemokinů (Orme and Cooper, 1999; Rhoades et al., 1995). Chemokinové receptory se vyskytují na povrchu velkého množství buněk imunitního systému a interagují s nejrůznějšími ligandy. Jakmile makrofágy a dendritické buňky pohltí mykobakterie, začnou vytvářet cytokin interleukin-12 (IL-12) (Ladel et al., 1997), který podporuje TH1 odpověď a produkci IFN-γ. Lidé s mutací v genech IL-12p40 nebo IL-12R vykazují nižší produkci IFN-γ T lymfocyty a vyšší náchylnost k onemocnění (Ottenhoff et al., 1998). Interferon gama je produkován CD4+ a CD8+ T lymfocyty (Barnes et al., 1993; Serbina and Flynn, 1999) a také NK buňkami. Tento cytokin funguje jako hlavní aktivátor makrofágů a hraje významnou roli při obraně proti tuberkulóze u lidí (Ottenhoff et al., 1998). Zvyšuje prezentaci antigenů vedoucí k aktivaci CD4+ T lymfocytů a/nebo cytotoxických CD8+ T lymfocytů, jenž se podílejí na zneškodnění mykobakterií. Ačkoliv samotná produkce IFN-γ je nedostatečná pro zabránění infekce, je nutná k dalším imunitním reakcím. Lidé s poruchou v genech pro IFN-γ nebo jeho receptory jsou více náchylní k vážným mykobakteriálním onemocněním (Jouanguy et al., 1996; Ottenhoff et al., 1998). Tumor necrosis factor α (TNF-α) je tvořen makrofágy, dendritickými buňkami a T lymfocyty, a zastává několik úloh při odstraňování infekce a při zabránění jejímu rozšíření. Ovlivňuje dopravu a lokalizaci buněk v napadených tkáních a je důležitý pro tvorbu funkčních granulomů (Flynn et al., 1995; Garcia et al., 1997). Na myším modelu bylo zjištěno, že nepřítomnost TNF-α nebo jeho receptorů způsobuje rychlou smrt po nakažení bakterií M. tuberculosis (Flynn et al., 1995). Interleukin-10 (IL-10) je obecně považován za protizánětlivý cytokin, který je produkován makrofágy a T lymfocyty během mykobakteriální infekce. Jednou z jeho funkcí je deaktivace makrofágů a pokles produkce IL-12, což vede ke snížení tvorby IFN-γ T lymfocyty a snížení imunitní ochrany proti tuberkulóze. 25

26 Patologie tuberkulózy při koinfekci virem HIV Virus HIV napadá CD4+ T lymfocyty, které hrají hlavní roli při imunitních reakcích proti tuberkulóze. Důsledkem koinfekce virem HIV je vyšší pravděpodobnost rozvoje aktivní tuberkulózy po primární infekci (Daley et al., 1992), vyšší šance reaktivace latentní formy (Sharma et al., 2005), zhoršená diagnostika tuberkulózy a urychlený celkový průběh nemoci. Působení bakterie M. tuberculosis na druhou stranu ovlivňuje životní cyklus viru HIV a vývoj od asymptomatické fáze nemoci k AIDS je rychlejší (Raja, 2004). Silným aktivátorem replikace HIV v T lymfocytech je TNF-α, jenž je při mykobakteriální infekci vytvářen aktivovanými makrofágy v granulomech (Matsuyama et al., 1991) Vakcinační strategie proti tuberkulóze Na konci 19. století Robert Koch objevil původce tuberkulózy bakterii M. tuberculosis. Snažil se vyvinout terapii založenou na filtrátech in vitro kultur M. tuberculosis, ale při testech na pacientech s TBC nepozoroval žádné známky ochranné imunity před infekcí. Později dva francouzští vědci Albert Calmette a Camille Guérin kultivovali 13 let mykobakterii M. bovis a během té doby sledovali snižování její virulence u zvířat. Zjistili, že pokud se jejich vakcína podala narozeným dětem, snížila se úmrtnost na tuberkulózu o 90 %. První zpráva o úspěšné vakcinaci kmenem M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) v roce 1921 vedla k velkému rozšíření vytvořených kultur do laboratoří po celém světě (Behr and Small, 1999). Studie provedené ve 40tých a 50tých letech v některých vyspělých Evropských zemích ukázaly vysokou účinnost vakcíny (70 80 %), a proto se vakcinace běžně prováděla ve většině Evropských zemích, včetně České republiky. Nicméně mnoho klinických studií dokázalo, že úspěšnost BCG se liší v různých populacích a schopnost poskytovat ochranu před tuberkulózou se pohybuje v rozmezí od 0 do 80 %. Například v USA se BCG vakcína nikdy rutinně nepodávala, protože je v Severní Americe neúčinná. U mladších skupin jsou obecně dosaženy lepší výsledky než u lidí ve středním věku a starších, u kterých nelze prokázat dostatečnou ochranu. Výsledný efekt vakcíny tvoří několik faktorů, mezi které patří genetická rozdílnost populací, promoření environmentálními mykobakteriemi v různých zeměpisných šířkách, různé množství vakcíny v jedné dávce, rozvrh vakcinace a použití různých BCG kmenů Copenhagen-1331, Pasteur-1173P, Glaxo-1077, Tokyo-172, Russian nebo Moreau. Pro celosvětovou prevenci před tuberkulózou je nutné vyvinout mnohem efektivnější 26

27 vakcinační a imunizační strategie na ochranu před primární infekcí. Jako výsledek dlouhodobého bádání se objevilo několik různých přístupů, které zahrnují rekombinantní kmeny BCG (Horwitz et al., 2000; Murray et al., 1996), oslabené nebo auxotrofní mykobakteriální kmeny (Jackson et al., 1999; Sambandamurthy et al., 2002), DNA vakcíny (Baldwin et al., 1998; Lowrie et al., 1999), proteinové nebo peptidové vakcíny (Dietrich et al., 2005; Weinrich Olsen et al., 2001). Každá strategie má své přednosti, ale celkově zatím neprokazují lepší vlastnosti než nejčastěji aplikovaná vakcinace kmenem BCG. Nová úspěšná vakcína nezabrání možnému vzniku aktivního onemocnění u více než dvou miliard lidí, kteří jsou nyní infikovaní bakterií M. tuberculosis. Proto je stále potřeba zlepšovat diagnostické systémy a léčbu pro nadcházející příští desetiletí Léčba tuberkulózy Rychlé nalezení nakažených lidí, jejich izolace od okolí a úspěšná léčba jsou kroky důležité pro zabránění šíření nemoci. Současná léčba tuberkulózy spočívá v podávání antibiotik, především isoniazidu a rifampicinu, dále pak streptomycinu, pyrazinamidu a etambutolu (Drobniewski et al., 2007). Isoniazid disponuje baktericidními účinky a přispívá k rychlému uzdravení pacientů, rifampicin působí i proti nerostoucím bakteriím a umožňuje zkrátit dobu léčby z měsíců na přijatelných 6 9 měsíců (Di Perri and Bonora, 2004). Antibiotika se užívají v jedné denní dávce a nejúčinněji působí na mykobakterie ve stádiu množení. Jejich stálá hladina v krvi utlumuje metabolickou aktivitu bakterií, a proto se střídají podávané léky. Léčba probíhá dlouhodobě (6 12 měsíců), aby se zabránilo opakovanému výskytu nemoci v budoucnosti, kterou by mohly způsobit intracelulárně přežívající bakterie. Jedině správně vedená a pravidelná léčba může zajistit trvalé uzdravení. Každá mykobakteriální kultura může obsahovat malé procento jedinců přirozeně rezistentních na podávaný lék a z toho důvodu se používá kombinace antibiotik pro usmrcení veškerých bakterií. Aplikace rifampicinu a isoniazidu je většinou dostatečná proti běžným kmenům, avšak stále častěji se objevují multirezistentní kmeny (Wade and Zhang, 2004). Pacientům se musí podávat nejenom primární antibiotika, jako již zmíněný isoniazid, rifampicin, pyrazinamid, streptomycin, etambutol, ale i sekundární léky. Léčení se stává dvakrát až čtyřikrát zdlouhavější (Chan and Iseman, 2002), finančně náročnější a častěji se vyskytují nepříznivé reakce (Di Perri and Bonora, 2004). 27

28 2.7. Diagnostika aktivní tuberkulózy Aktivní tuberkulóza znamená, že se u infikovaného jedince naplno projeví příznaky nemoci, jelikož jeho imunitní systém není schopný potlačit nebo přímo odstranit bakterii M. tuberculosis. Lidé s otevřenou formou TBC mohou nakazit další osoby, protože se u nich bakterie nachází ve sputu, ze kterého jsou při kašlání uvolňovány infekční kapénky. Efektivní léčba je velmi závislá na včasném podchycení choroby, neboť pozdě nasazené podávání antibiotik může vést ke smrti pacienta. Dosud bylo vyvinuto několik různých technik umožňujících odhalit jedince s otevřenou formou TBC. Tradiční postup diagnostiky tuberkulózy spočívá v kultivaci bakterie na pevném médiu Löwenstein-Jensen nebo Middlebrook médium (Obr. 8 A). Předností je možnost detekce a izolace klonů mykobakterií, identifikace druhu a určení citlivosti na antibiotika. Kultivace je jednou z nejcitlivějších metod, ale kvůli pomalému růstu bakterie trvá 8 týdnů a v % případů se bakterii vůbec nepodaří nakultivovat (Andersen et al., 2000). Určité vylepšení poskytuje radiometrický systém BACTEC, při kterém se používají bohatá média pro urychlení růstu. Doba detekce je tak zkrácena na 9 16 dní. Velký problém představuje bezpečná likvidace radioaktivního odpadu a celkově jsou radiometrické systémy finančně náročnější. A B Obr. 8. Identifikace bakterie M. tuberculosis. (A) Morfologie kolonií s jejich typickým drsným květákovitým povrchem (upraveno dle Public Health Image Library ID #4428). (B) Mikroskopický snímek se zvětšením 1 000x. Bakterie jsou obarveny technikou Ziehl-Neelsen, a proto se jeví jako fialové (upraveno dle Public Health Image Library ID #4428). Další metodou je přímá mikroskopie sputa (Obr. 8 B), při které je zjišťována přítomnost mykobakteriálních bakterií v klinických vzorcích nebo kulturách. Mykobaterie obsahují velké množství lipidů ve své buněčné stěně, a proto je nelze klasicky barvit podle Grama. Řešením je detekce acidorezistentních bakterií metodou Ziehl-Neelsen, kde se jako 28

29 barvivo používá carbolfuchsin, který se váže na mykolové kyseliny nacházející se v buněčné stěně mykobakterií. Odbarvení probíhá kyselinou chlorovodíkovou a ethanolem. S rozvíjejícími se technologiemi se stále častěji upřednostňuje fluorescenční mikroskopie. Výhodou je rychlost průkazu infekce, ale nezbytné drahé vybavení a náročnost jeho obsluhy se odráží na ekonomické stránce metody. Obecná nevýhoda mikroskopie sputa jsou falešně negativní výsledky u 30 až 50 % infikovaných jedinců, často nelze rozlišit mezi jednotlivými kmeny mykobakterií a navíc je získávání vzorků od dětí velmi problematické. I přesto přímá mikroskopie často zůstává jedinou dostupnou metodou diagnostiky plicní TBC v rozvojových zemích (Dinnes et al., 2007). Základem sérologických testů je detekce protilátek proti různým antigenům. Největší využití mají v zemích třetího světa pro svou jednoduchost, rychlost a finanční dostupnost (Gounder et al., 2002). Žádný z těchto testů doposud neprokázal takovou přesnost, aby mohl být široce používán. Výsledky testů ovlivňují mimo jiné infekce environmentálními mykobakteriemi, BCG vakcinace nebo infekce virem HIV. Z těchto důvodu je citlivost sérologických testů velmi malá (Lyashchenko et al., 1998). Rentgenologické vyšetření plic se provádí hlavně u lidí bez výrazných příznaků nemoci, ale s pozitivním tuberkulinovým testem (kap ), nebo naopak u lidí s projevujícími se příznaky nemoci, kde mikroskopie sputa nic neodhalila. Při aktivní tuberkulóze lze na rentgenových snímcích pozorovat v plicní tkáni uzlíky, které fibrotizují a někdy až kalcifikují (Obr. 9). Podobné léze se mohou vytvářet i při jiných nemocech, tudíž vyšetření není příliš specifické. A B Obr. 9. Rentgenové snímky plic. A Snímek plicní tkáně zdravého člověka; B Typický snímek plicní tkáně pacienta s tuberkulózou, kdy se na plicích objevují léze (Public Health Image Library ID #2543). 29

30 Pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR Polymerase Chain Reaction) je možno zaznamenat i malé množství DNA nebo RNA, což může být použito k zjištění druhu bakterie a genů kódujících rezistenci na antibiotika. Ačkoliv se jedná o rychlou (3 6 hodin) a specifickou metodu, její citlivost je nižší než u kultivační techniky, neboť jakákoliv kontaminace může zapříčinit falešně pozitivní výsledky (Jatana et al., 2000). Optimalizace této metody by v budoucnu mohla přinést velmi dobré výsledky. Vyšší finanční náklady na vybavení laboratoří a celkový provoz brání jejímu běžnému použití v rozvojových zemích. Ligázová řetězová reakce (LCR Ligase Chain Reaction) je metoda pro amplifikaci DNA o známé sekvenci a lze ji využít při diagnostice tuberkulózy. Výhodou LCR je její rychlost (5 hodin), specificita, možnost automatizace (Lindbråthen et al., 1997; Tortoli et al., 1997) a mohla by doplňovat tradiční kultivační a mikroskopické diagnostické metody (O'Connor et al., 2000). Na druhou stranu LCR může poskytovat falešně negativní výsledky (Gilpin et al., 2002; Tortoli et al., 1997), neurčí rezistenci na antibiotika a je finančně nákladná (Shetty et al., 2000) Diagnostika latentní tuberkulózy Latentním onemocněním se rozumí stav, kdy bakterie M. tuberculosis přežívá v infikovaném jedinci aniž by vykazovala jakékoliv viditelné projevy onemocnění a není dále přenášena na ostatní lidi. Donedávna se předpokládalo, že je u bakterie navozeno nereplikativní dormantní stádium. Poslední výsledky však naznačují, že by mykobakterie mohly v těle dlouhodobě zůstávat ve formě spór (Ghosh et al., 2009). Osoby s latentní tuberkulózou nejsou přímou hrozbou pro své okolí, ale představují potenciální nebezpečí, neboť se u nich kdykoliv během života může rozvinout aktivní nakažlivá forma nemoci. Dalším důvodem důležitosti diagnostiky latentní TBC je levnější, rychlejší a jednodušší léčba infikovaných lidí. Prozatím jsou dostupné pouze nedokonalé testy, a proto je potřeba stále hledat nové přístupy diagnostiky latentní TBC Tuberkulinový kožní test Tuberkulinový kožní test (TST Tuberculin Skin Test) je v současnosti standardním nástrojem pro detekci jak aktivní, tak latentní infekce. Základem je imunitní reakce nazývaná přecitlivělost oddáleného typu (DTH Delayed Type Hypersensitivity) na injekčně aplikovaný přečištěný proteinový derivát (PPD Purified Protein Derivative) směs antigenů pocházejících z mykobakterií. Pro provedení celého testu jsou vyžadovány dvě návštěvy 30

31 lékaře, první na intradermální podání PPD a druhá na odečtení výsledku po hodinách (Obr. 10). U infikovaných lidí vzniká v místě vpichu zduřenina, u které se měří její průměr. Vyhodnocení testu není zcela objektivní, jelikož závisí na zkušenostech vyšetřující osoby. Dalšími komplikacemi je nemožnost provedení testu u lidí s kožními nemocemi a případně vznik bolestivého zánětu se zanecháním jizvy. Obr. 10. Tuberkulinový kožní test. Po aplikaci PPD vzniká u lidí infikovaných bakterií M. tuberculosis kožní zduřenina. Série obrázků zachycuje různé kožní reakce od negativní až po pozitivní. TST je relativně levný a na jeho provedení není potřeba speciální laboratoř. Na druhou stranu však poskytuje velké množství falešně pozitivních výsledků, protože PPD je málo definovaná směs antigenů, které jsou u mykobakterií široce rozšířené (Chaparas et al., 1970). Důsledkem je neschopnost testu rozlišit infekci virulentní bakterií od předchozí vakcinace kmenem BCG (Behr and Small, 1999) a výsledky mohou být také ovlivněny nakažením environmentálními mykobakteriemi (Andersen et al., 2000). Snížení obranyschopnosti, např. infekcí virem HIV, může být příčinou falešně negativních výsledků, protože je narušena funkčnost imunitního systému. Průměrně 10 až 25 % pacientů s aktivní TBC vůbec nereagují na podané PPD (Teixeira et al., 2007). Tuberkulinový kožní test vykazuje několik záporů, ale přesto donedávna představoval jediný možný způsob, jak vyšetřit potenciálně infikované pacienty. Pro jeho finanční dostupnost a relativní jednoduchost je v mnoha zemí hlavní diagnostickou metodou Krevní testy V posledních několika letech se začínají stále více prosazovat krevní testy, jejichž vývoj byl podmíněn objasněním funkce T lymfocytů a cytokinu IFN-γ při imunitních odpovědích (Rothel et al., 1990). Krevní testy jsou in vitro diagnostickou metodou (Obr. 11), jejímž prvním krokem je odběr vzorku krve do připravených heparizovaných zkumavek a přidání specifických mykobakteriálních antigenů. Během inkubace jsou antigeny pohlceny antigen prezentujícími buňkami, které je zpracují a vystaví na svém povrchu. Ve vzorcích 31

32 krve od nakažených nebo nemocných osob jsou prezentované mykobakteriální antigeny rozeznány specifickými efektorovými a paměťovými T lymfocyty, čímž dochází k jejich restimulaci a produkci cytokinu IFN-γ. Při krevních testech je in vitro zjišťován počet buněk vytvářejících IFN-γ pomocí metody ELISPOT (Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay) nebo stanoveno množství sekretovaného IFN-γ metodou ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Odběr vzorku krve Přidání antigenů a stimulace buněk Provedení testu ELISA nebo ELISPOT Stimulované buňky uvolňují IFN-γ Odečtení hodnot absorbance nebo spočítání počtu buněk Obr. 11. Základní schéma krevních testů. Principem je in vitro stanovení IFN-γ, který je produkován restimulovanými T lymfocyty u lidí s latentní nebo aktivní tuberkulózou. Restimulace probíhá po rozpoznání specifických antigenů T lymfocyty. Vyhodnocení je dosaženo buď pomocí metody ELISA nebo metodou ELISPOT. Diagnostika krevními testy přináší výhody v podobě rychlosti získání výsledků, pouze jedné návštěvy lékaře, větší objektivity, specificity a citlivosti. Výsledky jsou podpořeny pozitivní a negativní kontrolou, které u TST nelze provádět. T lymfocyty se původně restimulovaly pomocí PPD, které se používá v tuberkulinovém kožním testu, a proto byly výsledky testů ovlivněny vakcinací kmenem BCG, případně infekcí netuberkulózními kmeny. Podstatné zlepšení přišlo s objevem specifických mykobakteriálních antigenů, jenž se vyskytují pouze u virulentních kmenů (Behr and Small, 1999; Gordon et al., 1999). Výrazně se zlepšila specificita krevních testů a odboural problém s křížovými reakcemi u osob vakcinovaných kmenem BCG nebo infikovaných netuberkulózními mykobakteriemi. Nejčastěji používané antigeny pro restimulaci T lymfocytů jsou ESAT-6 (Early Secreted Antigenic Target), CFP-10 (Culture Filtrate Protein) nebo TB7.7. Na trhu jsou dostupné dva komerční testy. Firma Cellestis vyvíjí soupravu nazývanou 32

33 QuantiFERON-TB, jejíž počátky se datují do roku V roce 2004 byl v USA schválen nový typ QuantiFERON-TB Gold, kde se k restimulaci T lymfocytů začaly používat dva antigeny ESAT-6 a CFP-10, čímž bylo dosaženo výrazného zvýšení specificity a citlivosti. Firma Cellestis v roce 2007 představila vylepšenou soupravu QuantiFERON-TB Gold In-Tube, ve které byl k restimulaci přidán další antigen TB7.7 a bylo upraveno technické provedení. Princip testu je u variant Gold a Gold In-Tube stejný. Odběr krve je proveden do speciálních zkumavek a inkubace odebraného vzorku s mykobakteriálními antigeny probíhá po dobu hodin, kdy dochází k restimulaci specifických T lymfocytů, jenž začnou produkovat IFN-γ. Zkumavky s krví jsou po skončení inkubace centrifugovány a v odebrané plazmě je pomocí metody ELISA stanovena hladina IFN-γ. Firma Oxford Immunotec prodává sadu s názvem T-SPOT.TB, při níž je pomocí ELISPOT metody stanoven počet T lymfocytů uvolňujících IFN-γ. Po odebrání vzorku krve jsou na gradientu Ficollu separovány jednojaderné buňky (PBMC), které jsou v jamkách potaženými protilátkou proti IFN-γ smíchány s mykobakteriálními antigeny ESAT-6 a CFP-10. Během hodinové inkubace probíhá restimulace T lymfocytů a produkce cytokinu IFN-γ, který ihned zachycují příslušné protilátky. Nakonec jsou buňky a veškeré nečistoty odmyty a sekundární protilátkou je detekován zachycený cytokin IFN-γ. Každý bod v jamce představuje jednotlivý T lymfocyt schopný reagovat na specifické mykobakteriální antigeny. Komerční krevní testy jsou mnohem dražší než klasický tuberkulinový kožní test, musí být provedeny v laboratoři s příslušným vybavením a další problémy nastávají s manipulací se vzorky. QuatiFERON-TB Gold a T-SPOT.TB jsou založeny na podobných principech a jsou si v mnohém podobné, pouze se liší jejich praktické provedení (Tab. 1). Srovnávací studie obou testů udávají u dospělých podobné výsledky, které se však u dětí a lidí se sníženou imunitou mohou lišit (Ferrara et al., 2006; Lee et al., 2006; Menzies et al., 2007). Diagnostika latentní tuberkulózy se potýká s jedním velkým problémem. Neexistuje dosud žádný zlatý standard a nelze tedy přímo stanovit specificitu a citlivost nových testů pro latentní TBC. Obecně se věří, že pozitivní výsledek krevních testů značí, že pacient má buď aktivní nebo latentní tuberkulózu. Ačkoliv jsou krevní testy vysoce specifické, tak stejně jako TST nedokáží rozlišit mezi těmito dvěma stavy. Musí proto následovat další vyšetření, jakými jsou např. přímá mikroskopie, kultivace nebo rentgenologické vyšetření, která určí o jakou formu TBC se jedná. 33

34 QuantiFERON-TB Gold (In-Tube) T-SPOT.TB Tuberkulinový kožní test Technika In vitro ELISA In vitro ELISPOT In vivo kožní test Antigeny ESAT-6 a CFP-10 (TB7.7) ESAT-6 a CFP-10 PPD Ovlivnění BCG vakcinací Ne Ne Ano Ovlivnění netuberkulózními mykobakteriemi Ne (s výjimkami) Ne (s výjimkami) Ano Výsledek Koncentrace IFN-γ Počet buněk produkujících IFN-γ Průměr kožní zduřeniny v mm Pozitivní kontrola Ano Ano Ne Nutná druhá návštěva lékaře Ne Ne Ano Čas do zjištění výsledku hodin (+ 4 hodiny ELISA) hodin (+ 4 hodiny ELISPOT) hodin Vyšetřovaný materiál Plná krev Jednojaderné buňky z periférní krve (PBMC) Podkožní zduřenina Tab. 1. Srovnání testů pro diagnostiku latentní tuberkulózy. Srovnání dvou komerčních testů QuantiFERON-TB Gold (In-Tube) a T-SPOT.TB a běžně používaného tuberkulinového kožního testu (upraveno dle Richeldi, 2006; Zellweger, 2008). Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny nedostatečnou funkčností imunitního systému pacienta, malým množstvím T lymfocytů ve vzorku krve, špatnou manipulací s krví nebo nesprávně provedeným testem. Falešné pozitivní výsledky mohou vznikat v důsledku předchozí infekce některými mykobakteriemi. Hlavní výhodou krevních testů je jejich vyšší specificita oproti TST, neboť použité antigeny ESAT-6, CFP-10 a TB7.7 se nacházejí pouze u virulentních kmenů M. tuberculosis a nenajdeme je u vakcinačních kmenů BCG. Výsledky nejsou ovlivněny vakcinací a ani předchozím kontaktem s netuberkulózními mykobakteriemi, kromě M. kansaii, M. szulgai a M. marinum (Andersen et al., 2000; Meier et al., 2005), a zlepšuje se přesnost diagnózy u lidí s latentní tuberkulózou, kteří mají TST často falešně negativní, jako např. u lidí koinfikovaných virem HIV. Dalšími přednostmi je možnost opakované aplikace a rychlost provedení celého testu, kdy výsledky mohou být dostupné za 24 hodin od začátku testování. Krevní testy poskytují vyšší objektivnost výsledků a nabízí i možnost automatického testování. 34

35 2.9. Diagnosticky významné mykobakteriální antigeny Osekvenování a srovnávací analýzy mykobakteriálních genomů vedly k odhalení tzv. RD oblastí (Region of Difference), jenž jsou jedinečné pro virulentní kmen M. tuberculosis a nenachází se u vakcinačních kmenů M. bovis BCG nebo jiných environmentálních mykobakterií (Behr and Small, 1999; Gordon et al., 1999). Zde jsou kódovány proteiny, které představují zdroj nových antigenů pro diagnostické účely. Vhodné antigeny by měly indukovat silnou T buněčnou odpověď a měly by být velmi specifické pro virulentní kmeny. Ne každý antigen z RD oblasti je použitelný, neboť může obsahovat T buněčné epitopy homologní k produktům genů mimo deletované oblasti nebo dokonce mimo mykobakteriální genom (Aagaard et al., 2004; Brock et al., 2004) a můžou se objevit křížové imunitní reakce Antigeny ESAT-6 a CFP-10 Aktuálně nejvíce prostudovanými a používanými antigeny pro diagnostické účely jsou sekreční mykobakteriální antigeny pojmenované Early Secreted Antigenic Target (ESAT-6; Rv3875) a Culture Filtrate Protein (CFP-10; Rv3874). ESAT-6 o velikosti 6 kda sestává z 95 aminokyselin (Andersen et al., 1995; Sørensen et al., 1995) a CFP-10 o velikosti 10 kda je tvořen 100 aminokyselinami (Berthet et al., 1998). Oba antigeny jsou kódovány na 9,5 kb dlouhém lokusu RD1, který se nachází u kmenů komplexu M. tuberculosis, ale chybí u všech testovaných BCG kmenů a environmentálních mykobakterií (Mahairas et al., 1996), kromě M. kansasii, M. szulgai a M. marinum (Kobashi et al., 2006). V oblasti RD1 a jeho okolí označovaném extrd1 (extended RD1) je kódován proteinový sekreční systém ESX-1 (Brodin et al., 2006; McLaughlin et al., 2007), který je zodpovědný za sekreci antigenů ESAT-6 a CFP-10 (Gao et al., 2004; Stanley et al., 2003). CFP-10 a ESAT-6 spolu tvoří pevný 1:1 komplex (Kd = 1,1 x 10-8 M) (Renshaw et al., 2002), kde se jádro komplexu skládá ze dvou podobných helix-turn-helix vlásenek jednotlivých proteinů, které jsou k sobě hydrofobně připojeny. Antigeny leží anti-paralelně proti sobě a dohromady tvoří čtyřšroubovici (Obr. 12). Pozoruhodnou vlastností komplexu jsou vyčnívající N- a obzvláště C-konce obou proteinů, jenž tvoří flexibilní ramena na koncích čtyřšroubovice. Dlouhé flexibilní C-koncové rameno antigenu CFP-10 je důležité pro vazbu na receptory na povrchu makrofágů a komplex ESAT-6.CFP-10 by mohl působit jako signální molekula, jenž po vazbě na povrch cílových buněk ovlivňuje jejich chování ve prospěch patogenu (Renshaw et al., 2005). K rozpadnutí komplexu dochází při nízkém ph a antigen CFP-10 by mohl fungovat jako chaperon, který je od antigenu ESAT-6 oddělen, 35

36 jakmile dojde k okyselení fagozomu obsahujícího bakterii M. tuberculosis (de Jonge et al., 2007). ESAT-6 a CFP-10 jsou imunodominantní antigeny, které vyvolávají produkci IFN-γ u efektorových a paměťových T lymfocytů v krvi infikovaných jedinců (Sørensen et al., 1995). Oba antigeny jsou specifické a už v minulosti prokázaly svůj velký přínos při diagnostice tuberkulózy (Arend et al., 2000; Ewer et al., 2003; van Pinxteren et al., 2000). Citlivost krevních testů využívajících ESAT-6 a CFP-10 se pohybuje kolem %, a proto je stále nutné hledat další antigeny, které by zvýšily celkovou citlivost testů a zároveň nesnižovaly jejich specificitu (Aagaard et al., 2004; Brock et al., 2004; Brodin et al., 2002; Cockle et al., 2002). Obr. 12. Struktura komplexu ESAT-6.CFP-10. Modře je znázorněn antigen ESAT-6 a červeně CFP-10. Tyto dva antigeny spolu vytváří pevný 1:1 komplex, ve kterém antigeny leží anti-paralelně proti sobě a dohromady tvoří čtyřšroubovici (Renshaw et al., 2005) Antigen TB7.7 O antigenu TB7.7 (Rv2654) toho zatím ve srovnání s ESAT-6 a CFP-10 není mnoho známo. Skládá se z 81 aminokyselin (Tab. 2) a má velikost 7,7 kda. Je kódován v oblasti RD11 (phirv2), která se nachází v genomu komplexu M. tuberculosis a chybí u atypických mykobakterií (Aagaard et al., 2004) a všech testovaných kmenů M. bovis BCG (Behr and Small, 1999). Oblast RD11 byla pravděpodobně fágem zanesena do genomu relativně nedávného společného předka komplexu M. tuberculosis (Aagaard et al., 2004), protože ji lze objevit u M. africanum (Oettinger and Andersen, 1994), M. microti (Brodin et al., 2002) a 36

37 u několika izolátů M. bovis (Behr and Small, 1999), chybí však u M. canetti (Brosch et al., 2002). In silico analýza 15 otevřených čtecích rámců (ORF Open Reading Frame) nacházejících se v RD11 odhalila dva malé geny Rv2653 a Rv2654 (TB7.7), které jsou součástí malého operonu podobného tomu, jenž kóduje antigeny ESAT-6 a CFP-10 (Berthet et al., 1998). SGHALAARTLLAAADELVGGPPVEASAAALAGDAAGAWRTAAVELARALVRAVAES HGVA AVLFAATAAAAAAVDRGDPP Tab. 2. Aminokyselinová sekvence antigenu TB7.7. V oblasti RD11 je kódován antigen nazývaný TB7.7, který sestává z 81 aminokyselin. TB7.7 je příkladem jedinečného antigenu specifického pro M. tuberculosis. Skládá se z velkého množství T buněčných epitopů rozmístěných po celém proteinu. Obzvláště důležitá je C-koncová část proteinu, která vyvolává silné T buněčné imunologické odpovědi u pacientů jak s plicní, tak mimoplicní tuberkulózou. Na druhou stranu nevyvolává zvýšené hladiny IFN-γ u lidí vakcinovaných kmenem M. bovis BCG (Aagaard et al., 2004). Díky jeho velké specificitě a schopnosti vyvolávat silné imunologické odpovědi má tento antigen velký potenciál stát se složkou diagnostických testů založených na buněčně zprostředkované imunitě. Už nyní je součástí komerčního testu QuantiFERON-TB Gold In-Tube (kap ), kde s úspěchem doplňuje antigeny ESAT-6 a CFP Další mykobakteriální antigeny Dosud používané antigeny ESAT-6, CFP-10 a TB7.7 nejsou jedinými kandidáty pro diagnostické účely. Jako příklad lze uvést antigen Rv2653 kódovaný v oblasti RD11, který je imunogenní a vyvolává silné T buněčné odpovědi u lidí s tuberkulózou. Jeho diagnostickému využití brání fakt, že indukuje imunitní reakce i u osob vakcinovaných kmenem BCG (Aagaard et al., 2004). Dalším možným kandidátem by mohl být protein MPT64 (Rv1980c) kódovaný na lokusu RD2. Nenachází se u 8 z 13 testovaných M. bovis BCG kmenů (Behr and Small, 1999), což ho činí použitelným, ale ne ideálním pro diagnostické účely. Navíc indukuje in vitro pouze nízké hladiny IFN-γ (Ulrichs et al., 1998; Wilcke et al., 1996) a jeho detekce v současných krevních testech by tak byla problematická. 37

38 2.10. CyaA toxoidy s mykobakteriálními antigeny Unikátní vlastnosti adenylát cyklázového toxinu, jako je vazba na antigen prezentující buňky, specifický výběr buněk majících na svém povrchu receptor CD11b/CD18 a doprava peptidů na molekuly MHC I a MHC II, vedly k myšlence využít detoxifikovanou formu toxinu jako nástroj pro přímou dopravu mykobakteriálních imunodominantních antigenů do buněk. Z několika studií je jasné, že CyaA může zlepšit krevní testy a celkově pomoci při diagnostice tuberkulózy (Connell et al., 2007; Vordermeier et al., 2004; Wilkinson et al., 2005). Fúzní proteiny CyaA s antigeny ESAT-6 a CFP-10 jsou dopravovány přímo do antigen prezentujících buněk, kde jsou dále zpracovány a vystaveny na povrchu s molekulami MHC I a MHC II. CyaA toxoidy s vloženými antigeny stimulují jak CD4+, tak CD8+ T lymfocyty (Wilkinson et al., 2005), což zvyšuje množství produkovaného IFN-γ. Stimulace obou typů T lymfocytů se hodí především u jedinců, kteří mají oslabené antigen specifické T buněčné imunitní odpovědi, jako jsou například HIV pozitivní osoby. Vyšší hladina IFN-γ zjednodušuje detekci lidí infikovaných bakterií M. tuberculosis, kteří vykazují nízké nebo žádné reakce na nativní TBC antigeny (Anderson et al., 2006; Connell et al., 2007; Vordermeier et al., 2004). Dále bylo pozorováno, že doprava pomocí detoxifikovaného toxinu CyaA snižuje až 10krát molární množství antigenů potřebných k restimulaci T lymfocytů a k získání optimálních odpovědí jak u HIV negativních, tak HIV pozitivních jedinců (Connell et al., 2007; Wilkinson et al., 2005). Zlepšilo se i samotné rozpoznání antigenů T lymfocyty, jejichž restimulace probíhala u více než 91,1 % pacientů s aktivní tuberkulózou a nakažených osob bez příznaků nemoci (Wilkinson et al., 2005). Jako další výhoda se jeví snížení množství objemu krve na méně než 0,5 ml oproti komerčním krevním testům, což přispívá k lepšímu využití v pediatrické praxi (Connell et al., 2007). Stávající diagnostické testy vylepšuje doprava antigenů ESAT-6 a CFP-10 pomocí CyaA, jak dokazují předchozí studie. Předpokládá se, že použití dalších imunodominantních mykobakteriálních antigenů povede k vyšší specificitě, lepší restimulaci více specifických T lymfocytů a větší produkci cytokinu IFN-γ. Vhodným antigenem by mohl být TB7.7, jenž by ve spojení s detoxifikovaným CyaA toxinem sloužil jako nástroj pro diagnostiku latentní tuberkulózy. 38

39 3. Materiál a metody 3.1. Chemikálie, materiál a přístrojové vybavení Chemikálie [α-32p]atp, MGP, Česká republika. [2,8-3H]cAMP, INC, USA. β-merkaptoethanol, Calbiochem, Německo. λ-dna, Fermentas International Inc., Kanada. Acetát draselný, Fluka, USA. Adenosin-5'-trifosfát (ATP), Sigma-Aldrich, USA. Adenosin-3',5'-(cyklický) monofosfát (camp), Sigma-Aldrich, USA. Agaróza SeaKem LE AGAROSE pro DNA elektroforézu, Lonza, Švýcarsko. Akrylamid, Serva, Německo. Ampicilin, Biotika, Slovenská Republika. Antibiotika Antibiotic Antimycotic Solution (100krát koncentrovaná) jednotek penicilinu, 10 mg streptomycinu a 25 μg/ml amphotericinu B, Sigma-Aldrich, USA. Bacto-tryptone, Oxoid, Velká Británie. Bakteriologický agar, Oxoid, Velká Británie. Bromfenolová modř, Sigma-Aldrich, USA. Coomassie Brilliant Blue R-250, Serva, Německo. Dihydrogenfosforečnan draselný, Sigma-Aldrich, USA. Dihydrogenfosforečnan sodný (dihydrát), Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Dimethylsulfoxid (DMSO), Sigma-Aldrich, USA. Dithiothreitol (DTT), Serva, Německo. Diethylaminoethyl Sepharose (DEAE-Sepharose) CL-6B, Sigma-Aldrich, USA. Deoxyribonukleotidtrifosfát (dntp) Mix (10 mm roztok), Fermentas International Inc., Kanada. Dodecylsulfát sodný (SDS), Serva, Německo. Dulbecco s modified Eagle's médium (DMEM), PAA Laboratories, Rakousko. Ethanol, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Ethidiumbromid, Serva, Německo. Ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), Serva, Německo. Fetální hovězí sérum (FCS), GIBCO, USA. 39

40 Glycin, Serva, Německo. Glukóza, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Glukóza (25% roztok), Přípravna médií, Česká republika. Glycerol, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Hovězí sérový albumin Albumin Fraktion V (BSA), Carl Roth, Německo. Hydrogenfosforečnan disodný (dodekahydrát), Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Hydrogenuhličitan sodný, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Hydroxid draselný, Lachema, Česká republika. Hydroxid sodný, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Chlorid amonný, Sigma-Aldrich, USA. Chlorid draselný, Lachema, Česká republika. Chlorid hořečnatý (hexahydrát), Sigma-Aldrich, USA. Chlorid manganatý (tetrahydrát), Fluka, USA. Chlorid sodný, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Chlorid vápenatý, Lachema, Česká republika. Chlorophenol red-β-d-galactopyranoside (CRPG), Sigma-Aldrich, USA. Imidazol, Sigma-Aldrich, USA. Izopropanol, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Izopropyl β-d-thiogalaktopyranozid (IPTG), Sigma-Aldrich, USA. Konjugát camp-bsa, daroval Daniel Ladant, Institut Pasteur, Francie. Kvasničný extrakt, Oxoid, Anglie. Kyselina boritá, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Kyselina chlorovodíková, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Kyselina N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-2-ethansulfonová Německo. Kyselina octová, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Kyselina orthofosforečná 85%, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Kyselina sírová, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. L-glutamin (3% roztok), Přípravna médií, Česká republika. Methanol, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Močovina, Merck, Německo. N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin (TEMED), Serva, Německo. N,N'-methylen-bisakrylamid, Serva, Německo. Nonidet P 40 Substitute (NP-40), Fluka, USA. 40 (HEPES), Serva,

41 o-phenylendiamin (OPD), Sigma-Aldrich, USA. Oxid hlinitý (neutrální), Merck, Německo. Peroxid vodíku 30%, Lach-Ner, s. r. o., Česká republika. Persulfát amonný (APS), Serva, Německo. Phenyl-Sepharose CL-4B, Pharmacia, Praha, Česká republika. Proteinový standard PageRuler Unstained Protein Ladder, Fermentas International Inc., Kanada. Pyruvát (1,1% roztok), Přípravna médií, Česká republika. Roswell Park Memorial Institute médium (RPMI), Přípravna médií, Česká republika. Sestava na izolaci DNA, Top-Bio, Praha, Česká republika. Scintilační roztok BCS Scintillation Cocktail, GE Healthcare, Velká Británie. Síran hořečnatý (heptahydrát), Fluka, USA. Síran sodný, Sigma-Aldrich, USA. Tetracyklin, Sigma-Aldrich, USA. Thiamin hydrochlorid, Calbiochem, Německo. Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), Serva, Německo. Tris-Hydrochlorid (Tris-HCl), Serva, Německo. Triton X-100, Serva, Německo. Tween 20, Sigma-Aldrich, USA. Uhličitan sodný, Serva, Německo. Všechny použité chemikálie dosahovaly analytické čistoty Přístrojové vybavení Bürkerova komůrka, Marienfeld, Německo. Centrifuga Biofuge pico, Heraeus Instruments, Německo. Centrifuga Eppendorf 5415 R, Eppendorf AG, Německo. Centrifuga Rotanta 406 R, Hettich Zentrifugen, Německo. Centrifuga Sorvall RC26 Plus, Du Pont Instruments, USA. Centrifuga Universal 32 R, Hettich Zentrifugen, Německo. CO2 inkubátor MCO-17AIC, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd., Japonsko. CO2 inkubátor MCO-18AIC(UV), SANYO Electric Biomedical Co., Ltd., Japonsko. Digitální analytické váhy AB-104 S, Mettler Toledo, USA. Digitální váhy HF-2000G, A&D Weighing, USA. Dokumentační systém Syngene G:BOX, Syngene, Velká Británie. 41

42 Elektroforéza Mini-PROTEAN II, Bio-Rad, USA. ELISA reader Safire2, Tecan, Švýcarsko. ELISA washer Columbus Pro, Tecan, Švýcarsko. Filtr Syringe Filter 0,22 μm, TPP, Švýcarsko. Filtr Cell Strainer 0,70 μm, BD Biosciences, USA. Invertovaný mikroskop IX 71, Olympus, Japonsko. Laboratorní třepačka LT-2, Kavalier, Česká republika. Laminární box BioStar, Telstar, Španělsko. Laminární box EF / A 6, Clean Air Techniek B. V., Nizozemí. Mrazící box ( 20 C), Liebherr, Švýcarsko. Mrazící box ( 80 C), Jouan, Francie. PCR cyklér PCR Sprint Thermal Cycler, Thermo Scientific, USA. ph-metr inolab Level 1, WTW, Německo. Scintilační kapalinový počítač WALLAC 1409 DSA, PerkinElmer, USA. Spektrofotometr SECOMAM S.250I+, ALC-SECOMAM, Francie. Termostatovaný suchý blok Digital Dry Bath, Labnet International Inc., USA. Termostatovaná vodní lázeň Assistent 3180, Karl Hecht GmbH&Co KG, Německo. Termostatovaná vodní lázeň typ ESc, VEB MLW, Německo. Třepačka MaxQ 5000, Thermo Scientific, USA. Ultrasonikátor S3000, Misonix, USA. Vortex MS2 minishaker, IKA-Works, Inc., USA. Zařízení pro DNA elektroforézu Mupid-2, Cosmo Bio Co., LTD., Japan. Zařízení pro DNA elektroforézu Wide Mini-Sub Cell GT, Bio-Rad, USA. Zařízení pro izolaci DNA (Lego kit), Top-Bio, Praha, Česká republika. Zdroj pro elektroforézu PowerPac Basic Power Supply, Bio-Rad, USA Enzymy Alkalická fosfatáza (FastAP), Fermentas International Inc., Kanada. Křenová peroxidáza konjugovaná se streptavidinem, Amersham Biosciences, USA. Pankreatická ribonukleáza (RNáza), Fermentas International Inc., Kanada. Phusion High-Fidelity DNA polymeráza F-530L, Finnzymes, Finsko. T4 DNA ligáza, Fermentas International Inc., Kanada. 42

43 Protilátky goat anti-rabbit Px monoklonální kozí protilátka proti králičím protilátkám konjugovaná s křenovou peroxidázou, Amersham Biosciences, USA. biotin rat anti-mouse IL-2 (klon JES6-5H4) biotinylovaná monoklonální krysí protilátka proti myšímu cytokinu interleukinu 2 (IL-2), BD Pharmingen, USA. rabbit anti-camp monoklonální králičí protilátka proti camp, darovala A. Ullmann. rat anti-mouse IL-2 (klon JES6-1A12) monoklonální krysí protilátka proti myšímu cytokinu interleukinu 2 (IL-2), BD Pharmingen, USA. M1/70 monoklonální myší protilátka proti receptoru CD11b, Exbio a.s., Česká republika Restrikční endonukleázy Použité restrikční endonukleázy (Tab. 3) byly dodány firmou New England Biolabs, USA. Enzym Vhodný reakční NEB pufr Štěpné místo Vyžaduje BSA Acc65I G/GTACC 2, 3 Ano BamHI G/GATCC 1, 2, 4 Ano BsrGI T/GTACA 2, 4 Ano EcoRV GAT/ATC 2, 3 Ano HpaI GTT/AAC 4 Ne MluI A/CGCGT 2, 3 Ne NcoI C/CATGG 1, 2, 3, 4 Ne NheI G/CTAGC 1, 2, 4 Ano ScaI AGT/ACT 2 Ne XhoI C/TCGAG 1, 2, 3, 4 Ano Tab. 3. Seznam použitých restrikčních endonukleáz. Endonukleázy byly použity při přípravě a ověřování plazmidových vektorů kódujících CyaA proteiny. Štěpení probíhalo při teplotě 37 C. Při použití pufru psaného normálním písmem byla aktivita enzymu 75 % a při použití pufru psaného tučným písmem byla aktivita enzymu 100 %. 43

44 Syntetické oligonukleotidy Oligonukleotidy (Tab. 4) byly dodány jako jednovláknová DNA v lyofilizované formě (Generi Biotech, Hradec Králové, ČR). Pro následné použití při polymerázové řetězové reakci nebo pro sekvenaci byly rozpuštěny ve sterilní deionizované vodě na výslednou koncentraci 10 pmol/μl (10 μm). Oligonukleotidy spojované do dvouřetězcové DNA byly rozpuštěny ve sterilní deionizované vodě na výslednou koncentraci 100 pmol/μl (100 μm). Oligonukleotidy pro amplifikaci DNA sekvence kódující antigen TB7.7 TB7.7_for 5'- CGT GTA CAT AGC GGC CAC GCG TTG G -3' TB7.7_back 5'- GCG GTA CCG GCG GAT CAC CCC GG -3' Oligonukleotidy pro amplifikaci DNA sekvence kódující epitop z ovalbuminu SM2_for 5'- GCG GTA CCG CTA GCG AGT ATA ATC AAC TTT GAA AAA -3' SM2_back 5'- GCG GTA CCT CCC TCT CTT CCA TAA CAT T -3' Oligonukleotidy pro vytvoření adaptoru kódujícího peptid R5 R5_for 5'- GTA CAG GTT AAC CGT CGC CGT CGT CGC ATG -3' R5_back 5'- GTA CCA TGC GAC GAC GGC GAC GGT TAA CCT -3' Oligonukleotidy pro vytvoření adaptoru kódujícího peptid z TAT proteinu TAT_for 5'- GTA CAG GTT AAC GGC CGT AAG AAA CGT CGA CAG CGT CGC CGG ATG -3' TAT_back 5'- GTA CCA TCC GGC GAC GCT GTC GAC GTT TCT TAC GGC CGT TAA CCT -3' Oligonukleotid pro sekvenaci genů umístěných v místě seq 5'- GCT TGC ATG CCT GCA GGT CG -3' Oligonukleotid pro sekvenaci genů umístěných v místě 233 a 336 1seq 5'- CAT GTT CGC CAT TAT GCC GC -3' Tab. 4. Seznam použitých oligonukleotidů. Kurzívou jsou označeny DNA sekvence nekomplementární k sekvencím, které kódují antigen TB7.7, epitop z ovalbuminu nebo adaptory. Podtrženě jsou vyznačena restrikční místa nebo jejich části použitá k vlastnímu klonování či ověření správnosti klonování Roztoky a pufry Komerčně dodané pufry: Phusion HF Buffer F-518 (5krát koncentrovaný), Finnzymes, Finsko. Výrobce složení nezveřejnil. 44

45 T4 DNA ligační pufr (10krát koncentrovaný, ph 7,8 při teplotě 25 C), Fermentas International Inc., Kanada. Tris-HCl mm MgCl mm DTT mm ATP...5 mm (ph 7.8 at 25 C) Složení jednotlivých NEB pufrů (New England Biolabs, USA) použitých při štěpení restrikčními endonukleázami: NEB pufr 1 (10krát koncentrovaný, ph 7,0): Bis-Tris-Propan-HCl mm MgCl mm DTT...10 mm NEB pufr 2 (10krát koncentrovaný, ph 7,9): NaCl mm Tris-HCl mm MgCl mm DTT...10 mm NEB pufr 3 (10krát koncentrovaný, ph 7,9): NaCl mm Tris-HCl mm MgCl mm DTT...10 mm NEB pufr 4 (10krát koncentrovaný, ph 7,9): Acetát draselný mm Tris-acetát mm Acetát hořečnatý mm DTT...10 mm 45

46 Složení ostatních používaných pufrů a roztoků: 30% roztok akrylamidu pro SDS-PAGE elektroforózu: Akrylamid...29% (w/v) N,N'-methylen-bisakrylamid...1% (w/v) Barvící roztok pro SDS-PAGE elektroforézu: Methanol ml dh2o ml Kyselina octová...50 ml Coomassie Brilliant Blue R ,5 g BFB (5krát koncentrovaný): Bromfenolová modř...0,1% (w/v) Glycerol...40% (v/v) Bikarbonátový pufr (ph 9,6): NaHCO3...8,4 g Na2CO3...5,36 g dh2o ml Činidlo Bradfordové: Coomassie Brilliant Blue R ,01% (w/v) Ethanol...4,7% (v/v) H3PO4...8,7% (v/v) Odbarvovací roztok pro SDS-PAGE elektroforézu: Methanol ml dh2o ml Kyselina octová ml 46

47 o-phenylenediamin (OPD) substrát: 0,1 M citrát trisodný (ph 5)...10 ml OPD (50 mg/ml) μl H2O μl ph citrátu trisodného se upraví koncentrovanou kyselinou orthofosforečnou. OPD je citlivé na světlo, proto se substrát připravuje těsně před použitím. PBS (ph 7,4): NaCl mm KCl...3 mm Na2HPO mm KH2PO4...2 mm PBST: Tween ,1% (w/v) v PBS PBS-1% BSA: BSA...1% (w/v) v PBS Reakční směs pro stanovení cyklázové aktivity: Tris-HCl (ph 8,0)...60 mm MgCl2...7 mm CaCl2...0,1 mm Triton X ,1% (v/v) BSA...1 mg/ml Kalmodulin...1 mm camp...0,1 mm [2,8-3H]cAMP...asi 200 dpm/μl ATP...2 mm [α-32p]atp...asi dpm/μl 47

48 Rozdělovací gel pro SDS-PAGE elektroforézu 7,5% (ph 8,8): 30% roztok akrylamidu...1,24 ml dh2o...1,8 ml 1 M Tris-HCl pufr (ph 8,8)...1,87 ml 10% SDS...50 μl 25% APS...12,5 μl TEMED...12,5 μl Roztok I (ph 8): Glukóza...50 mm Tris-HCl...25 mm EDTA...10 mm Roztok II: NaOH...0,2 mm SDS...1% (w/v) Roztok III: 5 M acetát draselný...60 ml Kyselina octová...11,5 ml dh2o...28,5 ml Suspenzní roztok: 1 M Tris-HCl (ph 7,5)...0,5 ml 0,5 M EDTA (ph 8)...0,2 ml RNáza (10 mg/ml)...0,1 ml dh2o...9,2 ml TB pufr: HEPES...10 mm CaCl mm KCl mm ph se upraví na 6,7 pomocí 1 M KOH a poté se přidá MnCl2 do výsledné koncentrace 55 mm. Roztok se steriluje přes filtry o velikosti pórů 0,22 μm. 48

49 TBE pufr (ph 8,3): Tris...90 mm Kyselina boritá...90 mm EDTA...2 mm TBST (ph 8): Tris-HCl...50 mm NaCl mm Tween ,1% (w/v) TBST-2% BSA: BSA...2% (w/v) v TBST TCT pufr (ph 8): Tris-HCl...50 mm CaCl2...0,2 mm Triton X ,1% TE pufr (ph 8): Tris-HCl...10 mm EDTA...1 mm TEU4 pufr (ph 8): Tris-HCl...50 mm EDTA...2 mm Močovina...4 M TN pufr (ph 8): Tris-HCl...50 mm NaCl...1 M 49

50 TNC pufr (ph 7,4): Tris-HCl...50 mm NaCl mm CaCl2...2 mm TNE pufr (ph 8): Tris-HCl...50 mm NaCl mm EDTA...1 mm Tris-glycinový pufr (ph 8,3): Tris...25 mm Glycin mm SDS...0,1% (w/v) TUC pufr (ph 8): Tris-HCl...50 mm Močovina...8 M CaCl2...0,2 mm TUE pufr (ph 8): Tris-HCl...50 mm Močovina...8 M EDTA...2 mm TUN-A pufr (ph 8): Tris-HCl...50 mm Močovina...8 M NaCl mm TUN-B (ph 8): Tris-HCl...50 mm Močovina...8 M NaCl mm 50

51 TUS pufr (ph 8): Tris-HCl...50 mm Močovina...8 M SDS...1% (w/v) Vzorkový pufr pro SDS-PAGE elektroforézu (5krát koncentrovaný, ph 6,8): Tris-HCl mm DTT mm SDS...10% (w/v) Bromfenolová modř...0,5% (w/v) Glycerol...50% (v/v) Roztok se uchovává zamražený při teplotě 20 C. Před použitím se přidá β-merkaptoethanol do výsledné koncentrace 10 % (v/v). Z pufr (ph 7,0): PBS...48,8 ml 1 M MgCl μl 10% NP μl β-merkaptoethanol...1 μl CRPG...4,5 mg Vždy čerstvě připravený. Zaostřovací gel pro SDS-PAGE elektroforézu 5% (ph 6,8): 30% roztok akrylamidu μl dh2o...1,23 ml 1 M Tris-HCl pufr (ph 6,8) μl 10% SDS...60 μl 20% APS...20 μ TEMED...5 μl 51

52 Kultivační média pro bakteriální kultury Tekutá kultivační média Luria-Bertani (LB) médium: Bacto-tryptone...10 g NaCl...5 g Kvasničný extrakt...5 g dh2o...do ml Přidáním 5 M NaOH se upraví ph na hodnotu 7,2. MDO médium: NaH2PO4...1 g Na2HPO4...3 g NH4Cl...2 g Na2SO4...0,5 g Thiamin...10 mg Kvasničný extrakt...20 mg Glycerol...20 mg dh2o...do ml Přidáním 5 M NaOH se upraví ph na hodnotu 7,0. Super Optimal Broth (SOB) médium: Bacto-tryptone...20 g Kvasničný extrakt...5 g NaCl...0,6 g KCl...0,2 g dh2o ml Steriluje se autoklávováním (0,12 MPa, 30 minut). Poté se přidá 10 ml sterilního roztoku 1 M MgCl2 a 1 M MgSO4. Takto připravená média se uchovávají při 4 C. Médium s ampicilinem: Připraví se médium (LB médium nebo MDO médium) (kap ). Po sterilaci a vychladnutí se k médiu přidá ampicilin do výsledné koncentrace 150 μg/ml. 52

53 Médium s tetracyklinem: Připraví se médium (LB médium nebo MDO médium) (kap ). Po sterilaci a vychladnutí se k médiu přidá tetracyklin do výsledné koncentrace 12,5 μg/ml. Médium s ampicilinem a tetracyklinem: Připraví se médium (LB médium nebo MDO médium) (kap ). Po sterilaci a vychladnutí se k médiu přidá ampicilin do výsledné koncentrace 150 μg/ml a tetracyklin do výsledné koncentrace 12,5 μg/ml. Takto připravená média se uchovávají při 4 C Tuhá kultivační média LB médium s ampicilinem: Připraví se LB médium (kap ) a před sterilací se do média přidá 18 g/l bakteriologického agaru a po sterilaci a vychladnutí se k médiu přidá ampicilin do výsledné koncentrace 150 μg/ml. LB médium s tetracyklinem: Připraví se LB médium (kap ) a před sterilací se do média přidá 18 g/l bakteriologického agaru a po sterilaci a vychladnutí se k médiu přidá tetracyklin do výsledné koncentrace 12,5 μg/ml. LB médium s ampicilinem a tetracyklinem: Připraví se LB médium (kap ) a před sterilací se do média přidá 18 g/l bakteriologického agaru a po sterilaci a vychladnutí se k médiu přidá ampicilin do výsledné koncentrace 150 μg/ml a tetracyklin do výsledné koncentrace 12,5 μg/ml. Takto připravená média se uchovávají při 4 C. 53

54 Kultivační média pro tkáňové linie DC médium: RPMI s NaHCO ml L-glutamin (3% roztok)...5 ml Glukóza (25% roztok)...9 ml Pyruvát (1,1% roztok)...2,5 ml Antibiotika (100krát koncentrovaná)...5 ml β-merkaptoethanol...50 μm Fetální hovězí sérum (FCS)...50 ml GM-CSF...20 ng/ml Dulbecco s modified Eagle's médium (DMEM): Komerčně dostupné DMEM médium s vysokým obsahem glukózy (4,5 g/l), L-glutaminu a bez fenolové červeně bylo zakoupeno od firmy PAA Laboratories, Rakousko. Roswell Park Memorial Institute médium (RPMI): RPMI s NaHCO ml L-glutamin (3% roztok)...5 ml Glukóza (25% roztok)...9 ml Pyruvát (1,1% roztok)...2,5 ml Antibiotika (100krát koncentrovaná)...5 ml β-merkaptoethanol...50 μm Fetální hovězí sérum (FCS)...50 ml Plazmidy pet28b (Novagen, USA) nese gen pro rezistenci ke kanamycinu a DNA sekvenci pro histidinovou kotvu. Do plazmidu byla zaklonována DNA sekvence kódující antigen TB7.7 a vytvořený konstrukt sloužil pro amplifikaci vnesené sekvence. pt7ct7act1 (Iwaki et al., 1995) nese gen pro rezistenci k ampicilinu, gen cyaa kódující toxin CyaA a gen cyac kódující protein nezbytný pro posttranslační modifikaci CyaA mastnou kyselinou. Oba geny jsou pod kontrolou inducibilního lac promotoru a mají stejně silná ribozom vazebná místa. Plazmid byl používán pro produkci celého adenylát cyklázového toxinu v buňkách E. coli. 54

55 pt7ct7act1 E5 je odvozen od plazmidu pt7ct7act1, do jehož genu cyaa byl v místě 188 vložen dipeptid Gly-Ser, který způsobuje detoxifikovaci toxinu CyaA. Plazmid byl používán pro produkci celého detoxifikovaného adenylát cyklázového toxinu v buňkách E. coli. p7ct7act1-108bsrgi, pt7ct7act1-233bsrgi, pt7ct7act1-336bsrgi jsou odvozeny od plazmidu pt7ct7act1, do jehož genu cyaa bylo v místě 108, 233 a 336 vloženo unikátní restrikční místo rozeznávané endonukleázou BsrGI. Plazmidy byly používány pro inzerci DNA sekvence epitopu pocházejícího z ovalbuminu a antigenu TB7.7. Vytvořené konstrukty sloužily pro produkci upraveného adenylát cyklázového toxinu v buňkách E. coli. pt7ct7act1-108bsrgi E5, pt7ct7act1-233bsrgi E5, pt7ct7act1-336bsrgi E5 jsou odvozeny od plazmidu pt7ct7act1 E5, do jehož genu cyaa bylo v místě 108, 233 a 336 vloženo unikátní restrikční místo rozeznávané endonukleázou BsrGI. Plazmidy byly použity pro inzerci DNA sekvence epitopu pocházejícího z ovalbuminu a antigenu TB7.7. Vytvořené konstrukty sloužily pro produkci upraveného adenylát cyklázového toxinu v buňkách E. coli Bakteriální kmeny Bakteriální kmen Escherichia coli XL-1 Blue (Stratagene, USA) reca1 enda1 gyra96 thi- 1 hsdr17 supe44 rela1 lac [F'proAB lac1q ZΔM15Tn10(Tetr)] byl použit pro manipulaci s plazmidovými DNA a produkci CyaA. Tento bakteriální kmen nese gen pro rezistenci na tetracyklin Tkáňové linie B3Z T lymfocyty adherentní CD8+ T buněčné hybridomy exprimující T buněčný receptor rozeznávající epitop SIINFEKL z ovalbuminu (aminokyseliny ) (Karttunen et al., 1992). Daroval Kenneth L. Rock. MF2.2D9 T lymfocyty neadherentní CD4+ T buněčné hybridomy exprimující T buněčný receptor rozeznávající epitop IINFEKLTEWTSSNVMEER z ovalbuminu (aminokyseliny ) (Faiola et al., 2002). Daroval Kenneth L. Rock. RAW makrofágy adherentní myší buněčná linie exprimující na svém povrchu receptor CD11b/CD18 (Mac-1, CR3). Zakoupeno od ATCC (American Type Culture Collection), USA. 55

56 3.2. Metody a pracovní postupy Uchovávání bakteriálních kmenů Kmeny E. coli byly krátkodobě uchovávány na tuhém LB médiu s příslušným antibiotikem. Dlouhodobě byly uchovávány ve 40% glycerolu při teplotě 80 C. Bakteriální kmeny vzniklé transformací plazmidové DNA do kompetentních buněk E. coli byly krátkodobě uchovávány na tuhém médiu s příslušným antibiotikem při 4 C Příprava superkompetentních buněk Escherichia coli Na tuhé LB médium s příslušným antibiotikem byla nanesena suspenze buněk dlouhodobě uchovávaného kmene E. coli a dále kultivována (37 C, hodin). Poté byly 2 3 kolonie E. coli z tuhého LB média přeneseny do 50 ml LB média s příslušným antibiotikem a kultivovány přes noc při teplotě 30 C. Druhý den ráno bylo přeneseno 5 ml noční kultury do 500 ml SOB média a pokračovalo se v kultivaci při 30 C za intenzivního třepání a měření optické denzity bakteriální kultury. Po dosažení požadované optické denzity (OD600 = 0,6) následovalo prudké ochlazení kultury v lázni voda-led, rozplnění po 50 ml do centrifugačních zkumavek a poté odstředění (6 000 g, 4 C, 10 minut). Sediment bakteriálních buněk E. coli v každé centrifugační zkumavce byl resuspendován v 32 ml ledového TB pufru. Následovala inkubace buněčné suspenze v lázni voda-led (4 C, 10 minut) a opětovná centrifugace buněk (6 000 g, 4 C, 10 minut). Po odstranění supernatantu byl sediment bakteriálních buněk v každé centrifugační zkumavce resuspendován ve 4 ml ledového TB pufru. K buněčné suspenzi bylo přidáno DMSO do koncentrace 7 % (v/v) a po inkubaci v lázni voda-led (4 C, 10 minut) byla buněčná suspenze rozplněna po 200 μl do mikrozkumavek a zamražena v tekutém dusíku. Takto připravené superkompetentní buňky E. coli byly dlouhodobě uchovávány při teplotě 80 C Transformace plazmidové DNA do superkompetentních buněk K 50 μl suspenze superkompetentních buněk byl přidán 1 μl plazmidové DNA získané midipreparativní izolací (kap ) a obsah šetrně zamíchán. V případě získání transformované DNA ligací (kap ) bylo ke 100 μl superkompetentních buněk přidáno 10 μl ligační směsi DNA. Směs byla inkubována (4 C, 30 minut) a následně přenesena na 5 minut do vodní lázně o teplotě 37 C a poté ochlazena po dobu 2 minut v ledu. Po přidání 1 ml předehřátého tekutého LB média byla kultura inkubována (37 C, 60 minut). Během této doby se plazmid uvnitř transformovaných buněk replikoval a zároveň docházelo 56

57 k produkci určitého množství β-laktamázy, popřípadě jiného produktu genu pro rezistenci k určitému antibiotiku. V závěru celého procesu byla směs centrifugována ( g, 25 C, 1 min), pelet resuspendován v μl tekutého LB média a suspenze vyseta na tuhé LB médium s příslušným antibiotikem. Inkubace buněk probíhala při teplotě 37 C po dobu hodin Izolace plazmidové DNA Minipreparace plazmidové DNA Vždy jednou čerstvě narostlou bakteriální kolonií byly zaočkovány 2 ml LB média s příslušným antibiotikem a kultivovány za intenzivního třepání (37 C, hodin). Bakteriální kultura byla centrifugována ( g, 25 C, 1 min) a sediment resuspendován ve 100 μl roztoku I a inkubován 5 minut při teplotě 25 C. Buňky byly lyzovány přídavkem 200 μl roztoku II, šetrně promíchány a inkubovány 5 minut v ledu. K lyzátu bylo přidáno 150 μl roztoku III a směs následně promíchána a inkubována (4 C, 15 minut). Centrifugací ( g, 4 C, 15 minut) byly odstraněny zbytky buněčných struktur, vysrážené proteiny a chromozomální DNA. Supernatant byl převeden do nové mikrozkumavky a plazmidová DNA sražena stejným objemem izopropanolu (4 C, 10 minut). Po centrifugaci ( g, 4 C, 15 minut) byl pelet sražené DNA promyt 1 ml 70% ethanolu. Sediment byl sušen na vzduchu do úplného odpaření ethanolu a následně rozpuštěn ve 50 μl TE pufru ph 8,0 s termostabilní pankreatickou RNázou (20 μg/ml). Směs byla inkubována po dobu 30 minut při teplotě 70 C, která je optimální pro aktivitu RNázy. Plazmidová DNA byla dlouhodobě uchovávána při teplotě 20 C Midipreparace plazmidové DNA pomocí Lego kitu Bakteriální kolonií po transformaci požadovanou plazmidovou DNA bylo zaočkováno 50 ml tekutého LB média s příslušným antibiotikem a kultura byla kultivováno při teplotě 37 C po dobu hodin. Centrifugací (6 000 g, 4 C, 10 minut) byly odděleny bakteriální buňky a resuspendovány v 1 ml suspenzního roztoku. Suspenze buněk byla rozdělena do tří mikrozkumavek na tři stejné objemové díly. Do každé mikrozkumavky bylo přidáno 0,5 ml roztoku II a promícháno pomalou inverzí. Inkubace vzorků probíhala při teplotě 25 C po dobu 5 minut. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku III a obsah byl pomalou inverzí promíchán. Centrifugací ( g, 25 C, 7 minut) byly odstraněny vysrážené proteiny, chromozomální DNA a ostatní buněčné struktury. Supernatant byl převeden do 10 ml zkumavky a smíchán se stejným objemem DNA vazebného pufru. Směs byla postupně 57

58 nanesena na dvě minikolonky s 200 μl křemičitými partikulemi umístěné na vakuové pumpě a vystavena mírnému podtlaku. Minikolonky s navázanou plazmidovou DNA byly 4krát promyty 1 ml DNA promývacího pufru, přeneseny do nové mikrozkumavky a centrifugací byly odstraněny zbytky promývacího pufru ( g, 25 C, 2 minuty). Plazmidová DNA byla uvolněna z náplně minikolonky přídavkem 50 μl sterilní deionizované vody předehřáté na 50 C a centrifugací ( g, 25 C, 2 min) převedena do mikrozkumavky. Plazmidová DNA připravená tímto způsobem vykazovala vysokou koncentraci a byla uchovávána při teplotě 20 C. DNA vazebný pufr, promývací pufr a vazebné křemičité partikule tvoří součást komerčně dodávaného Lego kitu pro izolaci plazmidové DNA (Top Bio, Praha, ČR) Manipulace s DNA Štěpení plazmidové DNA restrikčními endonukleázami K 0,5-1 μg DNA byly přidány 2 μl 10krát koncentrovaného NEB pufru, zvoleného podle typu použité restrikční endonukleázy (kap ). Některé enzymy vyžadují ještě přidání 0,2 μl 100krát koncentrovaného roztoku BSA. Reakční směs byla doplněna sterilní deionizovanou vodou tak, aby její výsledný objem po přídavku restrikční endonukleázy odpovídal 20 μl. Po promíchání byly přidány 2 až 4 U příslušné endonukleázy a vzorek byl inkubován ve vodní lázni o teplotě požadované daným typem enzymu (kap ) po dobu 2 hodin. Při štěpení DNA více enzymy najednou byl použit takový NEB pufr a zvoleny takové reakční podmínky, které vyhovovaly všem použitým enzymům (kap ). Při štěpení větších množství DNA bylo vhodným způsobem upraveno i množství ostatních reakčních složek Defosforylace 5'-konců lineární plazmidové DNA Zabránění recirkularizace štěpené plazmidové DNA bez příslušného inzertu bylo dosaženo odstraněním 5'-fosfátových zbytků z její molekuly. Do mikrozkumavky obsahující směs štěpené plazmidové DNA (kap ) byl po skončení štěpení přidán 1 μl alkalické fosfatázy. Tato směs byla promíchána a inkubována při teplotě 37 C po dobu 30 minut. Alkalická fosfatáza byla inaktivována 15 minut při teplotě 75 C Ligace DNA fragmentů Štěpený plazmid byl smíchán s vkládaným DNA fragmentem (oba většinou izolovány z agarózového gelu) nebo syntetickým oligonukleotidem v molárním poměru 1:10, s 3 μl 58

59 10krát koncentrovaného ligačního pufru a deionizovanou vodou, která byla doplněna do 29 μl. Po promíchání byl přidán 1 μl T4 DNA ligázy a reakční směs inkubována 2 hodiny při teplotě 25 C při ligaci nedefosforilovaných kohezních konců DNA nebo 12 až 16 hodin při ligaci defosforylovaných kohezních konců DNA Amplifikace fragmentů plazmidové DNA Do tenkostěnné mikrozkumavky určené pro amplifikaci pomocí metody PCR bylo k 1 μl templátové DNA (200 ng/μl) přidáno 10 μl 5krát koncentrovaného kompletního pufru Phusion HF Buffer F-518. Následovalo přidání 2,5 μl 10 μm primeru I a 2,5 μl 10 μm primeru II, které byly rozpuštěny ve sterilní deionizované vodě. Dále bylo přidáno 5 μl 2 mm dntp, 13 μl sterilní deionizované vody, 15 μl 40% glycerolu a 1 μl Phusion DNA polymerázy. Celkový objem reakční směsi činil 50 μl. Templátová DNA byla denaturována zahřátím na 95 C po dobu 30 sekund, dále následoval nastavený cyklus, který se opakoval celkem 35krát: 10 sekund při teplotě 98 C, 30 sekund při teplotě 56 C a 30 sekund při teplotě 72 C. Po proběhnutí všech 35 cyklů byly zkumavky s reakční směsí ponechány 10 minut v PCR přístroji při teplotě 72 C a poté byl jejich obsah ochlazen na teplotu 4 C. Podle potřeby byly vzorky buď okamžitě zpracovány, či zamraženy při teplotě 20 C Elektroforéza DNA fragmentů v agarózovém gelu Podle velikosti dělených fragmentů byla zvolena koncentrace agarózového gelu. Většina případů vyžadovala použití 0,6% (w/v) a 2% (w/v). Gel byl připraven smícháním příslušného množství agarózy s 400 ml TBE pufru, přidáním ethidiumbromidu do výsledné koncentrace 0,5 μg/ml, povařením do úplného rozpuštění agarózy a ochlazením na teplotu 50 C. Poté byla připravená směs nalita do obdélníkové formy z plexiskla asi do výšky 0,5 1 cm. Výška hřebínku pro nanášení vzorků byla nastavena tak, aby dno jamky bylo ode dna formy vzdáleno asi 0,2 0,3 cm. Gel byl vložen do aparatury pro agarózovou elektroforézu a převrstven TBE pufrem do výšky asi 2 mm nad gel. Do jamek byly jednotlivé vzorky a standard k určování velikostí DNA (0,5 μg λ DNA štěpené restrikční endonukleázou PstI) naneseny v BFB. Zařízení bylo zakryto krytem z plexiskla a na elektrody bylo vloženo napětí o velikosti 5 V/cm. Elektroforéza probíhala většinou po dobu 2 hodin. Následovalo odpojení aparatury od zdroje napětí, odebrání krytu a vyjmutí gelu. Rozdělení jednotlivých DNA fragmentů bylo pozorováno při UV světle a gel zaprotokolován pomocí dokumentačního systému Syngene G:BOX. 59

60 Izolace DNA fragmentů z agarózového gelu Po elektroforéze byl požadovaný DNA fragment vyříznut z agarózového gelu a přenesen do mikrozkumavky s přídavkem 900 μl DNA vazebného pufru. Připravený vzorek byl inkubován při 55 C 10 minut do úplného rozpuštění agarózy. Směs byla nanesena na minikolonku se 100 μl křemičitých partikulí a vystavena mírnému podtlaku. Navázaná plazmidová DNA byla 2krát promyta 1 ml promývacího roztoku a přebytek tohoto roztoku odstraněn centrifugací ( g, 25 C, 2 min). Plazmidová DNA byla uvolněna z náplně minikolonky přídavkem 50 μl sterilní deionizované vody předehřáté na 50 C a centrifugací ( g, 25 C, 2 min) převedena do mikrozkumavky. Získané DNA fragmenty byly uchovávány při teplotě 20 C. DNA vazebný pufr, promývací pufr a vazebné křemičité partikule tvoří součást komerčně dodávaného Lego kitu pro izolaci plazmidové DNA (Top Bio, Praha, ČR) Spojení syntetických oligonukletidů Syntetické na výslednou oligonukleotidy koncentraci byly 100 pmol/μl rozpuštěny (100 μm). ve sterilní Směs dvou deionizované vodě komplementárních oligonukleotidů byla inkubována při teplotě 70 C po dobu 10 minut a poté pozvolna ochlazena na teplotu 25 C. Tímto způsobem byly oligonukleotidy převedeny na dvouvláknovou formu DNA Sekvenace plazmidové DNA Plazmidová DNA byla izolována midipreparací pomocí Lego kitu (kap ). Sekvenace byla provedena Sangerovou metodou kombinovanou s technikou cyklického sekvenování. Bylo použito kitu pro cyklické sekvenování (ABI PRISM Big Dye terminator ready reaction cycle sequencing kit, Applied Biosystems, USA), neznačeného primeru komplementárního k sekvenované DNA a vyhodnocení pomocí DNA sekvenátoru ABI PRISM 377 (Perkin Elmer, USA). Tato část práce provedla sekvenační laboratoř MBÚ AV ČR, v.v.i., Praha (Dr. J. Felsberg) Produkce a purifikace CyaA proteinů Produkce proteinů v 2 ml kulturách Každý nově vytvořený plazmidový konstrukt nesoucí gen pro CyaA vyžadoval ověření produkce příslušných proteinů v 2 ml kultuře. Teprve poté následovalo pěstování kultur 60

61 ve velkých objemech. Buňky E. coli byly transformovány (kap ) plazmidem určeným k expresi požadovaného proteinu a inkubovány přes noc na Petriho miskách s tuhým LB agarem obsahujícím příslušné antibiotikum. Druhý den bylo do 2 ml tekutého LB média obsahujícího příslušné antibiotikum přeneseno několik bakteriálních kolonií, které nesly plazmid s genem pro požadovaný protein. Bakterie E. coli byly kultivovány za stálého třepání při 37 C do optické denzity OD600 = 0,6. Poté byla produkce proteinu indukována přídavkem IPTG (o výsledné koncentraci 1 mm) vzhledem k tomu, že geny kódující CyaA, případně CyaC, jsou pod kontrolou inducibilního lac promotoru. Kultura rostla za stálého třepaní další 4 hodiny, aby mohl být gen pro CyaA exprimován. Pro analýzu vyprodukovaného množství proteinu v buňkách E. coli byl z narostlé bakteriální kultury odebrán vzorek (1 ml), který byl dále centrifugován ( g, 25 C, 1 minuta). Po odstranění supernatantu byl pelet buněk resuspendován v 200 μl TUS pufru. Následně bylo odebráno 20 μl této směsi a přidáno 5 μl vzorkového pufru. Po zahřátí (100 C, 5 minut) byl vzorek připraven k nanesení na SDS-PAGE, pomocí které bylo analyzováno množství vyprodukovaného CyaA proteinu v buňkách E. coli Produkce proteinů v 500 ml kulturách Buňky E. coli byly transformovány (kap ) plazmidem určeným k expresi požadovaného proteinu a inkubovány přes noc na Petriho miskách s tuhým LB agarem obsahujícím příslušné antibiotikum. Druhý den byly do 50 ml tekutého MDO média obsahujícího příslušné antibiotikum přeneseny 2 3 bakteriální kolonie, které nesly plazmid s genem pro požadovaný protein, a bakterie E. coli byly kultivovány za stálého třepání hodin při 37 C. Následovalo odebrání 5 ml pro zaočkování 500 ml čerstvého MDO média s příslušným antibiotikem. Bakteriální kultura byla inkubována za nepřetržitého třepání při teplotě 37 C do optické denzity OD600 = 0,6. Poté byla produkce proteinu indukována přídavkem IPTG (o výsledné koncentraci 1 mm) vzhledem k tomu, že geny kódující CyaA, případně CyaC, jsou pod kontrolou inducibilního lac promotoru. Kultura rostla za stálého třepaní další 4 hodiny, aby mohl být gen pro CyaA exprimován. Kultivaci bakterií ukončilo prudké ochlazením narostlé bakteriání kultury v lázni voda-led. Pro analýzu vyprodukovaného množství proteinu v buňkách E. coli byl z narostlé bakteriální kultury odebrán vzorek (1 ml), který byl dále centrifugován ( g, 25 C, 1 minuta). Po odstranění supernatantu byl pelet buněk resuspendován v 200 μl TUS pufru. Následně bylo odebráno 20 μl této směsi a přidáno 5 μl vzorkového pufru. Po zahřátí (100 C, 61

62 5 minut) byl vzorek připraven k nanesení na SDS-PAGE, pomocí které bylo analyzováno množství vyprodukovaného CyaA proteinu v buňkách E. coli Příprava močovinového extraktu CyaA proteinů Narostlá bakteriální kultura po kultivaci (kap ) byla centrifugována (6 000 g, 4 C, 20 minut), pelet buněk resuspendován v TNE pufru (20 ml) a buňky rozbity ultrazvukem (5 minut, 50 W, 4 C, 30 sekundový pulz, 60 sekundová přestávka na chlazení). Po rozbití ultrazvukem byly zbývající celistvé buňky odstraněny centrifugací (6 000 g, 4 C, 10 minut). Supernatant byl přenesen do nové centrifugační zkumavky a centrifugován ( g, 4 C, 30 minut), čímž došlo k odstředění proteinu přítomného v inkluzních tělískách bakterií. Supernatant byl odstraněn a membrány buněk stočené spolu s inkluzními tělísky byly odstraněny opatrným odmýváním sedimentu v TEU4 pufru. Obsah zkumavky byl znovu odstraněn a k vytvořenému peletu bylo přisypáno 4,8 g pevné močoviny a přidáno 6 ml 50 mm roztoku Tris-HCl (ph 8,0). Pelet byl resuspendován a obsah zkumavky promícháván pomalou inverzí po dobu 45 minut, aby došlo k úplnému rozpuštění močoviny na výslednou koncentraci 8 M. Poté následovala centrifugace obsahu zkumavky ( g, 4 C, 30 minut), převedení supernatantu (močovinový extrakt) obsahujícího denaturovaný CyaA protein do nových zkumavek a uchování při teplotě 20 C. Pro analýzu množství CyaA proteinu v močovinovém extraktu byl z extraktu odebrán vzorek 10 μl, ke kterému bylo přidáno 5 μl vzorkového pufru pro SDS-PAGE. Po zahřátí (100 C, 5 minut) byl vzorek připraven k nanesení na SDS-PAGE, pomocí které bylo analyzováno množství CyaA proteinu v močovinovém extraktu E. coli Purifikace proteinů iontoměničovou chromatografií na DEAE-Sepharose Chromatografická kolona byla naplněna 10 ml matricí DEAE-Sepharose a propláchnuta deionizovanou vodou, aby došlo k odstranění ethanolu, ve kterém byla matrice uchovávána. Kolona byla ekvilibrována TUN-A pufrem (asi 10krát objem kolony) do doby, než ph pufru, který vytékal z kolony, bylo stejné jako ph nanášeného pufru. Močovinový extrakt připravený k purifikaci (kap ) byl centrifugován pro odstranění koloidů ( g, 4 C, 30 minut) a byla v něm upravena koncentrace NaCl na výslednou hodnotu 50 mm. Takto upravený vzorek byl nanesen na předem připravenou kolonu s matricí DEAE-Sepharose, kde došlo k zachycení CyaA. Většina ostatních kontaminujících proteinů byla následně odstraněna promýváním kolony TUN-A pufrem (cca 3krát objem kolony). Navázaný CyaA protein byl z kolony eluován roztokem TUN-B. Během eluce probíhalo 62

63 sledování množství proteinu orientačním testem podle Bradfordové (10 μl eluovaného vzorku a 90 μl činidla Bradfordové). K odebranému vzorku (10 μl) z purifikované frakce bylo přidáno 5 μl vzorkového pufru pro SDS-PAGE. Po zahřátí (100 C, 5 minut) byl vzorek připraven k nanesení na SDS-PAGE, která slouží k analýze množství a čistoty CyaA proteinu v eluované frakci Purifikace proteinů hydrofobní chromatografií na Phenyl-Sepharose Chromatografická kolona byla naplněna 2 ml matricí Phenyl-Sepharose a propláchnuta deionizovanou vodou, aby došlo k odstranění ethanolu, ve kterém byla matrice uchovávána. Následovala ekvilibrace TN pufrem (cca 10krát objem kolony). Vzorek obsahující CyaA protein, jenž byl purifikován na DEAE-Sepharose (kap ), byl ředěn 4krát pomocí TN pufru. Tento krok umožnil naředění močoviny na koncentraci 2 M a částečnou renaturaci proteinů. Naředěný vzorek byl nanesen na předem připravenou kolonu s matricí Phenyl-Sepharose a kolona s navázaným CyaA proteinem byla poté střídavě promyta 20 ml 60% izopropanolu v 50 mm Tris-HCl (ph 8,0) a 20 ml 50 mm Tris-HCl (ph 8,0). Promytí kolony 60% izopropanolem bylo klíčové pro odstranění bakteriálního lipopolysacharidu (LPS) z purifikovaného CyaA proteinu. Promytí kolony s navázaným proteinem na Phenyl-Sepharose bylo opakováno celkem 3krát a navázaný CyaA protein byl z kolony eluován TUE pufrem v postupně odebíraných 1 ml frakcích. Množství proteinu bylo sledováno v každé frakci orientačním testem podle Bradfordové (10 μl frakce a 90 μl činidla Bradfordové). Přítomnost a čistota CyaA v jednotlivých eluovaných frakcích z Phenyl-Sepharose byla poté zjištěna pomocí SDS-PAGE. Frakce obsahující CyaA byly spojeny a vzorek purifikovaného proteinu ředěn 4krát pomocí TN pufru. Celý postup purifikace CyaA proteinu hydrofobní chomatografií na Phenyl-Sepharose byl opakován, čímž došlo k dalšímu snížení množství LPS v purifikovaném CyaA. Následovala analýza jednotlivých frakcí z Phenyl-Sepharose pomocí SDS-PAGE a konečné stanovení koncentrace proteinu v jednotlivých frakcích bylo provedeno metodou podle Bradfordové (kap ) Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) K μl proteinu bylo přidáno 5 μl vzorkového pufru určeného pro elektroforézu v SDS-polyakrylamidovém gelu. Po zahřátí na 100 C po dobu 5 minut byly vzorky nanášeny na gel sestávajícího z horního 5% zaostřovacího gelu a ze spodního 7,5 % rozdělovacího gelu. Po proběhnutí elektroforézy při nastaveném konstantním proudu 30 ma na jeden gel 63

64 v Tris-glycinovém pufru o ph 8,3 byl odstraněn zaostřovací gel a rozdělené proteiny vizualizovány barvícím roztokem pro SDS-PAGE s Coomassie Brilliant blue R-250 za mírného třepání a teplotě 25 C. Poté byl rozdělovací gel odbarven v odbarvovacím roztoku pro SDS-PAGE za mírného třepání a teplotě 25 C, promyt vodou a vysušen v celofánové fólii. Pro porovnání molekulové hmotnosti rozdělených proteinů byl použit standard molekulových hmotností Stanovení koncentrace proteinů Ke stanovení koncentrace proteinů ve vzorku bylo použito metody podle Bradfordové. Nejdříve byla v rozmezí μg/ml připravena série ředění BSA, který byl použit jako kalibrační standard. K ředění byl použit stejný pufr jako k přípravě měřeného vzorku. Poté bylo ke 100 μl jednotlivých ředěných standardů, 100 μl vzorku a 100 μl samotného pufru (referenční standard) přidáno 900 μl činidla Bradfordové. Vzorky byly promíchány a inkubovány při teplotě 25 C po dobu 15 minut. Absorbance série standardů a měřeného vzorku byla měřena proti referenčnímu standardu při vlnové délce 595 nm. Nakonec byla sestrojena kalibrační křivka, z níž byla odvozena koncentrace proteinu ve vzorku Stanovení vlastností CyaA proteinů Stanovení adenylát cyklázové aktivity Enzymaticky aktivní AC doména adenylát cyklázového toxinu bakterie B. pertussis katalyzuje po vstupu do cílových buněk hostitele přeměnu molekuly ATP na camp. Stejným způsobem je schopna katalyzovat přeměnu radioaktivního ATP na camp in vitro podle následující reakce: Mg2+ [α-32p]atp [32P]cAMP + PPi + H+. Jak je zřejmé z uvedené rovnice, při stanovení bylo použito radioaktivně značeného substrátu [α-32p]atp, který byl v průběhu reakce přeměňován na radioaktivní [32P]cAMP, a po změření radioaktivity ve všech vzorcích bylo vypočteno množství vzniklého camp (Sebo et al., 1991). Ze vzorku CyaA proteinu bylo odebráno 5 μl a přidáno k 50 μl reakční směsi v mikrozkumavce. Obsah byl promíchán vortexem a umístěn do lázně o teplotě 30 C. V časových intervalech 20 sekund byly postupně spuštěny reakce v ostatních vzorcích. 64

65 Zároveň byl připraven slepý vzorek, který obsahoval pouze reakční směs bez přítomnosti katalyticky aktivní AC domény a také pozitivní kontrolní vzorek obsahující původní wildtype toxin CyaA. Reakce probíhala 5 minut při teplotě 30 C, byla zastavena přidáním 200 μl 0,5 M HCl a vzorky byly vloženy na 5 minut do termostatovaného suchého bloku o teplotě 100 C. Zde proběhla kyselá hydrolýza kontaminant, které by mohly interferovat při následné adsorbční chromatografii, přičemž camp zůstává stabilní. Poté bylo upraveno ph vzorků na hodnotu 7,6 přídavkem 0,2 ml 1,5 M imidazolu. Vzorky byly naneseny na chromatografické kolony (Poly-Prep, Bio-Rad, USA) naplněné 1 g neutrálního oxidu hlinitého, kdy při ph 7,6 dochází k navázání negativně nabitných látek (ATP, ADP, AMP a PPi) na kolonu, zatímco camp volně protéká. Eluce camp byla provedena 3 ml 10 mm imidazolu o ph 7,6 do plastové scintilační lahvičky. K eluátu bylo přidáno 10 ml scintilačního roztoku a obsah byl důkladně protřepán. V připravených vzorcích byla po dobu 1 minuty měřena radioaktivita pro [32P] i [3H] (vnitřní standard). Naměřené hodnoty pro jednotlivé vzorky byly upraveny vzhledem ke ztrátám vzniklým vazbou k matrici pomocí hodnot radioaktivity vnitřního standardu ([3H]cAMP) a dále byly odečteny hodnoty dosažené pro slepý vzorek. Nakonec bylo ze známého množství [32P]ATP, jeho hodnoty radioaktivity a ze změřené radioaktivity [32P]cAMP vypočítáno množství vzniklého camp podle vztahu: A= n A PV A PB d AHR APR VME t A HV A...adenylát cyklázová aktivita vzorku [μmol/min/ml extraktu] APV...radioaktivita 32P ve vzorku [DPM] APB...radioaktivita 32P v slepém vzorku [DPM] APR...radioaktivita 32P v 50 μl reakční směsi [DPM] AHV...radioaktivita [2,8-3H]cAMP ve vzorku [DPM] AHR...radioaktivita [2,8-3H]cAMP v 50 μl reakční směsi [DPM] n...látkové množství ATP v 50 μl reakční směsi [μmol] d...ředění močovinového extraktu VME...objem přidaného purifikovaného CyaA proteinu k 50 μl reakční směsi [ml] t...reakční čas [min] 65

66 Stanovení vazebné aktivity CyaA na makrofázích Vazebná aktivita vyjadřuje schopnost toxinu interagovat s membránou cílových buněk a je úměrná množství molekul toxinu, které jsou schopny se navázat na membránu během inkubace. Princip stanovení spočíval v měření adenylát cyklázové aktivity toxinů, jenž interagovaly s membránou a nebyly v promývacích krocích odmyty. Jako model byly použity RAW makrofágy, které mají na svém povrchu receptor CD11b/CD18. Makrofágy byly resuspendovány v takovém objemu ledového DMEM média, aby výsledná koncentrace činila 106 buněk v 500 μl média. Všechny následující kroky byly prováděny na ledu, aby docházelo pouze k vazbě toxinu na buňky a ne k jeho následné endocytóze. Jako negativní kontrola sloužily buňky, které byly preinkubovány 15 minut na ledu s 10 μg/ml protilátky M1/70 proti CD11b/CD18. Do mikrozkumavky s 500 μl média s buňkami bylo přidáno 5 μl 100krát koncentrovaného toxinu a promícháno na vortexu. Pro zjištění celkového přidaného množství toxinu CyaA bylo ihned odebráno 10 μl vzorku, přidáno 90 μl TCT pufru a směs byla ponechána na ledu. Vzorky byly inkubovány 15 minut na ledu, kdy docházelo k navázání toxinu na buňky. Po skončení inkubace byly buňky s navázaným toxinem centrifugovány ( g, 3 min, 4 C) a supernatant odstraněn. Pro odstranění nenavázaného toxinu byl pelet dvakrát opatrně promyt v 500 μl ledového DMEM média a centrifugován ( g, 3 min, 4 C). Poté následovalo resuspendování peletu jen v 50 μl ledového DMEM média a opět centrifugace ( g, 3 min, 4 C). Dále byla stanovena adenylát cyklázová aktivita jak vzorků (kap ), kdy bylo k peletu přidáno 50 μl reakčního mixu, tak směsi pro zjištění celkového přidaného množství toxinu CyaA, kdy bylo k 50 μl reakčního mixu přidáno 5 μl směsi. Vazebná aktivita CyaA proteinů byla vztažena k vazebné aktivitě původního toxinu wild-type CyaA a vyjádřena v procentech Stanovení hemolytické aktivity CyaA Do mikrozkumavky byly odebrány 2 ml beraní krve a centrifugovány ( g, 1 min, 25 C). Supernatant byl odstraněn a pelet sestávající z červených krvinek byl 6krát promyt v 1 ml TNC pufru. Po posledním promytí byly červené krvinky naředěny v takovém objemu TNC pufru, aby se jejich počet rovnal 5 x 108. Měření počtu krvinek bylo provedeno následovně: k 900 μl naředěných krvinek bylo přidáno 100 μl TCT pufru (= 10krát ředění), čímž došlo k lýze krvinek a uvolnění hemoglobinu; poté byla směs spektrofometricky měřena při vlnové délce 541 nm oproti samotnému TCT pufru, kdy výsledná hodnota by měla být 66

67 A541 = 0,3. K 990 μl naředěných krvinek bylo přidáno 10 μl purifikovaného toxinu (kap ) o koncentraci 0,3 mg/ml. Směs byla promíchána a inkubována 3 hodiny při teplotě 37 C. Jako slepý pokus byl použit vzorek, který neobsahoval CyaA. Po inkubaci byly vzorky centrifugovány ( g, 1 min, 25 C). Supernatant obsahující uvolněný hemoglobin byl odebrán do spektrofotometrické kyvety. Absorbance při 541 nm byla stanovena proti slepému pokusu a získané hodnoty absorbance byly procentuálně vztaženy k maximální míře lýze krvinek Stanovení hladiny intracelulárního camp v makrofázích Adenylát cyklázová doména toxinu CyaA dokáže po translokaci do cytozolu buněk a vazbě kalmodulinu přeměňovat ATP na camp. Stanovením hladiny intracelulárního camp lze měřit invazivní aktivitu toxinu, tj. schopnost toxinu translokovat AC doménu do buněk. Koncentrace camp v buňkách inkubovaných s toxinem byla určena pomocí metody kompetitivní ELISA. První den byl konjugát camp-bsa naředěn 1:6 000 v bikarbonátovém pufru (ph 9,6) a přidán po 50 μl do jamek na ELISA destičce. Naplněná destička byla inkubována přes noc při 4 C a druhý den 2krát promyta 200 μl TBST. Poté došlo k zablokování destičky přídavkem 200 μl TBST-2% BSA a inkubaci po dobu 1 až 3 hodin při teplotě 25 C. Následně byla destička promyta v 200 μl TBST a připravena na přidání vzorků, které byly mezitím přichystány. Makrofágy byly staženy z misky pro tkáňové kultury, spočítány v Bürkerově komůrce, přidány do 96 jamkové mikrotitrační destičky pro tkáňové kultury o koncentraci buněk na jamku a inkubovány 1,5 3 hod v 37 C, 5% CO2. Poté bylo odstraněno RPMI médium, přidáno 50 μl DMEM média a buňky byly inkubovány dalších 20 minut v 37 C, 5% CO2. Do mikrotitrační destičky byla připravena ředící řada toxinů v TUC o koncentraci 100krát vyšší než byla požadovaná konečná koncentrace. Do každé jamky bylo přidáno 5 μl 100krát koncentrovaného toxinu a 245 μl DMEM média. Ihned bylo odebráno 50 μl naředěného toxinu a přidáno k inkubovaným buňkám (výsledné ředění 100krát). Dále probíhala inkubace buněk s definovaným množstvím toxinu po dobu 30 minut v 37 C, 5% CO2. Po inkubaci bylo odstraněno médium, přidáno 60 μl 50 mm HCl s 0,2% Tween 20 (zastavení tvorby camp) a inkubováno 15 minut při teplotě 100 C. Poté bylo přidáno 60 μl 150 mm neneutralizovaného imidazolu a vytvořené vzorky naneseny na připravenou ELISA destičku. 67

68 Do prvního sloupce ELISA destičky bylo přidáno 100 μl TBST (kontrola nespecifické vazby sekundární protilátky). Do druhého a třetího sloupce bylo přidáno 100 μl ředící řady camp nm, nm, 300 nm, 100 nm, 30 nm, 10 nm, 3 nm a 1 nm. Ředící řada byla připravena v TBST nebo v 50 mm HCl s 0,2% Tween 20 neutralizované 150 mm imidazolem. Do zbylých sloupců bylo vpraveno 100 μl příslušných vzorků. Poté bylo mimo prvního sloupce přidáno 50 μl králičí primární protilátky proti camp (rabbit anti-camp) ředěné 1:3 000 v TBST-2% BSA a destička byla inkubována přes noc při teplotě 4 C. Třetí den byla destička 4krát promyta 200 μl TBST a poté bylo přidáno 100 μl sekundární protilátky značené křenovou peroxidázou (anti-rabbit Px) ředěné 1:1000 v TBST-2% BSA. Po 2 až 3 hodinové inkubaci při teplotě 37 C byla destička 4krát promyta 200 μl TBST. Do každé jamky bylo přidáno 100 µl OPD substrátu (5 mg OPD + 10 µl 30% H2O2 v 10 ml 0,1 M roztoku citrátu trisodného o ph 5,0). Reakce probíhala několik minut podle intenzity zabarvení vzorků a byla zastavena přídavkem 50 μl kyseliny sírové. Nakonec byla odečtena hodnota absorbance při vlnové délce 492 nm a pomocí kalibrační křivky dopočítána koncentrace camp, která určuje invazivní aktivitu toxinu CyaA Stanovení prezentace antigenů s MHC molekulami I. třídy Pro studium prezentace antigenů s molekulami MHC I byly jako antigen prezentující buňky použity dendritické buňky odvozené z kostní dřeně (Bone-Marow derived Dendritic Cells, BM-DC), které byly kultivovány v RPMI médiu obsahující 2 ng/ml stimulačního faktoru GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor). Diferenciované buňky byly sklizeny den a připraveny k použití. Pro stanovení prezentace antigenů bylo nutné vložit kontrolní epitop SIIMEER (SM) do AC domény CyaA toxinu a jako pozitivní kontrola sloužil volný MHC I epitop o sekvenci SIINFEKL. Antigen prezentující buňky (105 buněk v 200 μl média) byly inkubovány s různými koncentracemi volného MHC I epitopu ředěného ve sterilním PBS + 10% FCS a rekombinantních CyaA-SM-TB7.7 toxinů ředěných v TUC pufru. Po 4 hodinách inkubace v CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC) byly buňky centrifugovány a odebráno médium s nenavázaným toxinem. Poté byly přidány CD8+ T buněčné hybridomy B3Z (105 buněk v 200 μl média ) a kultivace probíhala dalších 18 hodin v CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC). Buňky B3Z jsou schopny specificky rozpoznávat komplexy molekul MHC I s navázaným SIINFEKL epitopem na povrchu APC, což vede k intracelulární produkci β-galaktosidázy. Po skončení inkubace byly buňky centrifugovány, odebráno médium a přidáno 100 μl 68

69 Z pufru. Složky Z pufru způsobují lýzi buněk a uvolnění β-galaktozidázy do supernatantu. Z pufr dále obsahuje CRPG (chlorophenol red-β-d-galactopyranoside), který je β-galaktozidázou přeměněn na červený produkt. Reakce probíhala za mírného míchání bez přístupu světla při teplotě 30 ºC po dobu přibližně dvou hodin a byla zastavena přídavkem 50 μl 1 M glycinu. Při vlnové délce 570 nm proběhlo odečtení absorbance Stanovení prezentace antigenů s MHC molekulami II. třídy Studium prezentace antigenů s molekulami MHC II probíhalo zpočátku stejně jako v případě prezentace s molekulami MHC I (kap ). Jako pozitivní kontrola sloužil buď volný MHC II epitop o sekvenci IINFEKLTEWTSSNVMEER nebo celý protein ovalbumin. Po čtyřhodinové inkubaci v CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC), centrifugaci a odebrání média s nenavázaným toxinem byly přidány CD4+ T buněčné hybridomy MF2.2D9 (105 buněk v 200 μl média). Kultivace probíhala dalších 18 hodin v CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC), při níž buňky MF2.2D9 specificky rozpoznávaly komplexy molekul MHC II s navázaným kontrolním epitopem na povrchu APC. Tato stimulace vedla k extracelulární produkci interleukinu 2 (IL-2), který byl dále stanovován metodou IL-2 ELISA (kap ) IL-2 ELISA Pro stanovení cytokinu IL-2, který je produkován antigen prezentujícími buňkami, byla používána metoda sandwich ELISA. Na mikrotitrační destičku (Maxisorp, Nuncimmuno) bylo do každé jamky naneseno 50 μl protilátky proti IL-2 (rat anti-mouse IL-2) o výsledné koncentraci 1 μg/ml naředěné v bikarbonátovém pufru (ph 9,6) a inkubováno přes noc při teplotě 4 ºC. Druhý den ráno byly jamky promyty 3krát 300 μl PBST přístrojem Columbus Pro od firmy Tecan a obsah jamek dále blokován 100 μl PBS-1% BSA po dobu 1 hodiny při teplotě 37 ºC. Jamky byly opět promyty 3krát 300μl PBST a do každé z nich bylo přidáno 100 μl supernatantu s cytokinem IL-2, který byl vytvořen při stanovování prezentace antigenů s molekulami MHC II (kap ). Inkubace probíhala další 2 hodiny při teplotě 37 ºC, kdy docházelo k navázání IL-2 na protilátku rat anti-mouse IL-2. Dále byly jamky promyty PBST, přidáno 100 μl biotinylované protilátky proti IL-2 (biotin rat anti-mouse IL-2) o výsledné koncentraci 0,25 μg/ml naředěné v PBS-1% BSA a směs inkubována 1 hodinu při teplotě 25 C. Po dalším promytí PBST bylo přidáno 100 μl křenové peroxidázy konjugované se streptavidem ředěné 1:5 000 v PBS-1% BSA a směs inkubována 30 minut při teplotě 25 C. Po opětovném promytí PBST bylo přidáno 100 μl OPD substrátu a reakce 69

70 probíhala podle intenzity zabarvení vzorků (přibližně 3 až 10 minut). Reakce byla zastavena přídavkem 100 μl 2 M kyseliny sírové a na závěr byla odečtena hodnota absorbance při vlnové délce 492 nm Práce s tkáňovými liniemi Uchovávání tkáňových linií Tkáňové linie byly uchovávány v konzervách s kryoprotektivním roztokem (FCS 450 μl/ml, 450 μl/ml růstového média a 100 µl/ml DMSO) při teplotě 80 C Rozmražení buněk Konzerva buněk s kryoprotektivním roztokem byla rychle rozmražena ve vodní lázni o teplotě 56 C a buňky převedeny do růstového média. Suspenze buněk byla následně centrifugována (120 g, 25 C, 3 minuty), aby došlo k odstranění kryoprotektivního roztoku. Po odstranění supernatantu byl sediment buněk resuspendován v 15 ml růstového média. Buňky byly dále vysety na Petriho misku a kultivovány v CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC) Izolace a maturace dendritických buněk z kostní dřeně Lýtkové a stehenní kosti vypreparované z myši byly pomocí injekční stříkačky s jehlou propláchnuty 10 ml PBS. Vyizolované buňky byly centrifugovány (120 g, 25 C, 3 minuty) a supernatant odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 10 ml DC média a přečištěny přes filtr s póry o velikosti 70 μm. Dále byl stanoven počet buněk pomocí Bürkerovy komůrky (kap ) a suspenze centrifugována (120 g, 25 C, 3 minuty). Pelet byl následně resuspendován v takovém objemu DC média, aby bylo dosaženo koncentrace 2 x 106 buněk/ml. Vzniklá suspenze buněk byla rozdělena po 1 ml na Petriho misky, doplněna DC médiem na celkový objem 10 ml a umístěna do CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC), kde probíhala kultivace. K buňkám bylo 3. den od izolace přidáno 10 ml nového DC média. Po dalších třech dnech (tj. 6. den od izolace) inkubace v CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC) bylo z každé misky odebráno 10 ml média, které bylo následně centrifugováno (120 g, 25 C, 3 minuty). Staré médium bylo odstraněno a buňky resuspendovány ve stejném množství nového DC média. Na každou misku bylo vráceno 10 ml a buňky byly dále kultivovány v CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC). Za následující dva dny (tj. 8. den od izolace) byly dendritické buňky maturovány a připraveny pro další použití (kap a kap ) 70

71 Pasážování buněk Buňky adherentní tkáňové linie byly během pasážování staženy buněčnou škrabkou do média RPMI a buňky neadherentní tkáňové linie byly pouze omyty proudem média. Následovala centrifugace (120 g, 25 C, 3 minuty) a odstranění supernatantu. Buňky byly resuspendovány v 15 ml čerstvého RPMI média a rozděleny na Petriho misky. K buňkám bylo přidáno médium do celkového objemu ml a Petriho misky umístěny do CO2 inkubátoru (5% hladina CO2, 37 ºC), kde byly dále kultivovány. U kultivovaných buněk proběhla každý druhý den výměna RPMI média Stanovení počtu buněk v suspenzi pomocí Bürkerovy komůrky Suspenze buněk byla nanesena do Bürkerovy komůrky. Množství buněk bylo spočítáno v 16 polích a stanoven průměrný počet buněk v jednom poli. Pro stanovení celkového počtu buněk v 1 ml buněčné suspenze sloužil vzorec: n= x ,004 n...počet buněk v 1 ml buněčné suspenze x...průměrný počet buněk v jednom poli 71

72 4. Výsledky 4.1. Příprava plazmidů pro produkci CyaA proteinů Následující část práce měla za cíl připravit nové konstrukty pro produkci adenylát cyklázového toxinu nesoucího mykobakteriální antigen TB7.7, jenž byl vložený do AC domény za aminokyseliny na pozici 233 nebo 336. Tyto dvě permisivní místa byla už dříve úspěšně použita pro umístění mykobakteriálních antigenů ESAT-6 a CFP-10. Pro stanovení prezentace antigenů s molekulami MHC I a MHC II byl zvolen kontrolní epitop odvozený od ovalbuminu, který byl vložen do permisivního místa 108. Detoxifikace toxinu byla provedena vložením dipeptidu Gly-Ser do pozice 188 a plazmidy či proteiny nesou označení E5. Výchozí plazmid pt7ct7act1 E5 vytvořila Mgr. Lenka Sadílková. Konstrukt Gly-Ser SIIMEER TB7.7 TB7.7 v místě 188 v místě 108 v místě 233 v místě 336 pt7ct7act1 pt7ct7act1 E5 + pt7ct7act1-108sm + pt7ct7act1-108sm E5 + + pt7ct7act1-233tb7.7 + pt7ct7act1-233tb7.7 E5 + + pt7ct7act1-336tb7.7 + pt7ct7act1-336tb7.7 E5 + + pt7ct7act1-108sm-233tb pt7ct7act1-108sm-233tb7.7 E pt7ct7act1-108sm-336tb pt7ct7act1-108sm-336tb7.7 E Tab. 5. Seznam expresních vektorů použitých pro produkci proteinů. Tabulka ukazuje, ve kterých pozicích je vložen dipeptid Gly-Ser způsobující ztrátu enzymatické aktivity toxinu, kontrolní epitop SIIMEER a mykobakteriální antigen TB PCR amplifikace DNA sekvence kódující kontrolní OVA epitop Jako kontrolní epitop byla vybrána část ovalbuminu (OVA) s názvem SIIMEER (SM), což označuje aminokyselinovou sekvenci SIINFEKLTEWTSSNVMEER o velikosti 2,5 kda. Epitop SIINFEKL je po dopravení do APC a následném zpracování vystavován s molekulami MHC I. Druhá část molekuly označuje epitop, který je naopak vystavován s molekulami MHC II. 72

73 DNA sekvence kódující epitop byla získána PCR amplifikací (kap ) z plazmidu pet28b-ova, který nese celou DNA sekvenci pro ovalbumin, použitím dvojice primerů SM2_for a SM2_back (kap ). Výsledný PCR produkt o velikosti 85 pb byl ohraničen štěpnými místy pro restrikční endonukleázu Acc65I, která jsou určena pro klonování PCR fragmentu do expresních vektorů pt7ct7act1-108bsrgi a pt7ct7act1-108bsrgi E5. Štěpení endonukleázami Acc65I a BsrGI vede ke vzniku stejných kohezních konců, ale jejich vzájemné spojení způsobí zánik původních štěpných míst. Získaný PCR fragment obsahoval štěpné místo pro restrikční endonukleázu NheI, jenž sloužilo pro ověření správné orientace fragmentu po ligaci do vektoru. Přítomnost PCR produktu o velikosti 85 pb v reakční směsi byla ověřena pomocí elektroforézy v agarózovém gelu (kap ) PCR amplifikace DNA sekvence kódující antigen TB7.7 DNA fragment kódující specifický mykobakteriální antigen TB7.7 byl získán PCR amplifikací (kap ) z plazmidu pet28b-dhis-tb7.7 použitím dvojice primerů TB7.7_for a TB7.7_back (kap ). Výsledný PCR produkt o velikosti 240 pb byl ohraničen štěpnými místy pro restrikční endonukleázy BsrGI a Acc65I, která jsou určena pro klonování PCR fragmentu do expresních vektorů pt7ct7act1-233bsrgi a pt7ct7act1-336bsrgi. Bylo použito stejné strategie klonování jako v předchozím případě. Přítomnost PCR produktu o velikosti 240 pb v reakční směsi byla ověřena pomocí elektroforézy v agarózovém gelu (kap ) Konstrukce expresních vektorů pro produkci CyaA proteinů Ke konstrukci expresních vektorů č. 1 až 4 z Tab. 6 byly výchozí vektory linearizovány štěpením restrikční endonukleázou BsrGI (kap ) a zpětné recirkulaci vektorů zabránila defosforylace linearizovaných vektorů alkalickou fosfatázou (kap ). Linearizované vektory byly izolovány z agarózového gelu (kap ) a ligovány (kap ) s PCR fragmentem, jenž byl předem štěpený restrikční endonukleázou PCR fragment nesoucí DNA sekvenci kódující kontrolní epitop SIIMEER (kap ) byl štěpený rektriktázou Acc65I (kap ) a PCR fragment kódující mykobakteriální antigen TB7.7 (kap ) byl štěpený restriktázou BsrGI a Acc65I (kap ). PCR fragment pro SIIMEER byl navržen tak, aby po ligaci zanikly místa na obou stranách. U PCR fragmentu pro TB7.7 zanikne štěpné místo pouze na 3' konci fragmentu, čehož lze využít pro ověřování správnosti ligace a další klonování. 73

74 Konstrukce plazmidů č. 5 a 6 z Tab. 6 byla provedena překlonováním fragmentů z vytvořených expresních vektorů č. 3 a 4 obsahujících sekvenci kódující antigen TB7.7 do výchozích vektorů kódujících detoxifikovaný toxin CyaA (Obr. 13). Klonování bylo provedeno štěpením restrikčními endonukleázami BsrGI a XhoI (kap ), čímž vznikly z každého vektoru dva fragmenty o různých velikostech, izolací fragmentů z agarózového gelu (kap ) a ligací delších úseků z výchozích vektorů obsahujících dipeptid Gly-Ser způsobující detoxifikaci toxinu s kratšími úseky, které obsahují DNA sekvenci pro antigen TB7.7. Tímto klonováním vznikly plazmidy, jenž kódují detoxifikovaný toxin CyaA s vloženým antigem TB7.7. Číslo Konstrukt Vektor Původ fragmentu Použité restrikční endonukleázy 1 pt7ct7act1108sm pt7ct7act1108bsrgi PCR fragment kódující BsrGI, Acc65I epitop SM 2 pt7ct7act1108sm E5 pt7ct7act1108bsrgi E5 PCR fragment kódující BsrGI, Acc65I epitop SM 3 pt7ct7act1233tb7.7 pt7ct7act1233bsrgi PCR fragment kódující BsrGI, Acc65I antigen TB7.7 4 pt7ct7act1336tb7.7 pt7ct7act1336bsrgi PCR fragment kódující BsrGI, Acc65I antigen TB7.7 5 pt7ct7act1233tb7.7 E5 pt7ct7act1233bsrgi E5 pt7ct7act1233tb7.7 BsrGI, XhoI 6 pt7ct7act1336tb7.7 E5 pt7ct7act1336bsrgi E5 pt7ct7act1336tb7.7 BsrGI, XhoI 7 pt7ct7act1108sm-233tb7.7 pt7ct7act1108sm pt7ct7act1233tb7.7 EcoRV 8 pt7ct7act1108sm-336tb7.7 pt7ct7act1108sm pt7ct7act1336tb7.7 EcoRV 9 pt7ct7act1pt7ct7act1108sm-233tb7.7 E5 233TB7.7 E5 pt7ct7act1108sm E5 BamHI 10 pt7ct7act1pt7ct7act1108sm-336tb7.7 E5 336TB7.7 E5 pt7ct7act1108sm E5 BamHI Tab. 6. Seznam expresních vektorů. V tabulce jsou uvedeny názvy vytvořených konstruktů, vektory, do kterých byly klonovány fragmentů získané buď PCR amplifikací, nebo vyštěpením z vybraných plazmidů, a restrikční endokuleázy použité při klonování. 74

75 Plazmidy č. 7 až 10 z Tab. 6 kódují toxiny CyaA, popř. jejich detoxifikované formy, nesoucí jak kontrolní epitop SIIMEER v permisivním místě 108, tak specifický mykobakteriální antigen TB7.7 v pozicích 233 nebo 336. Pro vytvoření konstruktů (Obr. 14 a Obr. 15) byly výchozí plazmidy štěpeny buď rektrikční endonuleázou EcoRV, nebo BamHI, kdy z každého plazmidu vznikly dva fragmenty o různých velikostech, protože obě endonuleázy mají uvnitř plazmidů dvě štěpná místa. Delší DNA fragmenty byly defosforylovány (kap ), aby bylo při následné ligaci zabráněno recirkularizaci vektoru. Následovala izolace vybraných fragmentů z agarózového gelu (kap ) a nakonec byly provedeny čtyři souběžně probíhající ligační reakce, kdy do větších fragmentů byly ligovány kratší úseky. Ligační směsi byly transformovány do superkompetentních buněk E. coli XL-1 Blue (kap ) a z jednotlivých kolonií byly minipreparací izolovány plazmidové DNA (kap ). Přítomnost epitopu SIIMEER a jeho orientace v expresních vektorech č. 1 a 2 ověřila restrikční analýza pomocí endonukláz NheI a BamHI. Ověření ligace a správné orientace antigenu TB7.7 v konstruktech č. 3 a 4 bylo provedeno restrikčními endonukleázami BsrGI a NcoI. Překlonování antigenu TB7.7 do vektorů č. 5 a 6 bylo potvrzeno štěpením endonuleázami MluI a XhoI. Úspěšnost ligace a vznik konstruktů č. 7 až 10, které kódují toxiny CyaA a jejich detoxifikovanou verzi nesoucí antigen TB7.7 a kontrolní epitop SIIMEER, byla ověřena restrikční analýzou pomocí endonukleáz NheI a NcoI. Expresní vektory, ze kterých úspěšně proběhla produkce cílových proteinů, byly na závěr ověřeny sekvenací (kap ). 75

76 pt7ct7act1-233tb7.7 pt7ct7act1-336tb pb pt7ct7act1-233bsrgi E5 pt7ct7act1-336bsrgi E pb cyac cyac Amp Amp TB7.7 Gly-Ser BsrGI BsrGI cyaa cyaa XhoI XhoI pt7ct7act1-233tb7.7 E5 pt7ct7act1-336tb7.7 E pb cyac Amp Gly-Ser TB7.7 BsrGI cyaa XhoI Obr. 13. Grafické schéma konstrukce expresních vektorů pro produkci proteinů CyaA233TB7.7 E5 a CyaA-336TB7.7 E5. Výchozí vektory byly štěpeny restrikčními endonukleázami BsrGI a XhoI. Vybrané fragmenty byly izolovány z gelu a ligovány T4 DNA ligázou. Dipeptid Gly-Ser leží v ATP vazebném místě, což vede ke ztrátě enzymatické aktivity toxinu. 76

77 pt7ct7act1-233tb7.7 pt7ct7act1-336tb pb cyac pt7ct7act1-108sm 8977 pb cyac EcoRV Amp Amp SM TB7.7 cyaa EcoRV cyaa EcoRV EcoRV pt7ct7act1-108sm-233tb7.7 pt7ct7act1-108sm-336tb pb cyac Amp SM EcoRV TB7.7 cyaa EcoRV Obr. 14. Grafické schéma konstrukce expresních vektorů pro produkci proteinů CyaA108SM-233TB7.7 a CyaA-108SM-336TB7.7. Výchozí vektory byly štěpeny restrikční endonukleázou EcoRV. Vybrané fragmenty byly izolovány z gelu a ligovány T4 DNA ligázou. 77

78 pt7ct7act1-233tb7.7 E5 pt7ct7act1-336tb7.7 E pb pt7ct7act1-108sm E pb BamHI BamHI cyac Amp cyac SM Amp BamHI BamHI TB7.7 cyaa cyaa pt7ct7act1-108sm-233tb7.7 E5 pt7ct7act1-108sm-336tb7.7 E pb BamHI cyac Amp SM BamHI TB7.7 cyaa Obr. 15. Grafické schéma konstrukce expresních vektorů pro produkci proteinů CyaA108SM-233TB7.7 E5 a CyaA-108SM-336TB7.7 E5. Výchozí vektory byly štěpeny restrikční endonukleázou BamHI. Vybrané fragmenty byly izolovány z gelu a ligovány T4 DNA ligázou. Restrikční místo BamHI v genu cyaa kóduje dipepid Gly-Ser, který způsobuje detoxifikaci toxinu. 78

79 4.2. Produkce a purifikace vytvořených CyaA proteinů Pro produkci rekombinantního wild-type toxinu CyaA a dalších CyaA proteinů byl využíván plazmid pt7ct7act1 (kap ), ve kterém je stejně silné ribozom vazebné místo jak před genem pro CyaA, tak před genem pro CyaC. Protein CyaC je acyltransferáza, která posttranslačně modifikuje toxin CyaA, což vede ke vzniku plně aktivního toxinu CyaA. U každého nově vytvořeného konstruktu pro produkci proteinu CyaA byla nejprve vyzkoušena exprese v 2 ml kulturách (kap ) a následně přistoupeno k produkci proteinů buňkami E. coli XL-1 Blue ve velkých objemech v 500 ml MDO média při teplotě 37 C (kap ). Během kultivace vznikají uvnitř buněk inkluzní tělíska obsahující CyaA protein, který je z nich získávám extrakcí v 8 M močovině (kap ). A kda B kda Obr. 16. Elektroforetická analýza CyaA proteinů. Alikvóty proteinů byly děleny pomocí 7,5% SDS-PAGE elektroforézy a gel byl barven Coomassie Brilliant Blue. (A) Průběh purifikace původního wild-type toxinu CyaA WT. (1) Bakteriální lyzát; (2) Močovinový extrakt; (3) Eluce z DEAE-Sepharose; (4) Eluce z první purifikace na Phenyl-Sepharose. (B) Eluce z druhé purifikace na Phenyl-Sepharose. Množství proteinů na gelu činí 3 μg. (1) CyaA WT; (2) CyaA E5; (3) CyaA-233TB7.7; (4) CyaA-233TB7.7 E5; (5) CyaA-336TB7.7; (6) CyaA-336TB7.7 E5; (7) CyaA-108SM; (8) CyaA-108SM E5; (9) CyaA-108SM-233TB7.7; (10) CyaA-108SM-233TB7.7 E5; (11) CyaA-108SM-336TB7.7; (12) CyaA-108SM336TB7.7 E5. 79

80 Proteiny byly poté purifikovány metodou gravitační iontoměničové chromatografie na DEAE-Sepharose (kap ) a dále pomocí chromatografie na koloně plněné hydrofobní matricí Phenyl-Sepharose (kap ). Pro dokonalé odstranění bakteriálního endotoxinu lipopolysacharidu (LPS) bylo nutno hydrofobní chromatografii provést dvakrát, přičemž o kvantitativním odstranění LPS rozhoduje promývání 60% izopropanolem. Pomocí SDS-PAGE elektroforézy (kap ) byla ověřena produkce CyaA proteinů, jejich přítomnost v močovinových extraktech a čistota jednotlivých frakcích při purifikaci. Z hodnot absorbancí kalibračního standardu, kterým byl hovězí sérový albumin (BSA), byla sestrojena kalibrační křivka, podle níž byly metodou podle Bradfordové (kap ) stanoveny koncentrace purifikovaných proteinů v jednotlivých elučních frakcích (Tab. 7). Koncentrace (mg/ml) Protein CyaA WT ( wild-type ) 1,42 CyaA E5 (detoxifikovaný toxin) 1,64 CyaA-108SM 0,84 CyaA-108SM E5 1,51 CyaA-233TB7.7 1,17 CyaA-233TB7.7 E5 1,10 CyaA-336TB7.7 0,38 CyaA-336TB7.7 E5 1,58 CyaA-108SM-233TB7.7 1,08 CyaA-108SM-233TB7.7 E5 0,86 CyaA-108SM-336TB7.7 1,11 CyaA-108SM-336TB7.7 E5 1,51 Tab. 7. Seznam purifikovaných proteinů a jejich koncentrace. Tabulka zobrazuje názvy purifikovaných proteinů a jejich koncentrace, které byly stanoveny metodou podle Bradfordové. 80

81 4.3. Charakterizace biologických vlastností CyaA proteinů Další z cílů této části diplomové práce se týkalo charakterizace biologických vlastností jednotlivých CyaA proteinů. Byla stanovena adenylát cyklázová aktivita (kap ), vazba toxinu na buňky (kap ), hemolytická aktivita (kap ), invazivní aktivita pomocí stanovení intracelulární hladiny camp (kap ) a schopnost prezentace antigenů s molekulami MHC I a MHC II (kap ) Adenylát cyklázová aktivita CyaA proteinů Adenylát cyklázový toxin CyaA dokáže po translokaci své AC domény do cytozolu buněk, kde dochází k vazbě kalmodulinu, velmi účinně přeměňovat ATP na camp.tato schopnost se nazývá adenylát cyklázová aktivita. Do adenylát cyklázové domény toxinu CyaA lze díky její strukturní flexibilitě vkládat různé epitopy, aniž by došlo ke snížení enzymatické aktivity toxinu (Ladant et al., 1992; Osicka et al., 2000). V některých případech vložení peptidů do určitých míst vede k detoxifikaci toxinu, což má za následek neschopnost přeměňovat ATP na camp. Následující stanovení (kap ) určilo, zda došlo k detoxifikaci toxinu nebo zda byl CyaA protein stále aktivní, popřípadě jestli byla snížena jeho enzymatická aktivita. CyaA protein AC aktivita CyaA WT (wild type) +++ CyaA E5 (detoxifikovaný toxin) CyaA-108SM ++ CyaA-108SM E5 CyaA-233TB CyaA-233TB7.7 E5 CyaA-336TB7.7 CyaA-336TB7.7 E5 CyaA-108SM-233TB7.7 + CyaA-108SM-233TB7.7 E5 CyaA-108SM-336TB7.7 CyaA-108SM-336TB7.7 E5 Tab. 8. Adenylát cyklázová aktivita CyaA proteinů. V tabulce jsou zaznamenány adenylát cyklázové aktivity CyaA proteinů. Počet znamének plus ukazuje nakolik je zachována enzymatická aktivita. Znaménko minus značí toxiny, u kterých došlo k detoxifikaci. 81

82 Uvedené údaje potvrdily, že CyaA proteiny označené jako E5 s vloženým dideptidem Gly-Ser do místa 188 jsou detoxifikované a nedokáží přeměňovat ATP na camp. Dále bylo zjištěno, že vložení antigenu TB7.7 do pozice 336 zapříčiní také detoxifikaci toxinu. Oproti tomu vložení antigenu TB7.7 do pozice 233 nijak nenarušuje enzymatickou aktivitu toxinu CyaA. Vložení kontrolního epitopu SIIMEER do permisivního místa 108 nevede přímo k detoxifikaci, ale pouze ke snížení enzymatické aktivity. Toxin je sice stále schopný přeměňovat ATP na camp, ale s nižší účinností Vazebná aktivita CyaA proteinů Toxin CyaA se specificky váže na buňky, které mají na svém povrchu receptor CD11B/CD18. Jedná se především o antigen prezentující buňky jako jsou dendritické buňky, makrofágy nebo neutrofily. Pro tento experiment byly zvoleny RAW makrofágy, které mají na svém povrchu zmíněný receptor. Principem stanovení je inkubace toxinu s buňkami majícími receptor CD11b/CD18 (kap ) a následné stanovení adenylát cyklázové aktivity (kap ) toxinů navázaných na membránu makrofágů. Povaha tohoto experimentu dovoluje zjistit vazebnou aktivitu pouze u toxinů, které jsou enzymaticky aktivní. V důsledku toho byla vazebná aktivita stanovena pouze u vytvořených konstruktů CyaA-233TB7.7, CyaA-108SM, CyaA-108SM-233TB7.7 (kap. 4.1) a wild-type toxinu CyaA WT, jenž sloužil jako pozitivní kontrola. Veškeré kroky probíhaly na ledu, aby bylo zabráněno endocytóze toxinu. Jako negativní kontrola sloužil toxin CyaA WT preinkubovaný po dobu 15 minut s protilátkou M1/70, která blokuje vazbu toxinu na receptor CD11b/CD18. Používaná koncentrace toxinu činila 3 μg/ml. Čas inkubace toxinu s buňkami byl nastaven na 15 minut. Při vlastním stanovení adenylát cyklázové aktivity (kap ) reakce probíhala 10 minut. Z výsledných hodnot adenylát cyklázové aktivity bylo z celkového přidaného množství toxinu určeno procentuální zastoupení navázaných molekul CyaA na buňce a vazebná aktivita byla procentuálně vztažena k původnímu wild-type toxinu CyaA WT (Obr. 17). Stanovením vazebné aktivity bylo zjištěno, že vybrané konstrukty CyaA WT, CyaA233TB7.7, CyaA-108SM a CyaA-108SM-233TB7.7 jsou schopné se vázat na buňky mající na svém receptoru CD11b/CD18. Proto lze tvrdit, že vložení kontrolního epitopu SIIMEER a antigenu TB7.7 neovlivňuje vazebnou aktivitu toxinu CyaA. 82

83 160 Vazebná aktivita (%) /70 SM 1 B T aa +M A23 23 Cy T a M W aa Cy y 8S A C 0 a 1 y C aa y C T W 7.7 B T Obr. 17. Vazebná aktivita CyaA proteinů. Vazebné aktivity byly procentuálně vztaženy k wild-type toxinu CyaA WT, který sloužil jako pozitivní kontrola. Jako negativní kontrola byl použit toxin CyaA WT preinkubovaný s protilátkou M1/70 proti receptoru CD11b/CD18. Z grafu vyplývá, že vytvořené CyaA proteiny mají zachovanou vazebnou aktivitu Hemolytická aktivita CyaA proteinů Následující metodou (kap ) byla zjištěna schopnost toxinu CyaA tvořit oligomerní kanály v membránách buněk. Kanálotvorná aktivita toxinu je důležitá pro dopravení antigenů na molekuly MHC II a vyvolání antigen specifických CD4+ T buněčných odpovědí (Obr. 4). O toxinu CyaA je známo, že je schopen v membránách červených krvinek tvořit póry, kterými do buňky proudí voda. Krvinky zvětšují svůj objem až nakonec dochází ke koloidně osmotické lýze buněk a k uvolnění hemoglobinu, jenž je spektrofotometricky měřen při vlnové délce 541 nm. Při pokusu byly používány červené krvinky izolované z beraní krve. Toxiny byly naředěny na stejnou výchozí koncentraci 0,3 mg/ml a pro vlastní experiment byla používána finální koncentrace 3 μg/ml. Doba inkubace toxinů s buňkami byla nastavena na 3 hodiny. Jako pozitivní kontrola sloužil detoxifikovaný toxin CyaA. Získané hodnoty absorbance byly procentuálně vztaženy k maximální míře lýze krvinek (Obr. 18). Všechny konstrukty jsou odvozeny od wild-type toxinu CyaA a veškeré úpravy probíhaly pouze v adenylát cyklázové doméně. Hydrofobní kanálotvorná doména nebyla nijak dotčena, a tudíž bylo předpokládáno, že vytvořené CyaA proteiny budou schopné tvořit 83

84 oligomerní kanály v membránách buněk. Provedený experiment potvrdil tuto domněnku a výsledky ukazují, že purifikované CyaA proteiny jsou hemolyticky aktivní. 70 Hemolýza (%) E5 8SM E5 B7.7 7 E5 B7.7 7 E5 B7.7 7 E5 B7.7 7 E5 A a SM 33T 10 6T 3T 6T B B B B Cy aa T A-3 6T M-2 3T M-3 6T aa a Cy yaa S S y y 8 8 M C C aa aa C SM S Cy Cy aa A a -1 Cy yaa Cy yaa C C Obr. 18. Hemolytická aktivita CyaA proteinů. Použitá finální koncentrace toxinů byla 3 μg/ml. Jako pozitivní kontrola sloužil detoxifikovaný toxin CyaA. Získané hodnoty absorbance byly procentuálně vztaženy k maximální míře lýze krvinek. Uvedené výsledky ukazují, že stanovované CyaA proteiny jsou hemolyticky aktivní Invazivní aktivita CyaA proteinů Další z měřitelných aktivit toxinu CyaA je schopnost translokovat AC doménu do cytozolu cílových buněk (Bellalou et al., 1990; Rogel et al., 1989), kde dochází k navázání buněčného kalmodulinu a nekontrolované přeměně ATP na camp (Confer and Eaton, 1982; Hanski and Farfel, 1985; Wolff et al., 1980). Z tohoto důvodu je možno hladinu molekuly camp použít pro stanovení invazivní aktivity toxinu (kap ). Jako antigen prezentující buňky sloužily RAW makrofágy, které mají na svém povrchu receptor CD11b/CD18. K buňkám byly přidány CyaA proteiny o různé koncentraci a inkubace probíhala po dobu 30 minut. Během této doby by mělo docházet k navázání toxinu na buňky, translokaci AC domény a masivní přeměně ATP na camp. Hladina vytvořeného camp byla zjištěna pomocí metody kompetitivní ELISA, kdy dochází ke kompetici mezi pevně navázanými molekulami camp na stěnách jamek mikrotitrační destičky a volnými molekulami camp, jenž pocházejí z makrofágů inkubovaných s CyaA proteiny. Jako 84

85 primární protilátka byla použita králičí protilátka proti camp (rabbit anti-camp). Sekundární protilátka značená křenovou peroxidázou (anti-rabbit Px) přeměňuje OPD substrát na žlutý produkt a výsledek reakce byl spektrofometricky změřen při vlnové délce 492 nm. Pomocí kalibrační křivky byly dopočítány koncentrace camp v každé jamce a určena invazivní aktivita CyaA proteinů (Obr. 19). Koncentrace camp (nm) CyaA WT CyaA-233TB7.7 CyaA-108SM Koncentrace toxinu (ng/ml) Obr. 19. Invazivní aktivita CyaA proteinů. Jako pozitivní kontrola sloužil wild-type toxin CyaA WT. Toxin CyaA-108SM má sníženou adenylát cyklázovou aktivitu, a proto byly použity 10x vyšší koncentrace oproti zbylým proteinům, aby bylo možno porovnávat invazivní aktivity CyaA proteinů. Povaha provedené metody dovoluje zjišťovat invazivní aktivitu pouze u enzymaticky aktivních toxinů. Použitá koncentrace toxinu CyaA-108SM byla 10x vyšší než u toxinů CyaA WT a CyaA-233TB7.7. Důvodem byla snížená AC aktivita toxinu CyaA-108SM (kap ) a pro porovnání invazivních aktivit jsou nutné stejné AC aktivity měřených CyaA proteinů. Původní wild-type toxin CyaA WT sloužil jako pozitivní kontrola a výsledky potvrdily, že dokáže translokovat AC doménu do cytozolu cílových buněk. Dále bylo zjištěno, že vložení kontrolního epitopu SIIMEER za aminokyselinu 108 neovlivňuje schopnost toxinu dopravovat AC doménu do buněk. Naproti tomu vložení antigenu TB7.7 do pozice 233 vede k výraznému snížení invazivní aktivity. Doprava AC domény do antigen prezentujících buněk je klíčová pro vystavení antigenů s molekulami MHC I (Obr. 4). Snížení translokace by mohlo být způsobeno negativním nábojem antigenu TB7.7 nebo strukturní změnou AC domény vyvolanou vložením antigenu. 85

86 Konstrukce expresních vektorů pro zlepšení translokace AC domény Stanovením invazivní aktivity vytvořených CyaA proteinů bylo zjištěno, že vložení antigenu TB7.7 do CyaA toxinu výrazně snižuje schopnost translokace AC domény do cytozolu cílových buněk (kap ). Pokud nedochází k dopravě AC domény do buněk, nemůže následovat zpracování antigenů a jejich vystavení s molekulami MHC I (kap ). Jednou z možných příčin zodpovědnou za znemožnění translokace AC domény může být celkový náboj vloženého antigenu. Bylo ukázáno, že translokace je závislá na celkovém náboji vkládaného antigenu a neprobíhá pokud se náboj antigenu pohybuje v záporných hodnotách (Karimova et al., 1998). Náboj antigenu se rovná rozdílu mezi pozitivně (Arg + Lys) a negativně (Asp + Glu) nabitými aminokyselinami a u TB7.7 činí 3. Přidání několika pozitivně nabitých aminokyselin k antigenu TB7.7 změní celkový náboj na kladné hodnoty a to by mohlo vést ke zlepšení translokace AC domény. Další aminokyseliny byly vkládány do vytvořeného konstruktu pt7ct7act1-233tb7.7 (kap ), který nemá sníženou enzymatickou aktivitu (kap ), váže se na buňky s receptorem CD11b/CD18 (kap ), tvoří oligomerní kanály v membráně cílových buněk (kap ), ale jeho invazivní aktivita je však výrazně snížená (kap ). V sekvenci vybraného konstruktu se před antigenem TB7.7 v AC doméně nalézá štěpné místo pro restrikční endonukleázu BsrGI, které bylo využito pro vložení dvou různých malých peptidů. Jeden z peptidů byl nazván R5, jelikož se skládal z pěti po sobě jdoucích argininů. Druhý peptid pochází z proteinu TAT viru HIV a bylo o něm zjištěno, že může být translokovaný přes membránu buněk (Vivès et al., 1997). Peptid R5 zvyšuje náboj o +5 a peptid z proteinu TAT o +7. R5 peptid RRRRR HIV TAT peptid GRKKRRQRR Tab. 9. Aminokyselinová sekvence R5 peptidu a HIV TAT peptidu. Tyto dva peptidy mají pozitivní náboj a mění celkový náboj AC domény. Peptidy byly vkládány před antigen TB7.7 v pozici 233 do štěpného místa pro restrikční endonuklázu BsrGI, které se nachází před antigenem TB7.7. Pro přípravu nových konstruktů byly firmou Generi Biotech nasyntetizovány dva komplementární řetězce (kap ) pro každý peptid. Řetězce byly následně spojeny (kap ) a dvouřetězcové oligonukleotidy zaligovány do plazmidu pt7ct7act1233tb7.7, který byl předem naštěpen restrikční endonukleázou BsrGI. Syntetické 86

87 oligonukleotidy nesly na svých koncích kohezivní konce odpovídající endokleáze Acc65I. Dále nesly unikátní štěpné místo pro endonulázu HpaI, což umožnilo ověřit přítomnost peptidů v novém konstruktu. Po zaligování do linearizovaného vektoru rozštěpeného endonukleázou BsrGI zaniknou štěpná místa pro obě restriktázy. Ligační směsi byly transformovány do superkompetentních buněk E. coli XL-1 Blue (kap ) a z jednotlivých kolonií minipreparací izolovány plazmidové DNA (kap ). Úspěšnost ligace a přítomnost peptidu R5 nebo peptidu z TAT proteinu v CyaA toxinu nesoucího na pozici 233 antigen TB7.7 byla ověřena restrikční analýzou pomocí endonukleáz HpaI a ScaI. Správná orientace vložených peptidů byla zjištěna produkcí proteinů v 2 ml kultuře (kap ). Špatná orientace vkládaných malých peptidů vede ke vzniku STOP kodónu, který způsobí produkci neúplného CyaA toxinu, což lze pozorovat na gelu z SDS-PAGE elektroforézy. Vytvořené plazmidy byly na závěr osekvenovány (kap ) a označeny pt7ct7act1-233r5-tb7.7 a pt7ct7act1-233tat-tb7.7. Produkce a purifikace nových konstruktů probíhala stejně jako u konstruktů bez vloženého peptidu R5 nebo peptidu z TAT proteinu (kap. 4.2). Ke kontrole všech kroků sloužila elektroforetická analýza (Obr. 20). Během purifikace proteinu CyaA-233R5-TB7.7 došlo k jeho částečné degradaci, jak lze vidět na Obr. 20 A, kde se objevil druhý produkt o nižší molekulové hmotnosti. A B kda Obr. 20. Elektroforetická analýza produkce a purifikace proteinů. Alikvóty proteinů byly děleny pomocí 7,5% SDS-PAGE elektroforézy a gel byl barven Coomassie Brilliant Blue. (A) Protein CyaA-233R5-TB7.7; (B) Protein CyaA-233TAT-TB7.7. (1) Bakteriální lyzát; (2) Močovinový extrakt; (3) Purifikace na DEAE-Sepharose; (4) Purifikace na Phenyl-Sepharose. 87